DE2627455A1

DE2627455A1 - Verfahren zur radioimmunologischen in-vitro-bestimmung von thyroxin und abgepacktes testbesteck zur durchfuehrung dieses verfahrens

Info

Publication number: DE2627455A1
Application number: DE19762627455
Authority: DE
Inventors: Salvatore S Margherita
Original assignee: Byk Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH
Current assignee: Byk Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH
Priority date: 1975-06-26
Filing date: 1976-06-18
Publication date: 1977-01-13
Also published as: CA1050425A; AU1430876A; BR7603472A; AU500821B2; JPS584782B2; NL7605447A; DD125022A5; US4110076A; FR2317655A1; BE843484A; US4111656A; JPS523820A; GB1499958A

Description

Byk-Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH., Dietzenbach-Steinberg

Verfahren zur radioimmunologischen in-vitro-Bestimmung von Thyroxin und abgepacktes Testbesteck zur Durchführung dieses Verfahrens

Die Erfindung betrifft radioimmunologische Untersuchungsmethoden und insbesondere radioimmunologische Untersuchungsmethoden, Reagentien und abgepackte Testbestecke zur in-vitro-Bestimmung von Thyroxin in nicht-extrahiertem Blutserum.

Bekannte Methoden zur radioimmunologischen Bestimmung von Thyroxin (Τ4) sehen die Verwendung von Antiseren gegen

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Thyroglobulin (Chopra, I.J.J. Clin. Endocr. 34:938 (1972)), von !^-spezifischen Antikörpern gegen !Conjugate aus Τ4 und Rinderserumalbumin (RSA), Humanserumalbumin (HSA) und Ovalbumin (OA) (Meinhold, H. und Wenzel, K.W., Horm. Metab. Res. 6 (1974) 169 - 170) und eines Antikörpers vor, der als Reaktion gegenüber Injektionen eines T4-Albuminkonjugats erzeugt worden ist (Dunn, R.T. und Foster, L.B., Clin. Chem. 19/9, 1063 - 1066 (1973)). Es sind jedoch T4-Antiseren anzustreben, die eine größere Spezifizität und eine höhere Affinität haben, so daß bei radioimmunologischen Bestimmungsmethoden für T4 eine größere Empfindlichkeit und eine verbesserte Reproduzierbarkeit erzielt werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes radioimmunologisches Bestimmungsverfahren für Thyroxin in nichtextrahiertem Blutserum zur Verfügung zu stellen, das eine höhere Spezifizität und Empfindlichkeit besitzt als die bekannten Verfahren und das eine verbesserte Reproduzierbarkeit aufweist. Durch die Erfindung soll auch ein neues Antiserum zur Verwendung bei der radioimmunologischen Bestimmung von Thyroxin sowie ein neues Immunogen zur Verfügung gestellt werden, aus dem ein solches Antiserum hergestellt wird.

Das radioimmunologische Bestimmungsverfahren für T4 gemäß der Erfindung wird in der Weise durchgeführt, daß man ein Antiserum verwendet, das einen Antikörper enthält, der gegenüber Thyroxin eine Immunoreaktivität besitzt. Das Antiserum wird aus einem Immunogen hergestellt, das ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekoppelt an Rinderserumalbumin, mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid enthält.

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Die Erfindung wird anhand der beigefügten Figur näher erläutert. Diese stellt ein Diagramm dar, das eine beispielhafte Standardkurve darstellt, die in der Weise erhalten worden ist, daß die Prozentmenge gebundenes radioaktives Thyroxin gegen die Konzentration von Standardthyroxinlösungen, ausgedrückt als Mikrogrammprozent Thyroxin, aufgetragen worden ist.

Es wurde nun gefunden, daß bei einer radioimmunologischen Bestimmungsmethode für Thyroxin verbesserte Ergebnisse erhalten werden können, wenn man ein Antiserum verwendet, das aus einem Immunogen hergestellt worden ist, das ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekuppelt an Rinderserumalbumin mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, enthält. Mit diesem Antiserum kann eine größere Spezifizität erhalten werden, als mit anderen Thyroxinantikörpern. Weiterhin wird hierdurch eine größere Affinität, d.h. eine engere Bindung zwischen dem Antigen und dem Antikörper in dem Antiserum, erhalten. Hierdurch wird wiederum eine größere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Testergebnisse erhalten.

Das neue Antiserum und das neue Immunogen, hergestellt wie nachfolgend beschrieben, ermöglichen die Erzielung einer verbesserten Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Testmethoden. So hat z.B. eine Vergleichsuntersuchung, durchgeführt mit einem erfindungsgemäßen Antiserum und einem Antiserum, das mit dem freien Thyroxin anstelle de:s N-Acetylderivats des Thyroxins hergestellt worden ist, ergeben, daß im ersten Falle eine Standardabweichung erhalten wird, die ungefähr nur ein Fünftel derjenigen ist, die im letzte-

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ren Falle erhalten wird. Bei Verwendung dieses neuen Antiserums ist somit die Schwankung der Wiederfindungswerte von Thyroxin niedriger.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen radioimmunologischen Bestimmungsmethode für Thyroxin wird zunächst eine Probe des Blutserums, dessen Thyroxingehalt bestimmt werden soll, mit einem Reagens vermischt, das im wesentlichen aus einer gepufferten Lösung, die radioaktiv markiertes Thyroxin enthält, und einem Inhibitor für die Inhibierung der Bindung des Thyroxins an thyroxinbindendes Globulin besteht.

Als Inhibitorkomponente des Reagens können die verschiedenen bekannten Inhibitoren verwendet werden. Beispiele hierfür sind Natriumsalicylat, Merthiolat_s Dilantin, Tetrachlorthyronin und 8-Anilino-i-naphthalinsulfonsäure. Allerdings ergibt 8-Anilino-i-naphthalinsulfonsäure nicht-reproduzierbare Ergebnisse j wenn es nicht in hoher Reinheit vorliegt. Es wurde nun gefunden, daß die Magnesium-„ Calcium- und Alkalimetallsalze von S-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure wirksame Inhibitoren für die Bindung von Thyroxin an thyroxinbindendes Globulin sind. Diese Salze können als gereinigte Formen der 8-Anilino-1-naphthalinsulipnsäure angesehen werden. Das Magnesiumsalz ist der bevorzugte Inhibitor zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Yerfahren und Besteck, obgleich auch die anderen Salze in gleicher Weise verwendet werden können. Bei der Herstellung von 8-Anilino-i-naphthalinsulfonat sollte die als Ausgangsmaterial verwendete freie Säure von teerartigen Produkten frei sein. Die Calcium- und Alkalimetallsalze (z.B. das

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Natrium- und Kaliumsalz) können nach ähnlichen Methoden hergestellt werden. Bei der Lagerung in einem Exsikkator bei -20⁰C ist das Magnesiumsalz der 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure mindestens 4 Monate lang stabil.

Zu dem in der ersten Stufe erhaltenen Gemisch wird das neue Antiserum gegeben. Dieses wird, wie nachstehend beschrieben werden wird, aus einem neuen Immunogen hergestellt, das ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekuppelt an Rinderserumalbumin mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, darstellt. Das resultierende Gemisch wird bei solchen Temperatur- und Zeitverhältnissen inkubiert, daß im wesentlichen ein Gleichgewicht zwischen dem an den Antikörper gebundenen Thyroxin und dem ungebundenen Thyroxin erhalten wird. Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen radioimmunologischen Bestimmungsverfahren der Inkubationsschritt bei einer Temperatur von 37 C und über einen Zeitraum von ungefähr 30 min durchgeführt. Längere Inkubationszeiten können zwar angewendet werden, sind aber nicht von Vorteil.

Nach Beendigung des Inkubationsschri.tts wird das ungebundene Thyroxin von dem an den Antikörper gebundenen Thyroxin abgetrennt. Somit können ungebundenes Thyroxin -und an den Antikörper gebundenes Thyroxin beispielsweise in der Weise getrennt werden, daß man das Gemisch mit einem zweiten Antikörper inkubiert, um die an den Antikörper gebundene. Fraktion zur Ausfällung zu bringen. Die an den Antikörper gebundene Fraktion kann auch in unspezifischer Weise durch Substanzen, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Trichloressigsäure, oder durch Lösungsmittel, wie Dioxan,

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Äthylalkohol, Aceton oder Polyäthylenglykol, ausgefällt werden. Weiterhin kann die Trennung des gebundenen vom freien Thyroxin durch Adsorption an bestimmte Substanzen vorgenommen werden, beispielsweise an dextranbeschichtete Holzkohle, Talk, Kaolin und kornförmige- Anionenaustauscher . Die Trennung wird jedoch vorzugsweise in der Weise bewirkt, daß man das Gemisch mit einem relativ dünnen Streifen einer Membran, die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht, über einen Zeitraum von ungefähr 30 min bei Raumtemperatur in Berührung bringt. Die Ionenaustauscherharz-Membranen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind relativ dünne Streifen, Folien oder Filme eines festen wasserhaltigen Gels, das aus einer unlöslichen Polymermatrix besteht, an die dissoziierbare kationische oder anionische Gruppen angefügt sind. Das Gel ist vorzugsweise mit einem geeigneten faserartigen Material verstärkt. Es sind bereits viele geeignete Harzmembranen dieser Art bekannt. Beispiele hiervon werden in den US-Patentschriften 2 730 768, 2 780 604, 2 800 445 und 2 860 097 beschrieben. Ein handelsübliches anionenselektives Harz, das für die Zwecke der Erfindung geeignet ist, ist beispielsweise ein Produkt, das unter dem Warenzeichen "AR-111" (von Ionics, Inc., Watertown, Massachusetts) vertrieben wird. Am Ende der Inkubätions--Periode werden die Harzstreifen aus den Test- und Vergleichsgläschen, beispielsweise mit einer Pinzette, herausgenommen und verworfen.

Sodann werden die relativen Mengen des an den Antikörper gebundenen radioaktiven Thyroxins und des ungebundenen radioaktiven Thyroxins ermittelt. Dies kann z.B. durch Be-

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Stimmung des radioaktiven Thyroxins in jedem Gläschen mittels eines Gammazählers geschehen. Die Zählrate der Gläschenkomponenten nach der Entfernung des Harzstreifens gibt die Serumkonzentration des Thyroxins wieder. Die prozentuale Menge des radioaktiven Thyroxins, die an den Antikörper gebunden ist, wird sodann nach folgender Gleichung errechnet:

Prozent gebundenes Thyro- _ Netto-Restimpulsrate (Impulse pro min] xin - Jod-125 ~ Netto-Gesamtimpulsrate (Impulse pro

min)

Bei steigenden Mengen des nicht-radioaktiven Thyroxins (beim Patienten oder der Standardprobe) nimmt das an den Antikörper gebundene radioaktive Thyroxin ab. Nach diesem Prinzip wird eine Eichkurve hergestellt, indem man die Prozentmenge des gebundenen radioaktiven Thyroxins in einer Reihe von Thyroxin-Standardpräparaten gegen die jeweilige Konzentration des Thyroxins aufträgt. Das Gesamtserumthyroxin des Patienten wird sodann leicht ermittelt, indem man die Prozentmenge des radioaktiven gebundenen Thyroxins in dem Serum des Patienten mit der Eichkurve vergleicht.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen radioimmunologischen Bestimmungsmethode werden abgepackte Testbestecke vorgesehen. Diese Bestecke enthalten eine gepufferte Lösung, die radioaktives Thyroxin und einen Inhibitor für die Inhibierung der Bindung des Thyroxins an thyroxinbindendes Globulin enthält, eine gepufferte Lösung, äie das neue Thyroxinantiserum enthält und schließlich sine Vielzahl von relativ dünnen Streifen einer Ionenaustauscherharz-Membran .

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Die Erfindiang wird in dem folgenden Beispiel erläutert.

Beispiel Natriumbarbital-(Veronal)-Puffer

Eine 0,075M-Veronalpufferlösung mit einem pH-¥ert von 8,6 bis 8,8 wird in der Weise hergestellt, daß Natriumbarbital (entwässerte Form) zu destilliertem Wasser (900 ml) in einem 1-1-Kolben gegeben wird. Die Natriumbarbitalmenge ist so bemessen, daß 15,45 g/l erhalten werden. Das Natriumbarbital wird unter Rühren aufgelöst. Natriumazid (100 mg) wird als Konservierungsmittel zugesetzt. Weiterhin wird Äthylendiamintetraessigsäure (1,86 g) zugefügt und unter Rühren aufgelöst. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Säure oder Base auf 8,6 bis 8,8 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird auf ein Endvolumen von 1 1 verdünnt und bei 4°C gelagert. Zur Verwendung als Antikörper-Verdünnungsmittel mit 0,1% (G/V) Humanserumalbumin (HSA) wird eine durch Wärme inaktivierte HSA-Lösung (4 ml, 25% G/V; 52°C - 2°C 60 min lang) vor der Einstellung auf das Endvolumen zugesetzt.

Herstellung von Magnesium-8-anilino-i-naphthalinsulfonat;

8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (10 g) mit hohem Reinheitsgrad (Eastman Kodak Co.) wird zu destilliertem Wasser (200 ml) gegeben, das in einem 500-ml-Becherglas enthalten ist. Natriumhydroxid (5N) wird tropfenweise zu dem Gemisch gegeben, wobei dieses auf einer heißen Platte mechanisch gerührt wird. Bei einer Temperatur von 75 bis 85⁰C erfolgt die Auflösung, wobei ungefähr 5,5 ml

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Natriumhydroxidlösung zugegeben worden sind. Die heiße Lösung wird durch eine weitporige Glasfritte abfiltriert, das Filtrat wird in einem Becherglas gesammelt und auf 10 bis 20⁰C abgekühlt. Zu dem Filtrat wird unter Rühren eine solche Menge gesättigter wäßriger Magnesiumchloridlösung zugegeben, daß eine maximale Ausfällung erfolgt (im allgemeinen 6 bis 7 ml). Der Niederschlag wird über eine weitporige Glasfritte abgesaugt und der Rückstand wird mit eiskaltem Wasser gewaschen. Das rohe Magnesium-8-anilino-1-naphtheilinsulfonat wird in destilliertem Wasser (150 ml) unter Erhitzen (75 bis 85°C) aufgelöst. Durch rasches Abkühlen wird die Kristallisation bewirkt. Der Zeitraum, der für eine praktisch vollständige Kristallisation erforderlich ist, beträgt etwa 30 bis 45 min. Sodann wird das Material abgesaugt und der Rückstand wird mit eiskaltem Wasser gewaschen. Es ist eine zweite Kristallisation erforderlich. Das grüne bis gelbe Magnesium-8-anilino-i-naphthalinsulfonat wird in Luft auf einem Uhrglas bis zum konstanten Gewicht getrocknet und bei -20 bis -30⁰C in einem Exsikkator gelagert.

Die Wirksamkeit und die optimale Menge des bei dem erfindungsgemäßen radioimmunologischen Bestimmungsverfahren für Thyroxin zu verwendenden Manesiüm-8-anilino.-i-naphthalinsulfonats wird wie folgt.bestimmt:

1. Bei der Herstellung der Lösung des Magnesium-8-anilino-1-naphthalinsulfonats (enthaltend- 6 mg/ml) in 0,075M-Veronalpuffer (pH 8,6 bis~8,8) ist heftiges Rühren-zur..Auflösung des Magnesium~8-anilino-1-naphthalinsulfonats erforderlich.

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Zu einer Reihe von 5 Gläschen werden 0,05, 0,10, 0,15, 0,20 bzw. 0,30 ml der Magnesium-8-anilino-i-naphthalinsulfonatlösung zugegeben. Zu dem sechsten Gläschen werden 0,3 ml der Veronalpufferlösung zugesetzt. In jedes Gläschen wird normales Humanserum (10 JiI) gegeben, das mit einem Ionenaustauscherharz extrahiert worden ist. Zu jedem Gläschen wird auch Jod-125 enthaltendes radioaktives Thyroxin ( ^J-Thyroxin, 100 pg. - 20 pg. aus einer 350- bis 700-mC/mg-Zubereitung) in Veronalpuffer gegeben. Das Volumen jedes Gläschens wird mit Veronalpuffer auf 1,2 ml eingestellt. Unter Verwendung eines Gamma-Szintillations-Bohrlochzählers wird die Gesamtimpulsrate für jedes Gläschen bestimmt.

2. Alle Gläschen werden 1/2 Stunde lang (statisch) bei 37°C inkubiert. _;

3. Ein Streifen eines Ionenaustauscherharzes (vom quaternären Ammoniumtyp, hergestellt von Ionics, Inc.) wird zu jedem Gläschen gegeben und die Käppchen werden wieder aufgesetzt.

4. Die Gläschen werden 1/2 Stunde " bei Raumtemperatur (15°C bis 32°C) rotiert.

5. Die Streifen werden aus den Gläschen sorgfältig herausgenommen und verworfen.

6. Die Restimpulsrate wird bei jedem Gläschen ermittelt.

7. Auf linearem mm-Papier wird % gebundenes J-Thyj /Restimpulsrate (Impulse pro min) -inn^ «««

^roxin ^Gesamtimpulsrate (Impulse pro min} ^{x ιυυ;} S^e6^en

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die Menge des zugegebenen Magnesium-8-anilino-i-naphthalinsulfonats (iig) aufgetragen. Die erhaltene Kurve sollte einen maximalen Effekt (minimale prozentuale Menge gebundenes radioaktives Thyroxin) bei 500 bis 600 ng 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat-(ANS-)Inhibitor zeigen.

8. Die prozentuale Inhibierung wird wie folgt errechnet:

ohne ANS.gebundenes Thyroxin*,% - bei maximalem

ANS gebundenes Thyroxin*, % x 100 =

ohne ANS gebundenes Thyroxin*,%

% Inhibierung

Die zulässigen Inhibierungsgrenzen sind &0% oder mehr.

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Herstellung von ^J-Thyroxin mit hoher spezifischer Aktivität:

Es werden die folgenden Lösungen hergestellt:

A. Freie Thyroxinsäure (4 mg) wird in 0,05M-Natriumphosphatpuffer (1,0 ml) durch Zugabe von 1N-Natriumhydroxidlösung (40 ill) aufgelöst und sodann mit t-Butylalkohol (9,0 ml) verdünnt.

B. Chloramin T (2,6 mg) wird in 0,05M-Natriumphosphatpuffer (1,0 ml) aufgelöst.

C. Natriummetabisulfit (5,0 mg) wird in Natriumphosphatpuffer (1,0 ml) aufgelöst.

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D. Ameisensäure (23 ml) wird zu sterilem und pyrogenffeiern Wasser (77 ml) gegeben.

E. Ammoniumhydroxid (0,5 ml) wird zu Methanol (50 ml) gegeben.

Verfahrensweise:

1. Die Lösung D wird in eine geeignete chromatographische Kammer gebracht und sie wird dort mindestens 1 St. vor der Verwendung ins Gleichgewicht gesetzt.

2. In ein 4-ccm-Gläschen werden die folgenden Komponenten eingegeben:

a. 25 Ji1 Thyroxin (Lösung A 10 ηg)

b. 5 nC Natriumiodid J-125

c. 25 JiI Natriumphosphatpuffer

d. 15 ill Chloramin T (Lösung B 39 ug)

e. Reaktionszeit 60 see

f. 20 ill Natriummetabisulfit (Lösung C 100 ng).

3. Auf einen 2,5-cm breiten. Streifen aus Whatman-Chromatographie-Papier. wird ein Flecken mit genügendem Material für;ein Radi'ochromatogramm.,aufgebracht.

4. Der Rest des Thyroxinreaktionsgemisches wird auf einen anderen 2,5-cm breiten Streifen aus Whatman-Chromatographie-Papier aufgebfacht.

5. Beide Streifen werden in der Lösung D zu einer Höhe von 25 bis 30 cm entwickelt.

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6. Das Thyroxinband auf dem Streifen des Schritts 4 wird lokalisiert und das Thyroxin wird mit 8 bis 12 ml der Lösung E extrahiert. Es wird gesättigte Natriumsulfitlösung (150 iil) zugesetzt.

7. Der Streifen des Schritts 3 wird- zur Ermittlung der spezifischen Aktivität auf die Radioaktivität gemessen.

8. Die Thyroxinlösung des Schritts 6 wird mit einem Luftstrom zur Trockene eingedampft.

9. Das getrocknete Thyroxin wird mit 60 ml Thyroxinverdünnungsmittel (SRS 78) aufgelöst.

Herstellung von Thvrbxin-armem Serum;

Das Serum Thyroxin wird nach folgender Methode aus normalem Humanserum extrahiert:

1. Anionenaustauscherharz (1 Jig für jeweils 5 ml zu behandelndes Humanserum; Amberlite CG-400, von Rohm &
Haas Company, 0,149 bis 0,074 mm, vom quaternären Ammoniumtyp, 3_t3 mÄq./g) wird in 0,15M-Kochsalzlösung gewaschen und die Feinstoffe werden entfernt. Sodann wird
durch eine weitporige Glasfritte filtriert.

2. Das Serum wird durch ein 8- u-Milliporfilter (MF)

zur Entfernung von teilchenförmigen Stoffen filtriert.

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Es wird eine genügende Spurenmenge von ^J J-Thyroxin zugesetzt, daß ungefähr 50 bis 100000 Impulse pro min und
ml als Gesamtimpulsrate erhalten werden.

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3. Das feuchte Harz wird zu dem in einem Glasgefäß enthaltenen Serum in der Weise gegeben, daß die Tiefe des Gemisches einen Minimalwert hat. In das Gefäß wird eine Rührstange eingebracht und der Gefäßinhalt wird langsam bei 4⁰C 16-20 Stdn. lang durchgemischt. Die Rührgeschwindigkeit sollte so bemessen sein, daß das Absetzen des Gefäßinhaltes gerade vermieden wird. Die Rührstange wird so ausgewählt, daß der Gefäßdurchmesser so weit wie möglich ausgenützt wird.

4. Das Gemisch wird mit 10000 Upm (Rotor Nr. 5534, Sorvall,Radius 13,3 cm)^1 St.bei 4°C - 2°C zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig in ein MF-Filter (Porendurchmesser 8 u) hineindekantiert und das FiItrat wird bei 4°C gesammelt. Die Filtration wird mit einem 3-U-MF-Filter und sodann mit einem 0,22- η-MF-Filter, wie oben beschrieben, wiederholt. 1 ml des Endfiltrats wird der Zählung unterworfen. Ungefähre Ausbeute = 70 % oder mehr.

Zulässige Grenze des Extraktionswirkungsgrades = 92'% oder mehr.

Tmpulsrate des Filtrats (Impulse pro min und ml) ino - A Impulsrate des Ausgangsmaterials (Impulse pro ~ min und ml)

100-A = % extrahiertes Thyroxin.

Das wie oben hergestellte, an Thyroxin arme Serum wird sodann in folgender Weise auf die Bindungskapazität untersucht :

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1. Veronalpuffer (1,09 ml) wird zu jedem der zwei Gläschen gegeben (Doppelbestimmung).

2. 100 iil -\j-Thyroxin (100 pg. i 20 pg.) werden zu jedem Gläschen gegeben.

3. In das eine Gläschen wird Ausgangsserum (10 Ml) und in das andere das extrahierte oder verarmte Serum (10 ul) gegeben. Die Gläschen werden durch Rotation durchgemischt und der Zählung unterworfen.

4. Die Gläschen werden bei 37⁰C 1/2 Stunde (Wasserbad, statisch) inkubiert.

5. Ein Harzstreifen wird zu jedem Gläschen gegeben und die Gläschen werden 3/2 .Stunde bei Raumtemperatur (15 bis 32°C) rotiert.

6. Die Streifen werden sorgfältig herausgenommen und die Gläschen werden der Zählung unterworfen.

7. Für jedes Gläschen wird das % gebundene Thyroxin errechnet.

Restimpulsrate (Impulse pro min) _4nn _ ., 125_T m^_rr,_nv^_n „_o Gesamtimpulsrate (Impulse pro min) ^{x ιυυ} ~ * ^_r,JiZz^v ^g

Das verarmte Serum sollte über die Zählung des Ausgangsma terials um £\ 6% oder mehr hinausgehen. Ein an Thyroxin armes . Serum, das diesen Spezifikationen genügt, wird sodann mit Natriumazid bis zu einer Natriumazidkonzentra-

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tion von 0,6% versetzt und bei 4⁰C gelagert, bis die Standardproben hergestellt werden.

Herstellung der Thyroxin-Standardproben:

Das Ausgangsmaterial ist die freie Thyroxinsäure. Eine Losung von Thyroxin in methanolischer Ammoniumhydroxidlösung wird chromatographiert, um die Verunreinigung mit L-Trijodthyronin abzuschätzen. Lösungen mit nennenswerten L-Trijodthyroningehalten werden verworfen.

1. 10 mg bei -20⁰C im Vakuum gelagertes Thyroxin werden genau abgewogen und in einem Gemisch aus Methanol und ΝΗλΟΗ (99 : 1) zu einer Lösung mit 100 η g/ml verarbeitet (Lösung 1).

2. Zu der Lösung 1 (1,0 ml) wird Veronalpuffer (99 ml), der zuvor auf 37°C erwärmt worden ist, gegeben (Lösung 2 = 1 ji g/ml).

3. Die untenstehend angegebenen Volumina der Lösung 2 werden zu den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Die Zugaben sollten zu 50-ml-Eichkolben erfolgen, die mit dem Thyroxin-armen.. .. Serum gründlich gespült worden sind.

Konz.	Konz.	Konz.	Lösung 2
/ig/ml	/ig %	eingestellt* /ig %	(ml)
0,04	4	40	2
0,02	2	20	1
0,01	1	10	0,5
0,005	0,5	5	0,25
0,002	0,2	2	0,1
0,001	0,1	1	0,05

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* Da 1/10 der Menge (10 ill) des Testserums verwendet werden, werden die Standardproben so hergestellt, daß sie 1/10 des Thyroxins enthalten.

4. Das Thyroxin-arme Serum wird zu 50 ml zugesetzt und es wird "bei 4⁰C gelagert.

Herstellung von Thyroxin-Immunogen und Thyroxinantiserum;

Kristallines Rinderserumalbumin (RSA; 150 mg) wird abgewogen und in destilliertem Wasser (75 ml) von 2 bis 8°C aufgelöst. Das N-Acetylderivat von Thyroxin (100 mg, von Fox Chemical Co.) wird abgewogen und unter Erwärmen auf 37°C in Dimethylformamid (34 ml) aufgelöst. Nach der Auflösung werden 2,7 bis 4,5 UC J-Thyroxin zugesetzt und damit vermischt. 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (ECDI; 100 mg) wird abgewogen und in destilliertem Wasser (2 ml) von Raumtemperatur aufgelöst. Die ECDI-Lösung wird zu der RSA-Lösung gegeben, die sich in einem Gefäß mit einem Rührmagneten befindet, und es wird mäßig gerührt. Der pH-Wert wird mit 0,05N-HCl und 0,05N-NaOH auf 5,8 eingestellt. Nach 1 St. wird weiteres ECDI (50 mg) in fester Form zugesetzt. Der pH-Wert, der zum Ansteigen neigt, wird nach tropfenweiser Zugabe des Thyroxins auf 5,8 gehalten.Nach 2 Stdn. vird das Reaktionsgefäß in Aluminiumfolie eingewickelt und 18-24 Stdn. bei 2 bis 8°C gerührt.

Das Reaktionsgemisch (1 ml) wird gezählt und das Volumen wird auf 0,1 ml genau bestimmt. Das Reaktionsgemisch wird in eine Dialysemembran aus Cellophan gegeben und 3 Tage gegen destilliertes Wasser unter häufigem Austausch des

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Wassers dialysiert. Das Verhältnis von Dialysewasser zu Reaktionsgemisch sollte mindestens 15 : 1 sein. Die trübe Lösung wird aus dem Dialysebeutel entfernt. 1 ml wird der Zählung unterworfen und das Volumen wird auf 0,1 ml genau bestimmt. Das gebundene Thyroxin, ausgedrückt in mg, wird wie folgt errechnet:

Impulse pro min (vor der Dialyse) χ Anzahl der ml _10Q Impulse pro min (nach der Dialyse) χ Anzahl der ml

mg Thyroxin/150 mg RSA

₌ χ _{= Molverhältnis Thyrox}in/RSA

Das Molverhältnis muß mindestens 10 : 1 sein.

Die auf diese Weise hergestellte Immunogenzubereitung wird Std. bei 5 Ji oder weniger lyophilisiert. Hierzu wird das Material in RSA-Mengen von 9 mg eingegeben. Zur Immunisierung wird die gefriergetrocknete Zubereitung in destilliertem Wasser (3 ml) resuspendiert. Die unlösliche Suspension wird durch Hochgeschwindigkeitshomogenisierung zerrieben (Virtis-Homogenisator, volle Geschwindigkeit). Vollständiges Freund¹sches Adjuvans (3 ml) wird zugesetzt und das Gemisch wird durch Hochgeschwindigkeitshomogenisierung emulgiert. Nach einer vor der Immunisierung erfolgenden Blutabnahme werden den Tieren an zwei Stellen subkutan in der Thoraxgegend (im Falle von Ziegen und Schafen) eine Gesamtdosis von etwa 3 mg und an vier Stellen 0,5 ml subkutan oder intramuskulär im Oberschenkelmuskel, in die subskapulare Gegend und in die Thoraxgegend (im Falle von Kaninchen) eine Gesamtdosis von etwa 3 mg injiziert. Die

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Immunisierung wird in 2- bis 3-wöchigen Intervallen wiederholt und Serenproben werden periodisch durch Titration getestet. Wenn der Antikörpertiter 10000 oder höher ist, dann wird dem Tier ein größeres Blutvolumen abgenommen und das Antiserum erhalten.

Die Antiseren werden lyophilisiert in Mengen von 0,2 ecm und 1,0 ecm gelagert. Unter Verwendung beispielsweise der 0,2-ccm-Menge wird das Thyroxinantiserum in der Weise rekonstituiert, daß man kaltes, destilliertes Wasser (0,2 ecm) zusetzt. Verdünnungen werden in Veronal-0,1% HSA-Pufferlösung hergestellt, um die Einstellung in den vorhergesehenen Titer vorzunehmen. Es wird somit die Verdünnung des Antiserums hergestellt, die 5O?6 des Thyroxin* in Gegenwart einer Matrix, die Magnesium-8-anilino-i-naphthalinsulfonat und das markierte Thyroxin enthält, und in Gegenwart von - Thyroxin-armem . Serum bindet. Untenstehend ist ein Probeprotokoll, bei dem anstelle der Matrix die einzelnen Komponenten zugegeben werden, angegeben:

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Komponenten

Nr. 1

Nr. 2

Nr. 3

Nr. 4

Nr. 5

Nr. 6

ο co co

ml Veronal-0,1# HSA-Puffer ml mg ANS (6 mg/ml) ml Thyroxin-armes Serum-· · ml Antiserumverdünnung Anti s erum-Verdtlnnung ml ¹²⁵J-Thyroxin (1000 pg./ml)

0,89 0,1 0,01 0,1 10 0,1

100

500

1000

5000

10000

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Die Gläschen werden 1 min lang rotiert, worauf die Gesamtimpulsrate bestimmt wird. Die Gläschen werden 4/2 Stunde bei 37⁰C im Wasserbad inkubiert. In jedes Gläschen wird ein Harzstreifen gegeben und die Gläschen werden 1/2 Stunde bei Raumtemperatur rotiert. Die Streifen werden herausgenommen und es wird die Restimpulsrate der Gläschen bestimmt. % gebundenes ^ J-Thyroxin wird wie folgt bestimmt:

Restimpulsrate (Impulse pro min) ._nn ., _Μί,,_ιη/,_οηββ Gesamtimpulsrate (Impulse pro min) ^{x Ίυυ} = J geounaenes

'^J-Thyroxin

Die Werte für die Prozentmengen gebundenes Thyroxin* werden als Ordinate gegen die Verdünnung aufgetragen. Aus dem Diagramm ergibt sich die Verdünnung, bei der 50# der markierten Menge gebunden sind (50%-Endpunkt).

Herstellung der Bestandteile des Bestecks und des Besteckes:

A. Reaktionsgläschen: Zu 8 Volumina Veronalpuffer wird 1 Vol. ¹²⁵J-Thyroxinl6sung (100 pg. i 20 pg./0,1 ml) und 1 Vol. Mg-ANS-Lösung (6 mg/ml), beide in Veronalpufferlösung, gegeben. Es wird gründlich gemischt und in 1 ml aliquote Mengen eingegeben. Die Gläschen werden bei 4°C gelagert.

B. Thyroxinantiserum: 5-ml-Serum-Gläschen mit LyophilisierungsstSpseln werden verwendet. Aus dem Titrationsdiagramm wird die Verdünnung abgelesen, die eine Thyroxin*- Bindung von 65 bis 80% liefert. Wenn dieser Titer beispielsweise 1 : 1200 ist, dann wird eine 1 : 600-Verdün_r nung in einem Veronalpuffer mj,t doppelter Stärke (0,150M)

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hergestellt. 275 ml werden in die Serumgläschen gegeben lind unter korrekter Einsetzung der Lyophilisierungsstöpsel wird lyophilisiert. Zum Gebrauch wird der lyophilisierte Antikörper in 5,5 ml destilliertem Wasser rekonstituiert. Der lyophilisierte Antikörper wird bei 4°C gelagert.

C. Die Thyroxin-armen Serum-Thyroxin-Standardproben werden, wie oben beschrieben, hergestellt.

D. Ionenaustauscherharzstreifen werden in

0,9%ige Kochsalzlösung gelagert (50 Streifen pro Flasche).

Ein typisches abgepacktes Testbesteck enthält die folgenden Komponenten:

1. 125 Reaktionsgläschen (1 ml), die beim Eichdatum weniger als 0,1 Mikrocurie Thyroxin J-I25, 600 Mikrogramm Magnesium-8-anilino-1-naphthalinsulfonat und 0,075 Mol Veronalpufferlösung enthalten.

2. Gläschen mit Thyroxin-Standardproben, welche 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0 und 40,0 Mikrogrammprozent Thyroxin in thyroxinfreiem Humanserum enthalten. Die Menge beträgt 0,5 ml pro Gläschen.

3. Lyophilisiertes Thyroxinantiserum (Kaninchen-, Schaf- oder Ziegen-ThyroxinantikÖrper in einer Verdünnung von mehr als 1 : 100). Jedes Gläschen enthält 0,075M-Veronalpuffer und 0,1% Humanserumalbumin. Das rekonstituierte Volumen beträgt 5,5 ml.

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4. Ionenaustauscherharzstreifen. Radioimmunologisches Bestimmungsverfahren für Thyroxin;

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen radioimmunologischen Thyroxin-BeStimmungsverfahrens wird wie folgt vorgegangen:

1. Das lyophilisierte Antiserum wird mit 5,5 ml destilliertem Wasser rekonstituiert. Die erforderlichen Komponenten des Tests werden aus dem Kühlschrank herausgenommen und auf Raumtemperatur (15 "bis 32⁰C) gebracht. Die Reaktionsgläschen werden durch mäßiges;Schwenken durchge-*· mischt. Vorzugsweise, wird der Test als Doppelbestimmung, durchgeführt. ._:

2. Während der Temperaturausgleichsperiode des Schritts wird bei den mehreren Reaktionsgläschen die Nettogesamtimpulsrate über einen Zeitraum bestimmt, der ausreichend ist, damit ein Minimum von 10000 Zählungen erhalten wird. Die Nettqgesamtimpulsrate (Impulse pro min) wird bestimmt und aufgezeichnet.

3. Jeweils 10 Mikroliter der 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0 und 40,0 Mikrogrammprozent-Standardproben werden zu einer Reihe von Reaktionsgläschen gegeben. Zu Jedem der anderen Reaktionsgläschen werden mit 10 Mikroliter-Mikropipetten 10 Mikroliter des Serums des Patienten gegeben.

4. 100 Mikroliter Antiserum werden in jedes Reaktionsgläschen eingegeben und die Kappen werden wieder aufgesetzt.

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Dies kann durch eine halbautomatische Mikroliterpipette oder eine Mikroliter-Repetierspritze geschehen'..

5· Die Gläschen werden ü"ber einen Minimalzeitraum von 30 min, jedoch nicht langer als 40 min in einem Wasserbad von 37⁰C (das bis zu der gleichen Tiefe wie das Niveau der Lösung der Reaktionsgläschen oder etwas höher gefüllt ist) inkubiert. Die Reaktionszeit muß bei allen Reaktionsgläschen gleich sein.

6. Die Reaktiohsgläschen werden aus dem Wasserbad herausgenommen. Ein Harzstreifen wird in jedes Reaktionsgläschen eingesetzt und die Käppchen werden wieder aufgesetzt.

7. Die Reaktionsgläschen werden über einen Minimalzeitraum von 30 min, jedoch nicht mehr als 40 min bei Raumtemperatur (15 bis 32°C) auf einem Rotator rotiert, der ein Überkopf-Mischen bei 12 bis 14 Upm ergibt. Die Trennungszeit muß bei allen Reaktionsgläschen gleich sein.

8. Die Harzstreifen werden sofort herausgenommen und verworfen. Die Harzstreifen sollten über dem Gläschen ablaufen gelassen werden, in_jdem die Streifen leicht die Oberseite des Gläschens berühren. Dann werden die Käppchen wieder aufgesetzt.

9. Bei jedem Reaktionsgläschen wird die Restimpulsrate über einen Zeitraum gemessen, daß mindestens 10000 Zählungen erhalten werden. Die Nettorestimpulsrate (Impulse pro min) wird bestimmt und aufgezeichnet.

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10. Bei jedem Reaktionsgläschen(Schritt 9)wird die Nettorestimpulsrate (Impulse pro min) durch die mittlere Nettogesamtimpulsrate (Impulse pro min)(Schritt 2)dividiert. Der Quotient stellt die Prozent an den -Antikörper gebundenes Thyroxin J-125 dar.

Prozent gebundenes Nettorestimpulsrate (Impulse pro min)

Thyroxin J-125 ⁼ . 9) _x100

Nettogesamtimpulsrate £ Impulse pro min)

11. Die mittlere gebundene Prozentmenge der Doppelbestimmung der Werte jeder Standardprobe wird auf die lineare Achse von halblogarithmischem mm-Papier als Funktion der Konzentration der Standardproben, ausgedrückt als Mikrogrammprozent, aufgetragen.

12. Der Wert für die in Prozent ausgedrückte gebundene Menge von jedem Serum des Patienten wird bestimmt. Die Thyroxinkonzentration für diese in Prozent ausgedrückte gebundene Menge wird anhand der Eichkurve (vgl. die Figur) ermittelt.

Die in der Figur dargestellte Eichkurve wird in der Weise hergestellt, daß die folgenden Zahlen aufgetragen werden:

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Thyroxin-Standardprobe (yag %)

co
co
co
to

1,0

2,0

5,0

10,0

20,0

40,0

mittlere Nettogesamtimpulsrate (Impulse pro min) mittlere Nettorestimpulsrate (Impulse pro min)

% gebundenes Thyroxin J-125

36997 27415 26379 23160 18683 13837 9730

74,1

71,3 62,6 50,5 37,4 26,3

Nach diesem radioimmunologisehen Bestimmungsverfahren wurde der normale Thyroidbereich als 4,5 bis 12,0 lig % Thyroxin mit einem Mittelwert von 7,4 ί 1,8 bestimmt.Bei hyperthyreoten Patienten wurde ein Mittelwert von 17,1 ί 4,8 ug % festgestellt. Bei hypothyreoten Patienten wurde ein Mittelwert von 2,7 - 1,5 ng % festgestellt. Unter Anwendung dieses Normalbereiches wurde gefunden, daß bei 92# der Patienten, die klinisch hyperthyreot ren, die Serum-Thyroxinwerte erhöht waren. Bei Patienten, die klinisch hypothyreot waren, hatten 88% Serum-Thyroxinwerte unterhalb des Normalbereiches.

Bei Patienten, die schwanger waren oder die eine Östrogentherapie erhielten, wurde der mittlere Serum-Thyroxingehalt als 11,0 ί 1,4 rig % bzw. 10,9 - 2,8 ng % bestimmt, d.h. er lag im oberen Teil des Normalbereichs. Bei Patienten, die mit Androgenen behandelt wurden, betrug der mittlere Serum-Thyroxingehalt 4,3 - 1,0 ug Ji,

Bei Neugeborenen.betrug der mittlere Serum-Thyroxingehalt 19,5 ί 5,1 yug %.

Die folgenden Werte wurden unter Verwendung eines repräsentativen Bestecks erhalten. Sie stellen die mittleren und die Standardabweichungen für jeden Satz von 6 wiederholten Bestimmungen dar, die an Jedem von sieben verschiedenen Tagen bei Kontrollseren mit bekannten Thyroxinkonzentrationen durchgeführt wurden.

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Kontroll serum I Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag

Kontrolle (tatsächlicher Thyroxingehalt, yug %) 4,0

mittlerer bestimmter

Thyroxingehalt, ng %

(M - 6) ' 3,3 3,8 3,8 3,7 4,4 3,7 3,6

Standardabweichung

(jug %) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2

c£> Kontrollserum II

Ot Kontrolle (tatsäch-

rsj licher Thyroxinge-

-^. halt, iig %) 8,0

ο mittlerer bestimmter
Thyroxingehalt, ng %
(M - 6) ' 7,6 8,0 7,9 7,9 7,9 7,5 7,6

Standardabwe i chung

" ; %) 0,3 0,4 0,2 0,3 0,2 0,4 0,5

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cn ο co OO CX)

-EN-CO

- 29 -

Kontrollserum III Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag

Kontrolle (tatsächlicher

Thyroxingehalt, ng %) 12,0

mittlerer bestimmter Thy- \

roxingehalt, iig % (M = 6) Standardabweichxing (ng %)

11,	1	12,	9	11,	1	11,	1	12	,3	10	,7	12	,9
o,	7	0,	5	o,	2	o,	6	0	,7	0	,4	0	,5

Intra-Assay- Variation;

Die folgenden Werte wurden unter Verwendung eines repräsentativen Bestecks erhalten. Sie stellen die durchschnittliche und die Standardabweichung für jeden Satz von sechs wiederholten Bestimmungen dar, die an jedem von vier verschiedenen Tagen mit einem hypothyreoten, euthyreot.en (d.h. normalen) und hyperthyreöten Kontrollserum durchgeführt wurden.

Hypothyreotes Kontrollserum Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag

durchschnittlicher Thyroxin-

wert (jig %) (N = 6) 2,8 3,4 2,7 3,2

Standardabweichung ( iig %) 0,3 0,6 0,5 0,2

Euthyreotes Kontrollserum Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag

durchschnittlicher Thyroxin-

wert (^g %) (N = 6) 7,2 7,1 6,6 6,8

Standardabweichung (ug %) 0,2 0,4 0,5 0,5

Hyperthyreot'es Kontrollserum Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag

durchschnittlicher Thyroxin-

wert (^g %) (N = 6) 14,4 13,7 13,7 13,5

Standardabweichung (ug %) 0,3 0,2 0,6 0,6 Inter-Assay-Variation;

Die folgenden Werte wurden unter Verwendung eines repräsentativen Bestecks erhalten. Sie stellen die Mittelwerte jedes Satzes von vier wiederholten Bestimmungen sowie die mittlere und Standardabweichung für die Sätze von

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Bestimmungen dar, die an vier aufeinanderfolgenden Tagen mit einem hypothyreoten, euthyreoten und hyperthyreoten Kontrollserum durchgeführt wurden.

	Hypothyreotes Kontrollserum, mittlerer Thy- roxingehalt, /ig % (N = 4)	Euthyreotes Kontrollserum, mittlerer Thy- roxingehalt. /ig % (N = 4)	Hyperthyreotes Kontrollserum, mittlerer Thy- roxingehalt. /ig % (N = 4)
Tag 1	2,8	7,2	14,4
Tag 2 ·	3,4	7,1	13,7
Tag 3	2,7	6,6	13,7
Tag 4	3,2	6,8	13,5
Mittel wert	3,0	6,9	13,8
(N = 16)
Standard abwei chung	0,3	0,2	0,4

Die Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode für Thyroxin sind so hoch, daß zwischen den Standardproben mit 1 und 2 ng % 0,5 Ug % Thyroxin unterscheidbar sind.

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Claims

Verfahren zur radioimmunologischen in-vitro-BeStimmung von Thyroxin in nicht-extrahiertem Blutserum, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Probe des Blutserums, deren Gehalt an Thyroxin bestimmt werden soll, mit einem Reagens vermischt, das im wesentlichen aus einer gepufferten Lösung besteht, die radioaktives Thyroxin und einen Inhibitor für die Inhibierung der Bindung des Thyroxins an thyroxinbindendes Globulin enthält;

zu dem Gemisch ein Antiserum gibt, welches einen Antikörper enthält, der dazu imstande ist, mit dem Thyroxin eine Immunoreaktivität zu haben und das aus einem Immunogen hergestellt worden ist, welches ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekuppelt an Rinderserumalbumin mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, enthält;

das resultierende Gemisch bei einer Temperatur und über einen genügenden Zeitraum inkubiert, daß das an den Antikörper gebundene Thyroxin und das ungebundene Thyroxin praktisch ins Gleichgewicht gebracht werden; das ungebundene Thyroxin von dem an den Antikörper gebundenen Thyroxin abtrennt; und daß man die relativen Mengen des an den Antikörper gebundenen radioaktiven Thyroxins und des ungebundenen radioaktiven Thyroxins bestimmt.

2 · Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ e i ch η e t , daß man den Inkubationsschritt' bei einer

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Temperatur von 37°C und über einen Zeitraum von ungefähr 30 min durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das ungebundene Thyroxin von dem an den Antikörper gebundenen Thyroxin in der Weise abtrennt, daß man das Gemisch über einen vorbestimmten Zeitraum mit einem relativ dünnen Streifen einer Membran in Berührung bringt, die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht.

4.· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch über einen Zeitraum von ungefähr 30 min und bei Raumtemperatur mit der Membran in Berührung hält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Thyroxin Jod-125 enthaltendes Thyroxin und/oder Jod-131 enthaltendes Thyroxin ist.

6. Immunogenzubereitung für die Herstellung eines Antiserums, welches einen Antikörper enthält, der dazu imstande ist, mit dem Thyroxin eine Immunoreaktivität zu haben, dadurch gekennzeichnet , daß sie ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekuppelt an Rinderserumalbumin mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, enthält.

7. Antiserum, welches einen Antikörper enthält, der dazu imstande ist, mit Thyroxin eine Immunoreaktivität

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zu haben, dadurch gekennzeichnet , daß es aus einem Immunogen hergestellt worden ist, welches ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekuppelt an Rinderserumalbumin mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, enthält,

8, Abgepacktes Testbesteck zur Verwendung bei einem Verfahren zur radioimmunologischen in-vitro-BeStimmung von Thyroxin in nicht-extrahiertem Blutserum, gekennzeichnet durch die Kombination aus

a) einer gepufferten Lösung, die radioaktives Thyroxin und einen Inhibitor für die Inhibierung der Bindung von Thyroxin an thyroxinbindendes Globulin enthält,

b) einer gepufferten Lösung, die ein Antiserum enthält, welches einen Antikörper enthält, der dazu imstande ist, mit Thyroxin eine Immunoreaktivität zu haben, und das aus einem Immunogen hergestellt worden ist, welches ein Konjugat des N-Acetylderivats von Thyroxin, gekuppelt an Rinderserumalbumin mit 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, enthält, und

c) einer Vielzahl von relativ dünnen Streifen einer Membran , die im wesentlichen aus einem Ionenaustauscherharz besteht.

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