CN111566081B - 一种双酰胺复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双酰胺复合物及其快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法。本发明制备出的复合物能有效检测微量的有机磷和氨基甲酸酯类农药，而且使用方便、检测时间短、灵敏性高、稳定性好。故本发明可广泛应用于蔬菜、水果等农产品及环境中的微痕量有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留检测，也可用于对食品和环境安全评价、监控其有机磷和氨基甲酸酯类农药的污染情况等。

Description

一种双酰胺复合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种快速检测胆碱脂酶活性的方法，具体是涉及一种双酰胺复合物，其能够实现对有机磷和氨基甲酸酯类物质的检测。
背景技术
有机磷农药因其具有防治对象多、应用范围广、价格低等特点，已成为目前世界农药三大支柱之一，在农业稳产、高产中发挥着巨大作用。氨基甲酸酯类农药，是在有机磷酸酯之后发展起来的合成农药，氨基甲酸酯类农药一般无特殊气味，在酸性环境下稳定，遇碱分解，大多数品种毒性较有机磷酸酯类低。但是，由于大多数有机磷农药都属于高毒化合物，不仅污染土壤、水源等自然资源，且在动、植物体内产生蓄积，通过食物链，成为危害人们生命安全的隐患，然而氨基甲酸酯类农药虽然不是剧毒化合物，但具有致癌性，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸酯类列为2A类致癌物。食物中毒发生后，快速筛查出是否是由有机磷或氨基甲酸酯类的农药或鼠药所致，对于及时抢救伤者具有重要意义。
农药的检测重点是有机磷或氨基甲酸酯类农药。为预防和控制有机磷农药残留对人体健康的影响，就需要加强对食品中有机磷农药残留检测的力度，目前关于有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测方法，国家已经制定出国家标准快速检验方法GB/T5009.199-2003，但是很多农药的检出限已经不能满足《GB2763-2016食品安全国家标准食品中最大农药残留限量》中规定，如何实现微量有机磷农药残留快速、高灵敏性的检测方法成为人们迫切需要解决的问题，对食品安全评价、增强我国农产品国际竞争力等方面具有重要意义。
现有检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法主要有气相色谱、质谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、高效液相色谱、拉曼光谱等。这些方法虽然具备定量准确、灵敏度高等优点，但多为大型仪器，检测周期长，不适合现场检测和大批量样品的筛选，难于满足预防和控制突发事件。针对现有的有机磷和氨基甲酸酯类等食品农残检测的不足之处，本发明提供一种快速且能够检测微量有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法，具有能实现对微量有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速、高灵敏性、选择性检测，且检测成本低，操作简单等优点。
胆碱酯酶(cholinesterase)是一类糖蛋白，以多种同工酶形式存在于体内。一般可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱脂酶。在临床中,测定血清胆碱酯酶活性是协助诊断有机磷中毒和评估肝实质细胞损害的重要手段。
现有检测胆碱脂酶的方法主要有比色法和连续监测速率法，比色法显色不稳定，特别是室温超过20℃时影响明显，误差较大；另外连续监测速率法需要依赖生化分析仪，不适合于现场快速检测分析。然而本发明技术可以实现，仅需微量样本即可现场快分析。
发明内容
本发明的目的是公开一种双酰胺复合物，其制备方法和使用该复合物检测有机磷和氨基甲酸酯类物质的方法，同时使用该复合物检测胆碱酯酶的方法。
本发明在第一方面公开一种双酰胺复合物，该复合物由如下结构的化合物组成:A-[B]n-[C]m，其中N≥M≥1，A、B和C三者通过酰氨键连接而成，其中A为聚合物，B和C为化合物；
聚合物A为表面被氨基或羧基活化的高分子聚合物；
化合物B具体为下式结构式的化合物，
Figure GDA0002482942580000021
R1、R2、R3中只有一个基团为氨基或羧基，剩余基团为H、烷烃基、芳香基、硝基、卤素、羟基或其衍生物。
化合物C为含有游离伯氨基或羧基的化合物，该化合物可以为分子量小于5000道尔顿的小分子化合物，或者是分子量大于5000道尔顿的核酸、多肽、蛋白质类大分子化合物。
在一个优选的实施例中聚合物A、化合物B和化合物C的摩尔比为1：N：M，其中N≥M≥1，双酰胺化合物能够与硫代胆碱等巯基类化合物反应，释放出化合物C的衍生物。
其中化合物A可选氨基微球或羧基微球，优选的氨基微球粒径为0.5-30μm，更优选为5-15μm，更优选6μm、8μm、或10μm。化合物A也可选择粒径为1-100nm的磁性纳米聚苯乙烯颗粒。
其中化合物B可选任何符合上述结构式的化合物，例如5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸CAS号：69-78-3，或是4,4'-二硫代二苯胺CAS号：722-27-0，或是4,4'-二硫代双苯甲酸CAS号：1155-51-7，或是2,2'-二硫双(3-甲基苯甲酸)CAS号：13363-59-2。
化合物C为含有游离伯氨基或羧基的化合物，该化合物可以为分子量小于5000道尔顿的小分子化合物，或者是分子量大于5000道尔顿的核酸、多肽、蛋白质类大分子化合物。
本发明第二方面公开复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过碳二亚胺法活化化合物B溶液；
(2)加入化合物C溶液，进行反应，得到化合物B与化合物C的偶联物；
(3)再加入聚合物A溶液，使得化合物B-化合物C偶联物偶联至聚合物A上，得到聚合物A-化合物B-化合物C的衍生物。
在一个具体实施方式中，步骤(1)是指在化合物B溶液中，加入EDC溶液和NHS溶液，室温反应，得到溶液。
在一个具体的实施例中，EDC和NHS物质的量比为2:1。
在一个具体实施方式中，步骤(2)是指在步骤(1)所得溶液中加入化合物C。
在一个具体实施方式中，步骤(3)是指在化合物B-化合物C偶联物的溶液中加入聚合物A溶液，使得化合物B-化合物C偶联物以共价键结合在聚合物A上，形成聚合物A-化合物B-化合物C的衍生物。
在一个具体实施方式中，化合物A可选氨基微球或羧基微球，粒径为0.5-30μm，优选的氨基微球粒径为5-15μm，更优选6μm、8μm、或10μm。
在一个具体实施例中聚合物A为聚苯乙烯氨基微球，聚合物A球粒径为10μm。
在一个具体实施例中化合物B为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(简称DTNB)。
在一个具体实施例中化合物C为降钙素原(简称PCT)。
在一个具体实施例中双酰胺复合物为以下的结构(其中微球为聚苯乙烯氨基微球)：
Figure GDA0002482942580000041
在一个实施方式中DTNB和PCT的摩尔比为5-20：1。
在一个实施方式中聚合物A可选择氨基微球，粒径为0.5-30μm，优选的氨基微球粒径为5-15μm，更优选6μm、8μm、或10μm。
在另一个具体实施方式中，聚合物A可选择球粒径为1-100nm的磁性纳米聚苯乙烯颗粒。
在一个实施方式中，氨基微球与DTNB的质量摩尔比(g:mol)为：300-900:1，优选的330:1、600:1或700:1。
在一个具体实施例中化合物C为磺胺嘧啶，化合物A为氨基微球，化合物B为DTNB。
在一个实施方式中DTNB和磺胺嘧啶的摩尔比例是1：0.5～3，DTNB和磺胺嘧啶的优选摩尔比例为1:1.5。
在一个具体实施例中双酰胺复合物为以下的结构：
Figure GDA0002482942580000051
本发明的复合物能够实现与硫代胆碱反应，同时释放化合物C，从而通过免疫学方法检测化合物C的含量，从而间接反映出有机磷和氨基甲酸酯类农药的浓度。
本发明第三方面公开一种检测有机磷和氨基甲酸酯类物质的方法，主要包括如下步骤:
待测物溶液(样本液)依次与胆碱酯酶，酰化硫代胆碱和双酰胺复合物反应，释放出化合物C，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C的含量，从而间接反映出有机磷和氨基甲酸酯类农药的浓度。
其中，酰化硫代胆碱水溶性差且不稳定，一般可选水溶性好的酰化硫代胆碱的卤素盐，例如碘化硫代乙酰胆碱，碘化硫代丁酰胆碱等。免疫学检测的方法及技术主要有：酶免疫测定技术、放射免疫测定技术、免疫荧光技术、免疫胶体金标记技术等。
在一个具体实施例中使用荧光免疫层析分析技术，聚合物A为氨基微球，聚合物A球粒径为0.5-30μm，化合物B为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(简称DTNB)；化合物C为降钙素原(简称PCT)。
荧光免疫层析分析的检测方法是：1、将样本滴加在包埋有胆碱酯酶的结合垫上面，样本中水溶液使胆碱脂酶溶解，而向着吸水纸一端发生泳动迁移；2、泳动过程中，迁移的液体与含有碘化硫代乙酰胆碱的结合垫反应，在一定条件下胆碱酯酶能够催化碘化硫代乙酰胆碱生成硫代胆碱和乙酸；3、生成硫代胆碱随着液体进一步向前泳动，进一步与含有氨基微球-DTNB-化合物C复合物结合垫反应，硫代胆碱能够催化氨基微球-DTNB-化合物C复合物(下面简称复合物)，生成化合物C-TNB或者化合物C-硫代胆碱-NTB可溶性衍生物(下面简称化合物C衍生物)；由于复合物中微球直径较大不能通过硝酸纤维素膜(NC膜)，而被截留在NC膜底端，然而生成化合物C衍生物能够随着液体继续在NC膜上泳动，从而使未反应的复合物和释放出的化合物C衍生物发生分离；4、释放出的化合物C衍生物随着液体进一步向前泳动，进一步与荧光微球标记的抗体1(下面简称荧光微球抗体I)反应，形成化合物C-荧光微球抗体I复合物；5、形成化合物C-荧光微球抗体I复合物随着液体继续在NC膜上向前层析迁移，与包被在NC膜上抗体11或者化合物C-半抗原发生反应，从而使荧光微球被截留下来，由于荧光微球在一定波长光激发下，能发射出特殊波长信号，通过仪器收集特殊波长信号的强弱而分析出化合物C的含量水平；6、化合物C的含量水平，直接反映出了硫代胆碱的含量水平，而硫代胆碱的含量水平直接体现出胆碱酯酶的活性；7、胆碱脂酶活性高低间接反映出样本中有机磷或者氨基甲酸酯类农药(以下简称农药)的含量水平，胆碱酯酶的活性越低，反映出农药含量水平越高；胆碱酯酶的活性越高，反映出农药含量水平越低。
在另一个具体实施例中以磁性纳米颗粒分离-酶标记免疫化学发光分析技术进行检测，聚合物A为氨基活化的磁性纳米聚苯乙烯颗粒，聚合物A球粒径为1-100nm的磁性纳米聚苯乙烯颗粒，磁性纳米颗粒可以通过四氧化三铁均匀包裹纳米级聚苯乙烯颗粒实现，也可以通过其他任何磁性的且具有粘附性质的物质包裹纳米级颗粒实现。化合物B为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(简称DTNB)；化合物C为降钙素原(简称PCT)。在一个具体实施例中，检测方法是：1、将样本滴加在冻干有胆碱酯酶的微孔中，样本中水溶液使胆碱脂酶溶解，而形成均一稳定液态体系；2、再依次加入底物碘化硫代乙酰胆碱、磁性纳米颗粒-DTNB-化合物C复合物(下面简称复合物)，混匀。在一定条件下胆碱酯酶能够催化碘化硫代乙酰胆碱生成硫代胆碱和乙酸；生成的硫代胆碱，进一步与复合物反应，生成化合物C-TNB或者化合物C-硫代胆碱-NTB可溶性复合物(下面简称化合物C)；3、反应一段时间后，再采用含磁性的物质吸附未反应完全的复合物：由于复合物能够被磁性物质所吸附，从而使未反应的复合物和释放出的化合物C发生分离；4、释放的化合物C与微孔包被抗体1(下面简称包被抗体I)和酶标记的抗体II(以下简称标记抗体II)或者酶标记的化合物C-半抗原(以下简称：标记抗原)反应，形成包被抗体1-化合物C-标记抗体II或者化合物C-标记抗原复合物，再通过洗涤去除未反应的标记抗体II或者标记抗原；5、酶(可选辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)能够催化鲁米诺或其衍生物等发光底物，发射出特殊波长信号，通过仪器收集特殊波长信号的强弱而分析出化合物C的含量水平；6、化合物C的含量水平，直接反映出了硫代胆碱的含量水平，而硫代胆碱的含量水平直接体现出胆碱酯酶的活性；7、胆碱脂酶活性高低间接反映出样本中有机磷或者氨基甲酸酯类农药(以下简称农药)的含量水平，胆碱酯酶的活性越低，反映出农药含量水平越高；胆碱酯酶的活性越高，反映出农药含量水平越低。
本发明第四方面公开一种检测有机磷和氨基甲酸酯类物质的试纸条，所述试纸条包括以下部件：
1)酶结合垫:含有胆碱酯酶；
2)底物结合垫:含有酰化硫代胆碱；
3)复合物结合垫：包被有氨基微球-DTNB-化合物C复合物；
4)标记抗体垫：包被有抗化合物C的单克隆抗体-标记物偶联物；
5)反应膜上检测线和质控线：检测线包被有化合物C-半抗原或化合物C的另一种单克隆抗体；质控线包被有抗步骤4)中抗体的抗抗体；
6)吸水纸：用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
如上所述的试纸条，其特征在于所述试纸条进一步包括底板，其中所述底板上粘贴有依次搭接的酶结合垫、底物结合垫、复合物结合垫、荧光微球垫、反应膜和吸水纸。
特殊注明：其中酶结合垫包含两种形式，一种形式为包埋在特殊材料上，与检测试纸条同时存在于底板上；另一种形式为液体或者冻干粉保存在特殊容器中，与底板部分各自独立存在。
在一个具体实施方式中，依次搭接粘贴的酶结合垫、底物结合垫、复合物结合垫、荧光微球垫、反应膜和吸水纸。
在一个具体实施方式中，所述胆碱酯酶为市售的或合成的乙酰胆碱酯酶(AChE)或丁酰胆碱酯酶(BChE)，胆碱酯酶可以由血浆纯化或通过重组DNA技术制备。
在一个具体实施方式中，所述酰化硫代胆碱包含乙酰硫代胆碱、丙酰硫代胆碱、丁酰硫代胆碱、苯甲酰硫代胆碱等。酰化硫代胆碱的水溶性差且不稳定，一般可选水溶性好的酰化硫代胆碱的卤素盐作为底物，例如碘化硫代乙酰胆碱等，碘化硫代丁酰胆碱等。
在一个具体实施方式中，所述氨基微球-DTNB-化合物C复合物，是一种能够与硫代胆碱反应，释放化合物C的复合物，该复合物由氨基微球、DTNB和化合物C三者偶联而成。
在一个具体实施方式中，所述微球复合物，其微球为羧基微球。
在一个具体实施方式中，所述反应膜为NC膜。
在检测时，如果化合物C的类型为伯氨基化合物类小分子，例如化合物C为磺胺嘧啶(SD)，样本中含量水平应与T值/C值的比值，呈反比例关系。
如果化合物C的类型为多肽、核酸或者蛋白质类大分子，例如化合物C为降钙素原(PCT)，样本中含量水平应与T值/C值的比值，呈正比例关系。
本发明的第五方面，公开了一种检测胆碱酯酶活性的方法，该方法利用胆碱酯酶能够催化酰化硫代胆碱与本发明的前述双酰胺复合物反应生成化合物C衍生物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C的含量，从而间接反映出胆碱酯酶的活性。
由于主要检测样品例如血液中存在其他巯基类物质，也会与本发明前述双酰胺复合物发生释放化合物C衍生物的反应，这样会对检测形成较大干扰，因此检测样品的胆碱酯酶活性时，要排除掉样品中自带的巯基类化合物所产生的化合物C衍生物对检测结果的影响。这时我们引入背景检测卡，计算出背景所产生的化合物C衍生物，这里为了方便计算，我们也将该背景的干扰换算为胆碱酯酶活性值，这样直接从检测卡所测得的总酶活中减掉背景所对应的酶活值，即可计算出酶催化反应的酶活值。将化合物C衍生物含量换算为胆碱酯酶活性，均依据化合物C与胆碱酯酶活性的标准曲线计算得到，该标准曲线为利用胆碱酯酶标准品多次实验获得。由此优选的检测胆碱酯酶活性的方法为：先检测不加酰化硫代胆碱的情况下，样品中产生的化合物C衍生物所对应的胆碱酯酶活性1，再检测添加酰化硫代胆碱的情况下，样品中的背景以及酶催化反应的总胆碱酯酶活性2，活性2与活性1的值相减即除掉样品中自带的巯基类化合物对检测结果的影响，获得了酶催化反应的胆碱酯酶活性。
该检测胆碱酯酶活性方法包括如下步骤:
(1)背景检测：待测物溶液(样本液)与前面所述的复合物反应，释放出化合物C的衍生物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C衍生物的含量，根据该含量计算出酶活性1；
(2)样品检测：待测物溶液(样本液)依次与酰化硫代胆碱和权利要求1所述的双酰胺复合物反应，释放出化合物C的复合物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C衍生物的含量，根据该含量计算出酶活性2；
(3)计算样品中胆碱酯酶活性：计算活性1和活性2差值，计算出酶催化反应的酶活性水平。
本发明的第六方面，公开了一种检测胆碱酯酶活性的背景试纸条，其特征在于所述试纸条包括以下部件：
1)复合物结合垫：包被有氨基微球-DTNB-化合物C复合物；
2)标记抗体垫：包被有抗化合物C的单克隆抗体-标记物偶联物；
3)反应膜上检测线和质控线：检测线包被有化合物C-半抗原或化合物C的另一种单克隆抗体；质控线包被有抗步骤(2)中的抗体的抗抗体；
4)吸水纸：用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
还公开了一种检测胆碱酯酶活性的样品试纸条，其特征在于所述试纸条包括以下部件：
1)底物结合垫:含有酰化硫代胆碱；
2)复合物结合垫：包被有氨基微球-DTNB-化合物C复合物；
3)标记抗体垫：包被有抗化合物C的单克隆抗体-标记物偶联物；
4)反应膜上检测线和质控线：检测线包被有化合物C-半抗原或化合物C的另一种单克隆抗体；质控线包被有抗步骤3)中抗体的抗抗体；
5)吸水纸：用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
该发明中的术语解释：
酰化硫代胆碱是指酰化硫代胆碱及其卤素盐，包括但不限于碘化乙酰硫代胆碱、氯化乙酰硫代胆碱、溴化乙酰硫代胆碱、碘化丙酰硫代胆碱、氯化丙酰硫代胆碱、溴化丙酰硫代胆碱、碘化丁酰硫代胆碱、氯化丁酰硫代胆碱、溴化丁酰硫代胆碱、碘化苯甲酰硫代胆碱、氯化苯甲酰硫代胆碱、溴化苯甲酰硫代胆碱等。
化合物C是指一类为多肽、核酸或者蛋白质类大分子，其分子量大于5KD，例如：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清蛋白、血蓝蛋白、降钙素原、甲胎蛋白、癌胚抗原、促人绒毛膜性腺激素、卵泡刺激素等。化合物C也可以是一类为含有伯氨基的化合物，其分子量小于5KD。例如：三聚氰胺、苯胺、磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、克伦特罗、多巴胺等。
氨基微球是指表面被氨基化的微球。微球的材质主要有：树脂、乙基纤维素、聚丙乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、乳聚丁苯橡胶、聚乙酸乙烯脂等。
羧基微球是指表面被羧基化的微球。微球的材质主要有：树脂、乙基纤维素、聚丙乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、乳聚丁苯橡胶、聚乙酸乙烯脂等。微球主要包括：荧光微球、彩色微球等。
DTNB是指5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，CAS号：69-78-3。
偶联是指偶联是一个化学反应发生时其它反应以化学计量学的关系相伴进行的现象，偶联反应，也作偶连反应、耦联反应、氧化偶联，是由两个有机化学单位进行某种化学反应而得到一个有机分子的过程。
偶联物是指将两个有机化学物质通过偶联反应形成相应的物质。
免疫学方法检测是指利用免疫学原理，以待测物作为抗原或抗体(受体或配体)从而测定样品中待测物质含量的方法。
含量是指物质中所包含的某种成分的量。
EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，CAS号：25952-53-8。
NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺，CAS号：6066-82-6。碳二亚胺，(Carbodiimide)，含有N＝C＝N官能团，是一类常用的失水剂。一般由硫脲失硫化氢或脲失水制备，水解得到脲衍生物。主要用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成。碳二亚胺法是指利用碳二亚胺活化羧基，促使酰胺和酯的生成。
NC膜是指硝酸纤维素膜，每4cm膜水的层析流速多少秒来定义孔径的，根据流速的快慢常用的有90，120，135，180，240等规格。
胆碱酯酶是一类糖蛋白，以多种同工酶形式存在，胆碱酯酶包括但不限于乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。
标记物是指荧光素，放射物性金属，微球，生物酶等。
附图说明
图1是本发明实施例10的背景卡具体构造图；
图2是本发明实施例10的检测卡具体构造图；
图3是本发明实施例12的装配完的试剂卡图；
图4是本发明实施例12胆碱酯酶以冻干粉形式存在于检测卡之外，即省略掉酶结合垫的图；
图5是本发明实施例11的结论图，上述结果显示胆碱酯酶荧光微球免疫层析测试卡检测胆碱酯酶，在45-1215U/L之间具有良好的线性，可以进行胆碱酯酶活性鉴定。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例中的抗原抗体均市售可得，但这些原料也可以自制，抗原抗体的来源并非本发明的关键。
实施例1：氨基微球-DTNB-PCT(降钙素原)复合物制备
氨基微球溶液：将氨基微球(备注：固体含量为0.01g/ml)(以下简称氨基微球)用PBS按照1:10稀释；
抗原溶液：用PBS溶液将PCT(降钙素原)配制10mmoL/L溶液；
DTNB溶液：将DTNB用DMF溶解，并配制成浓度为10mmoL/L溶液；
EDC溶液：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(以下简称：EDC)用水溶解，并配制成浓度为100mmoL/L溶液；
NHS溶液：将N-羟基琥珀酰亚胺(以下简称：NHS)用水溶解，并配制成浓度为100mmoL/L溶液；
DTNB活化：在4mL的棕色玻璃瓶中加入300μL DTNB溶液，再加入840μL的EDC溶液和420μL的NHS溶液，室温振荡反应10～16小时。(投入物质的量比约为DTNB:EDC:NHS＝25：700：350)。
在10mL棕色瓶中加入30μLPCT溶液，将活化好的DTNB溶液全部缓慢加入到PCT溶液，继续室温振荡反应0.5小时(物质的量比约为DTNB:EDC:NHS:PCT＝25：700：350：2.5)。
反应两小时后再向上述溶液中加入1.0mL稀释好的氨基微球(微球为1mg)，继续室温振荡反应2小时。
将反应后的液体转移到离心管中，以4℃10000r/min的速度离心20min；弃去上清液，再用PBS溶液离心洗涤5次。得离心后沉淀物，在低温真空干燥后得干粉，置于4℃密封避光保存。
实施例2：氨基微球-DTNB-磺氨嘧啶(SD)复合物制备
氨基微球溶液：将氨基微球(备注：固体含量为0.01g/ml)(以下简称氨基微球)用PBS按照1:10稀释；
抗原溶液：用PBS溶液将磺氨嘧啶(SD)配制10mmoL/L溶液；
DTNB溶液：将DTNB用DMF溶解，并配制成浓度为10mmoL/L溶液；
EDC溶液：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(以下简称：EDC)用水溶解，并配制成浓度为100mmoL/L溶液；
NHS溶液：将N-羟基琥珀酰亚胺(以下简称：NHS)用水溶解，并配制成浓度为100mmoL/L溶液；
DTNB活化：在4mL的棕色玻璃瓶中加入300μL DTNB溶液，再加入840μL的EDC溶液和420μL的NHS溶液，室温振荡反应10～16小时。(投入物质的量比约为DTNB:EDC:NHS＝25：700：350)。
在10mL棕色瓶中加入450μL磺氨嘧啶(SD)溶液，将活化好的DTNB溶液全部缓慢加入到SD溶液，继续室温振荡反应0.5小时(物质的量比约为DTNB:EDC:NHS:SD＝25：700：350：37.5)。
反应两小时后再向上述溶液中加入1.0mL稀释好的氨基微球(微球为1mg)，继续室温振荡反应2小时。
将反应后的液体转移到离心管中，以4℃10000r/min的速度离心20min；弃去上清液，再用PBS溶液离心洗涤5次。得离心后沉淀物，在低温真空干燥后得干粉，置于4℃密封避光保存。
实施例3：检测试剂卡酶结合垫与底物结合垫制备
按以下方法配制酶稀释缓冲液(以下简称：酶稀液)：分别称取3g Na2HPO4·12H2O；0.25g NaH2PO4·2H2O；8.7g NaCl；10g牛血清白蛋白；5g海藻糖；1g叠氮钠；10g羟丙基-beta-环糊精，先用800mL去离子水充分溶解，再调节pH值至8.0，最后用去离子水定容至1L。
按以下方法配制底物稀释缓冲液(以下简称：底物液)：分别称取5g羟基亚乙基二磷酸；30g异丙醇；2g海藻糖；3g亚硫酸钠；0.5g苯甲酸；1g叠氮钠，先用800mL去离子水充分溶解，再调节pH值至6.0，最后用去离子水定容至1L。
酶结合垫制备：
第一种形式：将用酶稀液稀释成0.1～3U/mL的乙酰胆碱酯酶(购自北京索来宝公司)，再用移液器取1～2mL平铺在5mm*300mm的玻璃纤维纸上，置于室温(25℃±5℃)，湿度≤30％，通风干燥24小时，干燥后于4℃保存备用。
第二种形式：将用酶稀液稀释成0.1～3U/mL的乙酰胆碱酯酶(购自北京索来宝公司)，直接以液体状态保存在0.5～100mL塑料瓶或者玻璃瓶中，或者采用冻干粉的状态保存在0.1～100mL塑料瓶(孔)或者玻璃瓶(孔)中。
底物结合垫制备：将碘化硫代乙酰胆碱用底物液稀释成1～5mg/mL，再用移液器量取1～2mL平铺在5mm*300mm的玻璃纤维纸上，置于室温(25℃±5℃)，湿度≤30％，通风干燥24小时，干燥后于4℃保存备用。
实施例4：复合物氨基微球-DTNB-PCT结合垫制备
将实施例1的氨基微球-DTNB-抗原复合物用酶稀液，按照1:10的比例稀释，再用移液器量取1～2mL平铺在5mm*300mm的玻璃纤维纸上，置于室温(25℃±5℃)，湿度≤30％，通风干燥24小时，干燥后于4℃保存得氨基微球-DTNB-PCT复合物结合垫备用。
实施例5：氨基微球-DTNB-SD复合物结合垫制备
按以下方法配制微球稀释缓冲液(以下简称：微球稀释液)：分别称取3g Na2HPO4·12H2O；0.25g NaH2PO4·2H2O；5g羟基亚乙基二磷酸；30g异丙醇；5g蔗糖；3g亚硫酸钠；1g叠氮钠，先用800mL去离子水充分溶解，再调节pH值至6.5，最后用去离子水定容至1L。
补充将实施例2的氨基微球-DTNB-抗原复合物用微球稀释液，按照1:10的比例稀释，再用移液器量取1～2mL平铺在5mm*300mm的玻璃纤维纸上，置于室温(25℃±5℃)，湿度≤30％，通风干燥24小时，干燥后于4℃保存得氨基微球-DTNB-SD复合物结合垫备用。
实施例6：降钙素原(PCT)抗体荧光微球垫制备
1、将抗降钙素原(PCT)(以下简称PCT)的单克隆抗体I(购自海肽生物科技(上海)有限公司)用pH7.4 0.05M PBS溶液，透析3次，每次体积置换比例为1:100，透析完成后用pH7.4 0.05M PBS将PCT的单克隆抗体I和单克隆抗体II调节成浓度为1mg/mL。
2、在1mL羧基微球(时间分辨荧光微球(铕)：水＝1g：1000mL，Bangs Lab)中，加入0.4mg NHS(用pH5.5 50mM MES缓冲液配制成浓度为1mg/mL的溶液)；再加入0.6mg EDC(用pH5.5 50mM MES缓冲液配制成浓度为1mg/mL的溶液)，室温(25℃±5℃)下反应30分钟，摇床翻转混匀。
3、反应完成后，以4℃10000r/min的速度离心20min，离心完成弃去上清液，得沉淀物；再用pH5.5 50mM MES缓冲液洗涤沉淀物3次，每次洗涤液体为2mL。
4、将上述洗涤好的沉淀物，用0.75mLpH7.4 0.05M PBS重悬，再加入0.5mg透析好的抗PCT的单克隆抗体I，室温(25℃±5℃)下反应2小时，摇床翻转混匀，速度60转/分钟。
5、将上述反应完成后液体用超声波震荡30秒，再加入200μL 1.0M乙醇胺溶液(用超纯水配制)和100μL 2.0M甘氨酸溶液(用超纯水配制)，室温(25℃±5℃)下反应1小时，摇床翻转混匀，速度60转/分钟。(终止反应)
6、将上述反应完成后用液体超声波震荡30秒，以4℃10000r/min的速度离心20min，离心完成弃去上清液，得沉淀物；再用0.1％吐温-20PBS洗涤沉淀物3次，每次洗涤液体为2mL。(去除杂质)
7、将上述洗涤好的沉淀物用5mL酶稀液重悬，再用移液器量取1mL平铺在5mm*300mm的玻璃纤维纸上，置于室温(25℃±5℃)，湿度≤30％，通风干燥24小时，干燥后于4℃保存备用。
实施例7：抗磺胺嘧啶(SD)抗体荧光微球垫制备
1、将抗磺胺嘧啶(SD)(以下简称SD)的单克隆抗体(购自深圳市宝安康生物技术有限公司)用pH7.4 0.05M PBS溶液，透析3次，每次体积置换比例为1:100，透析完成后用pH7.4 0.05M PBS将抗SD的单克隆抗体调节成浓度为1mg/mL。
2、在1mL羧基微球((时间分辨荧光微球(铕)：水＝1g：1000mL，Bangs Lab)，加入0.4mg NHS(用pH5.5 50mM MES缓冲液配制成浓度为1mg/mL的溶液)；再加入0.6mg EDC(用pH5.5 50mM MES缓冲液配制成浓度为1mg/mL的溶液)，室温(25℃±5℃)下反应30分钟，摇床翻转混匀。
3、反应完成后，以4℃10000r/min的速度离心20min，离心完成弃去上清液，得沉淀物；再用pH5.5 50mM MES缓冲液洗涤沉淀物3次，每次洗涤液体为2mL。
4、将上述洗涤好的沉淀物，用0.5mL PBS重悬，再加入0.5mg透析好的抗SD的单克隆抗体，室温(25℃±5℃)下反应2小时，摇床翻转混匀，速度60转/分钟。
5、将上述反应完成后液体用超声波震荡30秒，再加入200μL 1.0M乙醇胺溶液(用超纯水配制)和100μL 2.0M甘氨酸溶液(用超纯水配制)，室温(25℃±5℃)下反应1小时，摇床翻转混匀，速度60转/分钟。
6、将上述反应完成后用液体超声波震荡30秒，以4℃10000r/min的速度离心20min，离心完成弃去上清液，得沉淀物；再用0.1％吐温-20PBS洗涤沉淀物3次，每次洗涤液体为2mL。
7、将上述洗涤好的沉淀物用5mL酶稀液重悬，再用移液器量取1mL平铺在5mm*300mm的玻璃纤维纸上，置于室温(25℃±5℃)，湿度≤30％，通风干燥24小时，干燥后于4℃保存备用。
实施例8：反应膜上检测线和质控线的包被(PCT抗体包被)
抗PCT的单克隆抗体II和羊抗鼠IgG的二抗(以下简称二抗，购自海肽生物科技(上海)有限公司)包被到NC膜上。
用pH7.4 0.05M PBS将抗PCT的单克隆抗体II调节包被物浓度为0.5mg/mL和将二抗调节包被物浓度为0.5mg/mL,喷膜量为0.8μL/cm；
检测线包被抗化合物C的单克隆抗体II，质控线包被二抗，两区位置相隔6mm，质控线距NC膜顶端10mm，检测线距NC膜底端9mm；
37℃烘干处理过夜后，于室温干燥的环境下保存备用。
实施例9：反应膜上检测线和质控线的包被(SD-BSA抗原包被)
SD-BSA偶联物和羊抗抗SD的单克隆抗体的二抗(以下简称二抗，购自海肽生物科技(上海)有限公司)包被到NC膜上
用pH7.4 0.05M PBS将SD-BSA偶联物调节包被物浓度为0.5mg/mL和将二抗调节包被物浓度为0.5mg/mL,喷膜量为0.8μL/cm；
检测线包被SD-BSA偶联物，质控线包被二抗，两区位置相隔6Mm，质控线距NC膜顶端10mm，检测线距NC膜底端9mm；
37℃烘干处理过夜后，于室温干燥的环境下保存备用。
实施例10：胆碱酯酶荧光微球免疫层析背景卡和检测卡的装配
(1)基于PCT的胆碱酯酶背景卡和检测卡
背景卡：在底板上依次搭连地粘贴空白垫、实施例4或实施例5获得的复合物结合垫、实施例6获得的荧光微球垫、实施例8或实施例9获得的NC膜和吸水纸，粘贴好的试纸条板用切割机裁切成4mm试纸条，并组装到准备好的检测卡卡壳中，装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环境下至少可保存一年。背景卡具体构造如图1所示。
检测卡：
在底板上依次搭连地粘贴实施例3获得的底物结合垫、实施例4或实施例5获得的复合物结合垫、实施例6获得的荧光微球垫、实施例8或实施例9获得的NC膜和吸水纸，粘贴好的试纸条板用切割机裁切成4mm试纸条，并组装到准备好的检测卡卡壳中，装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环境下保存。检测卡具体构造如图2所示。
实施例11：胆碱酯酶荧光微球免疫层析检测卡的测试
检测前，先打开干式荧光检测仪，预热5分钟。
首先，由于样品中会存在一些干扰物质，它们与硫代胆碱类似，因此先使用实施例10(1)获得的胆碱酯酶荧光微球免疫层析背景卡检测样品背景干扰：
1、将胆碱酯酶用蒸馏水或者pH6.0～pH8.0的缓冲溶液，配置成0U/L、15U/L、45U/L、135U/L、405U/L、1215U/L的活性浓度，混匀后备用；
2、每批次检测时，以蒸馏水或者pH6.0～pH8.0的缓冲溶液作为空白对照；
3、将胆碱酯酶荧光微球免疫层析测试卡的从铝箔袋中取出，平整放在桌面上；
4、再将上述提取好样本液体用吸管吸取100μL样本液滴加在背景卡的样本孔中(S)；
5、37±2℃反应10分钟；
6、将反应完成的检测卡放入干式荧光检测仪中进行检测，照射365nm荧光激发光源，并在615nm处采集信号，获得检测线(T线)和对照线(C线)的信号值，比较检测线值(T值)与对照线值(C值)的比值，进行数据分析。分析释放出化合物C的含量水平，再通过化合物C和酶活标准曲线计算出背景的酶活性水平。
然后，依据同样的方法，使用实施例10(1)获得的胆碱酯酶荧光微球免疫层析检测卡检测背景和酶催化反应的酶活总和。
计算第一卡和第二卡之间的差值即是酶催化反应的酶活。
备注：该实施例中，化合物C为降钙素原(PCT)。
Figure GDA0002482942580000191
上述结果显示胆碱酯酶荧光微球免疫层析测试卡检测胆碱酯酶，在45～1215U/L之间具有良好的线性，可以进行胆碱酯酶活性鉴定。
实施例12：有机磷和氨基甲酸酯类药物荧光微球免疫层析检测卡的装配
(1)基于PCT的有机磷和氨基甲酸酯类药物检测卡
在底板上依次搭连地粘贴实施例3获得的酶结合垫、实施例3获得的底物结合垫、实施例4获得的复合物结合垫、实施例5获得的荧光微球垫、实施例8获得的NC膜和吸水纸，粘贴好的试纸条板用切割机裁切成4mm试纸条，并组装到准备好的检测卡卡壳中，装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，于室温干燥的环境下至少可保存一年。
(2)基于SD的有机磷和氨基甲酸酯类药物检测卡
也可以将实施例4中的复合物结合垫替换为实施例5的复合物结合垫，实施例8中的NC膜替换为实施例9中的NC膜，其余制备方法相同。
装配完的试剂卡如图3所示，胆碱酯酶以固相形式附着于样本垫的一端。
当然，胆碱酯酶还可以以冻干粉形式存在于检测卡之外，如图4所示，这时即省略掉酶结合垫，其余制备过程一样。
实施例13：有机磷和氨基甲酸酯类药物荧光微球免疫层析检测卡的测试方法
检测前，先把有机磷和氨基甲酸酯类农药残留荧光微球免疫层析测试卡和干式荧光检测仪打开，预热5分钟。
1、选取代表性的蔬菜或者水果样本，去除表面泥土，剪成1cm见方的碎片，取5g样本放入50mL塑料离心管中，再加入15mL蒸馏水或者pH6.0～pH8.0的缓冲溶液，上下颠倒50次左右，再静置3～5分钟；
2、每批次检测时，以蒸馏水或者pH6.0～pH8.0的缓冲溶液作为空白对照；
3、将有机磷和氨基甲酸酯类农药残留荧光微球免疫层析测试卡的从铝箔袋中取出，平整放在桌面上；
4、再将上述提取好样本液体用吸管吸取100μL样本液滴加在检测卡的样本孔中(S)；
5、37±2℃反应10分钟；
6、将反应完成的检测卡放入干式荧光检测仪中进行检测，照射365nm荧光激发光源，并在615nm处采集信号，获得检测线(T线)和对照线(C线)的信号值，比较检测线值(T值)与对照线值(C值)的比值，进行数据分析。
实施例14：定性及定量检测实验结果
一、定性判读
1、使用实施例12(2)装配的有机磷及氨基甲酸酯类药物检测卡进行检测，化合物C为磺胺嘧啶(SD)，其检测卡荧光微球免疫层析测试卡的检测结果按照如下方式判定：
空白对照T值/C值的比值应≤0.2；
如果T值/C值的比值<0.3为阴性结果；T值/C值的比值≥0.3为阳性结果。
具体结果如表1所示：
表1
Figure GDA0002482942580000211
依据数据显示不同蔬菜添加克百威药物浓度为100～200ng/ml时，表现为阳性结果。
2、使用实施例12(1)中装配的有机磷及氨基甲酸酯类药物检测卡进行检测，化合物C为降钙素原(PCT)，其检测卡荧光微球免疫层析测试卡的检测结果按照如下方式判定：
空白对照T值/C值的比值应≥1.1；
如果T值/C值的比值>0.9为阴性结果；T值/C值的比值≤0.9为阳性结果。
具体结果如表2所示：
表2
Figure GDA0002482942580000212
Figure GDA0002482942580000221
依据数据显示不同蔬菜添加克百威药物浓度为20～50ng/ml时，表现为阳性结果。
二、定量检测
1、如果化合物C的类型为伯氨基化合物类小分子，该实施例中，化合物C为磺胺嘧啶(SD)，其检测卡荧光微球免疫层析测试卡的检测结果依据每个药物的浓度，计算出每个浓度下仪器测试T值/C值的比值，样本中含量水平应与T值/C值的比值，呈反比例关系，绘制标准曲线，再对测定的结果进行计算：
2、如果化合物C的类型为多肽、核酸或者蛋白质类大分子，该实施例中，化合物C为降钙素原(PCT)其检测卡荧光微球免疫层析测试卡的检测结果依据每个药物的浓度，计算出每个浓度下仪器测试T值/C值的比值，样本中含量水平应与T值/C值的比值，呈正比例关系，绘制标准曲线，再对测定的结果进行计算：
该实施例中，化合物C为降钙素原(PCT)。
将药物敌敌畏(浓度为1mg/mL)用pH7.4 0.05M PBS，稀释为20ug/ml，再分别稀释成浓度为0ng/ml、8.8ng/ml、26.4ng/ml、79.2ng/ml、237.6ng/ml、712.8ng/ml，将稀释好的溶液吸取100ul滴加到检测卡的S孔中，室温反应5min，用干式荧光分析仪分析，照射365nm荧光激发光源，并在615nm处采集信号，获得检测线(T线)和对照线(C线)的信号值。
浓度 T值/C值
0ppb 2.276631
8.8ppb 2.072447
26.4ppb 1.901383
79.2ppb 1.63292
237.6ppb 1.547983
712.8ppb 1.266685
针对敌敌畏药物的灵敏度最高可达9ng/mL，线性回归R>0.99，线性良好。可见，该方法可以进行定量检测。
通过上述定性及定量检测实验，可以看出，本发明的方法不仅能够对有机磷及氨基甲酸酯类物质实现定性检测，还可以进行微量的定量检测，检测灵敏度很高，能够达到小于10ppb。
尽管已用于解释说明的目的公开了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可理解，可做出各种改变、增添和替换，而不脱离如后附权利要求所公开的本发明的范围和精神。

Claims (24)

1.一种双酰胺复合物，其特征在于该复合物由如下结构的化合物组成:A-[B]n-[C]m，其中n＝m＝1，A、B和C三者通过酰胺键连接而成，其中A为聚合物，B和C为化合物；
该复合物的聚合物A为直径为0.5-30μm的氨基微球或粒径为1-100nm的磁性氨基微球；
化合物B为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（简称DTNB）；
化合物C为降钙素原（简称PCT）或磺胺嘧啶。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于该复合物的聚合物A为直径为6μm，8μm，10μm的氨基微球。
3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于该复合物的化合物A为被氨基活化的聚苯乙烯微球。
4.如权利要求1所述的复合物，其特征在于该复合物与硫代胆碱化合物反应，释放出化合物C的衍生物。
5.如权利要求1-4任一项所述的复合物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）、通过碳二亚胺法活化化合物B溶液；
（2）、加入化合物C溶液，进行反应，得到化合物B与化合物C的偶联物；
（3）、再加入聚合物A溶液，使得化合物B-化合物C偶联物偶联至聚合物A上，得到聚合物A-化合物B-化合物C的复合物。
6.如权利要求5所述的制备方法，步骤（1）是在化合物B溶液中，加入EDC溶液和NHS溶液，室温反应，得到溶液。
7.如权利要求6所述的制备方法，其中EDC和NHS物质的量比2:1。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于化合物A与化合物B的质量摩尔比为：300-900g:1mol。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于化合物A与化合物B的质量摩尔比为330g:1mol。
10.如权利要求5所述的制备方法，化合物B为DTNB，化合物C为PCT，DTNB和PCT的摩尔比为5-20：1。
11.如权利要求5所述的制备方法，化合物B为DTNB，化合物C为磺胺嘧啶，DTNB和磺胺嘧啶的摩尔比例是1：0.5~3。
12.如权利要求5所述的制备方法，化合物B为DTNB，化合物C为磺胺嘧啶，DTNB和磺胺嘧啶的摩尔比例为1:1.5。
13.一种检测有机磷和氨基甲酸酯类物质的方法，其特征在于该方法包括如下步骤:
待测物溶液（样本液）依次与胆碱酯酶，酰化硫代胆碱卤素盐和权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物反应，释放出化合物C的衍生物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C衍生物的含量，从而间接反映出有机磷和氨基甲酸酯类农药的浓度。
14.如权利要求13所述的检测方法，其特征在于免疫学分析方法是指酶免疫测定技术、放射免疫测定技术、免疫荧光技术或免疫胶体金标记技术。
15.如权利要求13所述的检测方法，其特征在于所述酰化硫代胆碱包含乙酰硫代胆碱、丙酰硫代胆碱、丁酰硫代胆碱、苯甲酰硫代胆碱。
16.一种检测有机磷和氨基甲酸酯类物质的试纸条，其特征在于所述试纸条包括以下部件：
1）胆碱酯酶：含有胆碱酯酶的酶结合垫，或者以干粉形式存在于检测卡外的微型容器中的胆碱酯酶；
2）底物结合垫:含有酰化硫代胆碱卤素盐；
3）复合物结合垫：包被有权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物；
4）标记抗体垫：包被有抗化合物C的单克隆抗体-标记物偶联物；
5）反应膜上检测线和质控线：检测线包被有化合物C-半抗原或化合物C的另一种单克隆抗体；质控线包被有抗步骤4）中抗体的抗抗体；
6)吸水纸：用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
17.如权利要求16所述的试纸条，其特征在于所述试纸条进一步包括底板，其中所述底板上粘贴有依次搭接的酶结合垫、底物结合垫、复合物结合垫、荧光微球垫、反应膜和吸水纸。
18.如权利要求16的试纸条，其特征在于所述胆碱酯酶为乙酰胆碱酯酶(AChE)或丁酰胆碱酯酶(BChE)。
19.如权利要求16的试纸条，其特征在于所述酰化硫代胆碱包含乙酰硫代胆碱、丙酰硫代胆碱、丁酰硫代胆碱、苯甲酰硫代胆碱。
20.如权利要求16的试纸条，其特征在于所述反应膜为NC膜。
21.一种检测胆碱酯酶活性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤:
该方法利用胆碱酯酶能够催化酰化硫代胆碱卤素盐与权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物反应生成化合物C衍生物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C的含量，从而间接反映出胆碱酯酶的活性。
22.一种如权利要求21所述的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤:
（1）背景检测：待测物溶液（样本液）与权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物反应，释放出化合物C的衍生物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C衍生物的含量，间接计算出背景对应的酶活；
（2）样品检测：待测物溶液（样本液）依次与酰化硫代胆碱卤素盐和权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物反应，释放出化合物C的衍生物，再通过抗原抗体或者配体受体免疫学分析方法检测化合物C衍生物的含量，间接计算出背景和酶催化反应的酶活总和；
（3）计算样品中胆碱酯酶活性：计算样品检测和背景检测的差值，得到酶催化反应的酶活性水平。
23.一种检测胆碱酯酶活性的试纸条，其特征在于所述试纸条包括以下部件：
1）底物结合垫:含有酰化硫代胆碱卤素盐；
2）复合物结合垫：包被有权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物；
3）标记抗体垫：包被有抗化合物C的单克隆抗体-标记物偶联物；
4）反应膜上检测线和质控线：检测线包被有化合物C-半抗原或化合物C的另一种单克隆抗体；质控线包被有抗步骤3）抗体的抗抗体；
5)吸水纸：用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
24.一种检测胆碱酯酶活性的背景试纸条，其特征在于所述试纸条包括以下部件：
1）复合物结合垫：包被有权利要求1-4任一项所述的双酰胺复合物；
2）标记抗体垫：包被有抗化合物C的单克隆抗体-标记物偶联物；
3）反应膜上检测线和质控线：检测线包被有化合物C-半抗原或化合物C的另一种单克隆抗体；质控线包被有抗步骤3）抗体的抗抗体；
4)吸水纸：用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
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