DE2805663A1 - Verfahren zur herstellung von antigenen und antikoerpern - Google Patents

Verfahren zur herstellung von antigenen und antikoerpern

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Description

· ΈΙΤΓ,Ε & PARTNER £ # U b 6 6
PATENTANWÄLTE
DR. ING. E. HOFFMANN {1930-1974) - DlPL-ING.W.EITIE - DS.RER.MAT.K.HOFFMANN · DIP1.-ING. W. LEHN
DfPL.-lNG. K. FOCHSiE - OR. REB. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 {STERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN β] - TELEFON {089J 911067 - TEtEX C5-2SW3? (PATH £|
30 278 o/wa
OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN
Verfahren zur Herstellung von Antigenen und Antikörpern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen aus einem Peptid-Protein-Komplex und ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern unter Verwendung der Antigene.
Ein Antigen ist eine Substanz, welche einen lebenden Organismus zur Bildung eines spezifischen Antikörpers stimuliert und damit spezifisch reagiert. Das faeisst, dass ein Antigen eine Substanz ist, welche eine Antigenität zur Bildung eines Antikörpers in vivo und eine Immunoreaktivität zur Umsetzung
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mit dem Antikörper in vitro aufweist. Typische Beispiele für Antigene sind Fremdproteine, wie Bakterien, Viren, verschiedene Toxine und dergleichen. Andererseits ist ein Antikörper eine Substanz, die im lebenden Organismus, beispielsweise in Säugetieren und dergleichen, aufgrund der Stimulation eines Antigens gebildet wird und die hauptsächlich in Blutserum, insbeondere in der Ύ-Globulinfraktion eines Blutserums vorliegt. Antikörper können mit Antigenen in vitro oder in vivo reagieren.
Antigene haben an ihrer Oberfläche eine oder mehrere bestimmte Gruppen, die mit Antikörpern reagieren können und Antikörper haben an der Oberfläche eine oder mehrere reaktive Gruppen, die sich mit diesen reaktiven Gruppen kombinieren können. Beide Substanzen haben eine komplimentäre Raumstruktur gegeneinander, wie sie von Ehrlich als "Schlüssel- und Schlüsselloch-Verhältnis" bezeichnet wurde und wodurch die Spezifität zwischen Antigenen und Antikörpern erklärlich ist.
Die meisten der in der Natur gefundenen Antigene haben an der Oberfläche ein Mosaik von verschiedenen bestimmten Gruppen und man nimmt bei spezifischen Antikörpern an, dass diese entsprechend den jeweiligen Bestimmungsgruppen gebildet werden.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion, die zwischen Antigenen mit gemeinsamen bestimmten Gruppen und den entsprechenden Antikörpern stattfindet, wird als "Kreuzreaktion" oder "Gruppenreaktion" bezeichnet.
Eine Antigen-Antikörper-Reaktion besteht aus einer ersten
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Stufe,in welcher das Antigen sich mit dem entsprechenden Antikörper innerhalb einer sehr kurzen Zeit (beispielsweise 20 Sekunden) und sogar bei niedrigen Temperaturen (beispielsweise von O C) unter Bildung eines Konjugates vereint, und einer zweiten Stufe, bei welcher die so erhaltenen !Conjugate miteinander unter Agglutination, die mit dem Auge beobachtet werden kann, kombinieren.
Eine der charakteristischen Eigenschaften einer Antigen-Antikörper-Reaktion ist die hohe Spezifität und solche Reaktionen sind deshalb häufig zur Diagnose zahlreicher Krankheiten herangezogen worden.
Die Bestimmung von Hormonen wurde unter Verwendung von Immunoreaktionen, d.h. einer Antigen-Antikörper-Reaktion, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt.
Pancreasglucagon ist eines der physiologischen Pancreashormone welche eine wichtige Rolle in der Aufnahme und dem Metabolismus von Zucker dienen und welches die folgende Aminosäuresequenz hat:
NH2
ι
His-Ser-Glu-Gly-Thr - Phe-Thr - Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Ser-Arg-Arg-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Glu-Try-Leu-Met-Asp-Thr 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Die quantitative Bestimmung von Pancreasglucagon ist in neuerer
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Zeit auf dem Gebiet der Diagnose, der Pathologie und dergleichen interessant geworden, weil die Bestimmung des Pancreasglucagons im Blut die Diagnose zahlreicher Erkrankungen oder pathologischer Zustände, beispielsweise von Diabetes, ermöglicht.
Die übliche Verfahrensweise zur Bestimmung von Pancreasglucagon wurde unter Anwendung des Radioimmunotests (nachfolgend als RIA-Methode bezeichnet) durchgeführt, bei dem Antikörper, die unter Verwendung von Pancreasglucagon per se oder Antigene, die Pancreasglucagon als Hapten enthalten, verwendet werden. Diese RIA-Methode ist in einigen Fällen erfolgreich (siehe Unger et al: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102, 621 (1959)) .
Durch weitere Forschungen wurde die Anwesenheit von glucagonähnlichen Substanzen im Verdauungstrakt oder im Darm von Säugetieren gefunden, die sich immunologisch ähnlich verhalten wie Pancreasglucagon und als "gut-GLI" bezeichnet werden (siehe Sutherland et al: J. Biol. Chem. 175, 663 (1964) und Unger et al: Metabolism, J_5, 865 (1966)). Es wurde auch festgestellt, dass Antikörper, die unter Verwendung von Pancreasglucagon per se erhalten wurden oder Antigene, die Pancreasglucagon als Hapten enthalten, nicht nur mit Pancreasglucagon sondern auch mit gut-GLI's kreuzreagieren, so dass sie nicht spezifisch gegenüber Pancreasglucagon sind. Dies besagt mit anderen Worten, dass bei der Bestimmung von Pancreasglucagon unter Verwendung der RIA-Methode die oben genannten bekannten Antikörper Werte ergeben, die solche Werte einschliessen, die der Reaktion mit gut-GLI's zuzuschreiben sind und daher bei der genauen diagnostischen Bestimmung Fehler ergeben.
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Kürzlich wurde berichtet, dass man zufällig Pancreasglucagonspezifische Antikörper unter Verwendung der vorher erwähnten Antigene gefunden hat (siehe Diabetes, JT7, Suppl. 1, 321 (1968)).
Es wurde auch berichtet, dass diese Antikörper, die als "G 58" und "30 K" bezeichnet werden, nur zufällig und sehr selten erhalten werden (siehe Saishin Igaku, Newest Medicine, 3O, (11) S. 1901 (1975) und Heading, L.G. Horm. Metab. Res., Λ_, 87-88 (1969)). Daher hat das Verfahren zur Herstellung von Antikörpern unter Verendung eines Antigens, welches Pancreasglucagon als Hapten enthält, eine schlechte Reproduzierbarkeit und ist für die Praxis ungeeignet.
Es wurde das Struktur-Funktions-Verhältnis von Glucagon untersucht (Assan et al: Diabetes, 2Λ_ι 843 (1972)) durch Synthese verschiedener Peptide, die in Beziehung zu Glucagon stehen, d.h. C1 bis C2o Fragmente und Bestimmung deren biologischer Aktivität, wobei die Erhöhung des Blutzuckerniveaus als Indikator verwendet wurde. Weitere Untersuchungen wurden an Antigenseiten des Glucagonmoleküls unter Verwendung eines Glucagonspezifischen Antikörpers "K 47" und eines Glucagon-nicht-spezifischen Antikörpers "PVP 8" durchgeführt und diese Untersuchungen haben zu der Annahme geführt, dass wenigstens zwei Antigenstellen in dem GlucagonmoleküT vorliegen und dass eine dieser Antigenstellen in dem C-endständigen Teil, insbesondere den C23 bis C39 Fragmenten des Glucagonmoleküls, vorliegt.
Über diese Untersuchungen über den Mechanismus des Immunologischen Verhaltens von Glucagon oder gut-GLI und die Entwicklung von in der Praxis geeigneten Antikörpern sind keine weiteren Veröffentlichungen ergangen.
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Wie vorher festgestellt, sind die bekannten Antikörper entweder gegenüber Pancreasglucagon unspezifisch oder sie werden mit schlechter Reproduzierbarkeit erhalten, so dass ein starkes Bedürfnis vorliegt, Verfahren zu entwickeln, die zur Herstellung von Antikörpern mit Spezifität gegenüber Pancreasglucagon geeignet und industriell durchführbar sind.
Ein Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die hochspezifisch gegenüber Pancreasglucagon sind, mit hoher Reproduzierbarkeit aufzuzeigen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen, die zur Herstellung von Pancreasglucagon-spezifisehen Antikörpern geeignet sind, aufzuzeigen.
Untersuchungen sind durchgeführt worden, um ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern aufzufinden, welches zur Bestimmung von Pancreasglucagon unter Verwendung der RIA-Methode geeignet ist und wiches ausreichend Reproduzierbar in industriellen Massen ist, um Antikörper mit hoher Spezifität gegenüber Pancreasglucagon zu bestimmen. Während dieser Untersuchungen wurde gefunden, dass die Antigenität gegenüber Schweinepancreasglucagon, das eine Aminosäuresequenz hat, die vollständig identisch ist mit der von menschlichem Glucagon, in der C1Q bis C2g oder C. g bis C2g Aminosäuresequenz vorliegt.
Aufgrund dieser Peststellung wurden weitere Untersuchungen zur Herstellung eines Antigens, welches die vorgenannten Peptide als Hapten enthält . und von Antikörpern mit hoher Spezifität
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gegenüber Pancreasglucagon unter Verwendung solcher Antigene durchgeführt.
Die Erfindung betrifft deshalb in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines Antigens aus einem Peptid-Protein-Komplex und ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptid der allgemeinen Formel (I)
H- (Arg)m-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asp-Thr (I)
worin m 0 oder 1 bedeutet, als einen Hapten mit einem Protein als Träger in Gegenwart eines Dialdehyds der allgemeinen Formel (II)
OHC-(CH2Jn-CHO (II)
worin η eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, umsetzt.
Gemäss einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Pancreasglucagon-spezifischen Antikörpers und ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Antigen aus einem Peptid-Protein-Komplex, wie er nach der obigen Ausführungsform erhalten wurde, einem Säugetier verabreicht unter Ausbildung eines Antikörpers, worauf man dann den erhaltenen Antikörper gewinnt.
Fig. 1 und 2 zeigen die Molekulargewichtsverteilung bzw.
das UV-Absorptionsspektrum des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Produktes.
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Fig. 3 und 4 zeigen die Molekulargewxchtsvertexlung bzw. das UV-AbsorptionsSpektrum des gemäss Beispiel 2 erhaltenen Produktes.
Fig. 5 ist eine grafische Darstellung der Immuno-
reaktivität des gemäss Beispiel 3 erhaltenen Antikörpers.
Fig. 6 ist eine grafische Darstellung, welche die
Spezifität der erfindungsgemässen Antikörper zeigt,
Fig. 7 ist eine grafische Darstellung, die das Bindung sverhältnis (in %) von GA-10 mit Standard-Glucagon, Hunde-gut-GLI und Schweine-gut-GLI bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen zeigt.
Fig. 8 ist eine grafische Darstellung, welche das
Bindungsverhältnis (%) des Antikörpers (1) mit Standard-Glucagon, Hunde-gut-GLI und Schweinegut-GLI bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen zeigt.
Fig. 9 ist eine grafische Darstellung, welche das Bindungsverhältnis (%) des Antikörpers 30 K mit Standard-Glucagon, Hunde-gut-GLI und Schweinegut-GLI bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen zeigt.
Es werden die üblichen Abkürzungen für Aminosäurereste unter
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Verwendung der Äminosäurenoiuenklatur gemäss IUPAC nachfolgend verwendet zur Bezeichnung der als Hapten erfindungsgemäss verwendeten Peptide.
Die Verwendung der Peptide gemäss der Formel (I) als einen Hapten ist bei der vorliegenden Erfindung wesentlich. Bei den gemäss der allgemeinen Formel (I) beschriebenen Peptiden entspricht das Peptid, bei dem m gleich 1 ist (nachfolgend als GCTR-1 bezeichnet) dem C18 bis C„„ Fragment von Schweine-Pancreasglucagon und das Peptid, bei dem m gleich ist (nachfolgend als GCTR-2 bezeichnet) entspricht dem C1g bis C2g Fragment von Schweine-Pancreasglucagon. Beide Peptide sind bekannte Verbindungen (siehe W- W. Bromer, A. Staub et al: "The Amino Acid Sequence of Glucagon", Journal of the American Chemical Society, 5. Juni 1957).
Bei der vorliegenden Erfindung können GCTR-1 und GCTR-2 einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Die durch die allgemeine Formel (II) bezeichneten Dialdehyde dienen als Verbindungsglied zwiscfen dem Hapten und dem Protein.
Geeignete Beispiele für Dialdehyde der allgemeinen Formel (II) die erfindungsgemäss verwadet werden können, schliessen Malonsäurealdehyd, Bernsteinsäurealdehyd, Glutarsäurealdehyd. Adipinsäurealdehyd und dergleichen ein.
Alle Proteine, wie sie üblicherweise zur Herstellung von Antigenen verwendet werden, können bei der vorliegenden Erfindung als Träger verwendet werden.
Typische Beispiele für solche Proteine, die als Träger geeignet
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sind, sind Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Menschenserumalbumin/ Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Kaninchenserumglobulin, Menschenserumglobulin und dergleichen.
Die erfindungsgemässen Antigene werden erhalten, indem man den Hapten der Formel (I) mit einem Protein in Gegenwart eines Dialdehyds der Formel (II) in einer wässrigen Lösung oder einer wässrigen Pufferlösung auf einen pH von 7 bis etwa 10, vorzugsweise 8 bis 9, und einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 400C, vorzugsweise nahe Raumtemperatur (20 bis 25°C) etwa 1 bis 24 Stunden umsetzt.
Geeignete Beispiele für Pufferlösungen sind 0,2 η Natriumhydroxid - 0,2 m Borsäure - 0,2 m Kaliumchlorid-Pufferlösung, eine 0,2 m Natriumcarbonat-, 0,2 m Borsäure-, 0,2 m Kaliumchlorid-Pufferlösung, eine 0,05 m Natriumtetraborat-0,2 m Borsäure-0,05 m Natriumchlorid-Pufferlösung oder eine 0,1 m Kaliumdihydrogenphosphat-0,05 m Natriumtetraborat-Pufferlösung.
Der Anteil des Hapten, des Dialdehyds und des Trägers beim erfindungsgemässen Verfahren hängt von den Bedingungen ab. Im allgemeinen wird ein Gewichtsverhältnis des Trägers zum Hapten von etwa 2:1 bis etwa 6:1 und vorzugsweise 3:1 bis etwa 5:1 und ein Molverhältnis des Dialdehyds zum Hapten von etwa 5:1 bis etwa 10:1 angewendet.
Nach Beendigung der Umsetzung können die so erhaltenen Antigene isoliert und gereinigt werden unter Anwendung üblicher Verfahren, beispielsweise durch Dialyse, Gelfiltration, fraktionierte Ausfällung und dergleichen. Die erfindungsgemässen
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Antigene können gelagert werden, beispielsweise durch Lyophilisierung.
Die erfindungsgemässen Antigene enthalten durchschnittlich 5 bis 15 Mole Peptid pro Mol des verwendeten Proteins.
Das oder die vorstehend beschriebene(n) Antigen(e) können als Ausgangsmaterial zur Herstellung von gegenüber Pancreasglucagon hochspezifischen Antikörpern verwendet werden. Antigene enthaltend 9 bis 12 Mole Peptid pro Mol Protein werden bevorzugt, weil sie zur Herstellung von Antikörpern mit einem höheren Grad geeignet sind.
Zur Herstellung von Antikörpern werden die Antigene Säugetieren nach üblichen Verfahren (siehe Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 347 (1968)) verabreicht und dann werden die im lebenden Organismus gebildeten Antikörper gesammelt. Die Erfindung schliesst ein Verfahren zur Herstellung der Antikörper ein.
Säugetiere, die zur Herstellung von Antikörpern gemäss der Erfindung verwendet werden können, sind nicht besonders limitiert und schliessen ein Rinder, Schweine, Pferde, Kaninchen, Meerschweinchen und dergleichen, wobei Kaninchen und Meerschweinchen wegen der Einfachheit der Handhabung bevorzugt sind.
Zur Herstellung von Antikörpern wird eine vorbestimmte Menge des Antigens mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine vorbestimmte Konzentration, beispielsweise 0,5 bis 2 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wird dann mit einem vollständigen "Freund's" Adjuvant vermischt unter Ausbildung einer Dispersion, die dann dem Säugetier verabreicht wird. Die so erhaltene
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Dispersion wird beispielsweise einem Kaninchen intradennal in einer Dosis von etwa 0,5 bis etwa 2 mg Antigen verabreicht. Anschliessend kann eine Dosis von 0,5 bis 2 mg einmal alle 2 Wochen während 2 bis 10 Monaten, vorzugsweise 4 bis 6 Monaten, wiederholt werden.
Die Gewinnung der Antikörper kann erfolgen, indem man dem immunisierten Tier nach Bildung einer grossen Menge des Antikörpers nach der letzten Verabreichung der das Antigen enthaltenden Dispersion, im allgemeinen 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung, Blut entnimmfcund das so erhaltene Blut zur Trennung des Antiserums (Antikörper) zentrifugiert.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist es aufgrund der Besonderheit des verwendeten Antigens möglich, konstant Antikörper mit ausgezeichneter Spezifität gegenüber Pancreasglucagon herzustellen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Antikörper weisen eine hohe Spezifität gegenüber Pancreasglucagon auf und sind geeignet zur ganz genauen Bestimmung von menschlichem Pancreasglucagon unter Anwendung der RIA-Methode.
In den nachfolgenden Beispielen sidn alle Teile, Prozente, Verhältnisse und dergleichen auf das Gewicht bezogen.
Beispiel 1
6 mg GCTR-1 wurden in 0,2 ml einer 0,2 η Kaiiumhydroxid-Lösung in Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Zu der Lösung wurde 1 ml
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eines Or2 η NatriTimhyäroxiä-Of2 m Borsänre-0,2 m Kaliumchlorid-Puffers mit dem pH 9 (nachfolgend der Einfachheit halber als "Pufferlösung" bezeichnet) gegeben ttnd dazu wurde tropfenweise 1 ml der Pufferlösung mit 2O mg darin gelöstem Rinderserumalbumin (nachfolgend als "BSA" bezeichnet) und 1 ml einer 0,03 m Glutaraldehyd-Lösung gegeben. Die Reaktionsmischung machte 3 ml aus und wurde unter Rühren bei Raumtemperatur Stunden umgesetzt.
Aus dem so erhaltenen Produkt wurden 0,5 ml eines aliquoten Teils herausgenommen und dazu wurden O,5 ml einer 2 %—igen NatritoBdodecylsulfat-Jiösung (nachfolgend als "SDS" bezeichnet) gegeben. Nach Erhitzen der Mischung auf 1OO C zum Auflösen des beim Abkühlen gebildeten Niederschlags,wurde die Mischung einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-75 filtriert und mit einer 1 %-igen SDS-Lösung zur Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung äquilibriert. Die Gelfiltration wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Bestimmung: optische Dichte bei 28O nm
Verwendete Säule: 1 χ AO cm Elutionsgeschwindigkeitj 3 mm/h
Elutionslosung: 1 % SDS-Lösung enthaltend
O,5 m NaCl.
Die erhaltenen Ergebnisse sind aus Fig. 1 ersichtlich.
In Fig. 1 gibt die Ordinate die optische Dichte und die Abszisse die Fraktionszahl an. Die Menge jeder Fraktion war 1 ml.
Aus den in Fig. 1 gezeigten Ergebnissen wird ersichtlich, dass
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das Reaktionsprodukt zwei ausgeprägte Peaks bei Fraktionen 14 und 17 (Fraktion I) und Fraktionen 18 bis 21 (Fraktion II) zeigte. Fraktion(I)hatte ein Molekulargewicht von etwa 75.000 oder mehr, welches höher ist als das Molekulargewicht von Motilin (ungefähr 2.700) und Fraktion(II)hatte ein Molekulargewicht ähnlich dem Molekulargewicht von Motilin. Beide Fraktionen (I) und (II) hatten ein Molekulargewicht welches höher ist als das Molekulargewicht von GCTR-1 (etwa 1.000).
Dann wurden Fraktionen (I) und (II) unter Erwärmen in einer 2 %-igen SDS-Lösung bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml aufgelöst. Nach dem Auflösen wurde jede Lösung in eine Zelle von 1 cm Länge gegeben und die UV-Absorption bei einer Wellenlänge im Bereich von 140 bis 300 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
In Fig. 2 gibt die Ordinate die optische Dichte und die Abszisse die Wellenlänge (nm) an. Die Bezeichnungen 1 und 2 bezeichnen das Absorptionsmuster der Fraktionen (I) bzw. (II). Die Bezeichnungen 3 und 4 geben das Absorptionsmuster von BSA bzw. GCTR-1 an, die unter den gleichen Bedingungen gemessen wurden wie im Falle der Fraktionen (I) und (II).
Aus den in Fig. 2 gezeigten Ergebnissen wird ersichtlich, dass Fraktion (I) (Kurve 1) ein Absorptionsmuster zeigt, das unterschiedlich vom Absorptionsmuster von BSA und GCTR-1 ist. Unter Berücksichtigung der in Fig. 1 hinsichtlich der Molekulargewichtsverteilung gezeigten Ergebnisse wurde festgestellt, dass Fraktion (I) dem Peptid-Protein-Komplex (d.h. GCTR-1-BSA) entspricht. Andererseits zeigte die Fraktion (II) (Kurve 2) ein Absorptionsmuster der gleichen Art wie GCTR-1 (Kurve 4). Aufgrund der in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse wurde
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— 1 ö —
festgestellt, dass Fraktion (II) einem Dimeren von GCTR-1, wie es durch Behandlung mit Glutaraldehyd gebildet wird, entspricht.
Ein anderer aliquoter Teil des Produktes (etwa 2,5 ml) wurde einer Gelfiltration in gleicher Weise wie vorher angegeben unterworfen und die Fraktionen, die der Fraktion (I) entsprachen wurden gesammelt und mit 0,6 % Natriumchlorid-Lösung bei 4°C 24 Stunden dialysiert und dann lyophilisiert, wobei man ein weisses Pulver des GCTR-1-BSA-Komplexes in einer Menge von 17,3 mg erhielt. Der so erhaltene Komplex war ein Komplex aus 1 Mol BSA mit durchschnittlich 11 Molen GCTR-1 daran gekuppelt. Das Bindungsverhältnis (%) wurde wie folgt bestimmt.
Zunächst wurde eine Standardkurve für die Konzentration von GCTR-1 gegenüber UV-Absorption gemessen und zwar basierend auf der Tatsache, dass die Fig. 1 nicht die Anwesenheit von nicht umgesetztem BSA zeigte; und die Menge von Fraktion (II) wurde aus dieser Standardkurve berechnet. Dann wurde die Menge der Fraktion (II) von der Menge des anfangs zugegebenen GCTR-1 abgeleitet. Die erhaltene Menge von GCTR-1 wurde entsprechend der Menge von GCTR-1, welches an BSA gebunden war, angenommen.
Beispiel 2
Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 6 mg GCTR-2 anstelle von GCTR-1 verwendet wurden. Das so erhaltene Produkt wurde einer Gelfiltration unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben unterworfen und die Molekulargewichtsverteilung
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wurden wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in den Pig. 3 rind 4 gezeigt- Ans den Ergebnissen in Fig. 3 wird ersichtlich, dass das Reaktionsprodukt zwei ausgeprägte Peaks (Fraktion I1 und II1) ähnlich wie bei den Ergebnissen des Beispiels 1 aufwies. Fraktionen (Is) und (II1) entsprachen dem GCTE.-2-BSA-XDinplex bzw. einem Dimer en VDn GCTR-2, beide hatten annähernd die gleiche Molekulargewichtsvertei— lung wie Fraktion (I) bzw. Fraktion (II1).
Fraktion (I1) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 dialysiert und lyophilisiert, wobei man ein weisses Pulver des GCTR-2-BSA-JKomplexes in einer Menge von 17,8 mg erhielt. Der so erhaltene Komplex enthielt durchschnittlich 10 Mole GCTR-2 pro Mol BSA.
Beispiel 3
7 mg der jeweils nach Beispiel 1 und 2 erhaltenen Komplexe wurden in 1,8 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 2,7 ml des vollständigen Freundfs Adjuvants wurden unter Ausbildung einer Dispersion zugegeben. Die so erhaltene Dispersion wurde intradermal durch Injektion Kaninchen in einer Dosierung von 1 ml/Kaninchen gegeben. Nach 2 Wochen wurde jedem Kaninchen weitere 1 ml der Dispersion verabreicht. Dann wurde eine frisch hergestellte Dispersion aus 3 mg Antigen, 3 ml einer physiologischen Kochsalzlösung und 3 ml des vollständigen Freund's Adjuvants intradermal 3,5 Monate in 2-Wochen-Abständen zum Immunisieren der Versuchstiere gegeben. 10 Tage nach der letzten Verabreichung der Dispersion wurde das Blut von den Versuchstieren gewonnen und zentrifugiert,
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wobei man unter Abtrennung des Antiserums den erfindungsgemässen Antikörper erhielt.
Die Aktivität des so erhaltenen Antikörpers wurde wie folgt gemessen.
§§stimmung_der_Antikörp_er aktivität
Jeder der Antikörper, d.h. Antikörper (I), hergestellt unter Verwendung des Antigens, das gemäss Beispiel 1 erhalten wurde und Antikörper (II) , hergestellt unter Verwendung des gemäss Beispiel 2 erhaltenen Antikörpers, wurden anfangs mit physiologischer Kochsalzlösung auf Konzentrationen von 10 ,
1Cf2, 1O~3, 10 und 10~5 verdünnt. Zu je 100ul der verdünn-
125
ten Lösung wurden 10OuI J-Glucagon und 300ul eines 0,5 m Phosphatpuffers mit dem pH 7 (enthaltend 0,5 Gew.% BSA, 0,1 Gew.% NaN-, und 0,14 m NaCl) gegeben und die Mischung wurde
bei 4°C 48 Stunden inkubiert und der erhaltene Komplex aus J-Glucagon und Antiserum wurde von nicht-uitigesetztem oder
1 25
freiem J-Glucagon unter Verwendung von dextranbeschichteter Holzkohle und Zentrifugieren bei 4 C mit einer Geschwindigkeit von 3.0OO üpm während 15 Minuten abgetrennt. Die Radioaktivität des so erhaltenen Komplexes wurde gemessen zur Be-
1 25 Stimmung des Bindungsverhältnisses (%) von -J-Glucagon und Antiserum bei jeder Konzentration.
Die erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt. In Fig.
1 25 gibt die Ordinate das Bindungsverhältnis (%) von J-Glucagon und Antiserum an und die Abszisse bezeichnet die ursprüngliche Verdünnung des geprüften Antiserums. Die Ziffern 1 und 2 bezeichnen die Antikörper (I) bzw. (II).
Aus den Ergebnissen der Fig. 5 ist ersichtlich, dass der Grad der Verdünnung des Antiserums, bei welchem das Bindungsverhältnis
809833/0963 _ 21 _
2§05663
1 25
(%) des Antiserums und J-Glucagon 50 % beträgt, d.h. die Aktivität (JDgo) des Antikörpers folgende ist:
Antikörper Aktivität (JD,-n)
50;
I etwa 50.000
II etwa 25.000
Diese Bestimmung wurde durchgeführt, basierend auf dem Prinzip, dass das Verhältnis der markierten Glucagonbindung zu einem Glucagonantikörper zu einer unmarkierten Glucagonbindung zu dem Glucagonantikörper identisch dem Verhältnis der Konzentration des markierten Glucagons zu dem des unmarkierten Glucagons in der Lösung ist und dass, wenn die Konzentration des markierten Glucagons feststeht, die Menge des markierten gebundenen Glucagons (B) abnimmt, während die Menge an freiem markierten Glucagon (F) sich erhöht in dem Masse wie die Konzentration an unmarkiertem Glucagon (des zu messenden Glucagons) ansteigt. Pancreasglucagon (Standardglucagon, Konzentration: 10 pg/ml bis 100 ng/ml), Hunde-gut-GLI (Verdünnung:
1:9 bis 1:2187) und Schweine-gut-GLI (Verdünnung 1:9 bis 1:2187)
1 25
wurden als Proben und J-Glucagon (10.000 cpm) als markiertes Glucagon verwendet.
1 25 200ul der oben genannten Glucagonproben, 200ul J-Glucagon und 200ul des Antikörpers (I) , erhalten gemäss Beispiel 3 (Aktivität etwa 50.000) und 10OuI Trasylol (hergestellt von BAYER AG, 1.000 KIU) wurden miteinander vermischt und 48 bis
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_22_ 2305663
72 Stunden bei 4°C inkubiert. Die so behandelte Mischung wurde aufgetrennt in gebundenes markiertes Glicagon (B) und freies markiertes Glucagon (F) unter Verwendung von dextranbeschichteter Holzkohle (siehe M. Boyns, L. Vanhaelst und J. Goldstein; Horm. Metan. Res., _3, 409 (1971) worauf anschliessend die Radioaktivität gemessen wurde. Das Bindungsverhältnxs (BO) entsprechend der Aktivität des verwendeten Antikörpers (I) wurde als 100 % angegeben und der Prozentsatz des gebundenen markierten Glucagon (B) der Proben bei jeder Konzentration und jedem Grad der Verdünnung wurde darauf bezogen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 angegeben. In Fig. 6 bedeutet die Ordinate das Bindungsverhältnis (%) (B/BO χ 100) und die Abszisse die Konzentration des Pancreasglucagon (ng/ml) und den Grad der Verdünnung mit GLI. In Fig. 6 bedeutet der Buchstabe (a) Pancreasglucagon und die Buchstaben (b) bzw. (c) bezeichnen Hunde-gut-GLI bzw. Schweine-gut-GLI.
Aus den Ergebnissen in Fig. 6 ist ersichtlich, dass der erfindungsgemässe Antikörper eine Kurve, welche die Reaktivität mit Pancreasglucagon zeigt, ergibt, die klar unterscheidbar ist von Kurven, bei denen die Reaktivität mit Hunde- und Schweine-gut-GLI's gezeigt wird. Daraus lässt sich schliessen, dass der erfindungsgemässe Antikörper mit GLI's nicht kreuzreagiert und eine ausgezeichnete Spezifität gegenüber Pancreasglucagon hat.
Wenn dagegen ein Antikörper mit einer niedrigen Spezifität gegenüber Pancreasglucagon verwendet wird, überschneiden sich die Reaktivitätskurven von Hunde- und Schweine-gut-GLI'S mit der Kurve, welche die Reaktivität mit Pancreasglucagon anzeigt, und die Reaktivität mit diesen GLI's ist eingeschlossen
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in die Reaktivität mit Pancreasglucagon und dadurch erfolgt eine unkorrekte Bestimmung des Pancreasglucagonnxveaus.
Beispiel 4
Diese Bewertung wurde basierend auf dem Verfahren der RIA-Methode durchgeführt, bei welcher markiertes Glucagon und unmarkiertes Glucagon zum Vergleich umgesetzt werden mit einer vorbestimmten Menge eines Glucagonantikörpers in der Antigen-Antikörper-Reaktion.
Standardpancreasglucagon (Rinder- oder Schweinepancreasglucagon; Konzentration: 10 pg bis 100 ng/ml) und Hunde- und Schweine-gut-GLI's (Verdünnung: 1:9 bis 1:2187) wurden als Versuchsproben verwendet. Eine Mischung aus 200ul jeder
1 25
Probe, 200ul von J-Glucagon-Lösung (enthaltend 15 pg
J-Glucagon; 10.000 cpm) und 200ul eines jeden Versuchsantikörpers (Antikörper (I) erhalten gemäss Beispiel 1,3OK und GA-10) und 100ul Trasylol (1000 KIU) wurden 48 bis 72 Stunden bei 4 C inkubiert und das erhaltene gebundene markierte Glucagon und das freie markierte Glucagon wurden mittels dextranbeschxchteter Holzkohle getrennt und anschliessend wurde die Radioaktivität jeweils bestimmt.
Das Verhältnis (B/T) von gebundenem markiertem Glucagon (B) zu gesamtem markierten Glucagon (T), wobei kein Standardglucagon zum System zugegeben wurde, wurde als 100 % bezeichnet und das Bindungsverhältnis (%) bei jeder Konzentration wurde gemessen.
Die erzielten Ergebnisse sind in den Fig. 7 bis 9 angegeben. In
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den Fig. 7 bis 9 bezeichnet die Ordinate das Bindungsverhältnis (B/BO x 100) und die Abszisse die Konzentration an Pancreasglucagon (ng/ial) und den Grad der Verdünnung von gut-GLI's. Die Buchstabden (a), (b) und (c) bezeichnen Standardpancreasglucagon, Hunde-gut-GLI bzw. Schweine-gut-GLI. Die Beziehung zwischen der Konzentration von Pancreasglucagon und dem Verdünnungsgrad wurde wie in Fig. 6 gezeigt festgehalten. Das heisst, dass unter Verwendung des Antikörpers GA-TO der in gleicher Weise hergestellt wurde wie gemäss Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass sirupöse Glucagonfibrile anstelle von GCTR-1 verwendet wurden, die Konzentration von Pancreasglucagon und der Verdünnungsgrad von GLI so bestimmt wurden, dass beide Verdünnungskurven miteinander überlappten.
Die so festgestellte Beziehung zwischen der Konzentration von Pancreasglucagon und dem Verdünnungsgrad von GLI wird auch in den Fig. 8 und 9 gezeigt.
Aus den in Fig. 8 erkennbaren Ergebnissen sieht man, dass Antikörper (I) eine Iinmunoreaktivität mit Pancreasglucagon aufwies, die deutlich unterscheidbar ist von der Reaktivität mit gut-GLI. Daraus folgt, dass Antikörper (I) gemäss der Erfindung eine niedrige Kreuzreaktivität aufweist und Hochspezifisch gegenüber Pancreasglucagon ist. Aus den Ergebnissen der Fig. 9 ist ersichtlich, dass 3O K eine Reaktivität mit Pancreasglucagon aufwies, die deutlich unterscheidbar ist von der Reaktivität mit gut-GLI. Daher hat 30 K eine niedrige Kreuzreaktivität mit gut-GLI und ist hochspezifisch gegenüber Pancreasglucagon.
Wenn andererseits ein nicht-spezifischer Antikörper verwendet
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wird, dann nähert sich die Reaktivität mit Pancreasglucagon der Reaktivität mit gut-GLI, so dass die Kurven, welche Pancreasglucagon betreffen und welche gut-GLI betreffen, miteinander überlappen. Aus den in den Fig. 8 und 9 ersichtlichen Ergebnissen ergibt sich, dass Antikörper (I) gemäss der Erfindung und der bekannte Antikörper 30 K annähernd das gleiche Spezifitätsniveau gegenüber Pancreasglucagon aufweisen.
Beispiel 5
Die Kreuzreaktivität der verschiedenen Peptidhormone der Tabelle 1 wurden mit der von Standardpancreasglucagon unter Verwendung des Antikörpers (I) nach dem Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben wurde, verglichen. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. In der nachfolgenden Tabelle 1 wurde die Kreuzreaktivität, die für Standardpancreasglucagon gemessen wurde, mit 100 % bezeichnet und das Verhältnis der beobachteten Werte für andere Peptidhormone zu dem des Standardpancreasglucagons wurde gemessen.
- 26 -
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Tabelle 1
KREUZREAKTIVITÄT VON ANTISERA, DIE SPEZIFISCH GEGENÜBER PANCREASGLUCAGON SIND IM VERGLEICH ZU ANDEREN PEPTIDHORMONEN
Probe
Kreuzreaktivität (%)
Standardpancreasglucagon Hund-gut-GLI
Schweineinsulin ** Schweinesecretin * Schweine-CCK-PZ ** menschliches Gastrin* Schweine VIP * Schweinemotilin* Schweinesomatostatin* Schweine-LH-RH * Schweinesubstanz-P* S chwe ineneuro tens ion *
100
0,64 <0,01 <O,O1 ^0,01 <·' 0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01
Anmerkung;
* : synthetische Peptide
** : Extrakte
CCK-PZ = Cholecystokinin-pancreozymin VIP = vasoaktives Intestinalpeptid LH-RH = luteinbildendes Hormon-abgebendes Hormon
Aus dem Ergebnis der obigen Tabelle 1 ist ersichtlich, dass der Antikörper (I) gemäss der Erfindung eine sehr niedrige
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Kreuzreaktivität mit anderen Peptidhormonen, beispielsweise Insulin, Somatostatin, Gastrin, Secretin, CCK-PZ, VIP, LH-BH, Motilin und dergleichen aufwies. Obwohl Pancreasglucagon zu der Secretinfamilie vom strukturellen Gesichtspunkt gesehen, gehört, zeigt der Antikörper gemäss der Erfindung praktisch keine Kreuzreaktivität mit Secretin, VIP und dergleichen und deshalb ist der erfindungsgemässe Antikörper im wesentlichen nicht-reaktiv mit anderen ähnlichen Peptidhormonen.
Beispiel 6
30 männliche Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 4 kg wurden mit GCTR-1 in gleicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben immunisiert, wobei man die Antikörper (III) bis (XXVI) erhielt. Es wurde die Spezifität dieser Antikörper gegenüber Pancreasglucagon in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt, mit der Ausnahme, dass bei den Vergleichsproben Hunde-gut-GLI verwendet wurde.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. In der Tabelle 2 wurde das Pancreasglucagonäquivalent, das erhalten wurde durch Messung von Hunde-gut-GLI mit GA-10 als 100 % definiert und die durch Messung von Hunde-gut-GLI mit den Antikörpern erhaltenen Werte und die Prozentsätze dieser Werte werden in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle 2
UNTERSCHIED DER IRG* WERTE VON KOMBINIERTEM HUNDE-GUT-EXTRAKT GEMESSEN JEWEILS MIT ANTIGLUCAGON-KANINCHENSERUM
Antiserum Hunde-gut-GLI Antiserum 1nn
(ng/ml PG äqui- GA-10 x IUU
valent) (%)
GA-1O 44,0 10O7O
30 K 0,29 0,64 Antikörper
III 0,36 0,82
IV 0,48 1,09
V 0,66 1,50
VI 0,29 0,64
VII 0,26 0,59
VIII 0,37 0,84
IX 0,25 0,57
X 0,32 0,72 XII O,21 0,48
XII 0,61 1,39
XIII O,43 0,98
XIV 0,27 0,61
XV 0,53 1,2
XVI 0,36 0,82
XVII 0,11 0,25
XVIII 0,13 0,30
XIX 0,39 0,89
XX 0,46 1,05
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Fortsetzung Tabelle 2
XXI O,33 0,75
XXII 0,23 O,52
XXIII 0,14 0,32
XXIV 0,17 0,39
XXV 0,28 0,64
XXVI 0,62 1,41
IRG* : Immunoreaktives Glucagon
Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die Antikörper III bis XXVI gemäss der Erfindung alle gegenüber Pancreasglucägon eine Spezifität aufweisen, die gleich oder besser als die von 30 K ist. Daraus folgt, dass nach dem Verfahren der Erfindung Antikörper erhalten werden in guter Reproduzierbarkeit, die gegenüber Pancreasglucägon nicht weniger spezifisch sind als 30 K, welches als das best bekannte Mittel hinsichtlich der Spezifität gegenüber Pancreasglucägon gilt.
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3ο
Leerse ite

Claims (12)

PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) ■ DIPL-ING.W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN ■ DlPL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-BOOO MDNCHEN 81 ■ TELEFON 1089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE) 30 278 o/wa OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD.,, TOKYO / JAPAN Verfahren zur Herstellung von Antigenen und Antikörpern PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines Antigens aus einem Peptid-Protein-Komplex, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Peptid der allgemeinen Formel (I)
NH2 NH2 NH2
III
H-(arg)m-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asp-Thr (I)
worin m O oder 1 bedeutet, als Hapten mit einem Protein als Träger in Gegenwart eines Dialdehyds der allgemeinen Formel (II)
OHC-(CH2)n-CHO (II)
worin η eine ganze Zahl von 1 bis 5 bedeutet, umsetzt.
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ORIGINAL INSPECTED
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass m O ist-
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass m 1 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der Proteinträger ein Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, menschliches Serumalbumin, Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Kaninchenserumglobulin oder menschliches Serumglobulin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der Dialdehyd Malonsäurealdehyd, Bernsteinsäurealdehyd, Glutarsäurealdehyd oder Adipinsäurealdehyd ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzung des Peptids der allgemeinen Formel (I) mit dem Protein als Träger in Gegenwart des Dialdehyds der allgemeinen Formel (II) in wässriger Lösung oder in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von 7 bis etwa 10 bei einer Temperatur von etwa O bis etwa 4O°C durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass der pH der wässrigen Lösung und der Pufferlösung 8 bis 9 beträgt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis des
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Proteins als Träger zu dem Peptid der allgemeinen Formel (I) im Bereich von 2:1 bis etwa 6:1 liegt und das Molverhältnis des Dialdehyds der allgemeinen Formel (II) zum Peptid der allgemeinen Formel (I) im Bereich von 5:1 bis etwa 10:1 liegt.
9. Verfahren zur Herstellung eines Pancreasglucagon-spezifischen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antigen gemäss Anspruch 1 einem Säugetier verabreicht unter Ausbildung eines Antikörpers und den erhaltenen Pancreasglucagon-spezifischen Antikörper gewinnt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass das Antigen in einer Menge von etwa O,5 bis etwa 2 mg pro Verabreichung verabreicht und die Verabreichung alle 2 Wochen während etwa 2 bis 10 Monaten wiederholt.
11. Pancreasglucagon-spezifischer Antikörper, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 9.
12. Antigen, erhalten nach Ansprüchen 1 bis 8.
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