CN116660538A - 试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例属于免疫诊断技术领域,涉及一种试剂盒及检测方法,所述试剂盒包括试纸条,所述试纸条包括结合垫和硝酸纤维素膜;所述结合垫上固定有荧光标记抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体;硝酸纤维素膜设有检测线和质控线;所述荧光标记抗体为ST2抗体时,所述检测线包被有ST2抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;所述为荧光标记抗体为补体因子H抗体时,所述检测线包被的有补体因子H抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;或者所述荧光标记抗体为胰岛素样生长因子结合蛋白‑3抗体时,所述检测线包被的有胰岛素样生长因子结合蛋白‑3抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体。本申请能够快速有效检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白‑3。
Description
技术领域
本申请涉及免疫诊断技术领域,尤其涉及试剂盒及检测方法。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(growth STimulation expressed gene 2,ST2)是白细胞介素1受体超家族的成员之一,包括4种亚型,即可溶性ST2(sST2)、跨膜型ST2(ST2L)、可溶型ST2(sST2)、多变型ST2(ST2V)以及跨膜多变型ST2(ST2LV)。其中sST2、ST2L是心力衰竭的重要研究对象。2005年,Schmitz等证实白介素-33(IL-33)为ST2的功能性配体,IL-33/ST2L能够抗心肌纤维化,从而起到保护心脏的作用。当心肌受到损伤时,sST2会在心肌细胞大量产生并作为“诱饵”受体与IL-33竞争性结合,导致IL-33/ST2L信号通路被切断,继而造成心肌纤维化,加速心肌重构等症状。因此,选择一种快速、准确地检测sST2的方法对于心力衰竭患者的诊断、预后评估意义重大。
补体因子H(complement factor H,CFH)又称膀胱肿瘤抗原,由尿路上皮肿瘤细胞和巨噬细胞产生的,不是正常表皮细胞产生的,是补体系统和炎症反应中非常重要的负性调节因子,其生物学功能主要是控制C3转化酶(C3bBb)的生成和稳定,促进补体C3b的降解,从而抑制循环中和细胞表面补体旁路途经的激活和放大效应,减轻后续的溶血细胞效应和炎症反应,当尿液补体因子H水平较高时,提示尿路上皮肿瘤的发生。因此,补体因子H可用于尿路上皮肿瘤的早期检测和复发监测。
胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)是一组具有促生长作用的多肽类物质。IGF系统主要由两个IGF(IGF-1、IGF-2)、两个IGF受体(IGF-R1、IGF-R2)和七个IGF结合蛋白(IGFBPs)组成。IGFBPs对IGF具有很高的亲和力。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)主要是由肝脏合成和分泌的,在血循环中以两种复合体形式存在:一种为大相对分子质量三聚体(150KDa),它携带约80%的IGF,该复合体难以通过毛细血管屏障,仅在IGFBP-3蛋白分解酶的作用下从复合体中释放出来的IGF-1才能通过血管内皮屏障到达组织血管发挥作用;另一种为小相对分子质量二聚体(40KDa),该复合体能通过毛细血管屏障,转运IGF-1到达靶细胞。IGFBP-3起着延长IGF-1半衰期的作用,可调整IGF对细胞的增殖、代谢和有丝分裂的作用。IGFBP-3是出生后血液中含量最丰富的一种IGF结合蛋白。它与IGF结合,防止它们被降解,促进IGF在身体各部分的运输,对IGFs结构进行修饰从而改变IGFs与其特异性受体之间的相互作用。由于血清IGFBP-3具有生长激素(GH)依赖性,并与生长激素分泌量相关,因此其测定有助于生长激素异常分泌的检测。尤其是在儿童时期,IGFBP-3值在确定生长激素分泌和作用的变化方面起着重要作用。血清IGFBP-3的水平主要受GH和IGF-1的调节。同样的,血清IGF-1和IGFBP-3水平反映了健康儿童内源性的生长激素分泌。在生长激素缺乏症患者血清IGF-1、IGFBP-3显著低于正常儿童,可作为筛选由GH-IGF轴异常引起生长发育迟缓的潜在指标。
目前,可溶性生长刺激表达基因2蛋白常用的检测方法主要为化学发光分析法、酶联免疫法、免疫层析法和胶乳免疫比浊法。
IGFBP-3常用的检测方法有化学发光法、电化学发光法、酶免疫法、放射免疫法。放射免疫法应用最早,但是此方法使用的仪器较贵且存在放射性污染等问题,在临床应用中具有很大的局限性。化学发光法其优点是灵敏度和准确度较好,但缺点是成本较高。
临床检测补体因子H的方法主要有细胞学检查、镜检及组织活检等,而快速检测的方法较少,其中最为常用和普遍的为酶联免疫吸附法(ELISA),目前也发展出来了胶体金免疫层析定量法。
常见的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的检测方法:
化学发光法,化学发光分析法主要是依据化学发光检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈现线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度进行检测,从而确定待测物含量的一种分析方法。化学发光分析法检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白具有检测周期短、灵敏度和自动化程度高等优点。但是该方法成本较高,且需要特定的化学发光仪,且检测精度不高。
酶联免疫法,将抗原和抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测方法。酶联免疫法主要原理是采用双抗夹心的方法进行检测,包被抗体吸附于固相的载体表面,用来和特异抗原结合,当待测物中含有特异抗原时,与其形成抗原-抗体的复合物。再加入另一种用酶标记的抗体作为检测抗体,这种方式可以保留酶的活性和抗体的免疫学活性,用来提高ELISA方法的灵敏度。酶标记后的抗体会和待测物中抗原的不同表位结合形成抗体-抗原-抗体的双抗夹心复合物,形成的复合物也被结合在固相载体上,加入酶反应的底物后,底物会被酶催化成有色产物,有色产物颜色的深浅则可以判断待测物中抗原的浓度,从而进行定性或者定量的实验。该方法检测时间较长,检测范围窄。酶联免疫法由于重复性不好,易出现假阳性,且操作繁琐,易受干扰因素多。
胶乳免疫比浊法,主要利用抗体标记的胶乳微球与抗原反应形成交联网结构,它会引起特定波长的吸光度发生改变,吸光度的变化与血清样本中的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的含量呈正比。该方法参与反应的成分比较多,且是生物活性物质,如底物、酶、抗体等,由于涉及抗体和酶的相互作用,抗体和酶等关键原材料筛选对于方法的建立至关重要,另一方面,各成分之间的比例协调对方法的线性、灵敏度有很大的影响。因此该方法的原材料筛选及配方开发都有较大的难度。同时,由于相关的酶、抗体要求较高,原料本身的获取不易,而进入生产端的检验难度也相应提高,因此也加大了该方法的研发及制造成本。
常见的IGFBP-3的检测方法:
酶免疫法,将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合,以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂进行免疫测试,所以具有很高的灵敏度。样本里的抗原(自由抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一起竞争相同的抗体,当样品里的自由抗原越多,就可以结合越多的抗体,而固定抗原就只能结合到较少的抗体,反之亦然。经清洗步骤,洗去自由抗原和抗体的复合物,只留下固定抗原和抗体的复合物,拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较,根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。可适用比较不纯的样本,而且数据再现性很高。但缺点是整体的敏感性和专一性都较差;操作过程有些繁琐,反应需要时间较长。
放射免疫法,既具有免疫反应的高特异性,又具有放射性测量的高灵敏度,因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质。但只由于使用了生物试剂,其稳定性受多种因素影响,需要有一整套质量控制措施来确保结果的可靠性。灵敏度受方法本身工作原理的限制,对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。由于放射免疫分析是竞争性的反应,被测物和标准物都不能全部参与反应,测得的值是相对量而非绝对量。此外,还存在放射线辐射和污染等问题。
化学发光法,指参与化学变化的物质的发光剂利用吸收的化学能进行辐射而产生光的现象,主要包括直接化学发光和酶促化学发光。直接化学发光最常见的为吖啶酯/过氧化氢系统,其灵敏度相对较高但同时存在发光时间短等缺点。酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)-鲁米诺系统、碱性磷酸酶(ALP)-AMPPD系统等。其优势是发光信号强而稳定,且发光时间较长,但可能会存在工作曲线随时间漂移的问题。化学发光法检测仪器设备的成本较高,不适宜现场操作或者基层推广。
电化学发光,是电化学和化学发光相结合的产物。它是指通过电极表面的电子转移反应生成激发态,当其返回基态时产生光辐射的现象。电化学发光经历两个过程:电化学反应和化学发光反应。以三丙胺作为电子供体,用三联吡啶钌来标记抗体(抗原)在电场环境中发生化学反应。相对于光致发光分析,电化学发光是电启动的,无需激发光源,其发光信号稳定,发光时间长,有效避免了杂散光及光源不纯所产生的干扰,极大增加了分析的灵敏度。但同时存在测量方式复杂、仪器维护成本高等缺点。
常见的补体因子H的检测方法
细胞学检查:将尿液静置24小时,取得沉淀物质,对其进行显微镜检查是否存在肿瘤细胞及观察其形态,需要连续检测3天以上,耗时长且步骤繁琐。
组织活检:组织活检需要在病人上用活检钳取部分病变组织做病理学检查,明确是否有肿瘤细胞,该方法为有创检查,而且需要结合切取部分的找到的肿瘤细胞才能对病情进行确诊。
酶联免疫法是将抗人补体因子H单抗包被于酶标板上,当样本中含有补体因子H时会与单抗结合,游离的成份被洗去。加入酶标抗体,抗人补体因子H抗体与结合在单抗上的人补体因子H结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。加入显色底物,若反应孔中有补体因子H,辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色,加终止液变黄。测定其吸光度,补体因子H浓度与吸光度呈正比,可通过绘制标准曲线求出标本中的补体因子H浓度。该方法的配套试剂需要保存在-20℃或者2-8℃,对贮存温度要求高,且检测所需时间较长,操作繁琐,精密度差,容易受到污染。
胶体金免疫层析定量法:免疫胶体金分析法是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的技术。近年来由于免疫技术的飞速发展,由于胶体金的颜色可直接用肉眼观察,给操作者带来极大的方便,免疫金标记技术得到广泛应用。由于胶体金产生的信号分辨率低,灵敏度与检测范围均较差,亟需性能更佳的标记物替代。
发明内容
本申请实施例的目的在于提出一种试剂盒及检测方法,能够快速有效检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3。
为了解决上述技术问题,本申请实施例提供一种试剂盒,采用了如下所述的技术方案:
一种试剂盒,所述试剂盒包括试纸条,所述试纸条包括结合垫和硝酸纤维素膜;
所述结合垫上固定有荧光标记抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体;
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线;
其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的ST2抗体时,所述检测线包被有ST2抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;
所述为荧光标记抗体为荧光标记的补体因子H抗体时,所述检测线包被的有补体因子H抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体时,所述检测线包被的有胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体。
进一步的,所述结合垫通过如下步骤制得:
将荧光微球加入至标记缓冲液MES中,混匀后加入1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液,混匀后离心,保留沉淀,加入标记缓冲液MES,混匀,加入ST2抗体或补体因子H抗体或胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体,反应后加入牛血清白蛋白封闭,离心保留沉淀,加入标记保存液,离心后保留上清液,获得第一目标溶液;
将荧光微球加入至标记缓冲液MES中,混匀后加入1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液,混匀后离心,保留沉淀,加入标记缓冲液MES,混匀后加入羊抗鸡IgY抗体,反应后加入牛血清白蛋白封闭,离心保留沉淀,加入标记保存液,离心后保留上清液,获得第二目标溶液;
等体积混匀所述第一目标溶液和第二目标溶液,获得荧光微球抗体标记溶液,将所述荧光微球抗体标记溶液喷在初始结合垫上,获得所述结合垫。
进一步的,所述试剂盒还包括检测卡,所述检测卡包括卡壳,所述卡壳包括荧光卡壳上盖和荧光卡壳下盖,所述试纸条设置于所述荧光卡壳上盖和所述荧光卡壳下盖之间。
进一步的,所述试纸条还包括样品垫、PVC底板和吸水纸。
进一步的,所述样品垫通过如下步骤制得:
将预先配置的样品垫处理液均匀涂抹在初始样品垫上,干燥后获得所述样品垫。
进一步的,所述样品垫处理液包括0.1M的PB溶液,0.5%~1%的牛血清白蛋白以及0.05%~0.1%的吐温20;或者
所述样品垫处理液包括0.1M的PBS溶液,1%~2%的牛血清白蛋白,1%的海藻糖以及0.1%的吐温20;或者
所述样品垫处理液包括0.2M的硼酸硼砂缓冲液,0.5%的吐温20,以及1%的牛血清白蛋白。
进一步的,所述目标硝酸纤维素膜通过如下步骤制得:
制备包被稀释液;
通过所述包被稀释液稀释第一包被抗体和第二包被抗体,获得第一抗体溶液和第二抗体溶液;
将所述第一抗体溶液和所述第二抗体溶液分别通过喷金滑膜仪在初始硝酸纤维素膜上划线,获得所述硝酸纤维素膜。
进一步的,所述荧光标记抗体为荧光标记的ST2抗体时,所述包被稀释液包括pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷和1%蔗糖,所述第一包被抗体为ST2抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的补体因子H抗体时,所述包被稀释液包括pH为7.4的磷酸盐缓冲液和1%蔗糖,所述第一包被抗体为补体因子H抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体时,所述包被稀释液包括pH7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷和1%蔗糖,所述第一包被抗体为IGFBP-3抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体。
进一步的,所述检测线包被的补体因子H抗体的包被浓度为1.2-1.5mg/mL,划膜量为1.0-1.2μL/cm。
为了解决上述技术问题,本申请实施例还提供一种应用上述试剂盒定量检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3的检测方法,采用了如下所述的技术方案:
一种应用上述试剂盒定量检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3的检测方法,包括如下步骤:
将待测样本加入至样本稀释液中,获得混合样本;
将所述混合样本加样到检测卡的加样孔上,并将检测卡放于已读取芯片数据的干式荧光免疫分析仪上,读取检测线和质控线的荧光信号值,获得检测结果。
与现有技术相比,本申请实施例主要有以下有益效果:
本申请的试剂盒基于荧光定量免疫层析技术,实现高灵敏度、特异性强、操作简单快速的检测。无需大型生化仪器,成本低,便于大批量生产,易于携带,便于在临床及社区家庭推广及使用。便于对ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3的快速定量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请中的方案,下面将对本申请实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本申请的定量检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3的检测方法的一个实施例的流程图;
图2是根据本申请的试剂盒的一个实施例的结构示意图;
图3是根据本申请的试剂盒的另一个实施例的结构示意图。
附图标记:1、PVC底板;2、样品垫;3、结合垫;4、硝酸纤维素膜;5、检测线;6、质控线;7、吸水纸;8、加样孔;9、检测区;10、卡壳。
具体实施方式
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同;本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请;本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象,而不是用于描述特定顺序。
在本文中提及“实施例”意味着,结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例,也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是,本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
以下的实施例便于更好地理解本申请,但并不限定本申请。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案,下面将结合附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
继续参考图1和图2,图1为本申请的试剂盒的结构示意图,图2为本申请的试剂盒的另一结构示意图。
本申请提供了一种试剂盒及检测方法。
所述试剂盒包括试纸条,所述试纸条包括结合垫和硝酸纤维素膜;
所述结合垫上固定有荧光标记抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体;
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线;
其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的ST2抗体时,所述检测线包被有ST2抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;
所述为荧光标记抗体为荧光标记的补体因子H抗体时,所述检测线包被的有补体因子H抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体时,所述检测线包被的有胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体。
所述试剂盒还包括检测卡,所述检测卡包括荧光卡壳上盖和荧光卡壳下盖,所述试纸条设置于所述荧光卡壳上盖和所述荧光卡壳下盖之间。
进一步的,所述样品垫通过如下步骤制得:
将预先配置的样品垫处理液均匀涂抹在初始样品垫上,干燥后获得所述样品垫。所述样品垫处理液包括0.1M的PB溶液,0.5%~1%的牛血清白蛋白以及0.05%~0.1%的吐温20;或者所述样品垫处理液包括0.1M的PBS溶液,1%~2%的牛血清白蛋白,1%的海藻糖以及0.1%的吐温20;或者所述样品垫处理液包括0.2M的硼酸硼砂缓冲液,0.5%的吐温20,以及1%的牛血清白蛋白。
所述结合垫通过如下步骤制得:
将荧光微球加入至标记缓冲液MES中,混匀后加入1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液,混匀后离心,保留沉淀,加入标记缓冲液MES,混匀,加入ST2抗体或补体因子H抗体或胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体,反应后加入牛血清白蛋白封闭,离心保留沉淀,加入标记保存液,离心后保留上清液,获得第一目标溶液;
将荧光微球加入至标记缓冲液MES中,混匀后加入1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液,混匀后离心,保留沉淀,加入标记缓冲液MES,混匀后加入羊抗鸡IgY抗体,反应后加入牛血清白蛋白封闭,离心保留沉淀,加入标记保存液,离心后保留上清液,获得第二目标溶液;
等体积混匀所述第一目标溶液和第二目标溶液,获得荧光微球抗体标记溶液,将所述荧光微球抗体标记溶液喷在初始结合垫上,获得所述结合垫。
此外,所述目标硝酸纤维素膜通过如下步骤制得:
制备包被稀释液;
通过所述包被稀释液稀释第一包被抗体和第二包被抗体,获得第一抗体溶液和第二抗体溶液;
将所述第一抗体溶液和所述第二抗体溶液分别通过喷金滑膜仪在初始硝酸纤维素膜上划线,获得所述硝酸纤维素膜。
其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的ST2抗体时,所述包被稀释液包括pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷和1%蔗糖,所述第一包被抗体为ST2抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的补体因子H抗体时,所述包被稀释液包括pH为7.4的磷酸盐缓冲液和1%蔗糖,所述第一包被抗体为补体因子H抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体时,所述包被稀释液包括pH 7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷和1%蔗糖,所述第一包被抗体为IGFBP-3抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体。
本申请还公开一种应用上述试剂盒的定量检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3的检测方法,包括:
将待测样本加入至样本稀释液中,获得混合样本;
将所述混合样本加样到检测卡的加样孔上,并将检测卡放于已读取芯片数据的干式荧光免疫分析仪上,读取检测线和质控线的荧光信号值,获得检测结果。
本申请的具体实施步骤如下所述:
一、定量检测ST2(生长刺激表达基因2蛋白)的试剂盒
定量检测ST2(生长刺激表达基因2蛋白)的试剂盒包括检测卡和芯片,检测卡由卡壳和试纸条构成,试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC底板,所述吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫固定于PVC底板上,且与所述硝酸纤维素膜相接触,所述结合垫和吸水纸分别粘附在硝酸纤维素膜(NC膜)的两端,所述样品垫粘附在结合垫的另一端,所述硝酸纤维素膜上设置了检测线和质控线,所有成分按照层析方向两两重叠粘贴在PVC底板上;芯片内包含有该试剂盒检测卡的曲线数据等信息。硝酸纤维素膜为CN140膜。结合垫和样品垫均为玻璃纤维素膜。吸水纸为滤纸纤维。试纸条的宽度为3~4mm。吸水纸压住硝酸纤维素膜的一端2mm,硝酸纤维素膜的另一端被纳米颗粒的结合垫压住1~2mm,样品垫压住纳米颗粒的结合垫1~2mm。
结合垫上含有荧光标记的ST2单克隆抗体1和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体,硝酸纤维素膜上检测区包被ST2单克隆抗体2,质控区包被鸡IgY抗体。
本试剂盒实现一步法快速检测人血清、血浆及全血样本中可溶性生长刺激表达基因2蛋白,具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、检测成本低等优点。
1、结合垫的制备
ST2抗体标记:取固含量为1%的时间分辨荧光微球100uL加入标记缓冲液MES1mL,涡旋混匀后加入100uL标记活化液(所述标记活化液包括1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液),混匀后旋转反应20~40分钟,待反应完成后,进行10000rpm、4℃离心20~40min,离心结束去除上清,留取沉淀,加入标记缓冲液MES 1mL,超声混匀,加入50~80μg ST2标记抗体,旋转反应20-40分钟,反应完成后加入封闭液(牛血清白蛋白)100uL,旋转反应2h,封闭完成后10000rpm、4℃离心20~40min,离心结束去除上清,留取沉淀,加入标记保存液5mL,超声混匀,离心后保留上清液,获得第一目标溶液2~8℃保存。
羊抗鸡IgY抗体标记:取固含量为1%的时间分辨荧光微球100uL加入标记缓冲液MES 1mL,涡旋混匀后加入100uL标记活化液(所述标记活化液包括1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液),混匀后旋转反应20~40分钟,待反应完成后,进行10000rpm、4℃离心20~40min,离心结束去除上清,留取沉淀,加入标记缓冲液MES 1mL,超声混匀,加入50~80μg羊抗鸡IgY标记抗体,旋转反应20~40分钟,反应完成后加入封闭液(牛血清白蛋白)100uL,旋转反应2h,封闭完成后10000rpm、4℃离心20~40min,离心结束去除上清,留取沉淀,加入标记保存液5mL,超声混匀,离心后保留上清液,获得第二目标溶液,2~8℃保存。
将上述第一目标溶液(ST2抗体标记液)和第二目标溶液(羊抗鸡IgY抗体标记液)等体积混合,超声混匀,2-8℃保存。
将制备好的荧光胶乳微粒溶液以3~6μL/cm的喷量均匀喷在结合垫上,在37℃下干燥(16~20)h。
2、样品垫的制备
样品垫处理液的配制:0.1M PB溶液,0.5%~1%BSA(牛血清白蛋白),0.05%-0.1%吐温20。
样品垫处理:将上述处理液按50mL/张(宽:25cm,长:30cm)的处理量均匀涂抹在样品垫上,在18-28℃干燥16-24h,即可。将干燥后的样品垫上下两条长边各裁去5mm,然后裁为(23±1)mm×(300±10)mm大小,备用。
3、NC膜的包被方法:硝酸纤维素膜的处理
(1)包被稀释液包括pH 7.4的0.05M Tris(三羟甲基氨基甲烷)和1%蔗糖。
(2)喷垫:将NC膜贴在PVC板上,用上述包被稀释液稀释包被抗体,ST2抗体包被浓度为0.8-1.2mg/mL,鸡IgY抗体的包被浓度为0.8-1.2mg/mL,划膜量为0.9-1.1μL/cm,37℃干燥24-28h。
4、组装
将处理好的样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在PVC板上,经切条机将组装好的PVC板切割成3.85-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸依序固定在PVC板上,所述结合垫、吸水纸与PVC板上的硝酸纤维素膜相接触,用裁条机将组装好的PVC板切割成3.80-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。将每一试纸条装入荧光卡壳下盖中,装好后,盖上上盖,置于压卡机上,调整压壳机高度为3.5mm,使荧光卡壳上下盖紧密结合,即为检测卡。
5、组装
将处理好的样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在PVC板上,经切条机将组装好的PVC板切割成3.85-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸依序固定在PVC板上,所述结合垫、吸水纸与PVC板上的硝酸纤维素膜相接触,用裁条机将组装好的PVC板切割成3.80-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。将每一试纸条装入荧光卡壳下盖中,装好后,盖上上盖,置于压卡机上,调整压壳机高度为3.5mm,使荧光卡壳上下盖紧密结合,即为检测卡。
6、样品检验及结果判定
样品检验:待检测的血清、血浆或全血样品平衡至室温,取80-100uL直接滴加至免疫层析试剂卡上进行免疫层析反应;随后在荧光检测器下采用与荧光微粒相对应的发射光波长进行荧光检测。荧光检测器下荧光检测时,仅在质检线上检测到信号,才能证明检测结果是有效的。
7、一种人体血清、血浆以及全血样本中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)快速检测试剂盒的组成成分、包装及数量(25人份/盒),如表1:
表1试剂盒的组成成分、包装及数量
8、一种一步法检测ST2的时间分辨荧光免疫层析芯片的制备
准备曲线数据:取ST2企业校准品(S1~S6),按照试剂说明书进行操作;在蓝勃AFS-1000干式荧光免疫实验管理工具上依次选择信号测试-重复性测试,点击新建重置页面,然后点击测试即可进行测试操作,将每一浓度的样本重复检测3次,计算测试得出T/C值的均值。将配制浓度与相对应的T/C均值作为线性数据。
配制芯片数据:
在蓝勃AFS-1000干式荧光免疫实验管理工具上,选择项目参数,使用新建或编辑进行相关参数的设置,编辑完成确认无误后点击保存,项目参数设置完毕。在蓝勃AFS-1000干式荧光免疫实验管理工具上,选择测试实验,点击新建,选择项目ST2,填写实验编号,点击确定,完成新建实验。在蓝勃AFS-1000干式荧光免疫实验管理工具上,选择曲线生成,在左侧实验列表中选择上一步新建的实验;将第一步准备的曲线数据填入表格中,数据填入后依次点击自动选中-自动排序-保存;保存完成后选择反应值变换为取对数、小数位数为4,选择浓度变换为取对数、小数位数为2,选择拟合算法为MMF Model四参数增长曲线拟合,确认无误后,点击拟合;拟合后会在右边拟合结果处显示R值以及曲线,确定拟合结果准确后完成曲线制备。在蓝勃AFS-1000干式荧光免疫实验管理工具上,选择生成ID文件,在左侧项目列表中选择本次新建的项目,在基本参数区、子项参数区以及曲线数据处会自动显示上述步骤所设置完成的各项参数;审核各项参数确保无误后,在基本参数区依次设定生产年、生产月以及批次,设定完成后会在条形码处自动生成条形码,确认条形码是否准确;确认无误后点击生成ID文件,弹出数据转移界面,点击确认,完成芯片数据配置。
芯片烧制:
返回桌面,选中蓝勃AFS-1000干式荧光免疫实验管理工具,点击鼠标右键,选择打开文件位置。双击Item文件夹。在Item文件中找到最新生成的与条码数据相对应的HEX文件。将上述芯片数据文件于编程器中烧出2-3个芯片,在已开权限的蓝勃单通道荧光分析仪读取芯片数据,验证数据是否已成功写入以及确定以下信息是否有误。数据及参数确认无误后,即可大批量烧制芯片。
9、基于时间分辨荧光免疫层析技术定量检测ST2的检测方法:
1)打开仪器,插入与试剂批号相同的芯片;
2)测试前试剂、样本应平衡至室温,测试应在室温下进行;
3)打开铝箔袋,取出检测卡,水平放置于桌面上;
4)用移液器吸取样本100μL,加入到检测卡的加样孔中;
5)在配套仪器上选择样本类型“血清\血浆”或“全血”;
6)即时测试:待室温反应15min后,将检测卡放入仪器卡槽中,选择“即时测试”模式,点击“测试”;标准测试:将检测卡放入仪器卡槽中,选择“标准测试”模式,点击“测试”,仪器自动计时,计时结束后,自动测试并显示结果;
7)点击“打印”,可打印检测结果报告。
目前有多种ST2的检测方法研究,较为常用的是化学发光方法以及ELISA方法,但是此类方法的仪器设备昂贵,且需要专业操作人员使用。本研究使用的荧光定量免疫层析方法是基于免疫学原理的一步定量检测方法,具有快速、操作简便、成本低的特点,且无需稀释,直接加样可测,应用前景广。
二、定量检测补体因子H的试剂盒,包括:样本稀释液、检测卡和芯片。样本稀释液包括0.01M的Tris-HCL溶液,具体的:在0.01M的Tris-HCL液中,添加1%蔗糖和0.05%PC300,搅拌均匀即样本稀释液。
检测卡包括试纸条和用于纳置试纸条的卡壳。试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC板。样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸依序固定在PVC板上,所述结合垫、吸水纸固定在所述PVC板内,且与所述硝酸纤维素膜相接触,补体因子H抗体和鸡IgY抗体固定在结合垫上,硝酸纤维素膜上固定有另一配对补体因子H抗体和羊抗鸡IgY作为检测线(T)和质控线(C),通过定量检测补体因子H的含量;芯片内包含有该试剂盒检测卡的曲线数据等信息。
卡壳为长条状构造,其设有加样孔和检测区;加样孔与试纸条的样品垫相对应,该检测区与硝酸纤维素膜相对应,用于显示硝酸纤维素膜的检测线和质控线的检测结果。
1、结合垫的制备
补体因子H抗体的标记:取固含量为1%的时间分辨荧光微球100uL加入标记缓冲液MES 900μL,涡旋混匀后加入EDC(1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺活化液),混匀后旋转反应半小时,待反应完成后,进行离心去除上清,留取沉淀,加入标记缓冲液MES 1mL,超声混匀,加入30-40μg补体因子H抗体,旋转反应半小时,反应完成后加入10-15μL的20%BSA(牛血清白蛋白)进行封闭反应,旋转反应1h,封闭完成后10000rpm、4℃离心30min,去除上清,留取沉淀,加入标记保存液4mL,超声混匀,离心后保留上清液,获得第一目标溶液,2~8℃保存。
鸡IgY抗体的标记:取固含量为1%的时间分辨荧光微球100uL加入标记缓冲液MES900μL,涡旋混匀后加入EDC和NHS,混匀后旋转反应半小时,待反应完成后,进行离心去除上清,留取沉淀,加入标记缓冲液MES 1mL,超声混匀,加入10-20μg鸡IgY抗体,旋转反应半小时,反应完成后加入10-15μL的20%BSA进行封闭反应,旋转反应1h,封闭完成后10000rpm、4℃离心30min,去除上清,留取沉淀,加入标记保存液4mL,超声混匀,离心后保留上清液,获得第二目标溶液,2~8℃保存。
将上述第一目标溶液(标记好的补体因子H抗体溶液)和第二目标溶液(标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液)等体积混合,超声混匀,获得荧光微球抗体标记溶液,2-8℃保存。
将制备好的荧光微球抗体标记溶液以3-5μL/cm的喷量均匀喷在结合垫上,在37℃下干燥16h。
2、样品垫的制备
样品垫处理液的配制:0.1M PBS溶液,1-2%BSA(牛血清白蛋白),1%海藻糖和0.1%吐温20。
样品垫处理:将上述处理液均匀涂抹在样品垫上,在37℃干燥16h即可。
3、硝酸纤维素膜的处理
包被稀释液配制:包被稀释液由PH7.4的磷酸盐缓冲液和1%蔗糖组成。
喷垫:将NC膜贴在PVC板上,用上述包被稀释液包被抗体,使得检测线上补体因子H抗体包被浓度为1.2-1.5mg/mL,划膜量为1.0-1.2μL/cm,质控线上鸡IgY抗体的包被浓度为0.8-1.2mg/mL,划膜量为0.9-1.1μL/cm,37℃干燥24h。
4、组装
将处理好的样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在PVC板上,经切条机将组装好的PVC板切割成3.80-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸依序固定在PVC板上,所述结合垫、吸水纸与PVC板上的硝酸纤维素膜相接触,用裁条机将组装好的PVC板切割成3.80-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。将每一试纸条装入塑料卡壳下盖中,装好后,盖上上盖,置于压卡机上,调整压壳机高度为3.5mm,使荧光卡壳上下盖紧密结合,即为检测卡。
5、芯片数据
在干式荧光免疫实验管理工具上,将测试出的曲线数据填入表格中,对曲线拟合,将曲线数据等信息烧制于芯片中。
6、结果读取及分析
在干式荧光免疫分析仪中读取芯片数据。取100uL尿液样本加入样本稀释液中,混合均匀,取100μL该混合样本加样到检测卡加样孔上,15分钟后在已读取芯片数据的干式荧光免疫分析仪上读取检测线和质控线的荧光信号值,由仪器直观反馈出检测样本中补体因子H含量。
7、定量检测补体因子H的检测方法,包括:将100μL尿液样本与样本稀释液混合,取100μL该混合样本加样到检测卡加样孔上,15分钟后在已识别芯片信息的干式荧光免疫分析仪上读取检测线和质控线的荧光信号值,由仪器直观反馈出检测样本中补体因子H含量。
本申请无需大型生化仪器,通过便携干式荧光免疫分析仪即可实现检测,可以实时监控尿路上皮肿瘤发生以及病变严重程度,便于补体因子H的临床辅助快速检测。这种补体因子H的检测方法特异性强,不需要大型的生化分析仪,检测所需时间短,15min即可得到检测结果,操作简便,成本低,便于大批量生产,易于携带,便于在临床及社区家庭推广及使用。
三、定量检测胰岛素样生长因子结合蛋白-3的试剂盒(荧光免疫层析法),包括:用于稀释样本的IGFBP-3稀释液、胰岛素样生长因子结合蛋白-3检测卡、ID卡芯片。所述检测卡组分如表2所示:
表2胰岛素样生长因子结合蛋白-3检测卡组分
所述IGFBP-3的样本稀释液包括:0.01M pH7.4 PBS,0.05%Proclin 300,0.5%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)以及1%氯化钠。样本稀释液配制:在1L 0.01M pH7.4 PBS缓冲液中添加0.5mLProclin 300、5mLPVP(聚乙烯吡咯烷酮)和10mL氯化钠,获得样本稀释液。
所述ID卡芯片:包含本批次试剂标准曲线信息。
该胰岛素样生长因子结合蛋白-3荧光免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸分别粘贴在PVC底板,所述硝酸纤维素膜的两端分别与吸水纸、结合垫搭接,所述结合垫的另一端与样品垫搭接;所述硝酸纤维素膜上设置检测线T和质控线C,该检测线T包被IGFBP-3抗体,该质控线C上包被鸡IgY抗体。所述结合垫上涂布有荧光微球标记的IGFBP-3抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体。
优选地,所述IGFBP-3的标记抗体(荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体)在检测卡上的终浓度为0.5~1.0mg/mL,所述IGFBP-3的包被抗体(检测线包被的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体)在检测卡上的终浓度为0.8~1.0mg/mL,所述用于质控线(C线)质控的标记抗体(荧光标记的羊抗鸡IgY抗体)在检测卡上的终浓度为0.5~1.0mg/mL,所述用于质控线(C线)质控的包被抗体(质控线包被的鸡IgY抗体)在检测卡上的终浓度为0.8~1.0mg/mL;
1、样品垫的制备:
样品垫处理液的配制:0.2M硼酸硼砂缓冲液(pH8.0),0.5%Tween-20,1%牛血清白蛋白。
样品垫处理:将上述处理液按50mL/张的量(宽:25,长:30cm)均匀涂抹在样品垫上,放置在温度(18~26)℃、相对湿度≤30%条件下干燥过夜(16~24)h。在温度(18~28)℃、相对湿度≤30%条件下,将干燥后的样品垫上下两条长边各裁去5mm,然后裁为(23±1)mm×(300±10)mm大小,备用。
2、结合垫的制备:
免疫荧光微球的活化:取100ul固含为1%的荧光微球悬浮液,加入到离心管中,加入标记缓冲液MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)1mL,混匀,量取30uL的EDC(1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(1:1)活化液与离心管中的胶乳混合,于旋转混匀仪上旋转反应30min,将反应后的悬浮液用超声波超声,使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中然后将微球悬浮液离心,离心条件12000r/min 15min,弃去上清液,保留沉淀;加入1ml2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液,然后用超声波超声分散均匀;
免疫荧光微球交联IGFBP-3抗体:向上述活化后的微球悬浮液加入0.5~1.0mg的IGFBP-3抗体,旋转反应2小时,反应完成后加入10%牛血清白蛋白进行封闭30min,将封闭好的微球分别进行4℃离心,速度为12000r/min15min。离心结束后,弃上清,留取沉淀,加入1mL Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷),超声3min,随后12000r/min,4℃,离心15min,重复一次此步骤。去上清后加入1mL标记保存液,超声3min,2000r/min离心3min,去沉淀,保留上清液,获得第一目标溶液,4℃避光保存。
免疫荧光微球交联羊抗鸡IgY抗体:向上述活化后的微球悬浮液加入0.5~1.0mg羊抗鸡IgY抗体,旋转反应2小时,反应完成后加入10%牛血清白蛋白进行封闭30min,将封闭好的微球分别进行4℃离心,速度为12000r/min 15min。离心结束后,弃上清,留取沉淀,加入1mL Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷),超声3min,随后12000r/min,4℃,离心15min,重复一次此步骤。去上清后加入1mL标记保存液,超声3min,2000r/min离心3min,去沉淀,保留上清液,获得第二目标溶液,4℃避光保存。
免疫荧光微球交联IGFBP-3抗体和免疫荧光微球交联羊抗鸡IgY抗体混合:将第一目标溶液(标记后的免疫荧光微球交联IGFBP-3抗体和第二目标溶液(免疫荧光微球交联羊抗鸡IgY抗体)等体积混合均匀,超声混匀,获得荧光微球抗体标记溶液,2-8℃保存。
喷垫:将玻璃纤维8964裁为(10±0.5)mm×(300±10)mm。将荧光微球标记抗体溶液按照3.0-5.0μL/cm的喷量,喷到剪裁后的结合垫上,放置于(37±2)℃,湿度≤30%中里干燥(16~24)h。
3、硝酸纤维素膜的处理:
包被稀释液包括:0.05M Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)和1%蔗糖。
划膜:将NC膜贴在PVC板上,用上述包被稀释液将NC膜的检测线上IGFBP-3抗体稀释为0.8-1.0mg/mL,质控线上鸡IgY抗体的包被浓度为0.8-1.0mg/mL。使用喷金划膜仪,在NC膜上的预定位置划出。
进一步的,划膜量为1μL/cm,划膜长度为300mm,C线和T线的距离为(5±0.5)mm,C线与硝酸纤维素膜下缘的距离为(10±0.5)mm,T线与硝酸纤维素膜上缘的距离为(10±0.5)mm。划膜完成后,将NC膜放置在温度(37±2)℃、湿度≤30%干燥箱中干燥(16~24)h。
4、组装检测卡:
吸水纸的制备:H-1初始吸水纸,将初始吸水纸裁剪成(23±1)mm×(300±10)mm大小。
组装:将处理好的样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在PVC板上,经切条机将组装好的PVC板切割成3.85-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸依序固定在PVC板上,所述结合垫、吸水纸与PVC板上的硝酸纤维素膜相接触,用裁条机将组装好的PVC板切割成(3.85±0.05)mm宽度的免疫层析试纸条。将每一试纸条装入荧光卡壳下盖中,装好后,盖上上盖,置于压卡机上,调整压壳机高度为3.5mm,使荧光卡壳上下盖紧密结合,每一试剂卡装入铝箔袋中,每袋加入干燥剂1包,封口,即为检测卡。
5、芯片数据
在干式荧光免疫实验管理工具上,将准备的曲线数据填入表格中,利用MMF Model四参数增长曲线拟合,完成曲线的制备,将上述芯片数据于编程器中烧制芯片。
6、胰岛素样生长因子结合蛋白-3试剂盒(荧光免疫层析法)的组成成分、包装及数量(1/10/25/50人份/盒),如表3:
表3试剂盒的组成成分、包装及数量
7、本申请还公开了一种人体血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3的快速检测的方法,包括取待检测的血清样品100uL加入到300uL的上述样本稀释液中,待混合均匀后滴加至免疫层析试剂卡上进行免疫层析反应;15分钟后在已读取芯片数据的荧光分析仪上读取检测线的荧光信号值,得到对应的胰岛素样生长因子结合蛋白-3样本含量。荧光检测器下荧光检测时,仅在质检线上检测到信号,才能证明检测结果是有效的。
具体步骤包括:
1)打开仪器,插入与试剂批号相同的芯片;
2)用移液器吸取100μL样本,加入到样本稀释液中,上下颠倒混匀;
3)打开铝箔袋,取出检测卡,水平放置于桌面上;
4)用移液器吸取稀释后混匀的样本100μL,加入到检测卡的加样孔中;
5)在配套仪器上选择样本类型“血清”;
6)即时测试:待室温反应15min后,将检测卡放入仪器卡槽中,选择“即时测试”模式,点击“测试”;标准测试:将检测卡放入仪器卡槽中,选择“标准测试”模式,点击“测试”,仪器自动计时,计时结束后,自动测试并显示结果;
7)点击“打印”,可打印检测结果报告。
本申请采用双抗体夹心法,利用荧光免疫层析的技术原理。测试时,样本与缓冲液混匀,并滴加到试剂的加样孔中,在毛细效应下进行层析,样本中的IGFBP-3抗原与荧光标记IGFBP-3抗体结合,扩散至测试区,被检测线包被的IGFBP-3单克隆抗体捕获,并形成“抗体-抗原-荧光抗体”复合物;样本中的IGFBP-3浓度与复合物荧光强度成正比,通过免疫荧光检测仪及设定的标准曲线,将荧光信号值转换成样本中IGFBP-3浓度。
8、本申请试剂盒的线性范围性能评估实验
将处理过的阴性血清配制浓度梯度为0.2μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL胰岛素样生长因子结合蛋白-3标准液,每个样本各重复3次,于荧光免疫分析仪上读取浓度值。计算每一样本3次检测结果均值,然后采用最小二乘法进行直线拟合,得出线性相关系数r。通过表4实验数据可以看出相关系数r>0.9900。
经检测,本试剂盒的检出限为0.2μg/mL,线性范围0.2-20μg/mL。
表4试剂盒线性范围检测结果
9、本申请试剂盒的准确度性能评估试验
配制IGFBP-3标准液取浓度约为1μg/mL、10μg/mL,与试剂盒中的样本稀释液充分混合,然后取100uL混合液加入试剂卡的加样孔中,静置反应15min后插入荧光免疫分析仪中得出相应的样本浓度。通过表5试验数据可看出,水平1(1μg/mL)的相对偏差分别为5.00%、-7.00%、1.00%,水平2(10μg/mL)的相对偏差分别为-5.60%、-5.90%、3.30%,所有样本的相对偏差均不超过±10%。
表5准确度检测结果
10、本申请试剂盒的精密度性能评估试验
配制IGFBP-3标准液取浓度约为1μg/mL、10μg/mL,每个浓度水平各重复10次,分别计算10次测量结果的平均值M和标准差SD,根据公式得出变异系数(CV)。取参考品100uL与试剂盒中的样本稀释液充分混合,取100uL混合液加入试剂卡的加样孔中,静置反应15min后插入荧光免疫分析仪中,读取荧光信号T/C值,得出相应的样本浓度。通过表6试验数据可看出,水平1(1μg/mL)的变异系数(CV)为7.01%,水平2(10μg/mL)的CV值为4.92%,样本的变异系数均不超过±10%。
表6试剂盒精密度检测结果
荧光定量免疫层析技术,是免疫荧光技术和传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术,通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值,即可分析出样品中待测物的浓度。该技术在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外,还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量,可以排除特异本底荧光的干扰。
干式荧光免疫层析法是基于配套定量仪器直接检测激发荧光信号,通过仪器内置的标准曲线即可得出样品中待测物的含量,具有快速、操作简单、高特异性、高灵敏性、检测成本低、所用试剂有良好的稳定性、检测限较宽、尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点,更适于床旁及时定量快速检测,因此可以简单、快速实现人体血清样本的定量检测。此检测方法克服了如免疫荧光法技术定量检测易出现假阴现象的缺陷、简化了样本处理过程、极大缩短了检测时间、降低了研究成本和技术复杂性。本申请使用了荧光定量免疫层析方法,是基于免疫学原理的定量检测方法,具有快速、操作简便、成本低的特点,便于基层社区医院推广。
应该理解的是,虽然附图的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示,但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明,这些步骤的执行并没有严格的顺序限制,其可以以其他的顺序执行。而且,附图的流程图中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段,这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成,而是可以在不同的时刻执行,其执行顺序也不必然是依次进行,而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。
显然,以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例,附图中给出了本申请的较佳实施例,但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现,相反地,提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来而言,其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构,直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理在本申请专利保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂盒,用于定量检测ST2、补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3,其特征在于,所述试剂盒包括试纸条,所述试纸条包括结合垫和硝酸纤维素膜;
所述结合垫上固定有荧光标记抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体;
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线;
其中,所述荧光标记抗体为荧光标记的ST2抗体时,所述检测线包被有ST2抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;
所述为荧光标记抗体为荧光标记的补体因子H抗体时,所述检测线包被的有补体因子H抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体;或者
所述荧光标记抗体为荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体时,所述检测线包被的有胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体,所述质控线包被有鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述结合垫通过如下步骤制得:
将荧光微球加入至标记缓冲液MES中,混匀后加入1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液,混匀后离心,保留沉淀,加入标记缓冲液MES,混匀,加入ST2抗体或补体因子H抗体或胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体,反应后加入牛血清白蛋白封闭,离心保留沉淀,加入标记保存液,离心后保留上清液,获得第一目标溶液;
将荧光微球加入至标记缓冲液MES中,混匀后加入1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化液,混匀后离心,保留沉淀,加入标记缓冲液MES,混匀后加入羊抗鸡IgY抗体,反应后加入牛血清白蛋白封闭,离心保留沉淀,加入标记保存液,离心后保留上清液,获得第二目标溶液;
等体积混匀所述第一目标溶液和第二目标溶液,获得荧光微球抗体标记溶液,将所述荧光微球抗体标记溶液喷在初始结合垫上,获得所述结合垫。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括检测卡,所述检测卡包括卡壳,所述卡壳包括荧光卡壳上盖和荧光卡壳下盖,所述试纸条设置于所述荧光卡壳上盖和所述荧光卡壳下盖之间。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试纸条还包括样品垫、PVC底板和吸水纸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述样品垫通过如下步骤制得:
将预先配置的样品垫处理液均匀涂抹在初始样品垫上,干燥后获得所述样品垫。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述样品垫处理液包括0.1M的PB溶液,0.5%~1%的牛血清白蛋白以及0.05%~0.1%的吐温20;或者
所述样品垫处理液包括0.1M的PBS溶液,1%~2%的牛血清白蛋白,1%的海藻糖以及0.1%的吐温20;或者
所述样品垫处理液包括0.2M的硼酸硼砂缓冲液,0.5%的吐温20,以及1%的牛血清白蛋白。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述目标硝酸纤维素膜通过如下步骤制得:
制备包被稀释液;
通过所述包被稀释液稀释第一包被抗体和第二包被抗体,获得第一抗体溶液和第二抗体溶液;
将所述第一抗体溶液和所述第二抗体溶液分别通过喷金滑膜仪在初始硝酸纤维素膜上划线,获得所述硝酸纤维素膜。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光标记抗体为荧光标记的ST2抗体时,所述包被稀释液包括pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷和1%蔗糖,所述第一包被抗体为ST2抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体;
所述荧光标记抗体为荧光标记的补体因子H抗体时,所述包被稀释液包括pH为7.4的磷酸盐缓冲液和1%蔗糖,所述第一包被抗体为补体因子H抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体;或者
所述荧光标记抗体为荧光标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-3抗体时,所述包被稀释液包括pH 7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷和1%蔗糖,所述第一包被抗体为IGFBP-3抗体,所述第二包被抗体为鸡IgY抗体。
9.根据权利要求1所述的试剂盒,所述检测线包被的补体因子H抗体的包被浓度为1.2-1.5mg/mL,划膜量为1.0-1.2μL/cm。
10.一种应用如权利要求1至9任意一项所述试剂盒定量检测ST2或补体因子H或胰岛素样生长因子结合蛋白-3的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
将待测样本加入至样本稀释液中,获得混合样本;
将所述混合样本加样到检测卡的加样孔上,并将检测卡放于已读取芯片数据的干式荧光免疫分析仪上,读取检测线和质控线的荧光信号值,获得检测结果。
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