JP2009039054A - ピレスロイド系農薬の検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】酵素阻害法を利用して一つの酵素により複数種のピレスロイドを検出することができるピレスロイド系農薬の検査方法を提供する。
【解決手段】試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程10と、酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、アデノシン三リン酸及びルシフェラーゼを加えて発光を生じさせる発光反応工程11と、発光を測定する発光測定工程12と、アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、ピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、を備えた。
【選択図】図1
【解決手段】試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程10と、酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、アデノシン三リン酸及びルシフェラーゼを加えて発光を生じさせる発光反応工程11と、発光を測定する発光測定工程12と、アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、ピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、を備えた。
【選択図】図1
Description
本発明は、酵素阻害法によるピレスロイド系農薬の検査方法に関する。
ピレスロイド系農薬は、古くから存在する除虫菊(シロバナムシヨケグサ)の殺虫有効成分から派生した農薬であり、例えば、アレスリン、フタルスリン、レスメトリンなど多数が殺虫剤として開発されている。また、菊酸には多数の光学異性体が存在し、従来、これら光学異性体の検査は、検査・分析機関や研究機関等に設置してある高価なガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用いなければ分析することができなかった(例えば、特許文献1参照)。
そこで、手間と時間並びに設備費等を抑えて、より簡便でかつ迅速に測定することが可能な、抗原抗体法を利用した免疫学的検出法もある(特許文献2参照)。
特許文献2記載の抗原抗体法を利用した免疫学的検出法によれば、ピレスロイドに対して特異的に反応するより優れた抗体を開発する上で鋭意研究したものであるが、特定ピレスロイド農薬に対しての分析には効果があると思われるが、残留農薬のように多種の成分が混合したものを分析する際は、それぞれの農薬に対して特異性のある多数の抗体を用意して分析する必要があり、抗体の開発に多大な手間と時間並びに費用がかかると思われる。
本発明は上記問題点にかんがみ、抗原抗体法を利用した免疫学的検出法よりも、より簡易的に残留農薬をスクリーニングする方法を提供するものであり、詳しくは酵素阻害法を利用して一つの酵素により複数種のピレスロイドを検出することができるピレスロイド系農薬の検査方法を提供することを技術的課題とする。
上記課題を解決するため請求項1記載の発明は、試料サンプル中のピレスロイド系農薬の濃度を検査するための方法であって、該方法は、a)試料サンプルとアピラーゼとをインキュベートして、前記試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程と、b)該工程で酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、アデノシン三リン酸及びルシフェラーゼを加えて、発光を生じさせる発光反応工程と、c)該発光反応工程にて生じる一定時間の発光を測定する発光測定工程と、d)アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、その相対活性値RAの逆数RA−1が、試料中のピレスロイド系農薬濃度に対して応答することを利用してピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、を備えたことを特徴とするものである。
請求項1記載の発明によれば、酵素接触の工程においては、アピラーゼをATP分解酵素として働かせるのではなく、ピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素と接触させ、次いで、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びアデノシン三リン酸を加えて発光反応工程を行うことでアピラーゼとルシフェラーゼの基質を奪い合う反応が発光量として測定できる。そして、アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、その相対活性値RAの逆数RA−1が、試料中のピレスロイド系農薬濃度に対して応答することを利用して農薬濃度を決定する濃度算出工程を備えているので、複数種のピレスロイド系農薬が共存する試料であっても、各農薬ごと酵素阻害した量の和をもって総括的な農薬による酵素阻害量を知ることができ、その酵素阻害量の測定結果(相対活性値)から、その中に含まれる複数の未知濃度の農薬すべてについての最大残存濃度を知ることができる。
なお、アピラーゼと同様にピレスロイド系農薬に酵素活性を阻害されるATPaseにあっては、検出感度が低いために農薬検出のような超微量検出が必要な測定には適さない。
本発明を実施するための最良の形態を説明する。ルシフェリンとルシフェラーゼを用いた生物化学発光法により細胞内ATP(アデノシン三リン酸)を測定し、食品などの雑菌による汚染を測定することはよく知られている。また、本発明者らはATPをAMP(アデノシン一リン酸)まで分解する酵素であるアピラーゼが、ピレスロイド系の農薬成分に高感度で阻害されることを見出した。ルシフェラーゼ及びアピラーゼ両酵素は共にATPを基質とし、これら2酵素の反応を利用することでピレスロイド系農薬成分含有量を推定することができる方法を開発したのである。
そして、本発明では、迅速に、一般的には、30分から60分で検出でき、しかも、100ppbレベル以下と感度もよく、水、土壌、食物(穀物、果物及び野菜など)やその他の物質に含まれる複数のピレスロイド系農薬を生物化学発光法により検出することができるものである。
図1は本発明の検査方法の検出手順を示す概略図である。図1に示す符号1は、被測定試料の前処理工程であり、被測定試料の粉砕工程2、粉砕試料の秤量工程3、農薬の抽出を行うための振とう工程4及び有機溶剤により抽出した農薬を水溶液中に溶解させ有機溶剤を除去する減圧濃縮工程5を備えている。この前処理工程1で抽出した農薬の水溶液を抽出液6とする。
そして、容量2mLの供試用のバイアル瓶7a及び対照用のバイアル瓶7b,7cの計3個のバイアル瓶を準備し、7aには抽出液6を0.5mL投入し7b,7cには抽出成分が入っていない緩衝液を投入し、次に各バイアルにアピラーゼ測定用緩衝液を投入し(符号8)、さらに、バイアル瓶7a,7bにはピレスロイド系農薬を投入し、バイアル瓶7cにはメタノール(MeOH)を投入する(符号9)。なお、符号9に示すピレスロイド系農薬及びメタノールのバイアル瓶7a,7b,7cの投入工程は、本来、被測定試料中にピレスロイド系農薬が含まれていれば不要である。本実施形態では、アピラーゼがピレスロイド系農薬成分を実際に阻害するか否かをテストするために、作為的に符号9の工程を設けている。
そして、バイアル瓶7a,7cには、アピラーゼ溶液を0.1mLずつ投入するとともに、バイアル瓶7cには、緩衝液を0.1mL投入して、約1時間放置して酵素接触させた(符号10)。
上記のように酵素接触させた後、バイアル瓶7a,7b,7cのそれぞれに発光試薬(ルシフェリン、ルシフェラーゼ)0.1mL及び測定ノイズとなる抽出液中のATPを無視できる程高濃度のATP0.1mLを添加して蛍光発光反応を開始させ(符号11)、各バイアル瓶7a,7b,7cの発光量をルミノメータ(光電子倍増管、アドバンテック社製、型式ATP−3010)により測定した(符号12)。
図2は蛍光発光反応の発光量の累積経時変化を示したもので、黒丸印でプロットしたもの(バイアル瓶7b)はルシフェラーゼの活性度合いを表す。白抜き丸印でプロットしたもの(バイアル瓶7c)は農薬非存在下でルシフェラーゼとアピラーゼが共存しているときのルシフェラーゼの活性度合いを表す。三角印でプロットしたもの(バイアル瓶7c)は農薬存在下でルシフェラーゼとアピラーゼが共存しているときのルシフェラーゼの活性度合いを表す。白抜き丸印でプロットしたもの(バイアル瓶7c)はアピラーゼの活性度合い分、黒丸印でプロットしたもの(バイアル瓶7b)に比べ累積発光量が低下する。一方、同様にアピラーゼとルシフェラーゼが共存していても、さらに農薬が加わることでアピラーゼのATP分解作用が阻害されるため、農薬濃度が高まる程、黒丸印でプロットしたもの(バイアル瓶7b)に近づくように発光量が回復する。
図3はアピラーゼの代替手段として、ATP分解酵素ATPaseを使用したときのシラフルオフェンの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示したものである。この図3は、例えば、本発明者らが発明した特許第3473022号に開示される、試料中に農薬が存在するときの酵素活性の程度と農薬が非存在下での酵素活性の程度との比から求めた相対活性値RAの逆数RA−1が、農薬濃度に対して応答することを利用して作図することができる。これにより、複数種のピレスロイド系農薬が共存する試料であっても、各農薬ごと酵素阻害した量の和をもって総括的な農薬による酵素阻害量を知ることができ、その酵素阻害量の測定結果(相対活性値)から、その中に含まれる複数の未知濃度の農薬すべてについての最大残存濃度を知ることができる。
そして、この図3を参照すれば、ATPaseはATPをADP(アデノシン二リン酸)に分解する酵素であり、アピラーゼと同様にピレスロイド系農薬に酵素活性を阻害されるものではあるが、感度が低いために残留農薬検出のような超微量検出が必要な測定には適さないことが分かった。
供試農薬として、ピレスロイド系殺虫剤を11種類(エトフェンプロックス、シハロトリン、シペルメトリン、シラフルオフェン、トラロメトリン、ビフェントリン、フェンバレレート、フェンプロパトリン、フルシトリネート、フルバリネート及びペルメトリン)準備した。使用酵素としては、ジャガイモ由来のアピラーゼを使用した。測定溶液としては、理想溶液(0.1M HEPES(pH7.5)+0.1M KCl+0.1M CaCl2+10mM NaCl+1mM EDTA)を用いた。測定方法としては、理想溶液に農薬、酵素を加えて2時間以上酵素接触した後、発光試薬とATPを添加してリシフェラーゼ反応を開始させ、反応後20〜21分の間の1分間の発光量をルミノメータ(光電子倍増管、アドバンテック社製、型式ATP−3010)により測定した。
上記実施例の代表的な結果を図4及び図5に示す。図4はシラフルオフェン及びエトフェンプロックスを測定したときの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示したもので、図5はシラフルオフェン、シハロトリン及びトラロメトリンを測定したときの酵素阻害信号と農薬濃度との関係を示したものである。このデータによれば、ピレスロイド系殺虫剤としての需要の高いシラフルオフェンと同等かそれ以上の高感度でアピラーゼに対する阻害剤としての素質があることが分かる。
図6は、シラフルオフェンを基準として前記各農薬がアピラーゼに対して同等の感度の阻害であるか(白丸印)、又はアピラーゼに対してシラフルオフェンよりも高感度の阻害であるか(黒丸印)を集計した結果を示す表である。これにより、測定した11種類のピレスロイド系殺虫剤の全てがシラフルオフェンと同等かそれよりも高感度にアピラーゼに対する阻害剤としての素質があることが分かる。
図7は、種々のピレスロイド系農薬を構造的に分類した図である。この図7からピレスロイド系農薬は分子構造の中に特徴となる構造が3つあること分かった。そして、図7に示す特徴1、特徴2及び特徴3の全ての構造を有するピレスロイド系農薬としては、トラロメトリン、シハロトリン、フェンプロパトリン、シペルメトリンが挙げられ、特徴1及び特徴2の構造を有するピレスロイド系農薬としては、フェンバレレート、フルバリネート、フルシトリネートが挙げられ、特徴1のみの構造を有するピレスロイド系農薬としては、エトフェンプロックス、シラフルオフェンが挙げられる。
図7のような分類によって、例外もあるが、特徴1、特徴2及び特徴3の全ての構造を有するピレスロイド系農薬はアピラーゼへの阻害性が、特徴1のみの構造を有するシラフルオフェンに比較して高い傾向にあることが分かった。
なお、本実施例で使用した使用酵素としては、ジャガイモ由来のアピラーゼを使用したが、これに限定されることはなく、昆虫由来のアピラーゼ、又はロブスターの筋や肝由来のアピラーゼを使用することができる。
1 前処理工程
2 粉砕工程
3 秤量工程
4 振とう工程
5 減圧濃縮工程
6 抽出液
7 バイアル瓶
8 緩衝液投入工程
9 農薬投入工程
10 酵素反応工程
11 発光反応工程
12 発光測定工程
2 粉砕工程
3 秤量工程
4 振とう工程
5 減圧濃縮工程
6 抽出液
7 バイアル瓶
8 緩衝液投入工程
9 農薬投入工程
10 酵素反応工程
11 発光反応工程
12 発光測定工程
Claims (8)
- 試料サンプル中のピレスロイド系農薬の濃度を検査するための方法であって、該方法は、
a)試料サンプルとアピラーゼとをインキュベートして、前記試料中に含まれるピレスロイド系農薬がアピラーゼに対しての酵素阻害剤として働くように酵素接触させる工程と、
b)該酵素接触させた混合物に、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びアデノシン三リン酸を加えて、発光を生じさせる発光反応工程と、
c)該発光反応工程にて生じる一定時間の発光を測定する発光測定工程と、
d)アピラーゼ無添加時のルシフェラーゼの発光量と、ピレスロイド系農薬非存在下でアピラーゼ添加時のルシフェラーゼ発光量と、試料サンプルで生じた発光量から、ピレスロイド系農薬非存在下と試料中でのアピラーゼの活性の程度を算出し、その相対活性値RAの逆数RA−1が、試料中のピレスロイド系農薬濃度に対して応答することを利用してピレスロイド系農薬の濃度を決定する濃度算出工程と、
を備えたことを特徴とするピレスロイド系農薬の検査方法。 - 前記アピラーゼが、昆虫、ロブスター又はジャガイモからなる群から選択される請求項1記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
- 前記ピレスロイド系農薬が、エトフェンプロックス又はシラフルオフェンからなる群から選択される請求項3記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
- 前記ピレスロイド系農薬が、フェンバレレート、フルバリネート又はフルシトリネートからなる群から選択される請求項4記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
- 前記ピレスロイド系農薬が、トラロメトリン、シハロトリン、フェンプロパトリン又はシペルメトリンからなる群から選択される請求項5記載のピレスロイド系農薬の検査方法。
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JP2007208727A JP2009039054A (ja) | 2007-08-10 | 2007-08-10 | ピレスロイド系農薬の検査方法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114235792A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-25 | 广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) | 一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法 |
-
2007
- 2007-08-10 JP JP2007208727A patent/JP2009039054A/ja active Pending
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CN114235792A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-25 | 广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) | 一种拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法 |
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