FR2601457A1

FR2601457A1 - Procede de differenciation des etats pathologiques dans des essais utilisant des anticorps anti-sida

Info

Publication number: FR2601457A1
Application number: FR8709634A
Authority: FR
Inventors: George B Lamotte
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1987-07-07
Publication date: 1988-01-15
Also published as: DE3722272A1; GB8716018D0; JPS63132168A; GB2193808A

Abstract

LES ANTICORPS DIRIGES CONTRE CERTAINES PROTEINES VIRALES PARTICULIERES DU SIDA, NOTAMMENT CELLES AYANT DES POIDS MOLECULAIRES DE 41 KD-43 KD MAIS AUSSI CELLES AYANT DES POIDS MOLECULAIRES DE 120 KD ET 24 KD, SONT MESURES EN TANT QUE MOYENS PERMETTANT DE DIFFERENCIER LES SUJETS QUI ONT ETE EXPOSES AU SIDA POUR DISTINGUER ENTRE CEUX QUI ONT EFFECTIVEMENT CONTRACTE LE SIDA ET CEUX QUI ONT ETE EXPOSES MAIS SONT RESTES EN BONNE SANTE. APPLICATION AU PRONOSTIC ETOU AU DIAGNOSTIC EN CE QUI CONCERNE LE SIDA. LA FIGURE UNIQUE REPRESENTE LES TAUX D'ANTICORPS CONTRE CERTAINES PROTEINES VIRALES DU SIDA CHEZ DES SUJETS AYANT LE SIDA, DES SUJETS HOMOSEXUELS (A RISQUES) ET DES SUJETS "NON-RISQUE".

Description

260145"

PROCEDE DE DIFFERENCIATION DES ETATS PATHOLOGIOUES DANS DES ESSAIS UTILISANT DES ANTICORPS ANTI-SIDA

La présente invention concerne la détection 5 d'anticorps dirigés contre les divers virus reconnus comme donnant naissance au Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise (SIDA). En particulier, l'invention concerne l'analyse de ces anticorps dans des fluides corporels

comme une indication de l'exposition au SIDA.

Des exemples de virus du SIDA reconnus sont le Virus-III de la leucémie des lymphocytes-T humains (HTLV-III), le virus associé à la lymphadénopathie (LAV) et le virus apparenté du syndrome d'immunodéficience acquise (ARV). Des essais pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre ces virus ont été mis au

point à la suite d'études séroépidémiologiques qui indiquent que lorsqu'il existe des taux détectables de ces anticorps, un virus infectieux peut également exister.

En tout cas, la présence des anticorps est considérée 20 comme une indication d'une exposition antérieure au virus ou d'une infection par celui-ci, et suggère la possibilité de la présence permanente du virus ou du

génome viral.

On a découvert à présent que la présence et les 25 quantités des anticorps dirigés contre certaines protéines virales du SIDA sont non seulement capables d'indiquer l'exposition d'un sujet au SIDA, mais également de faire la différence entre ceux qui ont effectivement contracté le SIDA et ceux qui ont été exposés mais sont 30 restés sains. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, les dispositions et les densités des bandes sur les Ospectres' obtenus selon la méthode dite Westerblot incubés dans le sérum et des milieux de liaison en phase solide similaires peuvent être lues pour 35 distinguer entre les deux états parmi ceux qui sont positifs aux essais de dépistage des anticorps antiSIDA. Dans les résultats d'essais donnés dans le présent mémoire, par exemple, les anticorps dirigés contre au moins six protéines virales du SIDA sont tous à des taux 5 augmentés chez ceux qui ont été exposés au SIDA par comparaison à ceux qui n'ont pas été exposés, et les taux d'anticorps dirigés contre trois de ces protéines présentent des différences statistiquement significatives entre les sujets sains et immunodéficients. Des informa10 tions concernant le pronostic et/ou le diagnostic en ce

qui concerne le SIDA peuvent ainsi être obtenues en mesurant le taux de l'un quelconque de ces trois anticorps ou de tous les trois, par comparaison avec des taux ou gammes étalons basés sur les évaluations statis15 tiques de populations connues.

Le dessin annexé est un diagramme en bâtons représentant les taux des anticorps dirigés contre certaines protéines virales du SIDA désignées, prélevées sur des sujets appartenant aux trois groupes: patients à 20 SIDA confirmé, homosexuels (groupe reconnu à haut

risque) et ceux non identifiés à un groupe à risque.

Les résultats d'essais qui ont conduit à la présente invention ont été obtenus à partir d'analyses par Western blot effectuées sur diverses populations de 25 sujets en utilisant un "Immunoblot Assay Kit" (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Californie) conformément aux instructions. du fabricant. Les bandes d'"Immunoblot" développées ont été évaluées par densitométrie par réflexion sur un Densitomètre Vidéo modèle 620 Bio-Rad 30 raccordé en série à un calculateur numérique Microvax II. La gestion des bases de données et les évaluations statistiques de celles-ci ont été effectuées avec un logiciel RS/1. Les sujets d'essai comprenaient 100 individus pour lesquels le SIDA avait été diagnostiqué, 124 35 homosexuels de sexe masculin (groupe reconnu à haut

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risque) et 59 individus n'appartenant pas à un groupe à risque connu. Chaque tracé de densitomètre a été évalué en ce qui concerne la réactivité dans des positions de Rf (mobilité relative) choisies, correspondant aux poids 5 moléculaires viraux suivants: 15kd, 18kd, 24kd, 32kd, 41kd-43kd, 55kd, 65kd et 120kd.

Chaque tracé a ensuite été assigné à l'une des classifications des dispositions de bandes suivantes:

T A B L E A U I

Poids Classification des dispositions des bandes moléculaire A B C D E F kd + - 0 0 0 65kd + 0 0 0 0 kd + + 0 O 0

41kd-43kd + + + - -

32kd + 0 0 0 0

24kd + + - + -

18kd 0 0 0 0 0 kd 0 0 0 0 0

+ = Réactivité exigée pour ce poids moléculaire.

- = Absence de réactivité exigée pour ce poids molécu25 laire.

0 = Aucune condition de réactivité pour ce poids moléculaire.

Apres que les tracés ont été ainsi assignés, les répartitions des dispositions des bandes ont été compa30 rées aux résultats d'essaissur les mêmes échantillons obtenus en utilisant un Essai aux Anticorps Immunofluorescent (ImmunoFluorescent Antibody test - IFA) effectué par les "Orange County Public Health and Medical Services Laboratories (Santa Anna, Californie) et trois 35 nécessaires autorisés par la FDA. Ces derniers étaient

les suivants: (1) Virgo HTLV-III ELISA, ElectroNucleonics, Inc. (ENI), Fairfield, New Jersey; (2) Abbott HTLV-III EIA, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois; et (3) HTLV-III Bio-Enzabead Test, Litton 5 Bionetics, Charleston, Caroline du Sud; tous ont été effectués conformément aux instructions du fabricant.

Les comparaisons sont données dans le tableau II.

T A B L E A U I

Comparaison des dispositions des bandes de l'Immunoblot avec IFA et divers ELISA Classification de la répartition Groupe testé SIDA Nombre des bandes

A B

21 34

Immunoblot

C D

41 0

Nombre total réactif sur l'Immunoblot IFA Positif N/D

E F

1 3

Nombre Abbott d'ELISA EN96 Positifs Litton Homosexuel 125 49 46 16 1 2 11 114 114 118 N/D N/D Sujet à risque, non homosexuel 44 10 7 1 0 0 26 18 18 26 N/D N/D Sujet à risque, préférence sexuelle inconnue 94 27 10 10 1 3 43 51 51 58 N/D N/D Aucun risque signalé 59 1 0 0 0 3 55 4 N/D 10 6 N/D CMV Positif 10 2 0 0 0 1 7 3 N/D 2 2 N/D Myélome Positif 11 0 O 0 0 0 11 O N/D 0 0 N/D Facteur. rhumatoide positif 12 0 0 O 0 0 12 0 N/D O 0 N/D ANA Positif 10 0 0 0 0 0 10 0 N/D 0 0 N/D N/D = Non déterminé CMV = cytomégalovirus ANA = Anticorps antinucléaire uLn r\' o

Les résultats de ce tableau indiquent une corrélation élevée entre le dosage Immunoblot de Bio-Rad et l'ELISA et l'IFA à la fois.en ce qui concerne la sensibilité et la spécificité pour la détection d'anticorps 5 dirigés contre les protéines virales associées au SIDA.

Plusieurs dispositions de bandes distinctes ont été observées à l'intérieur des groupes et entre les groupes et les individus à risque. Les individus chez lesquels le SIDA a été diagnostiqué avaient une proportion de la 10 disposition des bandes C plus élevée, tandis que

d'autres groupes à risque avaient principalement des dispositions de bandes A et B. Sur les 59 échantillons provenant d'individus n'appartenant pas à un groupe à risque connu, seul un pourcent présentait une réactivité 15 avec p24 ou l'intervalle gp41-43, tandis que cinq pourcents présentaient une réactivité pour d'autres poids moléculaires. Des échantillons choisis présentant un potentiel de réaction non spécifique ont également été testés et se sont révélés être généralement négatifs 20 tant à l'essai ELISA qu'à l'essai Immunoblot, à l'exception de trois individus CMV positifs.

Les moyennes des densités optiques pour des valeurs de Rf choisies sont données dans le dessin annexé pour trois des populations: les 100 sujets atteints de 25 SIDA, les 124 homosexuels de sexe masculin et les 59 sujets n'appartenant pas à un groupe à risque connu. La marge d'erreur pour chaque valeur est indiquée au sommet

de chaque bâton par un crochet vertical.

Les résultats de la figure montrent que pour des 30 valeurs de Rf correspondant à un poids moléculaire de 41kd-43kd, la densité optique moyenne de la population atteinte du SIDA (1,37) était supérieure d'une quantité statistiquement significative (P<0,005) à celle de la population homosexuelle (0,71). Inversement, pour des 35 valeurs de Rf correspondant à des poids moléculaires de 12Okd et 24kd, les densités optiques moyennes de la population homosexuelle étaient supérieures d'une quantité statistiquement significative à celle de la population atteinte de SIDA. Pour 120kd, la densité 5 optique moyenne de la population homosexuelle était de 0,05, contre 0,02 pour la population atteinte de SIDA (P<0,01); tandis que pour 24kd, la densité optique moyenne pour la population homosexuelle était de 0,62, contre 0,36 pour la population atteinte de SIDA 10 (P<0,001).- Aucune différence significative n'a été observée dans les densités optiques moyennes entre les populations homosexuelles et atteintes de SIDA pour des valeurs de Rf correspondant aux poids moléculaires de

kd, 55kd et 18kd.

Ainsi, les taux d'anticorps correspondant à des protéines virales du SIDA de poids moléculaires 41kd43kd, 120kd et 24kd montrent des distinctions statistiquement significatives entre les échantillons provenant de ceux ayant le SIDA et des échantillons provenant de 20 ceux appartenant à un groupe à haut risque (et probablement exposé au SIDA) qui sont restés en bonne-santé, le taux pour 41kd-43kd étant supérieur dans la population atteinte du SIDA d'un facteur d'environ 2, et les taux pour 120kd et 24kd étant inférieurs, ici encore d'un 25 facteur d'environ 2. Avec ces différences statistiquement significatives, on peut ainsi faire la différence entre ceux ayant le SIDA (parmi lesquels ceux chez lesquels le SIDA est imminent) et ceux ayant été exposés mais toujours en bonne santé. L'analyse peut être basée 30 sur n'importe lequel de ces trois poids moléculaires individuellement. L'intervalle 41kd-43kd, par exemple, présente une différence d'intensité des bandes particulièrement grande dans la figure. L'analyse peut aussi être basée sur les trois poids moléculaires ou sur n'im35 porte quelle autre combinaison qui met en évidence les distinctions statistiquement significatives entre des

populations saines et immunodéficientes.

La distinction entre les deux états (malade et

simplement exposé) peut être obtenue en comparant les niveaux de réaction au(x) poids moléculaire(s) choisi(s) 5 avec un étalon obtenu à partir d'un essai effectué par le même procédé sur un échantillon connu ou avec des gammes basées sur des évaluations statistiques des populations.

La détection peut être effectuée par n'importe 10 quel mode opératoire d'essai capable de détecter les taux d'anticorps dirigés contre des protéines déterminées (ou des protéines dans des bandes étroitement définies). On connait dans la technique une grande variété de ces modes opératoires. Comme exemples de ceux-ci, on 15 citera les dosages radioimmunologiques, les dosages par immunofluorescence (IFA), les dosages par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA), et les immunodosages enzymatiques (EIA). Ces dosages peuvent mettre en jeu des constituants en phase solide ayant des configurations 20 variées, parmi lesquelles des microbilles, des récipients revêtus ou des bandes ou membranes liées à des protéines. Les bandes sont particulièrement préférées, et celles-ci peuvent se préparer par diverses techniques, parmi lesquelles les techniques dites Western 25 blot et Southern Blot ainsi que des techniques par lesquelles des protéines sont isolées de manière indépendante et immobilisées sur les bandes dans des régions séparées. Un exemple met en jeu l'utilisation d'un Western 30 blot d'un électrophorétogramme d'un virus du SIDA. Les virus du SIDA peuvent être obtenus par le public de diverses sources. Par exemple, le HTLV-III peut être fourni par Organon Teknika Corporation, Bionetics Laboratory Products Div., Charleston, Caroline du sud; par Proto35 tech Incorporated, St. Paul, Minnesota; ou par la Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey. On peut aussi obtenir le LAV auprès de Genetic Systems, Seattle, Washington. Le virus peut être lysé par des procédés classiques, tel que par exemple l'utilisation de SDS

(dodécylsulfate de sodium) dans une solution tampon.

Le support en phase solide peut être n'importe quelle matière en phase solide inerte capable d'immobiliser les protéines virales. Des supports préférés sont des membranes absorbantes telles que par exemple la nitrocellulose, le papier aminobenzyloxyméthylé (ABM), le 10 papier traité par le 2-aminophénylthioéther (APT), le

nylon, le nylon modifié par des charges, le papier diazobenzyloxyméthylé (DBM), le papier traité par le 2diazophénylthioéther (DPT), et la cellulose diéthylaminoéthylée (DEAE). La nitrocellulose est particulièrement 15 préférée.

Les protéines virales sont séparées en régions ou bandes distinctes disposées spatialement dans une disposition choisie à l'avance pour l'immobilisation sur le support. La séparation est commodément obtenue par 20 fractionnement électrophorétique des protéines dans un gel en plaque tel que l'agarose ou le polyacrylamide, le polyacrylamide étant préféré. La disposition spatiale est ainsi celle de l'électrophorétogramme obtenu. L'immobilisation des bandes sur le support peut être réali25 sée par transfert direct à partir du gel. Celui-ci peut

être réalisé par transfert par diffusion. (Southern blotting) ou par transfert électrophorétique (Western blotting). Ce dernier est préféré. L'immobilisation est obtenue par adsorption superficielle par contact, de 30 préférence sans agent de liaison intermédiaire.

Pour augmenter l'uniformité d'un essai au suivant, et pour réduire au minimum les résultats d'essai faussement positifs, on préfère qu'il y ait des concentrations approximativement égales de chaque protéine 35 virale dans toutes les taches isolées. Il est rare que les virus eux-mêmes fournissent ces niveaux de concentration, et il est souhaitable en conséquence que certaines bandes soient diminuées ou augmentées au cours du processus de séparation des bandes. Ceci peut être ac5 compli en utilisant la chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou la chromatographie d'affinité pour concentrer ou supprimer les bandes appropriées. Si, par exemple, un échantillon de virus contient une quantité excessive de protéine p24, on peut faire passer l'échan10 tillon à travers une colonne de lectine qui retiendra toutes les protéines excepté la p24. Les protéines liées sont ensuite éluées sélectivement, et la p24 est renvoyée dans le mélange, en une proportion appropriée. Un autre exemple est celui d'échantillons de virus défi15 cients en p41 qui peuvent être complétés avec du p41 pur obtenu par HPLC à partir d'un autre virus ou d'une autre

source de la protéine à une concentration choisie.

Un agent bloquant est généralement incorporé

pour empêcher les liaisons non spécifiques dès que l'im20 mobilisation des protéines virales a eu lieu. Les protéines du lait et les détergents sont des agents bloquants particulièrement efficaces, qui sont généralement appliqués en solution aqueuse avec un agent antimousse.

Une concentration typique pour la protéine de lait est 25 dans l'intervalle d'environ 1 % à environ 10 % en poids.

Un nécessaire d'essai peut associer les divers constituants nécessaires pour effectuer plusieurs essais tels que décrits ci-dessus simultanément. Parmi les constituants du nécessaire figurent une série de bandes 30 de la matière en phase solide pratiquement identique, ayant chacune les protéines virales immobilisées sur un de leurs côtés, et espacées à des intervalles sur sa longueur. Les bandes peuvent être commodément découpées dans une membrane Western blot transférée à partir d'un 35 gel en plaque unique. Les bandes sont donc identiques en 1 1

ce qui concerne les types, les quantités et les positions des protéines virales. Les bandes sont de préférence marquées pour indiquer le côté sur lequel les protéines sont liées et pour indiquer l'orientation 5 adéquate, garantissant ainsi que toutes les bandes sont présentées dans le même ordre.

Un second constituant du nécessaire est une solution d'un conjugué d'un anticorps spécifique des anticorps de l'échantillon qui se lient aux protéines 10 virales, l'autre constituant du conjugué étant une

enzyme appropriée, de préférence une phosphatase alcaline. L'anticorps conjugué sera une anti-immunoglobuline humaine, telle que les anti-IgG, IgM, -IgA humaines, ou un anticorps particulier d'une autre classe ou sous15 classe d'anticorps. On préfère l'IgG anti-humaine.

La quantité de conjugué utilisée dans une quantité qui est supérieure à la gamme de la quantité d'anticorps de l'échantillon attendu dans chaque essai, de telle sorte que tous les anticorps de l'échantillon pré20 sents sur le support se lient pour former des complexes.

La concentration du conjugué dans la solution sera choisie sur la base de la sensibilité. La concentration la plus faible qui donnera des résultats visibles sur un échantillon étalon sera généralement utilisée. Dans la 25 plupart des applications, celle-ci se situera entre les

dilutions de 1:500 et 1:2000.

Un troisième constituant est une solution du substrat sur lequel agit l'enzyme, de préférence une combinaison de nitrobleu de chlorure de tétrazolium et 30 de phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (NBT/BCIP) dans des quantités approximativement équimolaires. La quantité de substrat utilisée est une quantité suffisante pour produire une modification détectable dueà l'action de l'enzyme. Pour le NBT/BCIP, celle-ci s'éta35 blira en général dans l'intervalle d'environ lx10-4 - 4mole/litre à environ 10x mole/litre pour chaque mole/litre à environ lOxlo mole/litre pour chaque constituant. On peut également y inclure une solution de lavage contenant l'agent bloquant. En outre, des bandes de comparaison complètement développées représentant les 5 étalons sont incluses comme guide pour l'opérateur. Ces bandes peuvent se présenter sous forme de photographies dans un manuel d'instruction ou sous forme de bandes réelles. Le nécessaire contient encore des réceptacles pour recevoir les bandes d'essai individuelles et les 10 plonger dans les échantillons, réactifs et solutions de lavage, en vue de l'incubation et de l'agitation, tout en permettant l'aspiration des liquides à divers stades

du processus d'essai.

Un autre exemple est celui de l'utilisation de 15 réactifs de liaison en phase solide préparés à partir d'un lysat viral de SIDA en isolant les protéines choisies du lysat, en diluant chaque protéine dans un liquide de support pour former des mélanges de réserve contenant chacun une protéine à une concentration choisie à 20 l'avance, et en appliquant les mélanges sur les régions séparées, définies de manière précise, sur un support en phase solide, en immobilisant les protéines sur celui-ci

dans une disposition choisie à l'avance.

Pour le préparer pour les séparations, le virus 25 est solubilisé par un détergent en utilisant du SDS ou CHAPS -- 3-[(chloramidopropyl) diméthylammonio]1-propane sulfonate -- et il est réduit par le mercaptoéthanol ou le dithiotréitol. Une chromatographie préliminaire sur une colonne de lectine retient alors toutes les glyco30 protéines (160, 120, 65 et 41-43 kd) du mélange. Les protéines non retenues sont alors concentrées sur une colonne de HPLC en phase inversée, puis éluées avec un gradient croissant de composé organique pour séparer les - protéines restantes. A ce stade, la colonne peut être 35 une colonne à phase liée telle que par exemple C-4, C-1, phényle ou cyclopropyle. Les glycoprotéines retenues sur la colonne de lectine sont éluées et concentrées sur une colonne de HPLC à phase inversée également, de laquelle elles sont séparées par élution à gradient. La colonne à phase inversée effectue dans chaque cas une concentra5 tion, une séparation supplémentaire et une dessalinisation des protéines. Après la chromatographie en phase inversée, les fractions peuvent être concentrées à sec sur un évaporateur tel qu'un Speed-Vac Savant. La séparation peut être suivie en prélevant de petits échantil10 lons de chaque fraction et en les testant par analyse

par Western blot.

Dans un autre schéma, la première séparation peut être effectuée par chromatographie à perméation de gel, qui sépare les protéines de poids moléculaires éle15 vés (160, 120 et 65 kd) les unes des autres et des constituants de poids moléculaires plus faibles. Les constituants de poids moléculaires plus faibles peuvent ensuite être appliqués directement sur une colonne à phase inversée pour la dessalinisation et la séparation simul20 tanées. Des séparations incomplètes peuvent alors être

répétées sur d'autres colonnes à phase inversée.

Une troisième solution est d'utiliser une chromatographie par échange d'ions ou sur hydroxyapatite en présence de détergents comme première dimension, puis 25 une séparation finale en phase inversée.

La chromatographie d'interaction hydrophobe en présence de modificateurs organiques est une quatrième solution, tandis que la chromatographie d'affinité en utilisant une colonne de colorant telle que le Bleu 30 AffiGel est une cinquième solution, toutes deux étant

suivies d'une HPLC en phase inversée.

On décrira à présent un exemple particulier

d'une séparation des protéines virales du SIDA en utilisant une technique de perméation de gel.

1. Préparation de l'échantillon de virus Le virus purifié est mis en suspension dans une solution de dodécylsulfate de sodium & 2 % et de 2mercaptoéthanol 700 mM dans du chlorure de TRIS 60 mM à pH 8,0, et chauffé pendant 2 minutes à 100'C. Le virus lysé et solubilisé obtenu est ajouté directement à une colonne de HPLC. 2. Chromatoaraphie par exclusion de taille La colonne est une colonne de chromatographie par exclusion de taille TSK 250 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Californie), et la chromatogra10 phie est effectuée en utilisant une élution isocratique avec un mélange de 20 % d'isopropanol dans du PBS contenant 0,05 % de Triton X-100. Le débit est de 0,75 ml/mn et l'effluent est suivi à 214 nm. Des fractions d'un volume de 0,5 ml sont recueillies par un collecteur 15 automatique de fractions, et le constituant organique est éliminé dans un évaporateur Speed-Vac. L'éluat est suivi par - la technique Western blot pour garantir la

séparation des protéines virales.

Les protéines virales ayant les poids moléculai20 res les plus élevés (160, 120 et 65 kd) sont isolées individuellement par cette séparation, tandis que les protéines restantes s'éluent sous forme de mélanges (65 et 55 kd; 55 et 41-43 kd; 41-43, 30 et 24 kd; et 24 et 18 kd). Les fractions à constituant unique (160, 120 et 25 65 kd) sont dessalinisés sur une colonne de garde à phase inversée (C-8, 4,6 x 40 mm) et le solvant est évaporé pour laisser la protéine pure. Les protéines provenant des fractions à constituants multiples sont isolées comme il est décrit dans les paragraphes suivants. 30 3. Chromatoqraphie d'interaction hvdrophobe en phase inversée Les fractions contenant la protéine 24 kd sont fractionnées sur une colonne TSK Phenyl-5PW Bio-Rad (7,5x 125 mm) pour éliminer sélectivement cette pro35 téine. Un gradient linéaire allant de 100 % de solvant A (acide trifluoroacétique aqueux à 0,1 %) à 100 % de solvant B (acide trifluoroacétique à 0,1 % dans de l'acétonitrile contenant 10 % d'isopropanol) est réalisé sur 30 minutes. La protéine p24 traverse la colonne la première tandis que les autres protéines s'éluent en5 suite sous forme de mélange. Le mélange est soumis à un fractionnement supplémentaire par chromatographie en

phase inversée sur une colonne C-4.

La colonne Phenyl-5PW peut aussi fonctionner sur le mode de l'interaction hydrophobe en utilisant un gra10 dient de sel inverse en présence de 20 % d'isopropanol,

avec des résultats similaires.

4. Chromatographie en phase inversée supplémentaire Les mélanges de protéines provenant de la co15 lonne de filtration sur gel décrite au paragraphe 2 ci-dessus sont soumis à un fractionnement supplémentaire sur une colonne Hi-Pore RP304 Bio-Rad. Avant le fractionnement, les échantillons sont évaporés dans un évaporateur Speed-Vac pour éliminer le constituant orga20 nique, puis injectés directement sur la colonne. On fait passer un gradient linéaire allant du tampon A (acide heptafluorobutyrique aqueux à 0,1 %) au tampon B (acide heptafluorobutyrique à 0,1 % dans l'acétonitrile) sur une durée de 60 minutes après 15 minutes initiales à 100 25 % de tampon A, avec un débit de 1 ml/mn tout en suivant l'éluant à 214 nm. Les fractions sont recueillies à des intervalles de 0,5 ml, et sont suivies par analyse Western blot. Tous les mélanges de protéines restants

sont résolus en constituants uniques par ce procédé.

La description détaillée qui précède est donnée

essentiellement dans un but d'illustration. Il est évident pour l'homme du métier que de nombreuses modifications, variations et substitutions supplémentaires, non mentionnées ici, pourraient être apportées sans sortir 35 de l'esprit et du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour déterminer la présence de SIDA dans un sujet, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à mesurer la concentration d'anticorps 5 dans le sérum de ce sujet, qui se lient à des protéines virales du SIDA ayant des poids moléculaires choisis dans le groupe constitué d'environ 24000, environ 41000 à environ 43000, et environ 120000, et à comparer la

mesure obtenue à un étalon.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ces protéines virales du SIDA sont celles qui ont des poids moléculaires allant d'environ 41000 à

environ 43000.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé 15 en ce qu'il comprend l'étape consistant à mesurer la concentration des anticorps dirigés contre chacune de

ces protéines virales du SIDA dans ce groupe.

4. Procédé pour lire une tache d'antigène viral du SIDA liée à des anticorps marqués provenant d'un su20 jet exposé au SIDA pour déterminer la présence de SIDA dans ce sujet, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à détecter le taux d'anticorps se liant à des protéines virales du SIDA ayant des poids moléculaires choisis dans le groupe constitué d'environ 24000, envi25 ron 41000 à environ 43000, et environ 120000, et à

comparer ce taux détecté à un étalon.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé

en ce que ces protéines virales du SIDA sont celles qui ont des poids moléculaires d'environ 41000 à environ 30 43000.

6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à mesurer la concentration d'anticorps dirigés contre chacune de ces

protéines virales du SIDA dans ce groupe.

7. Procédé pour déterminer le stade de développement du SIDA chez des sujets exposés au SIDA, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à détecter le taux d'anticorps dans ces sujets, qui se lient à 5 des protéines virales du SIDA ayant des poids moléculaires choisis dans le groupe constitué d'environ 24000, environ 41000 à environ 43000 et environ 120000, et à comparer ce taux détecté à la gamme du taux de ces anticorps chez des sujets à un stade de développement du 10 SIDA connu obtenu par évaluation statistique d'une

population de ces sujets.

8. Procédé pour détecter la présence du SIDA chez un sujet exposé au SIDA, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à faire incuber une tache 15 d'antigène viral du SIDA constituée de bandes de poids moléculaires d'antigène définis avec le sérum de ce sujet pour y former un dessin de liaison de bandes d'anticorps liées et à comparer ce dessin de liaison avec des dessins de liaison étalons représentant des sujets 20 connus pour avoir contracté le SIDA et des sujets connus pour avoir été exposés mais ne pas avoir contracté le SIDA.