DE2608096A1

DE2608096A1 - Antigene und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2608096A1
Application number: DE19762608096
Authority: DE
Inventors: Akira Miwa; Zenzo Tamura; Masanori Yoshioka
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-02-28
Filing date: 1976-02-27
Publication date: 1976-09-02
Also published as: FR2302304A1; US4122078A; FR2302304B1; JPS51101120A; DE2608096C2; JPS6139622B2

Description

FATEMTAhJWALTE PROF. DR. DR. J. ΠΠ i t TöTTER

DR.-IKÜ.W. BCiMl E

DR. W. KI^ZEBACH 260 8096

D - 8 MÜNCHEN 43, BAUERSTR POSTFACH 78Q

München, den 27. Februar 1976 M/17

DAIICHI SEIYAKU CO., LTD.

14-10, Nihonbashi 3-Chome,

Chuo-Ku,

Tokio 103 / JAPAN

Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung

Zir Messung einer in geringfügiger Menge im lebenden Körper vorliegenden Komponente, beispielsweise von Steroidhormonen, ist bekanntlich der Hapten-Radioimmunoassay brauchbar. Jedoch gibt es nur wenige Berichte, die mit der Bestimmung derart kleiner Moleküle, wie Catecholamine, befaßt sind.

Went et al. berichteten, daß Adrenalin-Antigen durch Kupplung von Diazoadrenalin mit einem Serum Albumin unter alkali-

- 1 609838/1015

ORIGINAL INSPECTED

sehen Bedingungen hergestellt wurde. Da Catecholamine unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Sauerstoff instabil sind, kann das Antigen am Catecholteil strukturell verändert sein, so daß die hieraus gebildeten Antikörper für Adrenalin nicht spezifisch sein müssen (Arch. Exp. Path. Pharm. 193, Seite 609 (1939)).

Spector offenbarte eine Synthese von Catecholamin-Antigenen durch Konjugieren eines Catecholamins mit einem Protein oder Polypeptid in Gegenwart eines Carbodiimids durch eine Peptidbindung (US-PS 3 704 282). Während dort die Aminogruppe des Catecholamins bei der Peptidbindung gebraucht wird, sollte eine derartige Aminogruppe des Catecholamins im Konjugat zur Bildung des spezifischen Antikörpers in freier Form erhalten werden.

Deshalb sind diese bislang berichteten Antigene zur Bildung der spezifischen Catecholamin-Antikörper nicht befriedigend.

Die Erfindung betrifft einen neuen Typ von Antigenen von Catecholaminen und die hieraus gebildeten Antikörper.

Die hier als Heptene gebrauchten Catecholamine sind Verbindungen mit der Catechol einheit und der Aminogruppe und können durch die allgemeine Formel II

CH-CH-NH (II)

t I I

worin R₁, R₃ und R₃,die jeweils für H, OH, CH₃ oder COOH

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stehen, dargestellt werden. Zu den Verbindungen der obigen Formel gehören beispielsweise Epinephrin R, = CH ), Norepinephrin (R₁ = OH,

= OH, R_ = H,

= H, R, = H), Dopamin

(R₁ = H, R₂ = H, R = H) und Dopa (R₁ = H, R₃ = COOH, R₃ = H).

Die erfindungsgemäßen Antigene sind die Konjugate von Catecholaminen mit Trägermaterialien, bei denen die Konjugationsbindung an einer bestimmten Position des Phenylkerns des Catecholamins erfolgt, so daß alle charakteristischen Gruppen des Catecholaminmoleküls für die Bildung des spezifischen Antikörpers zur Ausübung ihrer Wirkung übrig bleiben. Daher besitzen die durch Injektion dieser Konjugate an Wirtstieren gebildeten vorliegenden Antikörper gegenüber den Antigenen (Haptene und Konjugate) große Spezifitäten.

Die Arbeitsweise zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate ist im nachfolgenden Reaktionsschema zusammengestellt:

XX

CH-CH-NH

t I I

R^ Rp R-,

CH-CH-N-Acyl

t I I

R_p R-

Mannich-Reaktion

CH-CH-N-Acyl

t I t

R₂ R₃

CH₂-NH-Q

CH-CH-NH 1 t 1

CH₂-NH-Q

S03B3B/V01S

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In den Formeln besitzen die Reste FL, R~ und R, dieselben Bedeutungen wie bei der allgemeinen Formel II, und -NH-Q bedeutet ein Trägermaterial.

Die bei der Synthese des Konjugats angewendeten Techniken sind mit Ausnahme der Art von Schutzgruppen wohlbekannt. Bei dieser Arbeitsweise wird die Aminogruppe des Catecholamins durch eine Acylgruppe geschützt, die Konjugation zwischen dem geschützten Catecholamin und einem Trägermaterial wird nach der Mannich-Reaktion durchgeführt und anschliessend wird die Schutzgruppe entfernt.

Als Trägermaterial kann man Serumproteine oder -polypeptide von Säugern verwenden. Zu Beispielen für Serumproteine gehören Serumalbumin und gamma-Globulin von Säugern, und von diesen verwendet man üblicherweise Rinderserumalbumin (BSA) oder Kaninchenserumalbumin (RSA). Der Begriff "Polypeptide" steht beispielsweise für Polylysin oder Polyglutaminsäure.

Um die Aminogruppe zu schützen, sind Acylgruppen im allgemeinen brauchbar, jedoch sind die Maleylgruppe, die Tr ifluoracetylgruppe und die Citraconylgruppe zum Schutz der Catecholamine am brauchbarsten, da die Acylierung mit diesen ausgewählten Acylgruppen leicht durchgeführt werden kann und die Schutzgruppen unter milden Bedingungen durch Hydrolyse glatt entfernt werden können. Die Acylierung wird durchgeführt, indem man einen mehrfachen molaren, vorzugsweise einen 2-molaren Überschuß an Maleinsäureanhydrid, Trifluoressigsäure oder Citraconsäureanhydrid, bezogen auf das Catecholamin,in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol, Dimethylformamid und dergleichen, verwendet. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur oder bei etwas erhöhter Temperatur. Nach dem Entfernen des überschüssigen Acylierungsmittels

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wird die Reaktionsmischung mit verdünntem Natriumhydroxid, Natriumbicarbonat und dergleichen, neutralisiert, dann entfernt man, falls erforderlich, das unumgesetzte Catecholamin mit einem Kationenaustauscherharz (Natriumtyp) und lyophilisiert das Produkt. Das geschützte Catecholamin kann als Lyophil gelagert werden, jedoch kann man es vorzugsweise nach der nachfolgenden Behandlung aufheben.

Das lyophilisierte Zwischenprodukt wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und durch Zugabe von Äthylacetat ausgefällt, anschließend sammelt man den Niederschlag durch Zentrifugieren und trocknet unter vermindertem Druck.

Die physikalischen Eigenschaften der geschützten Catecholamine werden durch Elektrophorese auf Celluloseacetat und DünnschichtChromatographie auf Silikagel oder Cellulose, bestimmt. Die Bedingungen und Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt.

Elektrophorese auf Celluloseacetat.

Bedingung: Pufferlösung; 0,07 m Veronal/Natrium-Veronal, pH 8,6 elektrischer Strom und Spannung: 2mA/cm, 200 bis 250 Volt Temperatur und Zeit: 10 bis 15°C, 15 Minuten.

Ergebnisse: N-Maleyldopa 1»53

N-Maleylepinephrin 0,68

N-Maleylnorepinephrin 0,71

N-Maleyldopamin 0,71

Alle Maleylverbindungen bewegen sich zur Richtung der Anode, und die Ergebnisse sind durch die relative Beweglichkeit zu Bromkresolgrün (1,0)-Standard dargestellt; bei der Arbeits weise werden die Spots durch die Farbreaktion mit Eisen-II-sulfat (J.R. Doty, Analytical Chemistry 20, 1166 (1948) entdeckt. Die Ausgangsmaterialien (Catecholamine) bewegen sich in KathodenricAtu^ ^ 6 0 3 8 3 6/1015

Dünnschichtchromatographie (Nr.1)

Bedingung: Träger: Silikagel

Lösungsmittel: Methanol/Essigsäure (100:1) Temperatur und Zeit: 10 bis 15°C, 20 Minuten.

Ergebnis (Rf):	Dopa	0,58
	N-Maleyldopa	0,53
	Epinephrin	0,45
	N-Maleylepinephrin	0,52
	Norepinephrin	0,62
	N-Maleylnorepinephrin	0,74
	Dopamin	0,49
	N-Maleyldopamin	0,63

Dünnschichtchromatographie (Nr. 2)

Bedingung: " Träger: Cellulose

Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1) Temperatur und Zeit: 10 bis 15°C, 1 Stunde.

Ergebnis (Rf):	Dopa	0,35
	N-Maleyldopa	0,74
	Epinephrin	0,35
	N-Maleylepinephrin	0,70
	Norepinephrin	0,28
	N-Maleylnorepinephrin	0,70
	Dopamin	0,38
	N-Maleyldopamin	0,83

Dann konjugiert man das geschützte Catecholamin nach der Mannich-Reaktion mit einem Trägermaterial, wie Proteinen oder Polypeptiden. So läßt man beispielsweise einen über-

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schuß des geschützten Catecholamins, der gegenüber dem Peptid oder Protein, wie BSA, ein Mehrfaches eines zehnfachen bis hundertfachen molaren Überschusses ausmacht, wie folgt reagieren: Beide Reaktionspartner werden in Wasser gelöst, anschließend gibt man einen Überschuß an Formaldehyd und Acetatpuffer zur Lösung. Man läßt die Mischung bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur während wenigen oder mehreren Tagen stehen. Nach der Reaktion wird die Mischung beispielsweise gegen verdünnte Chlorwasserstoffsäure, während 24 Std. dialysiert und erwärmt. Wenn die Mischung in Gegenwart von Chlorwasserstoffsäure erwärmt wird, erzielt man die Entfernung der Schutzgruppe, wie Maleyl, sowie der Formylgruppen, die die Aminogruppe des Trägermaterials substituieren. Dann dialysiert man die erhaltene Mischung zwei Tage gegen Wasser und lyophilisiert dann. Das lyophilisierte Konjugat kann gelagert werden. Wenn nach der Synthese des Antigens Antikörper gebildet werden sollen, wird das vorerwähnte, mit Chlorwasserstoffsäure behandelte Antigen mit einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (0,01 m KH₂PO₁J, 0,15 m NaCl, pH 7,¹O dialysiert und anschließend in geeigneter Weise mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verdünnt und mit einem gleichen Volumen Freunds Adjuvans vermischt, um eine Emulsion des Wasser/Öl-Typs herzustellen.

Man stellt fest, daß das Hapten (Catecholamin) mit dem Trägermaterial in einem Verhältnis von 15 bis 35 zu 1 im Antigen (Konjugat) konjugiert ist, was durch die von der Catecholeinheit mit Eisenionen herrührenden Farbreaktion festgestellt wird.

Die physikalischen Ei-genschaften des Antigens werden durch

8 0 9 8 3 6 / 1 0 1 B

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Elektrophorese auf Celluloseacetat bestimmt; die Bedingungen und Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Elektrophorese auf Celluloseacetat

Bedingung: Pufferlösung: 0,07 m Veronal/Natrium-Veronalpufferlösung, pH 8,6.

Elektrischer Strom und Spannung: 2 mA/cm, 200 bis 250 Volt.
Temperatur und Zeit: 10 bis 15°C, 20 Minuten.

Ergebnis: BSA +1 cm

Epinephrin-BSA Konjugat + 1,5 cm

Dopa-BSA Konjugat + 1,9 cm

Dopamin-BSA Konjugat + 1,5 cm

Norepinephrin-BSA Konjugat + 1,5 cm.

Die Spots werden durch Anfärben mit Ponceau 3R entdeckt.

Das wie oben hergestellte Antigen kann einen für das Antigen (Catecholamine, Konjugate) sehr spezifischen Antikörper bilden, da alle empfindlichen Gruppen des zugrundeliegenden Catecholamins im Konjugat so bleiben wie sie sind.

Catecholamin-spezifische Antikörper können in Wirtstieren gebildet und aus den Seren isoliert werden, indem man Techniken anwendet, die auf dem immunochemischen Gebiet wohlbekannt sind. So wird beispielsweise eine Emulsion des Konjugats (Antigen) in Freunds-Adjuvans in ein Wirtstier injiziert, und nach Booster-Injektionen wird das Blut gesammelt. Als Wirtstiere kann man Säuger, wie Kühe, Pferde, Schafe, Ziegen, Schweine, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten und dergleichen verwenden. Das gesammelte Serum kann mit dem in der Konjugation verwendeten Trägermaterial behandelt werden, um den Anti-

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körper zum Trägermaterial hin zu entfernen.

Man stellt anhand der Ouchterlony-Methode (Handbook of Experimental Immunology 19.13 (1973)) fest, daß das Serum für das Antigen (Konjugat) spezifisch ist.

Die Isolierung des Antikörpers aus dem Serum wird bespielsweise durchgeführt, indem man das Serum nach der Dialyse durch eine Säule mit DEAE-Cellulose hindurchgibt. Genauer gesagt, wird das zuvor erhaltene Serum nacheinander gegen eine Harnstofflösung und anschließend gegen Phosphatpufferlösung dialysiert und durch eine DEAE-Cellulosesäule hindurchgegeben. Die gamma-Globulinfraktion (γ-G-Fraktion) wird gesammelt, indem man die Absorption bei 280 nm überwacht. Durch die Ouchterlony-Methode und die Gleichgewichtsdialyse-Methode (F. Karush; Advance in Immunology, Band 2, Seiten 1-40 (1962) usw.) wird bestätigt, daß es sich bei dieser Fraktion um den Antikörper mit hoher Spezifität für das Antigen handelt. Nach der Dialyse mit Wasser und dem Lyophilisieren kann der spezifische Antikörper gelagert werden. Die erfindungsgemäß erhaltenen spezifischen Antikörper sind brauchbar für die Messung der Catecholamine in verschiedenen Proben, und zwar durch Immunoassay-Methoden, wie Radioimmunoassay.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Arbeitsweise zur Herstellung der Antigene und der Antikörper sowie die Untersuchung der Spezifitäten der Antikörper.

Beispiel 1

Herstellung des Antigens und des Antikörpers von Dopa.

In einer Suspension von 197 mg L-Dopa und 2 ml Dimethylformamid löst man 200 mg Maleinsäureanhydrid. Die Reaktion wird in

80 9 8 36/1 01 S

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einem Wasserbad von 65 bis 7O°C während ungefähr 30 Minuten durchgeführt. Das Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird dreimal mit 5 ml Benzol gewaschen, um das unumgesetzte Maleinsäureanhydrid zu entfernen.

Man löst den Rückstand in 2 bis 3 ml kaltem Wasser und neutralisiert die Lösung durch tropfenweise Zugabe von einer kalten Lösung von 0,01η Natriumhydroxid. Die Lösung wird lyophilisiert und der Rückstand wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst. Zur Lösung gibt man Äthylacetat und sammelt den erhaltenen Niederschlag durch Zentrifugieren und Trocknen im Vakuum; auf diese Weise erhält man das Natriumsalz von N-Maleyldopa.

Man löst in 1 ml Wasser 33,9 mg oder 67,8 mg N-Maleyldopanatriumsalz und 100 mg BSA. Zur Lösung gibt man 0,3 ml 3 m Natriumacetat und 1 ml einer 7,5 /Sigen Pormaldehydlösung. Nachdem man im Testrohr, das mit einem Schliffstopfen versehen ist, die Luft durch Stickstoffgas ersetzt hat, läßt man die Mischung bei Raumtemperatur (18 bis 23°C) 5 Tage in der Dunkelheit stehen. Dann dialysiert man die Mischung mit 0,01n Chlorwasserstoffsäure und erwärmt 3 Std. auf 6O⁰C. Nach der zweitägigen Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung gibt man die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung zu, um eine endgültige Konzentration von 10 bis 20 mg/ml Konjugat

anteilige
zu erhalten. Bestimmt man das/molare Verhältnis zwischen dem Dopaanteil und dem BSA-Anteil des Konjugats durch eine Farbreaktion eines Eisenchelats, so stellt man fest, daß 16 bis 24 Mol Dopa pro 1 Mol BSA vorliegen.

Die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung des Konjugats wird mit einem gleichen Volumen vollständigem Freund-Adjuvans vermischt, um eine Emulsion des Wasser/Öl-Typs herzustellen. Die Emulsion

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wird in Kaninchenfußballen intradermal in einer Menge von 2 bis 3 mg Antigen injiziert. Nach 4 Wochen wird eine Phosphatgepufferte Kochsalzlösung des Konjugats (1 mg) in die Kaninchenohrrandvene injiziert (diese Operation kann ersetzt werden, indem man die Wasser/Öl-Emulsion der Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung des Konjugats (1 mg) und unvollständiges Freunds-Adjuvans subkutan injiziert). Eine Woche nach der Booster-Injektion nimmt man den Kaninchen Blut ab und erhält die Antiseren.

Die Spezifität der Antiseren gegen das Antigen wird durch die nachstehend beschriebene Ouchterlony-Methode bestimmt.

Man löst unter Erwärmen Agar in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung auf, um eine endgültige Konzentration von 1,2 % zu erhalten und verteilt die Lösung in einer Dicke von 2 mm auf einer Glasplatte. Nach dem Abkühlen werden sieben Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm im Zentrum und in den Ecken in Form eines echten Sechsecks mit 5 mm Seitenlänge gemacht. In das mittlere Loch füllt man das zuvor erhaltene oder hieraus auf 1/2 bis 1/3 mit der Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung verdünnte. Antiserum. In die Ecklöcher gibt man die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung des Konjugats (0,5 bis l,0mg/nl) und abwechselnd BSA. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird die Bildung von Niederschlag sowohl beim Konjugat als auch bei der BSA beobachtet. Hierzu gibt man ein gleiches Volumen BSA-Lösung (1 mg/ml) zum Antiserum und läßt die Mischung 1 Std. bei 37°C und anschließend über Nacht bei 4°C stehen. Die erhaltenen Niederschläge werden durch Zentrifugieren entfernt. Das erhaltene Antiserum bewirkt die Ausfällung nur mit dem Konjugat und nicht mit der BSA. Dieses Antiserum wird dann mit 6 m Harnstofflösung 15 Std. lang und anschließend 2 Tage lang mit Phosphatpuffer (0,007 m NaII₂POi₁, pH 6,3-) dialysiert. Die erhaltene Lösung

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M/17 031 . *■

gibt man durch eine Säule mit DEAE-Cellulose und sammelt die erste" Fraktion (gamma-Globulin-Fraktion, γ-G-Fraktion) unter Beobachtung der Absorption bei 280 nm. Wenn man die Fraktion nach der Ouchterlony-Methode untersucht, zeigt diese Fraktion den spezifischen Niederschlag auf das Antigen (Konjugat). Die ϊ-G-Fraktion wird mit Wasser dialysiert und zum Lagern lyophilisiert.

Beispiel 2

Herstellung des Antigens und Antikörpers von Epinephrin.

In einer Suspension von 183,2 mg L-Epinephrin und 5 ml Methanol löst man 200 mg Maleinsäureanhydrid. Nachdem man die Luft durch Stickstoffgas ersetzt hat, wird das Reaktionsgefäß verschlossen und die Lösung wird in der Dunkelheit bei Raumtemperatur 1 Std. lang gerührt. Nach dem Entfernen des Methanols wird die Mischung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 neutralisiert und das unumgesetzte Epinephrin wird entfernt, indem man durch eine Säule mit Dowex 50 WX-8 (Natriumtyp, 200 χ 400 mesh ( 0,074 mm - 0,037 mm) 0,9 x 7 cm) hindurchgibt. Dann wird die erhaltene Lösung von N-Maleylepinephrin-Natriumsalz lyophilisiert.

Das Natriumsalz (56,6 mg oder 84,9 mg) und 100 mg BSA werden in 1 ml Wasser gelöst. Nach der Zugabe von 0,3 ml 3 m Natriumacetat und 1 ml 7,5 /Siger Formaldehydlösung wird die Mischung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, und man erhält die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung des Epinephrin-BSA-Konjugats (10 bis 20 mg/ml). Man stellt fest, daß das Antigen ein Konjugat von 16 bis 24 Mol Epinephrin zu 1 Mol BSA ist.

Das Hapten wird an BSA gebunden, indem man die £-Aminogruppen

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der BSA-Lysineinheiten gebraucht, was durch Aminosäureanalyse des Epinephrin-BSA-Konjugats (T.P. King et al, J. Bio. Chem. 245, Seiten 6134-6148 (197O)) bestätigt wird. Man löst das Epinephrin-BSA in 6n Chlorwasserstoffsäure und hydrolysiert im verschlossenen Rohr 24 Std. lang bei 110 C. Die durch den Aminosäurenanalysator erhaltenen Daten sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. In der Tabelle bedeutet der in den Klammern befindliche Wert den Grundwert.

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Kontrolle

Amino säure	nach T.P.King et al. analy siertes BSA	BSA	BSA, mit Form aldehyd be handelt	Epinephrin- BSA
Ly s	58	(58)	48	27
His	17	16	16	15
Arg	23	22	(22)	(22)
Asp	54	(54)	(54)	(54)
Thr	32	33	32	32
S er	26	25	27	26
GIu	80	86	89	89
Pro	28	25	25	27
GIy	15	17	16	17
AIa	44	44	47
Cys	36	32	28	25
VaI	' 35	34	32	32
Met	4	4	4	3
He	14	13	12	12
Leu	58	60	57	59
Tyr	19	20	3	11
Phe	26	28	27	25

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/fs-

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Das Epinephrin-spezifische Antiserum und die γ-G-Fraktion werden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung der Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung des Konjugats und vollständigem Freunds-Adjuvans erhalten.

Beispiel

Herstellung des Antigens und Antikörpers von Norepinephrin.

In einer Suspension von 169 mg L-Norepinephrin und 5 Methanol löst man 200 mg Maleinsäureanhydrid. Man läßt die Mischung ungefähr 10 Min. bei Raumtemperatur stehen und konzentriert im Vakuum. Den Rückstand wäscht man zweimal mit 5 ml Benzol, suspendiert in einer Mischung aus Methanol und Wasser (1:1) und schüttelt ausreichend mit Äthylacetat. Nach dem Zentrifugieren wird der erhaltene Niederschlag getrocknet, wobei man ein kristallines Pulver von N-Maleylepinephrin erhält.

Analyse:

	53	C	ι»	H	5	N
ber.:	53	,93	5	,90	5	»21
gef.:	,81	,02	,16

Zu einer Mischung von 80,3 mg N-Maleylnorepinephrin und 100 mg BSA gibt man 0,3 ml 0,1 m NatriumMcarbonat und 0,7 ml Wasser. Zur Mischung gibt man 0,3 ml 3 m Natriumacetat und 1 ml 7,5 %-iges Formaldehyd.

Dann wird die Mischung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, jedoch wird die Reaktion 3 Tage lang durchgeführt und man erhält eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung des Konjugats. 20 bis 30 Mol Norepinephrin sind zu 1 Mol BSA konjugiert.

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Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wird das Antiserum von Norepinephrin gebildet und nach dem Entfernen des BSA-Antikörpers erhält man die γ-Globulin-Fraktion.

Beispiel

Herstellung des Antigens und des Antikörpers von Dopamin.

In einer Lösung von 190 mg Dopamin-hydrochlorid und 2 ml Methanol löst man 0,¹I ml Triäthylamin und gibt dann 36O mg Maleinsäureanhydrid zu. Man läßt die Lösung 10 Min. bei Raumtemperatur stehen und entfernt das Methanol im Vakuum. Den Rückstand wäscht man zweimal mit 5 ml Benzol und läßt ihn nach Zugabe von ungefähr 5 ml Wasser an einem kühlen Ort stehen; auf diese Weise erhält man leicht gelbliche Nadeln.

Analyse:

C HN

ber.:	57	,37	5	,22	5,	57
gef.:	56	,95	VJl	,34	5,	55

Zu 0,3 ml 1 m Natriumbicarbonatlösung gibt man 75,3 mg N-Maleyldopamin und 100 mg BSA. Nach der Zugabe von 0,3 ml 3 m Natriumacetat und 1 ml 7,5 £igem Formaldehyd wird die Mischung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 behandelt, wobei man die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung des Konjugats erhält. Man stellt fest, daß Dopamin und BSA in einem Verhältnis von 20 bis 35 Mol zu einem Mol konjugiert sind.

Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhält man hieraus den Dopamin-spezifischen Antikörper und die γ-G-Fraktion.

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Beispiel 5

Untersuchung der Spezifität der Antiseren.

Die Spezifität der Antiseren der Antigene wird nach der Ouchterlony-Methode untersucht. Die Antiseren werden verwendet, nachdem man sie mit ihrem Trägermaterial behandelt hat, um die Antikörper auf das Trägermaterial zu bringen. Als Antigen für das Dopa verwendet man zusätzlich zum BSA-Konjugat das Konjugat von Dopa mit Kaninchenserum Albumin (RSA). Die Konzentration des Antigens beträgt 1 mg/ml und der Grad der Niederschlagsbildung wird durch die Zeichen +++, +^+und ± bzw. - angezeigt.

Wie in der Tabelle dargestellt ist, bewirkt jedes Antiserum den Niederschlag mit seinem Antigen, bewirkt jedoch nicht oder kaum eine Ausfällung mit anderen Antigenen. Aus dem Ergebnis wird geschlossen, daß der durch das erfindungsgemäße Konjugat gebildete Antikörper bei der Immunoreaktion eine hohe Spezifität aufweist. Da andererseits das Antiserum für das L-Dopa-BSA-Konjugat die Ausfällung mit L-Dopa-Kaninchenserum Albumin-Konjugat (L-Dopa-RSA) bewirkt, wird angenommen, daß der Antikörper das Hapten selektiv entdeckt.

Antigen	Antiserum ZU L-Dopa-BSA	Antiserum zu Epine phrin-BSA	Antiserum zu Dopa min-BSA	Antiserum zu Norepi- nephrin
L-Dopa-BSA	+++
L-Dopa-RSA	+++	-	-	-
Epinephrin-BSA	-	+++	±	±
Dopamin-BSA		±	++	i
Norepinephrin- BSA	±		±
	6 0 9 8 3 8	η t⁷i 5

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Beispiel 6

Untersuchung der Spezifität der Epinephrin-Antikörper durch die Gleichgewichtsdialyse-Methode.

Die in Beispiel 2 erhaltene γ-Globulin-Fraktion wird gegen die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert, und man stellt eine Lösung mit der endgültigen Konzentration von 0,9¹I mg/ml her. Bei dieser Methode verwendet man die γ-Globulinlösung als die Antikörperlösung.

Bei dieser Arbeitsweise gibt man zur verwendeten Phosphatgepufferten Kochsalzlösung 0,01 % Natriummetabisulfit (Na und 0,015 % Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz.

Man verwendet eine Gleichgewichtsdialysevorrichtung mit einem Fassungsvermögen von 2 ml und gießt 500/ul der Antikörperlösung in die eine Zelle des Zellenpaars (Zelle A) und in eine weitere Zelle (Zelle B) 10/ul der Phosphatgepufferten Kochsalzlösung von DL-Epinephrin, das mit Tr it ium ( H) in einer Konzentration von 3 »4 χ ΙΟ"-³ m markiert ist und 490/ul Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Man schüttelt bei 25⁰C, um das Gleichgewicht einzustellen und bestimmt dann die Radioaktivität jeder Lösung durch Zählen. Der Unterschied jeder Zählung wird berechnet und als Standard angesetzt.

Dann gibt man 500/ul γ-Globulinlösung in die Zelle A und 10/ul einer Lösung mit der Konzentration von 3,4 χ ΙΟ"·⁵ m Epinephrin oder eines anderen Catecholamins oder analoger Verbindungen, 10/ul einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung von ^JH-Epinephrin (3,¹I x 10 ^J m) und 480/Ul Phosphatgepufferte Kochsalzlösung in die Zelle B. Die Lösungen werden auf dieselbe Weise wie oben geschüttelt und nach der Einstel-

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lung des Gleichgewichts wird die Radioaktivität jeder Lösung ge· messen. Der Unterschied wird berechnet, und die relativen Bindungen werden aus dem Standard berechnet.

Verbindung relative Bindung

100

L-Epinephrin 0

L-Dopa 90,7

Dopamin 88,0

L-Norepinephrin 5^,8

DL-Methanephrin 8l,7

DL-Normetanephrin 97,2

3,^-Dihydroxyphenylessigsäure 83,8

4-Hydroxy-3-methoxyphenylessigsäure 91>7

L-Isoproterenol 72,9

Beim -⁵H-Epinephrin handelt es sich um DL-Epinephrin, und die Konzentration des eingesetzten Antikörpers beträgt 5,9 x 10"⁶m.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE :

1. Antigen, im wesentlichen bestehend aus einem Katecholamin und einem Protein oder einem Polypeptid, worin das Protein oder Polypeptid an den Phenylkern des Katecholamins gebunden ist.

(2j Antigen gemäß Anspruch l,der allgemeinen Formel I

CH-CH-NH

t I I

(D

CH₂-NH-Q

worin R₁, R₂ und R, jeweils für H, OH, CH, oder COOH stehen und die Gruppe -NH-Q ein Trägermaterial, insbesondere Serumproteine oder -polypeptide von Säugern, bedeutet.

3. Antigen gemäß Anspruch 1, worin das Katecholamin unter Epinephrin, Norepinephrin, Dopamin oder Dopa ausgewählt ist.

4. Antigen gemäß den vorhergehenden Ansprüchen, worin das Protein Rinderserumalbumin ist.

5. Verfahren zur Herstellung von Antigenen gemäß Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Katecholamin

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an der Aminogruppe schützt, das geschützte Katecholamin mit dem Trägermaterial verbindet und anschließend die
Schutzgruppe entfernt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

CH-CH-NH

^f ' ' (ID

worin R₁, R₃ und R, die in Anspruch 2 angegebenen Bedeutungen besitzen, an der Stickstoffunktion acyliert, zur Anlagerung des Trägermaterials eine Mannich-Reaktion
durchführt und anschließend das N-acylierte Produkt
desacyliert.

7. Verwendung der Antigene gemäß Ansprüchen 1 bis 4 zur
Erzeugung eines Catecholamin-spezifischen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen einem
Wirtstier injiziert.

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