DK157340B

DK157340B - Fremgangsmaade til fremstilling af et pancreatisk glucagonspecifikt antistof

Info

Publication number: DK157340B
Application number: DK059778AA
Authority: DK
Inventors: Tomoyoshi Nishino
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1977-02-10
Filing date: 1978-02-09
Publication date: 1989-12-18
Also published as: BE863810A; GB1580582A; DE2805663A1; FR2380296A1; DE2805663B2; FR2380296B1; DK59778A; JPS5399320A; DK157340C; US4272433A; JPS5836308B2; SE7801545L; DE2805663C3; SE427931B; US4221777A

Description

1 DK 157340 B

Opfindelsen angâr en fremgangsmâde til fremstilling af et pancreatisk glucagonspecifikt antistof under anvendelse af antigener.

Et antigen er en forbindelse, der stimulerer en levende organisme til at fremstille et specifikt antistof og reagerer specifikt hermed. Det vil sige, at et antigen er en forbindelse, der er i besiddelse af en antigen virkning, der er i stand til at danne et antistof in vivo,og en iramunoreaktiv virkning, der er i stand til at reagere med antistoffet in vitro. Repræsentative eksempler pâ antigener er artsfremmede proteiner som f.eks. bakterier, virus, forskellige toxiner o.s.v. Pâ den anden side er et antistof en for- 2

DK 157340 B

bindelse, der er fremstillet i en levende organisme, f.eks. pattedyr osv., pâ grund af en antigenstimulering, og som er til stede især i blodserum, specielt i γ-globulinfraktionen i blodseruminet. Anti-stoffer kan reagere med antigener in vitro eller in vivo.

Antigener har pâ deres overflade en eller flere déterminante grupper, der kan reagere med antistoffer, og antistoffer har pâ deres overflade en eller flere reaktionsdygtige grupper, der kan kombineres med den/de déterminante gruppe(r). Disse to forbindelser har en komplementær rumlig opbygning - over for hinanden, af Ehrlich kaldet et "n0gle og n0glehulsforhold", hvilket tilskrives spécificité ten mellem antigener og antistoffer.

De fleste af de naturligt forekommende antigener antages pâ overfladen at hâve en mosaik af forskellige déterminante grupper, og specifikke antistoffer antages at være fremstillet svarende til de respektive determinanter.

Antigen-antistof-reaktionen, der sker mellem antigener, der har falles déterminante grupper, og de tilsvarende antistoffer be-nævnes en "krydsreaktion" eller "gruppereaktion".

En antigen-antistof-reaktion omfatter et f0rste trin, i hvil-ket antigenet forbinder sig med et tilsvarende antistof i en meget kort tid (f.eks. 20 sekunder) , selv ved lave temperaturer, f.eks. 0°C,under dannelse af et konjugat, og et andet trin, i hvilket de sâledes opnâede konjugater forener sig med hinanden for at for-ârsage agglutination, der kan observeres visuelt.

Et karakteristisk træk ved en antigen-antistof-reaktion er den h0je specificitet, og en sâdan reaktion er i vid udstrækning blevet benyttet ved diagnosen af forskellige sygdomme.

Bestemmelsen af hormoner er sædvanligvis blevet ud£0rt under anvendelse af en immunoreaktion, dvs. en antigen-antistof-reaktion, sâledes som det er velkendt inden for teknikken.

Pancreas-glucagon er en af de fysiologiske pancreashormoner, def spiller en vigtig rolle ved optagelsen og nedbrydningen af sukker-arter, og som har f0lgende aminosyresekvens 3

DK 157340 B

nh2

His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 nh2 nh2 nh2 ' « i

Ser-Arg-Arg-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Glu-Try-Leu-Met-Asp-Thr 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Kvantitativ bestemmelse af pancreas-glucagon har for nylig tiltrukket sig megen opmærksomhed inden for omrâderne diagnose# pathologi og lignende, da bestemmelse af pancreas-glucagonets niveau i blodet g0r det muligt at diagnosticere forskellige sygdomme eller pathologiske tilstande, f.eks. diabètes osv.

Den almindelige fremgangsmâde til at bestemme pancreas-glucagon er blevet udf0rt under anvendelse af en radioimmunofors0gs-metode (i det efterf0lgende omtalt som RIA-metoden), ved hvilken antistoffer,opnâet under anvendelse af pancreas-glucagon som sâdan eller antigener, der indeholder pancreas-glucagon som et hapten, anvendes. Denne RIA-metode er til en vis grad anvendelig (se Unger et al.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102, 621 (1959)).

Efterhânden som unders0gelser inden for denne teknik skri-der frem, er tilstedeværelsen af glucagonlignende forbindelser, der immunologisk opf0rer sig pâ samme mâde som pancreas-glucagon, blevet opdaget i ford0jelseskanalen eller tarmene hos pattedyr og derfor kaldet "gut-GLI" ("gut” = tarai) (se Sutherland et al.: J. Biol. Chem. 175, 663 (1964)) og Unger et al.: Metabolism, lj>, 865 (1966)), og det er ogsâ blevet opdaget, at antistofferne opnâet under anvendelse af pancreas-glucagon som sâdan eller antigener, der indeholder pancreas-glucagon som et hapten, krydsreagerer ikke alene med pancreas-glucagon men ogsâ med "gut-GLI", sâledes at de er ikke-specifikke over for pancreas-glucagon. Med andre ord, nâr man bestemmer pancreas-glucagon under anvendelse af RIA-metoden, giver de ovenfor beskrevne kendte antistoffer værdier, der omfatter vær-dier, der kan tilskrives reaktionen med "gut-GLI", hvilket re-sulterer i, at det ikke lykkes at frembringe en diagnostisk eksakt bestemmelse.

For nylig er det blevet rapporteret, at pancreatiske glucagon-specifikke antistoffer opnâedes tilfældigt under anvendelse af det samme antigen som beskrevet ovenfor (se Diabètes 17 (Suppl. 1), 321 (1968)).

4

DK 157340 B

Imidlertid berettes det ogsâ, at disse antistoffer, der kal-des "G 58" og "30 K", kun kan opnâs tilfældigt og meget sjældent (se Saishin Igaku (Newest Medicine) 30 (11) s. 1901 (1975) og Heading, L.G.: Horm. Metab. Res., 1, 87-88 (1969)). Derfor har metoden til at fremstille antistoffer under anvendelse af et anti-gen, der indeholder pancreas-glucagon soin et hapten, meget ringe reproducerbarhed og er ikke praktisk anvendelig»

Imidlertid er struktur-funktions-forholdet af glucagon blevet unders0gt (se Assan et al.: Diabètes, 21, 843 (1972)) ved at syn-tesitere forskellige peptider, der er beslægtet med glucagon, dvs. C^-til C23-brudstykker,og bestemme deres biologiske aktivitet under anvendelse af for0gelsen af blodsukkerniveauet sont en indika-tor. Yderligere blev der foretaget unders0gelser over antigene pladser i glucagonmolekylet under anvendelse af et glucagonspecifikt antistof "K 47" og et glucagon-ikke-specifikt antistof "PVP 8", hvilket f0rte til den antagelse, at der er mindst to antigene pladser i glucagonmolekylet, og at den ene af disse antigene pladser er til stede i den C-endestillede del, især C23~C29"*de^ene af glucagonmolekylet .

Fremskridtene i unders0gelserne af mekanismen af den immu-nologiske opf0rsel af glucagon eller "gut-GLI" som nævnt ovenfor har imidlertid ikke £0rt til rapporter om udviklingen af praktisk acceptable antistoffer.

Som anf0rt ovenfor er kendte antistoffer enten ikke-specifikke over for pancreas-glucagon eller kan opnâs med dârlig reproducerbarhed, sâledes at udviklingen af teknikker, der kan anvendes til at fremstille antistoffer med specificitet over for pancreas-glucagon i industriel mâlestok, er h0jst 0nskværdigt.

Den foreliggende opfindelse har derfor til hensigt at til-vejebringe en fremgangsmâde til fremstilling af antistoffer, der er h0jt specifikke over for pancreas-glucagon med stor reproducerbarhed, under anvendelse af antigener, der er fremstillet, sa de er velegnede til at fremstille sâdanne pancreatiske glucagonspeci-fikke antistoffer.

5

DK 157340 B

Omfattende unders0gelser er blevet foretaget for at opnâ en metode til fremstilling af antistoffer, der kan anvendes til at bestemme pancreas-glucagon under anvendelse af RIA-metoden, og som er tilstrækkelig reproducerbar til at bestemme antistoffer, der er h0jt specifikke over for pancreas-glucagon i industriel mâlestok. Under unders0gelserne har det vist sig, at den antigene virkning over for porcint pancreas-glucagon, der har en aminosyre-sekvens, der er fuldstændig lig med det humane glucagon, er til stede i C18 til C29-eller C19 til C^-aminosyresekvensen.

Pâ grund af disse fund blev foretaget yderligere omfattende unders0gelser for at fremstille antigener, der indeholdt de ovenfor beskrevne peptider som et hapten, og antistoffer, der var h0jt specifikke over for pancreas-glucagon, under anvendelse af sâdanne antigener.

Formâlet msd opfindelsen opnâs ved en fremgangsmâde, der er ejendommelig ved, at man til et pattedyr indgiver et peptid-protein-kompleks med den almene formel I

nh2 nh2 nh2

I I I

H-(Arg)m-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asp-Thr I

hvori m betegner 0 eller 1, som et hapten, med et protein som et bærestof i naerværelse af et dialdehyd betegnet med den almene formel II

OHC-(CH-) -CHO II

δ n hvori n betegner et helt tal pâ 1 til 5.

Foretrukne udforelsesformer af fremgangsmâden ifolge opfindelsen beskrives i underkravene.

Pâ tegningen viser

Fig. 1 og 2 henholdsvis molekylvægtfordelingen og UV-absorptionsspektret af forbindelsen opnâet i det efterfolgende eksempel 2,

Fig. 3 og 4 henholdsvis molekylvægtfordelingen og UV-absorp-tionsspektret af forbindelsen opnâet i det efterfolgende eksempel 2,

Fig. 5 en kurve, der repræsenterer den immunoreaktive virkning af antistoffet opnâet i eksempel 3, 6

DK 157340 B

Fig. 6 en kurva, der repræsenterer specificiteten af de omhandlede antistoffer,

Fig. 7 en karve over bindingsforholdet (i %) af "GA-10" med standard-glucagon, hunde-tarm-GûI og svine-tarm-GLI ved hver koncantration og fortynding,

Fig. 8 en kurva ovar bindingsforholdet (%) af antistof (I) med standard-glucagon, hunde-tarm-GLI og svine-tarm-GLI ved hver koncantration og fortynding, og fig. 9 en kurva ovar bindingsforholdet (%) af antistof "30 K" med standard-glucagon, hunde-tarm-GLI og svine-tarm-GLI ved hver koncentration og fortynding.

Standardforkortelserne for aminosyreresterne er den af IUPAC antagne aminosyre-nomenklatur og anvendes i den forelig-gende beskrivelse med krav for at angive de peptider, der anvendes soin et hapten ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen.

Anvendelsen af peptider betegnet med formlen I som et hapten er uundværlig ved den omhandlede fremgangsmade. Peptiderne betegnet med den almene formel I, dvs. det peptid, hvor m betegner 1 (her-efter omtalt som "GCTR-1" i forkortelse), svarer til C^g-C2g-gruppen af svine-pancreas-glucagon, og peptidet, hvor m betegner 0 (i det f0lgende omtalt som ,,GCTR-2") svarer til C-^-^g-delen af svine-pancreas-glucagon. Begge disse peptider er velkendte forbindelser (W.W. Bromer, A. Staub et al.: "The Amino Acid Sequence of Glucagon", Journal of the American Chemical Society, June 5, 1957).

Ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen kan "GCTR-l" og "GCTR-2'1 anvendes individuelt eller som en blanding.

Dialdehyderne betegnet med den almene formel II tjener som et forbindelsesled, der forbinder hapten og proteinet.

Velegnede eksempler pâ dialdehyder betegnet med den almene formel II, der kan anvendes ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, omfatter malonsyrealdehyd, ravsyrealdehyd, glutarsyrealdehyd, adi-pinsyrealdehyd osv.

Et vilkârligt protein, der sædvanligvis anvendes til frem-stilling af antigener, kan ogsâ anvendes som bærestof ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen.

7

DK 157340 B

Repræsentative eksempler pâ sâdanne proteiner, der er vel-egnet soin bærestoffer, omfatter serumalbumin fra heste, serumalbumir fra kvæg, serumalbumin fra kaniner, humant serumalbumin, serumglo-bulin fra heste, serumglobulin fra kvæg, serumglobulin fra kaniner, humant serumglobulin osv.

Det omhandlede antigen kan opnâs ved at omsætte haptenet be- \ tegnet med formlen I med et protein i nærværelse af et dialdehyd betegnet med den almene formel II i en vandig opl0sning eller en vandig EUfferopl0sning ved en pH-værdi pâ ca. 7 til ca. 10, for-trinsvis 8 til 9, ved en temperatur pâ ca. 0° til ca. 40°C, for-trinsvis nær stuetemperatur (20 til 25°C) i ca. 1 til 24 timer.

Velegnede eksempler pâ anvendelige pufferoplosninger omfatter en 0,2N natriumhydroxid-0,2M borsyre-0,2M kaliumchlorid-pufferopl0sning, en 0,2M natriumcarbonat-0,2M borsyre-0,2M kalium-chlorid-pufferopl0sning, en 0,05M natriumtetraborat-0,2M borsyre-0,05M natriumchloridpufferopl0sning, en 0,1M kaliumdihydrogenphos-phat-0,05M natriumtetraborat-pufferopl0sning osv.

Mængden af hapten, dialdehyd og bærestof anvendt ved frem-gangsmâden if0lge opfindelsen varierer afhængig af betingelserne. Imidlertid er et almindeligt anvendt vægtforhold af bærestof til hapten pâ ca. 2:1 til ca. 6:1, fortrinsvis 3:1 til 5:1, og et almindeligt anvendt molært forhold af dialdehyd til hapten er ca. 5:1 til ca. 10:1.

Efter at omsætningen er afsluttet, kan de sâledes opnâede antigener isoleres og let renses under anvendelse af sædvanlige fremgangsmâder, f.eks. dialyse, gelfiltrering, fraktioneret ud-fældning osv. De omhandlede antigener kan opbevares f.eks. ved lyophilisering.

De omhandlede antigener indeholder gennemsnitlig 5 til 15 mol peptid pr. mol anvendt protein.

Antigenst eller antigenerne fremstillet sâledes som beskre-vet ovenfor kan anvendes som udgangsmateriale til fremstilling ifolge opfindelsen af antistoffer, der er hojt specifikke over for pancreas-glucagon. Antigener indeholdende 9 til 12 mol peptid pr. mol protein foretrækkes, de de er i stand til at tilvejebringe antistoffer med en storre virkning.

8

DK 157340 B

Til fremstilling ifolge opfindelsen af antistoffer admini-strares antigenerne til pattedyr, idet man anvender en almindelig fremgangsmâde (sa Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 347 (1968)), og hsrefter opsamles de i dan levende organisme dannede antistoffer.

Pattedyr, der kan anvendes ved fremgangsmâden if0lge opfin-delsen til fremstilling af antistoffer, er ikke specielt begrænset, og kvæg og okser, svin, heste, kaniner, marsvin osv. kan anvendes, idet kaniner og marsvin foretrækkes, fordi er lette at hâve med at g0re.

Nâr man skal fremstille antistoffer, fortyndes en forudbe-stemt mængde af antigen med fysiologisk saltvandsopl0sning til en forudbestemt koncentration f.eks. 0,5 til 2 mg/ml. Herefter blandes denne opl0sning med Freund's komplette adjuvans til fremstilling af en dispersion, der herefter administreres til pattedyret. F.eks. administreres den ovenfor beskrevne dispersion intradermalt til en kanin i en dosis pâ ca. 0,5 til ca. 2 mg antigen pâ en gang. Herefter kan i en dosis pâ 0,5 til 2 mg administreringen gentages én gang hveranden uge i 2 til 10 mâneder, fortrinsvis 4 til 6 mâne-der.

Opsainling af antistoffer kan udf0res ved at afbl0de det immu-niserede dyr, nâr en stor mængde antistof er dannet efter den sidste administrering af dispersionen indeholdende antigenet, sædvanligvis 1 til 2 uger efter sidste administrering, hvorefter man centrifuge-rer det sâledes opnâede blod for at fraskille antiserum (antistof).

Ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen er det muligt konstant at tilvejebringe antistoffer, der har glimrende specificitet over for pancreas-glucagon pâ grund af ensartetheden af det anvendte antigen.

De omhandlede antistoffer har glimrende specificitet over for humant pancreas-glucagon, sâledes som beskrevet ovenfor# og er værdifulde ved bestemmelsen af humant pancreas-glucagon under an-vendelsen af RIA-metoden med stor n0jagtighed.

Opfindelsen beskrives nærmere i de f0lgende eksempler. Μβςΐ-mindre andet er angivet,er aile dele procenter,forhold og lignende udtrykt i vægt. Eksemplerne 1 og 2 angir fremstilling af et peptid-proteinkompleks til anvendelse ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen. De er folgelig mærket (M).

9 DK 157340 B

Eksempel 1 (M) I 0,2 ml af en 0,2N vandig kaliumhydroxidoplosning oplostes 6 mg GCTR-1 ved stuetemperatur. Til blandingen sattes 1 ml 0,2N natriumhydroxid-O,2M borsyre-0,2M kaliumchlorid-pufferoplesning pâ pH 9,0 (i det efterfolgende blot forkortet til "pufferoplos-ning") og 1 ml af pufferoplesningen, i hvilken der var oplest 20 mg kvægserumalbumin (i det efterfolgende omtalt som "BSA"), og 1 ml 0,05M glutaraldahydoplo.-sning tilsattes drâbevis. Reaktions-blandingen, der ialt var pâ ca. 3 ml, reagerede under omroring ved stuetemperatur i 24 timer.

Af det sâledes opnàade produkt udtoges en 0,5 ml prove, og 0,5 ml af en 2% natriumdodecylsulfatoplosning (i det efterfalgende omtalt serumalbumin (i det efterf0lgende omtalt som "BSA"), og 1 ml 0,05M glutaraldehydopl0sning tilsattes drâbevis. Reaktionsblandingen, der ialt var pâ ca. 3 ml, reagerede under omr0ring ved stuetemperatur i 24 timer.

Af det sâledes opnâede produkt udtoges en 0,5 ml pr0ve, og 0,5 ml af en 2% natrium-dodecylsulfat (i det efterf0lgende omtalt som "SDS") sattes til. Efter opvarmning af denne blanding til 100°C for at opl0se det dannede bundfald efterfulgt af k0ling, underkaste-des blandingen gelfiltrering under anvendelse af "Sephadex" G-75 bragt i ligevægt med 1% SDS-opl0sning for at unders0ge molekylvægt-fordelingen af produktet. Gelfiltreringen udf0rtes under f0lgende betingelser:

Unders0gelse: Optisk tæthed ved 280 nm (OD280^

Anvendt s0jle: 1 x 40 cm

Elueringshastighed: 3 ml/time

Elueringsopl0sning: 1% SDS-opl0sning indeholdende 0,5M NaCl

De opnâede resultater er vist i fig. 1.

I fig. 1 betegner ordinaten den optiske tæthed, og abscissen betegner fraktionsnummeret. Mængden af hver fraktion var 1 ml.

Af resultaterne i fig. 1 kan det ses, at reaktionsproduktet udviste to distinkte toppe ved fraktion nr. 14 til 17 (fraktion I) og fraktion nr. 18 til 21 (fraktion II). Fraktion I havde en mole-kylvægt pâ ca. 75.000 eller mere, hvilket er h0jere end molekylvæg-ten af motilin (ca. 2.700), og fraktion II havde en molekylvægt lig med molekylvægten af motilin. Begge fraktioner I og II havde en molekylvægt meget h0iere end molekylvægten af GCTR-l (ca. 1.000).

10

DK 157340 B

Yderligere opl0stes fraktionerne I og II under opvarmning i en 2% SDS-opl0sning i en koncentration pâ 0,5 mg/ml.

Efter afk0ling anbragtes hver opl0sning i en celle af 1 cm's længde, og UV-abscrptionen ved en bolgslængde i cmràdet 240 til 300 nm under-s0gtes. De opnâede resultater er vist i fig. 2.

I fig. 2 betegner ordinaten den optiske tæthed, og abscissen betegner b0lgelængden (nm). Numrene 1 og 2 betegner absorptions-m0nstrene af henholdsvis fraktion I og II. Numrene 3 og 4 betegner absorptionsm0nstrene af BSA og GCTR-1 malt med samme betingel-ser som i tilfældet med fraktion I og II.

Resultaterne i fig. 2 viser, at fraktion I (kurve 1) udviser et absorptionsm0nster, der er forskelligt fra absorptionsm0nstrene af BSA og GCTR-1. Nâr man tager resultaterne af molvægtforde-lingen afbildet i fig. 1 i betragtning, fandtes fraktion I at svare til peptid-proteinet (dvs. GCTR-l-BSA)-komplekset. Pâ den anden side viste fraktion II (kurve 2) et absorptionsm0nster med samme tendens som GCTR-1 (kurve 4) . Ud fra resultaterne afbildet i fig. 1 fandtes fraktion II at svare til en dimer af GCTR-1 'dannet ved glutaraldehydbehandling heraf.

En anden pr0ve af produktet (ca. 2,5 ml) underkastedes pâ samme made gelfiltrering, og fraktionerne svarende til fraktion I opsamledes og dialyseredes med 0,6% natriumchloridopl0sning ved 4°C i 24 timer efterfulgt af lyophilisering, hvorved man opnâede et hvidt pulver af GCTR-l-BSA-kompleks i en mængde pâ 17,3 mg. Det sâledes opnâede kompleks, var et kompleks bestâende af 1 mol BSA med i gennemsnit 11 mol GCTR-1 koblet hertil. Bindingsforholdet (%) opnâedes pâ f0lgende mâde.

F0rst fremstilledes en standardkurve for koncentrationen af GCTR-1 i forhold til UV-absorptionen ud fra den kendsgerning, at fig. 1 ikke viste tilstedeværelsen af uomsat BSA, og mængden af fraktion II udregnedes fra denne standardkurve. Herefter blev mængden af fraktion II fratrukket mængden af GCTR-1 oprindelig sat til. Den resulterende mængde GCTR-1 antoges at svare til mængden af GCTR-1 koblet til BSA.

11

DK 157340 B

Eksempel 2 (M)

Man gentog de samme fremgangsmâder sorti beskrevet i eksempel 1, bortset fra at 6 mg GCTR-2 anvendtes 1 stedet for GCTR-1. Det sâledes opnâede produkt underkastedes gelfiltrering under de samme betingelser som beskrevet i eksempel 1/ og molekylvægtfordelingen og UV-absorptionen mâltes som i eksempel 1.

De opnâede resultater er vist i fig. 3 og 4.

Af resultaterne vist i fig. 3 kan det ses# at reaktionspro-duktet udviser to distinkte toppe (fraktion 1' og fraktion II') svarende til resultaterne fra eksempel 1. Fraktionerne 1' og 11' fanâtes at svare til GCTR-2-BSA-kompleks og en dimer af GCTR-2, idet de begge havde næsten samme molekylvægt som fraktion I og fraktion II '.

Fraktion 1' dialyseredes og lyophiliseredes pâ samme mâde som i eksempel 1, hvorved der opnâedes et hvidt pulver af GCTR-2-BSA-kompleks i en mængde pâ 17,8 mg. Det sâledes opnâede kompleks indeholdt i gennemsnit 10 mol GCTR-2 pr, mol BSA.

Eksempel 3 7 mg af hvert af antigenerne, dvs. komplekserne fremstillet i eksempel 1 og 2 , opl0stes i 1,8 ml fysiologisk saltvandsopl0s-ning, og 2,7 ml af Freund's komplette adjuvans sattes hertil under dannelse af en dispersion. Den sâledes opnâede dispersion admini-streredes intradermalt ved injektion i kaniner i en dosis pâ 1 ml pr. kanin. Efter 2 ugers for10b administreredes andre 1 ml af dispersionen til hver kanin. Herefter administreredes en frisk fremstillet dispersion af 3 mg antigen, 3 ml fysiologisk saltvands-opl0sning og 3 ml af Freund's komplette adjuvans intradermalt med 2 ugers interval i 3¾ mâned for at immunisere hvert fors0gs-dyr. Ti dage efter den sidste administrering af dispersionen af-bl0dtes hvert dyr, og det sâledes opnâede blod centrifugeredes for at fraskille antiserum, det omhandlede antistof.

Den sâledes opnâede antistof's aktivitet blev malt pâ f0l-gende mâde.

Antistofs-aktivitetsbestemmelse

Hvert af antistofferne, dvs. antistof I fremstillet under anvendelse af antigenet opnâet i eksempel 1, og antistof II frem- 12

DK 157340 B

stillet under anvendelse af antigenet opnâet if0lge eksempel 2, fortyndedes f0rst med fysiologisk saltvandsopl0sning til koncentra- tionerne ίο"1, 1θ“2, 1θ“3, 1θ“4 og l(f5. Til 100 yl af hver for- 125 tyndet opl0sning sattes 100 yl I-glucagon og 300 yl af en 0,5M phosphatbuffer pâ pH 7,5 (indeholdende 0,5 vægt% BSA, 0,1 vægt% NaN^ og 0,14M NaCl), og blandingen inkuberedes ved 4°C i 48 125 timer. Det resulterende kompleks af I-glucagon og antiserum 125 skiltes fra uomsat eller frit I-glucagon under anvendelse af "Dextran"-overtrukket carbon og centrifugering ved 4°C med en hastighed pâ 3000 omdrejninger pr. minut i 15 minutter. Radioaktivi- teten af det sâledes opnâede produkt mâltes for at bestemme bindings- 125 forholdet (%) af I-glucagon og antiserum ved hver koncentration. De opnâede resultater er vist i fig. 5. I fig. 5 repræsen- 125 terer ordinaten bindingsforholdet (%) af I-glucagon og antiserum, og abscissen repræsenterer begyndelsesfortyndingen af det antiserum, der skal unders0ges. Numrene 1 og 2 betegner antistof I og anti-stof II.

Ifolge resultaterne vist i fig. 5 var graden af fortynding af antiserum, ved hvilken bindingsforholdet (%) af antiserum og

12 S

I-glucagon er 50%, dvs. aktiviteten (ID5q) antistof, f0lgende:

Antistof Aktivitet (ID^q) I ca. 50.000 II ca. 25.000 fancreas-glucagon-specificitetsbestemmelse

Denne bestemmelse udf0rtes ud fra det princip, at forholdet mellem mærket glucagon bundet til et glucagon-antistof og umærket glucagon bundet til glucagon-antistoffet er identisk med forholdet mellem koncentrationen af mærket glucagon og koncentrationen af 13

DK 157340 B

umærket glucagon i opl0sningen, og nâr koncentrationen af mærket glucagon fikseres, sâ aftager mængden af bundet mærket glucagon (B) medens mængden af fri mærket glucagon (F) for0ges, nâr koncentrationen af umærket glucagon (det glucagon, der skal mâles) for0ges. Pancreas-glucagon (standard-glucagon, koncentration: 10 pg/ml til 100 ng/ml), tarm-GLI fra hunde (fortynding: 1/9 til 1/2187) og tarm-GLI fra svin (fortynding: 1/9 til 1/2187) anvendtes som for- s0gspr0ver, og X-glucagon (10.000 cpm) anvendtes som mærket glucagon.

200 yl af den ovenfor nævnte glucagonpr0ve, 200 yl

1 O C

I-glucagon og 200 yl antiâtof I opnâet som i eksempel 3 (aktivi-tet ca. 50.000) og 100 yl "Trasylol" (fabrikeret af Bayer AG, 1,000 KIU) blandedes med hinanden og inkuberedes ved 4°C i 48 til 72 timer. Den sâledes behandlede blanding adskiltes i bundet mærket glucagon (B) og frit mærket glucagon (F), idet man anvendte "Dex-tran"-belagt carbon (se M. Boyns, L. Vanhaelst og J. Goldstein; Horm. Metab. Res., 3, 409 (1971)), efterfulgt af mâling af radio-aktiviteten. Bindingsforholdet (Bo) svarende til aktiviteten af det anvendte antistof I defineredes som 100%, og procenten af bundet mærket glucagon (B) af pr0verne ved hver koncentration og graden af fortynding udregnedes herfra.

De opnâede resultater er vist i fig. 6. I fig. 6 betegner ordinaten bindingsforholdet (%) (B/Bo x 100), og abscissen betegner koncentrationen af pancreas-glucagon (ng/ml) og graden af fortynding af GLI. I fig. 6 betegner bogstavet a pancreas-glucagon og bogstaverne b og c henholdsvis hunde-tarm-GLI og svine-tarm-GLI.

Af résultaterne vist i fig. 6 kan det ses, at det omhandlede antistof viser en kurve, der svarer til reaktionsevnen med pancreas-glucagon, der er klart skelnelig fra de kurver, der betegner reaktionsevnen med hunde- og svine-tarm-GLI. Af dette fremgâr, at det omhandlede antistof ikke krydsreagerer med GLI, og at det udviser glimrende specificetet over for pancreas-glucagon.

Hvis derimod et antistof, der har lav specificitet over for pancreas-glucagon, anvendes, overlapper kurverne, der betegner reaktionsevnen med hunde- og svine-tarm-GLI,den kurve,der représenterez reaktionsevnen med pancreas-glucagon, og reaktionsevnen med disse 14

DK 157340 B

GLI-stoffer er inkluderet i reaktionsevnen med pancreas-glucagon, hvilket f0rer til ukorrekt bestemmelse af pancreas-glucagonets niveau.

Eksempel 4

Denne bed0mmelse udf0rtes ud fra princippet fra RIA-metoden, i hvilken mærket glucagon og umærket glucagon i konkurrence med hinanden omsættes med en forudbestemt mængde af glucagon-antistof i antigen-antistof-reaktionen.

Standard-pancreas-glucagon (kvæg- eller svine-pancreas-glucagon; koncentration: 10 pg til 100 ng/ml) og hunde- og svine-tarm- GLI (fortynding: 1/9 til 1/2187) anvendtes som fors0gspr0ver.

125

En blanding af 200 yl af hver fors0gspr0ve, 200 yl I-glucagon- opl0sning (indeholdende 15 pg I-glucagon; 10.000 cpm) og 200 yl af hver fors0gsantistof (antistof I fremstillet ud fra eksempel 1, 30 K og GA-10), og 100 yl "Trasylol" (1.000 KIü) inkuberedes ved 4°C i 48 til 72 timer, og det resulterende bundne mærkede glucagon og frit mærkede glucagon adskiltes under anvendelse af "Dextran"-overtrukket carbon, hvorefter man mâlte radioaktiviteten heraf ved tælling.

Forholdet (B/T) mellem bundet mærket glucagon (B) og totalmærket glucagon (T), nâr der ikke var tilsat nogen standard-glucagon til systemet, defineredes som 100¾, og bindingsforholdet (%) maltes ved hver koncentration.

De opnâede resultater er vist i fig. 7 til 9. I figurerne 7 til 9 repræsenterer ordinaten bindingsforholdet (B/Bo x 100), og abscissen repræsenterer koncentrationen af pancreas-glucagon (ng/ml) og fortyndingsgraden af tarm-GLI. Bogstaverne a, b og c angi-ver henholdsvis standard-pancreas-glucagon, hunde-tarm-GLI og svine-tarm-GLI. Den indbyrdes afhængighed mellem koncentrationen af pancreas-glucagon og fortyndingsgraden fastsattes som angivet i fig. 6. Dvs., at man ved at anvende antistof GA-10 fremstillet pâ samme mâde som beskrevet i eksempel 1, bortset fra at sirupagtige glucagon-fibriller anvendtes i stedet for GCTR-1, bestemte koncentrationen af pancreas-glucagon og fortyndingsgraden af GLI sâ-ledes, at begge fortyndingskurver overlappede hinanden.

15 DK 157340 B

Den indbyrdes afhængighed mellem koncentrationen af pancréas-glucagon og fortyndingsgraden af GLI opnâet pâ denne mâde er ogsâ vist i figurerne 8 og 9.

Af resultaterne vist i fig. 8 kan det ses, at antistof I udviser en immunoreaktionsevne med pancreas-glucagon, der klart kan skelnes fra reaktionsevnen med tarm-GLI. Heraf f0lger, at det omhandlede antistof I har lav kryds-reaktionsevne og er h0jt spe-cifikt over for pancreas-glucagon. Af resultaterne vist i fig. 9 kan det ses, at 30 K viste en reaktionsevne med pancreas-glucagon, der klart kan skelnes fra reaktionsevnen med tarm-GLI. 30 K har derfor lav kryds-reaktionsevne med tarm-GLI og er h0jt .specifikt over for pancreas-glucagon.

Hvis derimod et ikke-specifikt antistof anvendes, nærmer reaktionsevnen med pancreas-glucagon sig reaktionsevnen med tarm-GLI, sâledes at kurven, der repræsenterer pancreas-glucagon, og kurven, der repræsenterer tarm-GLI, overlapper hinanden.

Det vil fremgâ af resultaterne vist i fig. 8 og 9, at det omhandlede antistof I og det kendte antistof 30 K viser næsten samme niveau af specificitet over for pancreas-glucagon.

Eksempel 5

Kryds-reaktionsevnen af forskellige peptidhormaner angivet i tabel 1 sammenlignedes med kryds-reaktionsevnen af standard-pancreas-glucagon under anvendelse af antistof I if0lge fremgangs-mâden beskrevet i eksempel 4.

Resultaterne er vist i tabel 1.

I tabel 1 nedenfor defineres kryds-reaktionsevnen af den mâlte standard-pancreas-glucagon som 100%, og man opnâede forholdet mellem den mâlte værdi af andre peptidhormoner og standardpancreas-glucagon.

16

DK 157340 B

Tabel 1

Kryds-reaktionsevne af antisera specifikke over for pancreas-glucagon over for andre peptidhormoner

Pr0ve Krydsreaktionsevne (%)

Standard-pancreas-glucagon 100

Hunde-tarm-GLI 0/64

Svine-insulin <0,01

Svine-secretin x <0,01

Svine-CCK-PZ xx <0,01

Humant gastrinx <0,01

Svine-VIP x <0,01

Svine-motilin x <0,01

Svine-somatostatin <0,01

Svine-LH-RH x <0,01

Svine-forbindelse-P x <0,01

Svine-neurotension x <0,01

Note: : Syntetiske peptider XX: Ekstrakter CCK-PZ=cholecystokinin-pancreozymin VIP=vasoaktivt tarmpeptid LH-RH=luteniserende hormon-frig0rende hormon

Af de ovenfor angivne resultater i tabel 1 fremgâr det, at det omhandlede antistof I viste meget lav kryds-reaktionsevne med andre peptidhormoner, f.eks. insulin, somatostatin, gastrin, secretin, CCK-PZ, VIP, LH-RH, motilin osv. Sk0nt pancreas-glucagon h0rer til secretinfamilien set ud fra et opbygningsmæssigt synspunkt, har det omhandlede antistof i det væsentlige ingen kryds-reaktionsevne med secretin, VIP osv., hvorfor det omhandlede antistof i det væsentlige ikke har nogen reaktionsevne med andre lignende peptidhormoner.

17 DK 157340 B

Eksempel 6 30 hankaniner, der vejede 2,5 til 4 kg* immuniseredes med GCTR-1 pâ samme mâde soin beskrevet i eksempel 3 feil opnâelse af antistofferne III til XXVI. Man bestemte speeificiteten af disse antistoffer over for pancreas-glucagon pâ samme mâde som beskrevet i eksempel 3, bortset fra at hunde-tarm-GLI anvendtes som forstfgs-pr0ve.

De opnâede résultater er vist i tabel 2 nedenfor. I tabel 2 defineredes pancreas-glucagon-a&vivalenten opnâet ved mâling af hunde-tarm-GLI med GA-10 som 100%, og de opnâede værdier ved mâling af hunde-tarm-GLI med hvert antistof og procenten af disse værdier er vist i tabel 2.

Tabel 2

Forskel i IRGx-værdier af sammenslâet hunde-tarm-ekstrakt malt med hver anti-glucagon-kaninserum

Hvert antisérum

Antiserum Hunde-tarm-GLI GA-10___ (ng/ml PG ækv.) % GA-10 44,0 100,0 30-K 0,29 0,54

Antistof III 0,36 0,δ2 IV 0,48 1,B9 V 0,66 1,50 VI 0,29 0,54 VII 0,26 0,59 VIII 0,37 0,84 IX 0,25 0,57 X 0,32 0,72 XI 0,21 0,48 XII 0,61 1,3.9 XIII 0,43 0,98 XIV 0,27 0,61 18

DK 157340 B

Tabel 2 (fortsat) XV 0,53 1,2 XVI 0,36 0,82 XVII 0,11 0,25 XVIII 0,13 0,30 XIX 0,39 0,89 XX 0,46 1,05 XXI 0,33 0,75 XXII 0,23 0,52 XXIII 0,14 0,32 XXIV 0,17 0,39 XXV 0,28 0,64 XXVI 0,62 1,41 * IRG: immunoreaktivt glucagon

Af resultaterne vist ovenfor i tabel 2 fremgâr det, at de omhandlede antistoffer III til XXVI aile udviser en specifici-tet over for pancreas-glucagon, der i det vassentlige er den sanne eller bedre end 30K's evne. Heraf f01ger,at ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen opnâede man antistoffer med udmærket reproducerbarhed, der havde en specificitet over for pancreas-glucagon, der ikke var lavere end 30K’s evne, som hidtil er blevet betragtet soin den bedste med hensyn til specificitet over for pancreas-glucagon.

Claims

1. Fremgangsmâde til fremstilling af et pancreatisk gluca-gonspecifikt antistof, kendetegnet ved, at man til et pattedyr indgiver et peptid-proteinkompleks msd den almene formel I nh2 nh2 nh2 , B 0 H- ( Arg) ^-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asp-Thr I hvori m betegner 0 eller 1, som et hapten, med et protein som et bærestof i nærværelse af et dialdehyd befcegnet med den almene formel II OHC”(CH,.) “CHO II <£ n hvori n betegner et helt tal pâ 1 til 5»

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at m betegner 0.

3. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at m betegner 1.

4. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at proteinbærestoffet er hesteserumalbumin, kvægserumalbumin, kaninserumalbumin, humant serumalbtanin, hesteserumglobulin, kvsg= serumglobulin, kaninserumglobulin eller humant serumglobulin. 5o Fremgangsmâde if0lge krav 1, kend.e te gne t ved, at dialdéhydet er malonsyrealdehyd, ravsyrealdehyd, glutarsyre-aldehyd eller adipinsyrealdehyd.

6. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at man ved fremstillingen af peptid-p.roteinkomplekset omsætter pep-tider med den almene formel I med proteinet som et bærestof i nærværelse af dialdehydet med den almene formel il i en vandig oplosning eller i en vandig pufferoplosning med en pH-værdi pâ ca. 7 til ca. 10 og ved en temperatur pâ ca. 0°C til ca. 40°C.

7. Fremgangsmâde ifalge krav 6, kendetegnet ved, at den vandige opl®sning og pufferoplosningen har en pH-værdi pâ 8 til. 9.

20 DK 157340 B

8. Fremgangsmâde ifolge krav 6, kendetegnet ved, at vægtforholdet mellem proteinst som bærestof og peptidet msd den almsne formel I ligger i omrâdet fra ca. 2:1 til 6:1, og at molforholdet mellem dialdehydet med den almene formel II og pep-tidet med den almene formel I ligger i omrâdet fra ca. 5:1 til ca. 10:1.

9. Fremgangsmâde ifelge krav 1, kendetegnet ved. at antigenet administreres i en mængde pâ ca. 0,5 til ca. 2 mg antigen pr. administreringsdosis, og at administreringen gentages hver andan ugs i ca. 2 til 10 mâneder.