CN114235792A - 一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,包括如下步骤:(1)将待测样品液和猪肝羧酸酯酶液混合均匀后静置;(2)取步骤(1)溶液,加入底物α‑乙酸萘酯,水浴加热;(3)取步骤(2)溶液,加入终止剂和显色剂,混合,再加入盐酸;(4)取步骤(3)溶液,测定溶液中显色产物的吸光度值;(5)设置不添加待测样品液的空白对照组,测定空白对照组中显色产物的吸光度值b;(6)比较吸光度值a与吸光度值b。本发明通过加入含有拟除虫菊酯类农药残留的待测液抑制猪肝羧酸酯酶的活性,以α‑乙酸萘酯为反应底物,固蓝B盐溶液为显色剂,经测定显色产物的吸光度值,通过吸光度值反应拟除虫菊酯类农药残留对酶的抑制效果,从而快速检测果蔬中的拟除虫菊酯类农药残留。
Description
技术领域
本发明涉及农药残留的检测方法技术领域,特别是涉及一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法。
背景技术
由于蔬菜水果的产量大、生产分散、销售期短,专业技术强、成本高、检测时间长的实验室检测技术已无法满足蔬菜水果的全面监测,因此农药残留快速检测技术成为了我国食品安全监管的主要技术手段。目前检出率较高的农药包括拟除虫菊酯类、有机磷类和氨基甲酸酯类农药,其中拟除虫菊酯类农药已成为第二大类除虫剂,其使用量约占所有农药使用量的1/4。然而目前蔬菜中农药残留快速检测的主要依据是国家标准GB/T 5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》,该标准方法只适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测,而不能用于检测检出率同样高的拟除虫菊酯类农药残留。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,所述方法操作简单快速,适宜基层人员现场操作,能够满足果蔬中拟除虫菊酯类农药快速检测的需求。
为了实现上述目的,本发明提供的技术方案为:
一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,包括如下步骤:
(1)将待测样品液和猪肝羧酸酯酶液混合均匀后静置,进行酶抑制反应;
(2)取步骤(1)溶液,加入底物α-乙酸萘酯,混合均匀,水浴加热,进行水解反应;
(3)取步骤(2)溶液,加入终止剂和显色剂,混合,使溶液反应显色,再加入盐酸使溶液显色稳定;
(4)取步骤(3)显色后的溶液,测定溶液中显色产物的吸光度值a;
(5)设置不添加待测样品液的空白对照组,执行步骤(1)~(4),测定空白对照组中显色产物的吸光度值b;
(6)比较吸光度值a与吸光度值b,当a小于b时,则检测出拟除虫菊酯类农药残留;否则,则无拟除虫菊酯类农药残留。
作为上述方案的进一步改进,所述步骤(1)的具体步骤为:吸取待测样品液和猪肝羧酸酯酶液加入离心管中,涡旋混合30~40s,静置5~20min进行酶抑制反应。
作为上述方案的进一步改进,所述待测样品液与所述猪肝羧酸酯酶液的体积比为70:1~100:1。
作为上述方案的进一步改进,所述待测样品液的浓度为0.1~0.5μg/mL,所述猪肝羧酸酯酶液的浓度为2~8μg/mL。
作为上述方案的进一步改进,所述待测样品液的浓度为0.3~0.4μg/mL。
作为上述方案的进一步改进,所述步骤(4)的具体步骤为:取步骤(3)显色后的溶液于比色皿中,利用双酶法农药残留快速检测仪器或分光光度计检测,在536nm波长下测定溶液中显色产物的吸光度值。
作为上述方案的进一步改进,所述步骤(2)中,水浴加热是在35~60℃水浴中加热10~20min。
作为上述方案的进一步改进,所述底物的浓度为2×10-4~10×10-4mol/L,所述盐酸溶液的浓度为1~10mol/L。
作为上述方案的进一步改进,所述终止剂为十二烷基硫酸钠溶液,质量分数为3~20%。
作为上述方案的进一步改进,所述显色剂为固蓝B盐溶液,质量分数为0.04~0.1%。
本发明基于羧酸酯酶的酶抑制原理,使用对拟除虫菊酯类农药残留敏感的猪肝羧酸酯酶作为酶液,建立分光光度法检测拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法。拟除虫菊酯类农药残留对猪肝羧酸酯酶有明显抑制作用,能抑制猪肝羧酸酯酶对α-乙酸萘酯的水解反应,使水解产物α-萘酚减少,导致其与显色剂固蓝B盐溶液的显色反应生成物也相应减少。在536nm波长下,测定显色产物吸光度值即可反映出拟除虫菊酯类农药的残留量,农药残留量越大,产生的抑制作用越强,显色产物的吸光度值就越小。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明选用猪肝羧酸酯酶作为工作酶,α-乙酸萘酯作为反应底物,固蓝B盐溶液作为显色剂,十二烷基硫酸钠(SDS)溶液作为终止剂,通过加入含有拟除虫菊酯类农药残留的待测液抑制猪肝羧酸酯酶的活性,利用分光光度法测定显色产物的吸光度值,通过吸光度值反应拟除虫菊酯类农药残留对猪肝羧酸酯酶的抑制效果,从而快速检测果蔬中的拟除虫菊酯类农药残留。
附图说明
图1为不同浓度α-萘酚标准溶液与固蓝B盐的显色反应情况图;
图2为不同浓度α-萘酚标准溶液与固蓝B盐的显色反应标准曲线图;
图3为联苯菊酯对猪肝羧酸酯酶的抑制效果图;
图4为甲氰菊酯对猪肝羧酸酯酶的抑制效果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
水解底物α-萘酚与固蓝B盐显色反应的标准曲线
分别移取4.0mL PBS缓冲液、0.25mL系列α-萘酚标准工作溶液(浓度分别为0、0.5×10-4、1×10-4、2×10-4、4×10-4、6×10-4mol/L)加入离心管中混合均匀,然后加入0.25mL终止剂(SDS)和0.25mL显色剂(固蓝B盐溶液),涡旋混匀30s,再加入0.25mL盐酸,摇匀后吸取3mL待测液于比色皿中,放入分光光度计中,在536nm波长下测定吸光度值,并绘制α-萘酚显色反应的标准曲线。
由图1和图2可知,水解产物α-萘酚与显色剂固蓝B盐溶液显色反应生成的红色物质随着α-萘酚浓度的增大而颜色加深,且在0~6×10-4mol/Lα-萘酚标准工作溶液浓度范围内,与吸光度值成线性相关,R2=0.9996。因此在536nm测定波长下,可以用分光光度法检测猪肝羧酸酯酶水解底物α-乙酸萘酯后与固蓝B盐的显色反应。
实施例1:
分别移取50μL浓度为2μg/mL的猪肝羧酸酯酶酶液、3.7mL PBS缓冲液、0.25mL浓度为0.1μg/mL的拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯)标准工作液加入离心管中,混合均匀,涡旋30s,静置;加入0.25mL浓度为2×10-4mol/L的α-乙酸萘酯底物混合均匀,在35℃下水浴加热10min,然后加入0.25mL终止剂(SDS)和0.25mL显色剂(固蓝B盐溶液),涡旋混匀30s,再加入0.25mL盐酸,摇匀后吸取3mL待测液于比色皿中,放入分光光度计中,在536nm波长下测定吸光度值,测定联苯菊酯对猪肝羧酸酯酶的抑制效果。
实施例2:
操作方法与实施例1相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯)标准工作液的浓度为0.2μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为3μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为2.5×10-4mol/L,水浴加热温度为40℃,加热时间为12min。
实施例3:
操作方法与实施例1相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯)标准工作液的浓度为0.3μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为5μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为3×10-4mol/L,水浴加热温度为45℃,加热时间为15min。
实施例4:
操作方法与实施例1相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯)标准工作液的浓度为0.4μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为7μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为3.5×10-4mol/L,水浴加热温度为50℃,加热时间为18min。
实施例5:
操作方法与实施例1相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯)标准工作液的浓度为0.5μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为8μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为4×10-4mol/L,水浴加热温度为60℃,加热时间为20min。
对比例1:
操作方法与实施例1相同,不同之处在于不加入拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯)标准工作液。
实施例6:
分别移取50μL浓度为2μg/mL的猪肝羧酸酯酶酶液、3.7mL PBS缓冲液、0.25mL浓度为0.1μg/mL的拟除虫菊酯类农药(甲氰菊酯)标准工作液加入离心管中,混合均匀,涡旋30s,静置;加入0.25mL浓度为2×10-4mol/L的α-乙酸萘酯底物混合均匀,在在35℃下水浴加热10min水浴加热,然后加入0.25mL终止剂(SDS)和0.25mL显色剂(固蓝B盐溶液),涡旋混匀30s,再加入0.25mL盐酸,摇匀后吸取3mL待测液于比色皿中,放入分光光度计中,在536nm波长下测定吸光度值,测定甲氰菊酯对猪肝羧酸酯酶的抑制效果。
实施例7:
操作方法与实施例6相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(甲氰菊酯)标准工作液的浓度为0.2μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为3μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为2.5×10-4mol/L,水浴加热温度为40℃,加热时间为12min。
实施例8:
操作方法与实施例6相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(甲氰菊酯)标准工作液的浓度为0.3μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为5μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为3×10-4mol/L,水浴加热温度为45℃,加热时间为15min。
实施例9:
操作方法与实施例6相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(甲氰菊酯)标准工作液的浓度为0.4μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为7μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为3.5×10-4mol/L,水浴加热温度为50℃,加热时间为18min。
实施例10:
操作方法与实施例6相同,不同之处在于所加入的拟除虫菊酯类农药(甲氰菊酯)标准工作液的浓度为0.5μg/mL,所加入的猪肝羧酸酯酶酶液的浓度为8μg/mL,所加入的α-乙酸萘酯底物的浓度为4×10-4mol/L,水浴加热温度为60℃,加热时间为20min。
对比例2:
操作方法与实施例6相同,不同之处在于不加入拟除虫菊酯类农药(甲氰菊酯)标准工作液。
分别将对比例1和实施例1~5以及对比例2和实施例6~10所测定的吸光度值进行统计,绘制成如图3、图4所示的曲线图。
由图3和图4可知,当联苯菊酯和甲氰菊酯浓度达到0.1μg/mL时即对猪肝羧酸酯酶产生了明显的抑制效果,且随着联苯菊酯和甲氰菊酯标准溶液浓度的增加,抑制效果更为显著,显色产物逐渐减少,吸光度值下降,当联苯菊酯浓度达到0.3μg/mL、甲氰菊酯浓度达到0.4μg/mL时,抑制程度达到最大值。因此拟除虫菊酯类农药对猪肝羧酸酯酶有明显的抑制效果,能影响猪肝羧酸酯酶催化α-乙酸萘酯水解的能力,使水解产物减少并无法与固蓝B盐形成显色产物。通过上述实验,确定了猪肝羧酸酯酶适合作为测定拟除虫菊酯类农药残留的工作酶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和替换,这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将待测样品液和猪肝羧酸酯酶液混合均匀后静置,进行酶抑制反应;
(2)取步骤(1)溶液,加入底物α-乙酸萘酯,混合均匀,水浴加热,进行水解反应;
(3)取步骤(2)溶液,加入终止剂和显色剂,混合,使溶液反应显色,再加入盐酸使溶液显色稳定;
(4)取步骤(3)显色后的溶液,测定溶液中显色产物的吸光度值a;
(5)设置不添加待测样品液的空白对照组,执行步骤(1)~(4),测定空白对照组中显色产物的吸光度值b;
(6)比较吸光度值a与吸光度值b,当a小于b时,则检测出拟除虫菊酯类农药残留;否则,则无拟除虫菊酯类农药残留。
2.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述步骤(1)的具体步骤为:吸取待测样品液和猪肝羧酸酯酶液加入离心管中,涡旋混合30~40s,静置5~20min进行酶抑制反应。
3.根据权利要求1或2所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述待测样品液与所述猪肝羧酸酯酶液的体积比为70:1~100:1。
4.根据权利要求1、2或3所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述待测样品液的浓度为0.1~0.5μg/mL,所述猪肝羧酸酯酶液的浓度为2~8μg/mL。
5.根据权利要求4所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述待测样品液的浓度为0.3~0.4μg/mL。
6.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述步骤(4)的具体步骤为:取步骤(3)显色后的溶液于比色皿中,利用双酶法农药残留快速检测仪器或分光光度计检测,在536nm波长下测定溶液中显色产物的吸光度值。
7.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中,水浴加热是在35~60℃水浴中加热10~20min。
8.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述底物的浓度为2×10-4~10×10-4mol/L,所述盐酸溶液的浓度为1~10mol/L。
9.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述终止剂为十二烷基硫酸钠溶液,质量分数为3~20%。
10.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法,其特征在于,所述显色剂为固蓝B盐溶液,质量分数为0.04~0.1%。
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