JP2003000298A - 残留農薬検出方法 - Google Patents
残留農薬検出方法Info
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- JP2003000298A JP2003000298A JP2001188744A JP2001188744A JP2003000298A JP 2003000298 A JP2003000298 A JP 2003000298A JP 2001188744 A JP2001188744 A JP 2001188744A JP 2001188744 A JP2001188744 A JP 2001188744A JP 2003000298 A JP2003000298 A JP 2003000298A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、簡便に有機リン系農薬とカルバメ
ート系農薬とを同時に検出する方法を提供する。 【解決手段】 検出対象のサンプルをカルボキシルエス
テラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合溶液中で反
応させ、反応後の溶液を用いてカルボキシルエステラー
ゼ特異基質とコリンエステラーゼ特異基質とを加水分解
し、基質の加水分解生成物に発色試薬を添加して発色さ
せるか、又は、加水分解生成物自身が発色する基質を使
用して発色させ、複数波長のスペクトル変化測定を同時
に測定することで、サンプル中の有機リン系農薬群とカ
ルバメート農薬群とを分別して同時に検出する。
ート系農薬とを同時に検出する方法を提供する。 【解決手段】 検出対象のサンプルをカルボキシルエス
テラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合溶液中で反
応させ、反応後の溶液を用いてカルボキシルエステラー
ゼ特異基質とコリンエステラーゼ特異基質とを加水分解
し、基質の加水分解生成物に発色試薬を添加して発色さ
せるか、又は、加水分解生成物自身が発色する基質を使
用して発色させ、複数波長のスペクトル変化測定を同時
に測定することで、サンプル中の有機リン系農薬群とカ
ルバメート農薬群とを分別して同時に検出する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、有機リン系殺虫剤
やカルバメート系殺虫剤等の農薬を検出する農薬検出方
法及びその装置に関し、特に、特異性の異なる２つの反
応基質を使用することにより、複数の農薬を分別的に同
時に検出し、これら複数の農薬の残留基準値を基にした
判定を行うための残留農薬検出方法に関する。
やカルバメート系殺虫剤等の農薬を検出する農薬検出方
法及びその装置に関し、特に、特異性の異なる２つの反
応基質を使用することにより、複数の農薬を分別的に同
時に検出し、これら複数の農薬の残留基準値を基にした
判定を行うための残留農薬検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】有機リン系農薬、カルバメート系農薬
は、有機塩素系農薬と比較して環境中で容易に代謝分解
されるため、殺虫剤、殺菌剤、除草剤として広く使用さ
れている。しかしながら、中でも有機リン系、カルバメ
ート系の殺虫剤とその代謝生成物は、動物体内に蓄積さ
れると神経系を著しく害することが知られている。そこ
で、食品危険度管理又は環境汚染管理的な見地から、安
全性確保のために、これら農薬の検出を行う機会が近年
増加している。一般に、このような分野での農薬検出
は、現場付近において簡易かつ迅速に測定できる方法が
望まれている。
は、有機塩素系農薬と比較して環境中で容易に代謝分解
されるため、殺虫剤、殺菌剤、除草剤として広く使用さ
れている。しかしながら、中でも有機リン系、カルバメ
ート系の殺虫剤とその代謝生成物は、動物体内に蓄積さ
れると神経系を著しく害することが知られている。そこ
で、食品危険度管理又は環境汚染管理的な見地から、安
全性確保のために、これら農薬の検出を行う機会が近年
増加している。一般に、このような分野での農薬検出
は、現場付近において簡易かつ迅速に測定できる方法が
望まれている。
【０００３】従来、殺虫剤等の農薬の検出には、ガスク
ロマトグラフやガスクロマトグラフ質量分析計等の大型
の精密分析装置を用いて行っている。しかしながら、こ
のような精密分析計を用いた農薬の検出方法は、サンプ
ル中に含まれている成分を網羅的に、精度良く検出でき
るものの、測定装置が高価であり、測定操作が煩雑で熟
練を要し、時間がかかる、また、測定ごとに機器校正の
ための農薬を使用せざるを得ない等の問題がある。
ロマトグラフやガスクロマトグラフ質量分析計等の大型
の精密分析装置を用いて行っている。しかしながら、こ
のような精密分析計を用いた農薬の検出方法は、サンプ
ル中に含まれている成分を網羅的に、精度良く検出でき
るものの、測定装置が高価であり、測定操作が煩雑で熟
練を要し、時間がかかる、また、測定ごとに機器校正の
ための農薬を使用せざるを得ない等の問題がある。
【０００４】ところで、特許第2927221号公報に開示さ
れている農薬検出装置では、現場での測定に適した簡易
な農薬測定装置とするため、農薬がコリンエステラーゼ
を不活性化させ、加水分解の能力を低下させる作用を利
用し、コリンエステラーゼの基質の分解量を測定する原
理に基づき、検出対象のサンプルをコリンエステラーゼ
と反応させ、反応後のコリンエステラーゼにより基質を
加水分解し、基質の分解量を測定することで間接的にサ
ンプル中の農薬の検出を行うものである。
れている農薬検出装置では、現場での測定に適した簡易
な農薬測定装置とするため、農薬がコリンエステラーゼ
を不活性化させ、加水分解の能力を低下させる作用を利
用し、コリンエステラーゼの基質の分解量を測定する原
理に基づき、検出対象のサンプルをコリンエステラーゼ
と反応させ、反応後のコリンエステラーゼにより基質を
加水分解し、基質の分解量を測定することで間接的にサ
ンプル中の農薬の検出を行うものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特許第
2927221号公報に開示されている農薬検出方法は、サン
プル中の複数の農薬を個別に検出する方法ではなく、コ
リンエステラーゼ阻害能を有する農薬について総括して
検出するものである。これまでの実験では、農薬ごとの
検出感度は、コリンエステラーゼの農薬による不活性化
の程度（コリンエステラーゼの農薬に対する感受性）に
より異なり、全体的にコリンエステラーゼに対する農薬
の感受性は、有機リン系農薬の方がカルバメート系農薬
と比較して約１００倍低いことが知見として得られてお
り、また、コリンエステラーゼの農薬に対する感受性と
農薬基準値（危険度）との間には相関がないことも知見
として得られている。
2927221号公報に開示されている農薬検出方法は、サン
プル中の複数の農薬を個別に検出する方法ではなく、コ
リンエステラーゼ阻害能を有する農薬について総括して
検出するものである。これまでの実験では、農薬ごとの
検出感度は、コリンエステラーゼの農薬による不活性化
の程度（コリンエステラーゼの農薬に対する感受性）に
より異なり、全体的にコリンエステラーゼに対する農薬
の感受性は、有機リン系農薬の方がカルバメート系農薬
と比較して約１００倍低いことが知見として得られてお
り、また、コリンエステラーゼの農薬に対する感受性と
農薬基準値（危険度）との間には相関がないことも知見
として得られている。
【０００６】つまり、有機リン系農薬は、カルバメート
系農薬と比較して、コリンエステラーゼ阻害能が約１０
０倍劣ることから、検出感度も約１００倍劣るはずであ
る。このため、特許第2927221号公報に開示されている
農薬検査方法では、有機リン系農薬については残留基準
値以下での検査に適用できず、これを実現するために
は、コリンエステラーゼよりも強く有機リン系農薬によ
って阻害される酵素が必要であった。
系農薬と比較して、コリンエステラーゼ阻害能が約１０
０倍劣ることから、検出感度も約１００倍劣るはずであ
る。このため、特許第2927221号公報に開示されている
農薬検査方法では、有機リン系農薬については残留基準
値以下での検査に適用できず、これを実現するために
は、コリンエステラーゼよりも強く有機リン系農薬によ
って阻害される酵素が必要であった。
【０００７】また、特許第2927221号公報に開示されて
いる農薬検出方法は、有機リン系農薬とカルバメート系
農薬とによるコリンエステラーゼの不活性化の程度を総
括して測定し、間接的に農薬量を検出するものであり、
分別的な定量性を有さないものである。さらには、有機
リン系農薬とカルバメート系農薬とで農薬残留基準値が
異なることから、農薬基準値を基にした危険度判定を行
うためには、有機リン系農薬とカルバメート系農薬とを
異なる基準で検出する必要がある。
いる農薬検出方法は、有機リン系農薬とカルバメート系
農薬とによるコリンエステラーゼの不活性化の程度を総
括して測定し、間接的に農薬量を検出するものであり、
分別的な定量性を有さないものである。さらには、有機
リン系農薬とカルバメート系農薬とで農薬残留基準値が
異なることから、農薬基準値を基にした危険度判定を行
うためには、有機リン系農薬とカルバメート系農薬とを
異なる基準で検出する必要がある。
【０００８】そこで、本発明は、簡便に有機リン系農薬
とカルバメート系農薬とを分別して同時に検出する方法
を提供することを技術的課題とする。
とカルバメート系農薬とを分別して同時に検出する方法
を提供することを技術的課題とする。
【０００９】
【発明が解決しょうとする手段】上記課題を解決するた
め本発明は、有機リン系農薬がカルボキシルエステラー
ゼ（EC3.1.1.1.）の加水分解する能力を強く不活性化す
る作用及びカルバメート系農薬がコリンエステラーゼ(E
C3.1.1.7.)の加水分解する能力を強く不活性化する作用
の２つの酵素阻害反応を併用し、両酵素反応での基質の
加水分解に起因する分解量を測定することによって農薬
の検出を行うものであり、検出対象のサンプルをカルボ
キシルエステラーゼとコリンエステラーゼを含む混合溶
液中で反応させ、反応後の溶液を用いてカルボキシルエ
ステラーゼ特異基質及びコリンエステラーゼ特異基質を
加水分解し、複数の波長を同時に照射して経時変化の測
定が行える分光光度計を使用して、両基質の分解に起因
する吸収を同時に検出し、演算処理により各酵素触媒反
応の反応速度を算出し、この反応速度変化からサンプル
中の有機リン系農薬とカルバメート系農薬とを分別的に
検出するのである。
め本発明は、有機リン系農薬がカルボキシルエステラー
ゼ（EC3.1.1.1.）の加水分解する能力を強く不活性化す
る作用及びカルバメート系農薬がコリンエステラーゼ(E
C3.1.1.7.)の加水分解する能力を強く不活性化する作用
の２つの酵素阻害反応を併用し、両酵素反応での基質の
加水分解に起因する分解量を測定することによって農薬
の検出を行うものであり、検出対象のサンプルをカルボ
キシルエステラーゼとコリンエステラーゼを含む混合溶
液中で反応させ、反応後の溶液を用いてカルボキシルエ
ステラーゼ特異基質及びコリンエステラーゼ特異基質を
加水分解し、複数の波長を同時に照射して経時変化の測
定が行える分光光度計を使用して、両基質の分解に起因
する吸収を同時に検出し、演算処理により各酵素触媒反
応の反応速度を算出し、この反応速度変化からサンプル
中の有機リン系農薬とカルバメート系農薬とを分別的に
検出するのである。
【００１０】さらに、本発明の農薬検出方法は、カルボ
キシルエステラーゼの不活性化の程度及びコリンエステ
ラーゼの不活性化の程度を測定することによって、対象
サンプル中に含まれる有機リン系農薬とカルバメート系
農薬を間接的に検出するものである。したがって、サン
プル中に含まれる複数の農薬を個別に検出するのではな
く、複数の有機リン系農薬と複数のカルバメート系農薬
とをそれぞれ総括して分別的に検出するものである。
キシルエステラーゼの不活性化の程度及びコリンエステ
ラーゼの不活性化の程度を測定することによって、対象
サンプル中に含まれる有機リン系農薬とカルバメート系
農薬を間接的に検出するものである。したがって、サン
プル中に含まれる複数の農薬を個別に検出するのではな
く、複数の有機リン系農薬と複数のカルバメート系農薬
とをそれぞれ総括して分別的に検出するものである。
【００１１】検出対象のサンプルをカルボキシルエステ
ラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合液中で反応さ
せると、活性カルボキシルエステラーゼは主に有機リン
系農薬により不活性化され、活性コリンエステラーゼは
主にカルバメート系農薬により不活性化される。このと
き、カルボキシルエステラーゼとコリンエステラーゼの
不活性化の程度は、それぞれサンプル中に含まれる有機
リン系農薬とカルバメート系農薬の量に応答して変化
し、反応後の溶液中には、活性カルボキシルエステラー
ゼ、不活性化されたカルボキシルエステラーゼ、活性コ
リンエステラーゼ及び不活性化されたコリンエステラー
ゼを含むことになる。次に、この反応後の混合酵素溶液
を用いて、それぞれの酵素触媒反応で特異的に反応する
基質を加水分解する。このとき、加水分解速度は、活性
を維持している酵素量、つまりは、残存活性に応答す
る。そこで、これら基質の分解速度を、それぞれ異なる
信号により測定すれば、サンプル中に含まれる有機リン
系農薬とカルバメート系農薬とを分別的に検出すること
ができる。
ラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合液中で反応さ
せると、活性カルボキシルエステラーゼは主に有機リン
系農薬により不活性化され、活性コリンエステラーゼは
主にカルバメート系農薬により不活性化される。このと
き、カルボキシルエステラーゼとコリンエステラーゼの
不活性化の程度は、それぞれサンプル中に含まれる有機
リン系農薬とカルバメート系農薬の量に応答して変化
し、反応後の溶液中には、活性カルボキシルエステラー
ゼ、不活性化されたカルボキシルエステラーゼ、活性コ
リンエステラーゼ及び不活性化されたコリンエステラー
ゼを含むことになる。次に、この反応後の混合酵素溶液
を用いて、それぞれの酵素触媒反応で特異的に反応する
基質を加水分解する。このとき、加水分解速度は、活性
を維持している酵素量、つまりは、残存活性に応答す
る。そこで、これら基質の分解速度を、それぞれ異なる
信号により測定すれば、サンプル中に含まれる有機リン
系農薬とカルバメート系農薬とを分別的に検出すること
ができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例に基づいて
本発明をより詳細に説明する。
本発明をより詳細に説明する。
【００１３】実施例１
コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）活性測定は、酵素に市販
であるシグマ社製の電気ウナギ由来アセチルコリンエス
テラーゼ（ＡＣｈＥ ＥＣ3.1.1.7）と、馬血清由来ブ
チリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ ＥＣ 3.1.1.
8）を使用し、触媒反応生成物を呈色試薬で呈色させ、
これを吸光度測定する方法で行った。ＣｈＥ活性比色測
定法には、有機酸生成によるｐＨ変化を捉（とら）える
ｐＨ比色法、反応基質の減少を捉えるベンゾイルコリン
法や、２種の共役の酵素を用いる４−アミノアンチピリ
ン法（４−ＡＡＰ法）等もあるが、本実施例では、室
温、中性付近の水溶液中での初速度法による迅速測定が
可能という理由で、アセチルチオコリン（ＡＴＣ）、ブ
チリルチオコリン（ＢＴＣ）を反応基質に使用し、触媒
反応生成物チオコリンをチオール基検出試薬５’５’−
ジチオビス（ＤＴＮＢ）により発色させる方法（チオコ
リン法）を採用し、一連の試験管中での農薬阻害測定を
行った。
であるシグマ社製の電気ウナギ由来アセチルコリンエス
テラーゼ（ＡＣｈＥ ＥＣ3.1.1.7）と、馬血清由来ブ
チリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ ＥＣ 3.1.1.
8）を使用し、触媒反応生成物を呈色試薬で呈色させ、
これを吸光度測定する方法で行った。ＣｈＥ活性比色測
定法には、有機酸生成によるｐＨ変化を捉（とら）える
ｐＨ比色法、反応基質の減少を捉えるベンゾイルコリン
法や、２種の共役の酵素を用いる４−アミノアンチピリ
ン法（４−ＡＡＰ法）等もあるが、本実施例では、室
温、中性付近の水溶液中での初速度法による迅速測定が
可能という理由で、アセチルチオコリン（ＡＴＣ）、ブ
チリルチオコリン（ＢＴＣ）を反応基質に使用し、触媒
反応生成物チオコリンをチオール基検出試薬５’５’−
ジチオビス（ＤＴＮＢ）により発色させる方法（チオコ
リン法）を採用し、一連の試験管中での農薬阻害測定を
行った。
【００１４】被測定農薬には、近年の食品中残留農薬検
査結果、生産・販売実績及び食品残留基準値を参考に、
検出頻度の多いもの、散布頻度の多いもの、基準値の厳
しい（危険の高い）ものから約２０種を抽出した（表１
参照）。なお、全ての実験において、標準品の農薬を使
用した。
査結果、生産・販売実績及び食品残留基準値を参考に、
検出頻度の多いもの、散布頻度の多いもの、基準値の厳
しい（危険の高い）ものから約２０種を抽出した（表１
参照）。なお、全ての実験において、標準品の農薬を使
用した。
【表１】
【００１５】分光測定装置１は図１に示すように、光源
２と、バンドパスフィルター３と、該フィルターを複数
個備えて、所望のフィルターに変換できるフィルターチ
ェンジャー４と、透明容器で形成した測定セル５と、該
測定セル５を複数個備えて、所望の測定セル５を測定部
に移動することが可能な回転ステージ６と、前記測定セ
ル５内に自動的に基質、発色試薬及び緩衝液を注入する
自動注入装置７と、前記測定部からの透過光を測定する
検出部８とを備えたものを使用する。
２と、バンドパスフィルター３と、該フィルターを複数
個備えて、所望のフィルターに変換できるフィルターチ
ェンジャー４と、透明容器で形成した測定セル５と、該
測定セル５を複数個備えて、所望の測定セル５を測定部
に移動することが可能な回転ステージ６と、前記測定セ
ル５内に自動的に基質、発色試薬及び緩衝液を注入する
自動注入装置７と、前記測定部からの透過光を測定する
検出部８とを備えたものを使用する。
【００１６】各農薬に対する検量線作成及び阻害定数の
算出は以下の手順で行った。まず、図１に示すような測
定セル５内に、５０ｍＭ濃度リン酸緩衝液（ｐＨ7.2）
0.88ｍｌを注入し、これにエタノールを溶媒とした種々
の濃度の農薬溶液を２０μｌ添加し、さらに、ＣｈＥ溶
液１００μｌを添加する。そして、室温（２１〜２３
℃）静止条件下で１５分間インキュベートした後、基質
と呈色剤との混合液２ｍｌを添加後、直ちに最大吸収波
長４１２ｎｍでの経時変化測定を行った。
算出は以下の手順で行った。まず、図１に示すような測
定セル５内に、５０ｍＭ濃度リン酸緩衝液（ｐＨ7.2）
0.88ｍｌを注入し、これにエタノールを溶媒とした種々
の濃度の農薬溶液を２０μｌ添加し、さらに、ＣｈＥ溶
液１００μｌを添加する。そして、室温（２１〜２３
℃）静止条件下で１５分間インキュベートした後、基質
と呈色剤との混合液２ｍｌを添加後、直ちに最大吸収波
長４１２ｎｍでの経時変化測定を行った。
【００１７】ＤＴＮＢ濃度（呈色剤濃度）は全ての測定
で１．５ｍＭとし、基質濃度は最終０．１〜１ｍＭとな
るように調製した。なお、ＡＣｈＥ−ＡＴＣ系では最終
濃度０．３ｍＭ以上で基質過剰による活性低下が確認さ
れたので、０．３ｍＭ以下に調製した。触媒反応初速度
Ｖは反応開始後３０秒間の吸光度変化から算出し、農薬
阻害のないものを参照値として相対活性値（残存活性
値）に換算した。農薬濃度Ｉは測定セル５内での最終濃
度とし、検量線の作成を行った。
で１．５ｍＭとし、基質濃度は最終０．１〜１ｍＭとな
るように調製した。なお、ＡＣｈＥ−ＡＴＣ系では最終
濃度０．３ｍＭ以上で基質過剰による活性低下が確認さ
れたので、０．３ｍＭ以下に調製した。触媒反応初速度
Ｖは反応開始後３０秒間の吸光度変化から算出し、農薬
阻害のないものを参照値として相対活性値（残存活性
値）に換算した。農薬濃度Ｉは測定セル５内での最終濃
度とし、検量線の作成を行った。
【００１８】以上の条件により測定した結果を以下詳述
する。全ての農薬について、農薬濃度と相対活性値との
関係は、図２に示すようなシグモイド型の曲線性を示
し、濃度応答範囲が狭いことが分かった。
する。全ての農薬について、農薬濃度と相対活性値との
関係は、図２に示すようなシグモイド型の曲線性を示
し、濃度応答範囲が狭いことが分かった。
【００１９】検討した範囲では、有機リン系殺虫剤より
もカルバメート殺虫剤のほうが、全体的に１０倍程度は
検出感度が良好で、ＡＣｈＥを素子とするカルバメート
系殺虫剤の検出が最も高感度であった。農薬により異な
るが、初期濃度（添加するエタノール溶液濃度）で言え
ば、０．１〜１０ｐｐｍ以上での判定が可能であった。
一方、有機リン系殺虫剤では、ＡＣｈＥよりもＢＣｈＥ
のほうが高感受性を示す傾向を示した。しかしながら、
他の農薬と比較して毒性の高いエトプロホスやテルブホ
スに対しては感受性が低く、さらには、人に対する毒性
が低くなるように合成されたマラチオン等ではわずかな
活性低下しか確認されなかった。
もカルバメート殺虫剤のほうが、全体的に１０倍程度は
検出感度が良好で、ＡＣｈＥを素子とするカルバメート
系殺虫剤の検出が最も高感度であった。農薬により異な
るが、初期濃度（添加するエタノール溶液濃度）で言え
ば、０．１〜１０ｐｐｍ以上での判定が可能であった。
一方、有機リン系殺虫剤では、ＡＣｈＥよりもＢＣｈＥ
のほうが高感受性を示す傾向を示した。しかしながら、
他の農薬と比較して毒性の高いエトプロホスやテルブホ
スに対しては感受性が低く、さらには、人に対する毒性
が低くなるように合成されたマラチオン等ではわずかな
活性低下しか確認されなかった。
【００２０】さらに、阻害定数は農薬ごとに異なること
が分かった。つまり、一連の試験管中での農薬阻害測定
において、阻害定数の算出結果と、一日摂取許容量（Ａ
ＤＩ）との相関を調べたところ、図３に示すように有機
リン系殺虫剤、カルバメート系殺虫剤ともに相関は確認
されなかった。
が分かった。つまり、一連の試験管中での農薬阻害測定
において、阻害定数の算出結果と、一日摂取許容量（Ａ
ＤＩ）との相関を調べたところ、図３に示すように有機
リン系殺虫剤、カルバメート系殺虫剤ともに相関は確認
されなかった。
【００２１】以上の結果、カルバメート系殺虫剤のＡＣ
ｈＥに対する阻害定数は、−logＫｉでいえば、ほとん
どが６．５〜７．５と高かった。この結果は、１ｐｐｂ
〜１０ｐｐｂオーダーでの残留農薬判定が行えることを
示している。
ｈＥに対する阻害定数は、−logＫｉでいえば、ほとん
どが６．５〜７．５と高かった。この結果は、１ｐｐｂ
〜１０ｐｐｂオーダーでの残留農薬判定が行えることを
示している。
【００２２】したがって、コリンエステラーゼ(EC3.1.
1.7.)の他に、カルボキシルエステラーゼ（EC3.1.1.
1.）の酵素阻害反応を併用することで、有機リン系殺虫
剤の検出感度を向上させることができるのである。
1.7.)の他に、カルボキシルエステラーゼ（EC3.1.1.
1.）の酵素阻害反応を併用することで、有機リン系殺虫
剤の検出感度を向上させることができるのである。
【００２３】カルボキシルエステラーゼとコリンエステ
ラーゼとを含む混合溶液中での、各農薬に対する検量線
作成及び阻害定数の算出は上記と同様方法で行えばよ
い。また、基質と呈色剤との混合液の添加後の吸収波長
測定には、コリンエステラーゼに適する波長４１２ｎｍ
を使用する他、カルボキシルエステラーゼに適する波長
を４００〜５００ｎｍの間の適宜波長を選択し、複数の
波長を使用して経時変化の測定を使用するのである。そ
して、両基質の分解に起因する吸収を同時に検出し、さ
らに、演算処理により各酵素触媒反応の反応速度を算出
し、この反応速度変化からサンプル中の有機リン系農薬
とカルバメート系農薬とを分別的に検出するとよい。
ラーゼとを含む混合溶液中での、各農薬に対する検量線
作成及び阻害定数の算出は上記と同様方法で行えばよ
い。また、基質と呈色剤との混合液の添加後の吸収波長
測定には、コリンエステラーゼに適する波長４１２ｎｍ
を使用する他、カルボキシルエステラーゼに適する波長
を４００〜５００ｎｍの間の適宜波長を選択し、複数の
波長を使用して経時変化の測定を使用するのである。そ
して、両基質の分解に起因する吸収を同時に検出し、さ
らに、演算処理により各酵素触媒反応の反応速度を算出
し、この反応速度変化からサンプル中の有機リン系農薬
とカルバメート系農薬とを分別的に検出するとよい。
【００２４】なお、前記加水分解生成物に添加する発色
試薬として、ＤＴＮＢ溶液を用いることもできるし、ま
た、前記加水分解生成物自身を発色する基質として、パ
ラニトロフェニル安息香酸を用いることもできる。
試薬として、ＤＴＮＢ溶液を用いることもできるし、ま
た、前記加水分解生成物自身を発色する基質として、パ
ラニトロフェニル安息香酸を用いることもできる。
【００２５】
【発明の効果】以上のように本発明によれば、有機リン
系農薬がカルボキシルエステラーゼ（EC3.1.1.1.）の加
水分解する能力を強く不活性化する作用及びカルバメー
ト系農薬がコリンエステラーゼ(EC3.1.1.7.)の加水分解
する能力を強く不活性化する作用の２つの酵素阻害反応
を併用し、両酵素反応での基質の加水分解に起因する分
解量を測定することによって農薬の検出を行うものであ
り、検出対象のサンプルをカルボキシルエステラーゼと
コリンエステラーゼを含む混合溶液中で反応させ、反応
後の溶液を用いてカルボキシルエステラーゼ特異基質及
びコリンエステラーゼ特異基質を加水分解し、複数の波
長を同時に照射して経時変化の測定が行える分光光度計
を使用して、両基質の分解に起因する吸収を同時に検出
し、演算処理により各酵素触媒反応の反応速度を算出
し、この反応速度変化からサンプル中の有機リン系農薬
とカルバメート系農薬とを分別的に検出するので、簡便
に有機リン系農薬とカルバメート系農薬とを同時に分別
する方法を提供することが可能となった。
系農薬がカルボキシルエステラーゼ（EC3.1.1.1.）の加
水分解する能力を強く不活性化する作用及びカルバメー
ト系農薬がコリンエステラーゼ(EC3.1.1.7.)の加水分解
する能力を強く不活性化する作用の２つの酵素阻害反応
を併用し、両酵素反応での基質の加水分解に起因する分
解量を測定することによって農薬の検出を行うものであ
り、検出対象のサンプルをカルボキシルエステラーゼと
コリンエステラーゼを含む混合溶液中で反応させ、反応
後の溶液を用いてカルボキシルエステラーゼ特異基質及
びコリンエステラーゼ特異基質を加水分解し、複数の波
長を同時に照射して経時変化の測定が行える分光光度計
を使用して、両基質の分解に起因する吸収を同時に検出
し、演算処理により各酵素触媒反応の反応速度を算出
し、この反応速度変化からサンプル中の有機リン系農薬
とカルバメート系農薬とを分別的に検出するので、簡便
に有機リン系農薬とカルバメート系農薬とを同時に分別
する方法を提供することが可能となった。
【００２６】検出対象のサンプルをカルボキシルエステ
ラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合液中で反応さ
せると、活性カルボキシルエステラーゼは主に有機リン
系農薬により不活性化され、活性コリンエステラーゼは
主にカルバメート系農薬により不活性化される。このと
き、カルボキシルエステラーゼとコリンエステラーゼの
不活性化の程度は、それぞれサンプル中に含まれる有機
リン系農薬とカルバメート系農薬の量に応答して変化
し、反応後の溶液中には、活性カルボキシルエステラー
ゼ、不活性化されたカルボキシルエステラーゼ、活性コ
リンエステラーゼ及び不活性化されたコリンエステラー
ゼを含むことになる。次に、この反応後の混合酵素溶液
を用いて、それぞれの酵素触媒反応で特異的に反応する
基質を加水分解する。このとき、加水分解速度は、活性
を維持している酵素量、つまりは、残存活性に応答す
る。そこで、これら基質の分解速度を、それぞれ異なる
信号により測定すれば、有機リン系農薬の農薬とカーバ
メート系農薬の農薬が混在している場合であっても、複
数の農薬群を、複数の酵素により反応速度論的に吸光度
検出することができる。
ラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合液中で反応さ
せると、活性カルボキシルエステラーゼは主に有機リン
系農薬により不活性化され、活性コリンエステラーゼは
主にカルバメート系農薬により不活性化される。このと
き、カルボキシルエステラーゼとコリンエステラーゼの
不活性化の程度は、それぞれサンプル中に含まれる有機
リン系農薬とカルバメート系農薬の量に応答して変化
し、反応後の溶液中には、活性カルボキシルエステラー
ゼ、不活性化されたカルボキシルエステラーゼ、活性コ
リンエステラーゼ及び不活性化されたコリンエステラー
ゼを含むことになる。次に、この反応後の混合酵素溶液
を用いて、それぞれの酵素触媒反応で特異的に反応する
基質を加水分解する。このとき、加水分解速度は、活性
を維持している酵素量、つまりは、残存活性に応答す
る。そこで、これら基質の分解速度を、それぞれ異なる
信号により測定すれば、有機リン系農薬の農薬とカーバ
メート系農薬の農薬が混在している場合であっても、複
数の農薬群を、複数の酵素により反応速度論的に吸光度
検出することができる。
【図１】分光測定装置の概略構成を示す縦断面図であ
る。
る。
【図２】農薬濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ
活性の依存性を示すグラフである。
活性の依存性を示すグラフである。
【図３】農薬によるコリンエステラーゼの阻害定数と一
日摂取許容量（ADI）との関係を示すグラフである。
日摂取許容量（ADI）との関係を示すグラフである。
１ 分光測定装置
２ 光源
３ バンドパスフィルター
４ フィルターチェンジャー
５ 測定セル
６ 回転ステージ
７ 自動注入装置
８ 検出部
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ61 QQ95 QR12 QR57
QS36 QX01
Claims (4)
- 【請求項１】 検出対象のサンプルをカルボキシルエス
テラーゼとコリンエステラーゼとを含む混合溶液中で反
応させ、反応後の溶液を用いてカルボキシルエステラー
ゼ特異基質とコリンエステラーゼ特異基質とを加水分解
し、基質の加水分解生成物に発色試薬を添加して発色さ
せるか、又は、加水分解生成物自身が発色する基質を使
用して発色させ、複数波長のスペクトル変化測定を同時
に測定することで、サンプル中の有機リン系農薬群とカ
ルバメート農薬群とを分別して同時に検出することを特
徴とする残留農薬検出方法。 - 【請求項２】 前記複数波長のスペクトル変化測定を同
時に経時的に測定した後、演算処理により前記各酵素に
よる触媒反応の反応速度を算出し、この反応速度変化か
らサンプル中の有機リン系農薬とカルバメート系農薬と
を分別的に検出してなる請求項１記載の残留農薬検出方
法。 - 【請求項３】 前記加水分解生成物に添加する発色試薬
として、ＤＴＮＢ溶液を用いてなる請求項１又は２記載
の残留農薬検出方法。 - 【請求項４】 前記加水分解生成物自身を発色する基質
として、パラニトロフェニル安息香酸を用いてなる請求
項１又は２記載の残留農薬検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001188744A JP2003000298A (ja) | 2001-06-21 | 2001-06-21 | 残留農薬検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001188744A JP2003000298A (ja) | 2001-06-21 | 2001-06-21 | 残留農薬検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003000298A true JP2003000298A (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=19027785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001188744A Pending JP2003000298A (ja) | 2001-06-21 | 2001-06-21 | 残留農薬検出方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003000298A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270008A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Satake Corp | 残留農薬分析方法 |
| KR101053096B1 (ko) | 2009-07-30 | 2011-08-03 | 대한민국 | 카트리지를 이용한 패러캇 디클로라이드 분석방법 |
| CN103305589A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-09-18 | 南宁市健雄厨房设备有限公司 | 一种蔬菜中农药残留的检测的方法 |
| WO2019096325A1 (zh) * | 2017-11-20 | 2019-05-23 | 江苏达骏生物科技有限公司 | 一种双酰胺复合物及其制备方法和用途 |
| CN111220602A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 上海尚湾信息技术有限公司 | 一种氨基甲酸酯类农药残留的快速检测装置 |
| CN113720942A (zh) * | 2021-09-24 | 2021-11-30 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 对硝基苯磷酸二甲酯水解体系实时定量的检测方法 |
| CN114235792A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-25 | 广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) | 一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法 |
-
2001
- 2001-06-21 JP JP2001188744A patent/JP2003000298A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270008A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Satake Corp | 残留農薬分析方法 |
| US7655430B2 (en) | 2004-03-25 | 2010-02-02 | Satake Corporation | Method for analyzing residual agricultural chemical |
| JP4553181B2 (ja) * | 2004-03-25 | 2010-09-29 | 株式会社サタケ | 残留農薬分析方法 |
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