JP2001518313A - Ｈｉｖ突然変異の評価方法およびキット - Google Patents
Ｈｉｖ突然変異の評価方法およびキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
ＨＩＶ感染試料由来の遺伝子材料の試料の対立遺伝子型に関する情報を得るための能率的、かつ階層的な方法は、試料中のＡおよびＴヌクレオチドの位置を評価することにより、ＨＩＶ−１の逆転写酵素およびプロテアーゼ遺伝子の既知の突然変異株変異の９３−９５％を決定することができるという観察によっている。それゆえ、ｄｄＡおよびｄｄＴのみをチェインターミネーターとして使用する試料において、２つの初期配列決定反応を実行することによって、全ての突然変異株変異の実質的な分画を明確に同定することができる。これら２つの塩基の位置に基いて同定し得ない試料の小分画については、第２のテストが実行され、全ての４塩基について配列が３′−方向に決定される。しかし、不確実さが残るものに対しては、最終テストが実行され、全ての４塩基について３′−および５′−方向の両方において、試料の配列が決定される。本方法を実施するために、階層内の３テストを実施するに適した試薬が、２ないしそれより多いサブセットを含有するキットとして、好適にセットになっている。第１のサブキットは、ＡおよびＴ配列決定を実行するための試薬を包含している。更なるサブキットは、標的ＤＮＡの１つまたは両方の鎖について、４塩基配列決定を実行するための試薬を含有している。
Description
【０００１】 （発明の背景） 病態の存在または感受性を決定するための遺伝子試験は、医療の改善に信じが
たい程の機会を提供しており、そしてそのような試験の可能性は、疾病関連遺伝
子、および／または、突然変異が同定される数の増加と共に、日常的に増加して
いる。しかしながら、この可能性を実現するために克服せねばならない主な障害
は、試験の高コストである。このことは、多数の変異体を試験する必要性が、試
験処理を高価にし、日常的な試験が達成できないような、高度に多型性の遺伝子
の場合において、特に真実である。
たい程の機会を提供しており、そしてそのような試験の可能性は、疾病関連遺伝
子、および／または、突然変異が同定される数の増加と共に、日常的に増加して
いる。しかしながら、この可能性を実現するために克服せねばならない主な障害
は、試験の高コストである。このことは、多数の変異体を試験する必要性が、試
験処理を高価にし、日常的な試験が達成できないような、高度に多型性の遺伝子
の場合において、特に真実である。
【０００２】 ＤＮＡ配列における変化に対する試験は、多くの当業者には、そのような試験
は、日常的な試験には余りにも高価すぎると信じられているのであるが、標的の
核酸の完全な配列決定を経て、実行することができる。ＤＮＡ配列の変化は、ま
た、Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：８７４−８７９（１９８９）、によ
って記載された、「一本鎖高次構造多型」（「ＳＳＣＰ」）と云われる技術によ
って、あるいは、Ｓａｒｋａｒら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：４４１０４４３（
１９９２）、によって記載されたジデオキシフィンガープリント法（「ｄｄＦ」
）と称するその変法によって、検出することができる。ＳＳＣＰおよびｄｄＦは
、共に、ＤＮＡ断片が、非変成電気泳動ゲル上で、電気泳動的に分離されるとき
に生成されるバンドのパターンを、評価するものである。このパターンは、断片
のサイズの組合せ、および非変成断片の三次元立体配座の組合せに依存している
。それゆえ、断片バンドの理論上の配置は等しくないから、パターンを配列決定
に使うことはできない。
は、日常的な試験には余りにも高価すぎると信じられているのであるが、標的の
核酸の完全な配列決定を経て、実行することができる。ＤＮＡ配列の変化は、ま
た、Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：８７４−８７９（１９８９）、によ
って記載された、「一本鎖高次構造多型」（「ＳＳＣＰ」）と云われる技術によ
って、あるいは、Ｓａｒｋａｒら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：４４１０４４３（
１９９２）、によって記載されたジデオキシフィンガープリント法（「ｄｄＦ」
）と称するその変法によって、検出することができる。ＳＳＣＰおよびｄｄＦは
、共に、ＤＮＡ断片が、非変成電気泳動ゲル上で、電気泳動的に分離されるとき
に生成されるバンドのパターンを、評価するものである。このパターンは、断片
のサイズの組合せ、および非変成断片の三次元立体配座の組合せに依存している
。それゆえ、断片バンドの理論上の配置は等しくないから、パターンを配列決定
に使うことはできない。
【０００３】 参照することにより、ここにとり入れられている、米国特許第５，５４５，５
２７号および国際特許公報ＷＯ９６／０７７６１、に記載されている、階層アッ
セイ法（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）は
、試験した遺伝子配列が存在しないことを、誤って示す結果が多いが、しかしそ
のような遺伝子配列の存在を誤って示す結果はまれであるような、１連の異なっ
た試験方法を利用することによって、試験当りのコストを、体系的に減少させる
機構を提供している。階層試験は、しばしば、分子試験の異なったタイプの組み
合わせである、例えば、イムノアッセイ、オリゴヌクレオチド・プローブハイブ
リダイゼーション・テスト、オリゴヌクレオチド断片解析、および直接核酸配列
決定法の組合せである。
２７号および国際特許公報ＷＯ９６／０７７６１、に記載されている、階層アッ
セイ法（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）は
、試験した遺伝子配列が存在しないことを、誤って示す結果が多いが、しかしそ
のような遺伝子配列の存在を誤って示す結果はまれであるような、１連の異なっ
た試験方法を利用することによって、試験当りのコストを、体系的に減少させる
機構を提供している。階層試験は、しばしば、分子試験の異なったタイプの組み
合わせである、例えば、イムノアッセイ、オリゴヌクレオチド・プローブハイブ
リダイゼーション・テスト、オリゴヌクレオチド断片解析、および直接核酸配列
決定法の組合せである。
【０００４】 国際特許公報ＷＯ９７／２３６５０は、ヌクレオチド配列の全ての４つの塩基
よりも少ない塩基の評価によって、多型遺伝子座の対立遺伝子型の評価を開示し
ている。その出願の発明は、ＨＬＡの対立遺伝子型の決定、およびクラミジア菌
株のタイピングに関して例示している。ＨＩＶの評価に使用するためのプローブ
について特別な開示はない。
よりも少ない塩基の評価によって、多型遺伝子座の対立遺伝子型の評価を開示し
ている。その出願の発明は、ＨＬＡの対立遺伝子型の決定、およびクラミジア菌
株のタイピングに関して例示している。ＨＩＶの評価に使用するためのプローブ
について特別な開示はない。
【０００５】 本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出および特徴づけのための単
独、あるいは、階層試験プロトコルの１部として使用することができる、特別な
１連の試験に関する。
独、あるいは、階層試験プロトコルの１部として使用することができる、特別な
１連の試験に関する。
【０００６】 （発明の概要） 本発明の方法は、ＨＩＶ感染試料由来の遺伝子材料の試料の対立遺伝子型に関
する情報を受けるための、簡素化した階層的方法を提供する。ＨＩＶのプロテア
ーゼおよび逆転写酵素遺伝子の公知の突然変異型変異の９３ないし９５％が、試
料中のＡおよびＴヌクレオチドの位置を評価することにより決定できることが確
定された。それゆえ、全ての突然変異型変異の実質的な画分を、ｄｄＡおよびｄ
ｄＴのみをチェインターミネーターとして使用して、試料で２つの開始配列決定
反応を行うことにより明確に同定することができる。これら２つの塩基の位置に
基づいて同定できない、小断片試料については、全ての４つの塩基について３′
−方向で配列が決定される、第２の試験が実行される。この試験は、実質的に残
りの試料の全てを同定することができる。しかしながら、あいまいさが残るもの
については、試料の配列が全ての４つの塩基に対し３′−および５′−方向の両
方において決定される、最終試験が実行される。
する情報を受けるための、簡素化した階層的方法を提供する。ＨＩＶのプロテア
ーゼおよび逆転写酵素遺伝子の公知の突然変異型変異の９３ないし９５％が、試
料中のＡおよびＴヌクレオチドの位置を評価することにより決定できることが確
定された。それゆえ、全ての突然変異型変異の実質的な画分を、ｄｄＡおよびｄ
ｄＴのみをチェインターミネーターとして使用して、試料で２つの開始配列決定
反応を行うことにより明確に同定することができる。これら２つの塩基の位置に
基づいて同定できない、小断片試料については、全ての４つの塩基について３′
−方向で配列が決定される、第２の試験が実行される。この試験は、実質的に残
りの試料の全てを同定することができる。しかしながら、あいまいさが残るもの
については、試料の配列が全ての４つの塩基に対し３′−および５′−方向の両
方において決定される、最終試験が実行される。
【０００７】 本発明の方法を実施するために、階層内の３つの試験を実施するのに適した試
薬は、２またはそれより多くのサブキットを含有するキットとして、好適にセッ
トになっている。第１のサブキットには、ＡおよびＴ配列決定を行うための試薬
が含まれる。追加のサブキットには、標的ＤＮＡの１つまたは両方の鎖の４つの
塩基配列の決定を行うための試薬が含まれる。１つの鎖の配列の決定は、３′−
方向の全てにおいて、５′−方向の全てにおいて、または２つの鎖の組合せとし
て、実行することができる。
薬は、２またはそれより多くのサブキットを含有するキットとして、好適にセッ
トになっている。第１のサブキットには、ＡおよびＴ配列決定を行うための試薬
が含まれる。追加のサブキットには、標的ＤＮＡの１つまたは両方の鎖の４つの
塩基配列の決定を行うための試薬が含まれる。１つの鎖の配列の決定は、３′−
方向の全てにおいて、５′−方向の全てにおいて、または２つの鎖の組合せとし
て、実行することができる。
【０００８】 （発明の詳細な説明） 本発明において使用される用語は、当該技術内での標準であるが、いくつかの
用語について以下の定義が、明確さを保証するために与えられる。 １．「対立遺伝子」は、多型的遺伝子座におけるヌクレオチド配列の特別のバー
ジョンを意味する。 ２．「多型部位」は、集団内で変異し得る遺伝子座において与えられたヌクレオ
チドの位置を意味する。 ３．「遺伝子」または「遺伝子座」は、与えられたゲノム内の特定のヌクレオチ
ド配列を意味する。 ４．遺伝子座におけるヌクレオチドの「位置」（ｌｏｃａｔｉｏｎ）」または「
位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、一般的には遺伝子のｃＤＮＡ配列またはゲノム
配列である、遺伝子でヌクレオチドに割り当てられた番号を意味する。 ５．ヌクレオチドのアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンは、時には、そ
の呼称、Ａ、Ｃ、ＧあるいはＴ、でそれぞれ代表される。チェインターミネータ
ーとして使用される、ジデオキシヌクレオチドはｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧおよび
ｄｄＴとして略称する。
用語について以下の定義が、明確さを保証するために与えられる。 １．「対立遺伝子」は、多型的遺伝子座におけるヌクレオチド配列の特別のバー
ジョンを意味する。 ２．「多型部位」は、集団内で変異し得る遺伝子座において与えられたヌクレオ
チドの位置を意味する。 ３．「遺伝子」または「遺伝子座」は、与えられたゲノム内の特定のヌクレオチ
ド配列を意味する。 ４．遺伝子座におけるヌクレオチドの「位置」（ｌｏｃａｔｉｏｎ）」または「
位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、一般的には遺伝子のｃＤＮＡ配列またはゲノム
配列である、遺伝子でヌクレオチドに割り当てられた番号を意味する。 ５．ヌクレオチドのアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンは、時には、そ
の呼称、Ａ、Ｃ、ＧあるいはＴ、でそれぞれ代表される。チェインターミネータ
ーとして使用される、ジデオキシヌクレオチドはｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧおよび
ｄｄＴとして略称する。
【０００９】 多型の遺伝子座内の特別な位置における塩基を同定する知識は、その位置の対
立遺伝子型を決定するのに充分であろうことは、当業者にずっと以前から明白な
ことであったが、この知識が配列決定手順の修正に導くことはなかった。むしろ
、そのような知識は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション・アッセイや対
立遺伝子特異的ライゲーション・アッセイ（ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の
ような技術の開発を促進した。しかしながら、その可能性を認識する技術の失敗
にもかかわらず、特異的な患者の試料中にはどのような対立遺伝子が存在してい
るかを決定するために、多型遺伝子座の全ての４つのヌクレオチドの配列を決め
る必要性は必ずしもないのである。国際特許公報Ｎｏ．ＷＯ９７／２３６５０に
一般的に開示されているように、遺伝子座のある種の対立遺伝子は、４つより少
ない、そして、しばしばたった１つのヌクレオチドの、位置の同定に基いて区別
し得る。この発見は、高度に多型なＨＩＶゲノム内での、改善された対立遺伝子
同定法の開発を可能にした。
立遺伝子型を決定するのに充分であろうことは、当業者にずっと以前から明白な
ことであったが、この知識が配列決定手順の修正に導くことはなかった。むしろ
、そのような知識は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション・アッセイや対
立遺伝子特異的ライゲーション・アッセイ（ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の
ような技術の開発を促進した。しかしながら、その可能性を認識する技術の失敗
にもかかわらず、特異的な患者の試料中にはどのような対立遺伝子が存在してい
るかを決定するために、多型遺伝子座の全ての４つのヌクレオチドの配列を決め
る必要性は必ずしもないのである。国際特許公報Ｎｏ．ＷＯ９７／２３６５０に
一般的に開示されているように、遺伝子座のある種の対立遺伝子は、４つより少
ない、そして、しばしばたった１つのヌクレオチドの、位置の同定に基いて区別
し得る。この発見は、高度に多型なＨＩＶゲノム内での、改善された対立遺伝子
同定法の開発を可能にした。
【００１０】 伝統的に、もし配列決定が多型遺伝子の対立遺伝子を評価するのに使われてき
たならば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７４：５４６３−５４６７（１９７７）によって記載された型の４ジデオキシヌ
クレオチド「配列決定」反応は、試料と同時に進行し、４つの反応産物がポリア
クリルアミドゲルによって分析される［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら著、「分子
生物学における最近のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、７．６章（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｕｎｓ；１９９５）を参照］。この周知技術において、４つの配列決定
反応のそれぞれが、複数のプライマー伸長産物を生成し、それらの全てが、特殊
な型のデオキシヌクレオチドの末端となる。電気泳動ゲル上の各レーンは、伸長
産物における塩基の１つの型の位置を反映しているが、しかしこの特別な型の塩
基間に介在するヌクレオチドの順序と型を表わしているものではない。４つのレ
ーンによって提供される情報は、それゆえに、公知の配列決定手順に組み合わさ
れて、全体として配列の複合された像に至るものである。
たならば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７４：５４６３−５４６７（１９７７）によって記載された型の４ジデオキシヌ
クレオチド「配列決定」反応は、試料と同時に進行し、４つの反応産物がポリア
クリルアミドゲルによって分析される［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら著、「分子
生物学における最近のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、７．６章（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｕｎｓ；１９９５）を参照］。この周知技術において、４つの配列決定
反応のそれぞれが、複数のプライマー伸長産物を生成し、それらの全てが、特殊
な型のデオキシヌクレオチドの末端となる。電気泳動ゲル上の各レーンは、伸長
産物における塩基の１つの型の位置を反映しているが、しかしこの特別な型の塩
基間に介在するヌクレオチドの順序と型を表わしているものではない。４つのレ
ーンによって提供される情報は、それゆえに、公知の配列決定手順に組み合わさ
れて、全体として配列の複合された像に至るものである。
【００１１】 本発明の方法において、診断に関連するプロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子
に良好な部分配列は、３つのステップで得られる：１）試料中に存在するＲＮＡ
からｃＤＮＡが生成され、そして、好ましくは、プロテアーゼの前６コドンから
ＨＩＶ−１の逆転写酵素のコドン３３５まで伸長された領域にわたって増幅され
る（プライマー領域はこの範囲には含まれない）。２）配列決定反応は、１また
はそれ以上のいくつかの段階の階層レベルで行われる。３）最後に、配列決定の
はしご（ｌａｄｄｅｒｓ）を、好ましくはＯｐｅｎＧｅｎｅTMＳｙｓｔｅｍ：Ｍ
ｉｃｒｏ ＧｅｎｅＢｌａｓｔｅｒTMＤＮＡシーケンサー、ＧｅｎｅＯｂｊｅｃ
ｔｓTMおよびＧｅｎｅＬｉｂｒａｒｉａｎTMソフトウエアを使って解析する。
に良好な部分配列は、３つのステップで得られる：１）試料中に存在するＲＮＡ
からｃＤＮＡが生成され、そして、好ましくは、プロテアーゼの前６コドンから
ＨＩＶ−１の逆転写酵素のコドン３３５まで伸長された領域にわたって増幅され
る（プライマー領域はこの範囲には含まれない）。２）配列決定反応は、１また
はそれ以上のいくつかの段階の階層レベルで行われる。３）最後に、配列決定の
はしご（ｌａｄｄｅｒｓ）を、好ましくはＯｐｅｎＧｅｎｅTMＳｙｓｔｅｍ：Ｍ
ｉｃｒｏ ＧｅｎｅＢｌａｓｔｅｒTMＤＮＡシーケンサー、ＧｅｎｅＯｂｊｅｃ
ｔｓTMおよびＧｅｎｅＬｉｂｒａｒｉａｎTMソフトウエアを使って解析する。
【００１２】 ＦＩＧ．１は、本発明の方法の１実施態様を図式的に示したものである。図に
示すように、ＲＮＡ試料が得られ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって処理
されて、標的細胞由来のＨＩＶゲノムのプロテアーゼおよび逆転写遺伝子にわた
る約１．３ｋｂのアンプリコンを産生する。この反応は、例えば、以下のプライ
マーを使用したＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ社のＴＩＴＡＮTMＯｎ
ｅ−Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲシステム（カタログ番号１８５５４７６または１８
８２３８２）を使用して実施することができる。
示すように、ＲＮＡ試料が得られ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって処理
されて、標的細胞由来のＨＩＶゲノムのプロテアーゼおよび逆転写遺伝子にわた
る約１．３ｋｂのアンプリコンを産生する。この反応は、例えば、以下のプライ
マーを使用したＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ社のＴＩＴＡＮTMＯｎ
ｅ−Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲシステム（カタログ番号１８５５４７６または１８
８２３８２）を使用して実施することができる。
【化９】 このステップで使用することのできる、その他のプライマーは以下の通りである
： フォワードプライマー：
： フォワードプライマー：
【化１０】 リバースプライマー：
【化１１】
【００１３】 このアンプリコンは、バッファー（２６０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．
３；３２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ2）ＴａｑＳＣ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４０２０７０）のようなポリ
メラーゼを含有する、主配列決定混合物と合わされる。このポリメラーゼは、例
えば、従来のＴａｑポリメラーゼのとり込み速度に相当する高いジデオキシヌク
レオチドのとり込み速度を有している。この混合物は、次の反応におけるストッ
クとして使用される。
３；３２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ2）ＴａｑＳＣ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４０２０７０）のようなポリ
メラーゼを含有する、主配列決定混合物と合わされる。このポリメラーゼは、例
えば、従来のＴａｑポリメラーゼのとり込み速度に相当する高いジデオキシヌク
レオチドのとり込み速度を有している。この混合物は、次の反応におけるストッ
クとして使用される。
【００１４】 本発明の方法において行われる第１の配列決定反応は、配列決定混合物中のｄ
ｄＡまたはｄｄＴのいずれかを使って実行される、１つの塩基配列決定反応であ
る。反応は、以下のプライマーを使用してプロテアーゼ遺伝子について行われる
： フォワードプライマー：
ｄＡまたはｄｄＴのいずれかを使って実行される、１つの塩基配列決定反応であ
る。反応は、以下のプライマーを使用してプロテアーゼ遺伝子について行われる
： フォワードプライマー：
【化１２】 リバースプライマー：
【化１３】 使用され得る代りのプライマーは：
【化１４】
【００１５】 逆転写酵素遺伝子については、プライマーの以下の３つのセットが使用される
： ＲＴ１プライマー フォワード：
： ＲＴ１プライマー フォワード：
【化１５】 リバース：
【化１６】 代りのフォワード：
【化１７】
【００１６】 ＲＴ２プライマー フォワード：
【化１８】 リバース：
【化１９】 代りのリバース：
【化２０】
【００１７】 ＲＴ３プライマー フォワード：
【化２１】 リバース：
【化２２】
【００１８】 ２つの異なった蛍光色素を検出および区別可能な、配列決定装置（例えば、Ａ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｍｏｄｅｌ、３７７，３１０または３７３またはＬｉＣｏｒ
ＩＲ2Ｓｙｓｔｅｍ）を使用するとき、フォワードおよびリバースの両方が、い ずれも、好ましくは２つの色素の１つで標識される。フォワードおよびリバース
配列決定断片は、ｄｄＡあるいはｄｄＴのいずれかの存在下に、多重熱サイクル
を行って試料を熱サイクルにかけて生成される。ゲル電気泳動を用いて生成した
配列決定断片の解析により、ＡおよびＴ塩基の位置の決定が可能となる。ＦＩＧ
．２Ａおよび２Ｂに示すように、ＡおよびＴ塩基の位置の知見で、逆転写酵素遺
伝子内の、全ての公知である突然変異的変異の９５％、およびプロテアーゼ遺伝
子内に変異の９３％が同定される。それゆえ、１回の反応を行うことによって、
試料の大部分の対立遺伝子型を同定することができる。
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｍｏｄｅｌ、３７７，３１０または３７３またはＬｉＣｏｒ
ＩＲ2Ｓｙｓｔｅｍ）を使用するとき、フォワードおよびリバースの両方が、い ずれも、好ましくは２つの色素の１つで標識される。フォワードおよびリバース
配列決定断片は、ｄｄＡあるいはｄｄＴのいずれかの存在下に、多重熱サイクル
を行って試料を熱サイクルにかけて生成される。ゲル電気泳動を用いて生成した
配列決定断片の解析により、ＡおよびＴ塩基の位置の決定が可能となる。ＦＩＧ
．２Ａおよび２Ｂに示すように、ＡおよびＴ塩基の位置の知見で、逆転写酵素遺
伝子内の、全ての公知である突然変異的変異の９５％、およびプロテアーゼ遺伝
子内に変異の９３％が同定される。それゆえ、１回の反応を行うことによって、
試料の大部分の対立遺伝子型を同定することができる。
【００１９】 もし、使用したシーケンサーが、１塩基しか評価することができなければ、２
回の反応を行う必要がある。これらは、同じチェインターミネーター（ｄｄＡま
たはｄｄＴ）の両者を使ったフォワードおよびバックワード配列決定反応、ある
いは、１つはｄｄＡでそして１つはｄｄＴで同一方向で行われる２つの反応であ
り、それによってＡおよびＴ塩基の位置が決定される。これら配列決定反応は、
上で考察したのと同じプライマーを用いて行うことができる。
回の反応を行う必要がある。これらは、同じチェインターミネーター（ｄｄＡま
たはｄｄＴ）の両者を使ったフォワードおよびバックワード配列決定反応、ある
いは、１つはｄｄＡでそして１つはｄｄＴで同一方向で行われる２つの反応であ
り、それによってＡおよびＴ塩基の位置が決定される。これら配列決定反応は、
上で考察したのと同じプライマーを用いて行うことができる。
【００２０】 もし、試料中に存在するＨＩＶの型が、第１の反応の結果に基づいて決定する
ことができない場合は、更なる配列決定反応が、全ての４塩基の位置を決定する
ために試料ストックについて実施される。好ましくは、これはＤＮＡの２つの鎖
の１つ、または１つの完全な直鎖配列を形成する２つの鎖の組合せの配列を含む
、中間的な複雑さの配列反応である。これは、配列断片を得るために、上記で同
定されたのと同じプライマーを用いて行うことができる。
ことができない場合は、更なる配列決定反応が、全ての４塩基の位置を決定する
ために試料ストックについて実施される。好ましくは、これはＤＮＡの２つの鎖
の１つ、または１つの完全な直鎖配列を形成する２つの鎖の組合せの配列を含む
、中間的な複雑さの配列反応である。これは、配列断片を得るために、上記で同
定されたのと同じプライマーを用いて行うことができる。
【００２１】 最後に、もし中間テストがＤＮＡ型の明確な同定を与えることができなければ
、両鎖の配列決定が行われる。再び、上記で決定されたのと同じ配列決定プライ
マーが使用される。フォワードおよびリバース配列決定断片は、はっきりと標識
されたフォワードおよびリバースプライマーを用いた、単一反応で、あるいは、
用いられた検出システムの性質に応じた別々の反応において、産生することがで
きる。
、両鎖の配列決定が行われる。再び、上記で決定されたのと同じ配列決定プライ
マーが使用される。フォワードおよびリバース配列決定断片は、はっきりと標識
されたフォワードおよびリバースプライマーを用いた、単一反応で、あるいは、
用いられた検出システムの性質に応じた別々の反応において、産生することがで
きる。
【００２２】 本発明の方法を実行するのに適した試薬は、キット形式で適切に包装される。
それゆえ、本発明は、階層アッセイを用いる、試料中のＨＩＶ−１遺伝子の遺伝
子型を解析するためのキットであって、別々にセットになっている以下の組み合
わせ： （ａ）複数のＡまたはＴ終結混合物、またはＡおよびＴ終結混合物の両者で、
Ｇ終結混合物またはＣ終結混合物ではなく、該ＡおよびＴ終結混合物は複数のプ
ライマー対の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった領域に隣接してお
り、対は、共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素の全てに実質的に隣接しており
、そして各対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識されていることを含む、
ＨＩＶ−１におけるＡおよびＴ配列決定を行うための第１のサブキット；および （ｂ）Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ終結混合物で、該終結混合物は複数のプライマー対
の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった領域に隣接しており、対は、
共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素の全てに実質的に隣接しており、そして各
対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識されていることを含む、ＨＩＶ−１
における４つの塩基配列決定を行うための第２のサブキットを含むキットを提供
する。４塩基配列決定を行うための追加的サブキットは、１つの鎖および両鎖に
ついて、中間および最終アッセイが必要なときに、包含される。
それゆえ、本発明は、階層アッセイを用いる、試料中のＨＩＶ−１遺伝子の遺伝
子型を解析するためのキットであって、別々にセットになっている以下の組み合
わせ： （ａ）複数のＡまたはＴ終結混合物、またはＡおよびＴ終結混合物の両者で、
Ｇ終結混合物またはＣ終結混合物ではなく、該ＡおよびＴ終結混合物は複数のプ
ライマー対の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった領域に隣接してお
り、対は、共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素の全てに実質的に隣接しており
、そして各対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識されていることを含む、
ＨＩＶ−１におけるＡおよびＴ配列決定を行うための第１のサブキット；および （ｂ）Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ終結混合物で、該終結混合物は複数のプライマー対
の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった領域に隣接しており、対は、
共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素の全てに実質的に隣接しており、そして各
対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識されていることを含む、ＨＩＶ−１
における４つの塩基配列決定を行うための第２のサブキットを含むキットを提供
する。４塩基配列決定を行うための追加的サブキットは、１つの鎖および両鎖に
ついて、中間および最終アッセイが必要なときに、包含される。
【００２３】 ここで使用される用語「終結混合物」は、４つのデオキシヌクレオチド三リン
酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物、チェインター
ミネーター・ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰま
たはｄｄＴＴＰ）の１種、および適切な配列決定プライマーを含む混合物を称す
る。
酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物、チェインター
ミネーター・ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰま
たはｄｄＴＴＰ）の１種、および適切な配列決定プライマーを含む混合物を称す
る。
【００２４】 ＨＩＶ−１のＡおよびＴ配列決定を行うためのサブキットは、ＡおよびＴヌク
レオチドのみの最初の決定を行うために別々に供給されてもよい。この型の好ま
しいキットは、階層アッセイを実行するために別々にあるいはキットの１部とし
て提供されるか、いずれにせよ、各プライマーは、異なった、そして分光学的に
区別し得る蛍光色素、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５、で標識されたプライ
マー対を有し、そして結合混合物の可能性のある２つの型の１つだけ、例えばＴ
結合混合粒のみ、を含んでいる。
レオチドのみの最初の決定を行うために別々に供給されてもよい。この型の好ま
しいキットは、階層アッセイを実行するために別々にあるいはキットの１部とし
て提供されるか、いずれにせよ、各プライマーは、異なった、そして分光学的に
区別し得る蛍光色素、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５、で標識されたプライ
マー対を有し、そして結合混合物の可能性のある２つの型の１つだけ、例えばＴ
結合混合粒のみ、を含んでいる。
【００２５】 以下の実施例は、本発明の、例示的な観点を含むものであり、いずれにおいて
も本発明を限定するものではない。
も本発明を限定するものではない。
【００２６】 実施例１ 変異あるいはＨＩＶのサブタイプは、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された試料の
シングル・トラック・シーケンシングによって決定することができる。
シングル・トラック・シーケンシングによって決定することができる。
【００２７】 反応混合物は、以下のようにして調製された。 ３μｌ結合ビーズ ３μｌ配列決定プライマー（全３０ｎｇ） ２μｌ、１３Ｘ配列決定バッファー（２６０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．
５、３９ｍＭ、ＭｇＣｌ2） ２μｌ、サーモ・シーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ・Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）（保存から１
：１０に稀釈し、３．２Ｕ／μｌに調製） ３μｌ蒸留水 最終容量：１３μｌ
５、３９ｍＭ、ＭｇＣｌ2） ２μｌ、サーモ・シーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ・Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）（保存から１
：１０に稀釈し、３．２Ｕ／μｌに調製） ３μｌ蒸留水 最終容量：１３μｌ
【００２８】 使用した配列決定プライマーは、配列鋳型増幅反応の非ビオチン化プライマー
であるが、しかしこの場合、検出し得る標識で標識された。ＭｉｃｒｏＧｅｎｅ
Ｂｌａｓｔｅｒで検出し得る好ましい標識は、プライマーの５′ヌクレオチド
に結合するＣｙ５．５である。
であるが、しかしこの場合、検出し得る標識で標識された。ＭｉｃｒｏＧｅｎｅ
Ｂｌａｓｔｅｒで検出し得る好ましい標識は、プライマーの５′ヌクレオチド
に結合するＣｙ５．５である。
【化２３】
【００２９】 反応混合物を氷上に保持する。１重鎖終結反応混合物は、本件の場合はＴヌク
レオチドである、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々７５０μ
Ｍ；および２．５μＭｄｄＴＴＰを合わせて調製された。終結混合物３μｌをチ
ューブに入れる。配列反応混合物３μｌを入れる。オイルを上層し、シングル・
トラック反応混合物を９５℃、２分間、ＰＴＣ−１００ プログラム温度制御装
置（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）またはＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ９６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で加熱し、そして以下のように２５サイ
クル（あるいは、もし充分ならそれ以下）で熱処理する： アニーリング：５０℃、１０秒、 伸長：７０℃、３０秒、 変性：９５℃、３０秒。
レオチドである、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々７５０μ
Ｍ；および２．５μＭｄｄＴＴＰを合わせて調製された。終結混合物３μｌをチ
ューブに入れる。配列反応混合物３μｌを入れる。オイルを上層し、シングル・
トラック反応混合物を９５℃、２分間、ＰＴＣ−１００ プログラム温度制御装
置（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）またはＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ９６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で加熱し、そして以下のように２５サイ
クル（あるいは、もし充分ならそれ以下）で熱処理する： アニーリング：５０℃、１０秒、 伸長：７０℃、３０秒、 変性：９５℃、３０秒。
【００３０】 ７０℃、５分の最終伸長の後、試料を９５℃、３０秒、変性し、そして氷上に
放置する。試料を、１００％ホルムアミドおよび５ｍｇ／ｍｌ色素、例えばデキ
ストランブルー、を含有するＳＴＯＰ／Ｌｏａｄｉｎｇバッファー、６μｌと混
じる。
放置する。試料を、１００％ホルムアミドおよび５ｍｇ／ｍｌ色素、例えばデキ
ストランブルー、を含有するＳＴＯＰ／Ｌｏａｄｉｎｇバッファー、６μｌと混
じる。
【００３１】 混合物１．５μｌをＭＩＣＲＯＧＥＮＥ ＢＬＡＳＴＥＲ（Ｖｉｓｉｂｌｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）の１レーン上におき、反応産物
を変性ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動により分離する。反応産物を、
ＧＥＮＥＯＢＪＥＣＴＳソフトウエア（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉ
ｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）で検出し、表示する。反応産物のフィンガープリント
あるいはバーコードを、病原核酸配列の公知の変異体と比較する。正確な一致を
捜す。もし、１つだけ一致するのが見つかると、サブタイプまたは変異体が陽性
と同定される。もし患者の試料が交ざった変異体であると、結果は不均一混合物
を示す。不均一混合物のメンバーおよび相対量が決定される。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）の１レーン上におき、反応産物
を変性ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動により分離する。反応産物を、
ＧＥＮＥＯＢＪＥＣＴＳソフトウエア（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉ
ｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）で検出し、表示する。反応産物のフィンガープリント
あるいはバーコードを、病原核酸配列の公知の変異体と比較する。正確な一致を
捜す。もし、１つだけ一致するのが見つかると、サブタイプまたは変異体が陽性
と同定される。もし患者の試料が交ざった変異体であると、結果は不均一混合物
を示す。不均一混合物のメンバーおよび相対量が決定される。
【００３２】 実施例２ 病原の変異体あるいはサブタイプは、ＣＬＩＰTM配列決定方法を使用して決定
することができる。この方法では、ＨＩＶ−１のプロテアーゼのセンス鎖および
アンチセンス鎖の両方の配列が、以下のように１ステップ反応において得られる
。
することができる。この方法では、ＨＩＶ−１のプロテアーゼのセンス鎖および
アンチセンス鎖の両方の配列が、以下のように１ステップ反応において得られる
。
【００３３】 以下の試料を合わせよく混合する： 濃度 容量 配列決定断片ＤＮＡ ３μｌ ＰＲ２１１*Ｃｙ５．５プライマー １０μＭ ０．５μｌ ＰＲ５２６*Ｃｙ５．０プライマー １０μＭ ０．５μｌ 稀釈Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ ３．２Ｕ／μｌ ２μｌ １３Ｘ反応バッファー ２μｌ ２倍稀釈Ｈ２０ ５μｌ 総容量 １３．０μｌ １３Ｘ反応バッファーはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２６０ｍＭ、ｐＨ８．３、ＭｇＣｌ 2 、３９ｍＭよりなる。
【化２４】
【００３４】 混合物３μｌを４チューブのそれぞれに入れる。チューブを９４℃、５分間加
熱し、温度を８５℃に下げる。各ｄＮＴＰ、０．７５ｍＭおよびチェインターミ
ネーティングヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）２．５μＭを含有する８５℃
のｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ溶液、３μｌを加えて、混合する（４チューブのそれぞ
れに異なったｄｄＮＴＰを使用する）。
熱し、温度を８５℃に下げる。各ｄＮＴＰ、０．７５ｍＭおよびチェインターミ
ネーティングヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）２．５μＭを含有する８５℃
のｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ溶液、３μｌを加えて、混合する（４チューブのそれぞ
れに異なったｄｄＮＴＰを使用する）。
【００３５】 混合物を以下の熱サイクル反応６０サイクルで処理する：９４℃、１０秒、６
２℃、１５秒、７０℃、１分間。完了後、混合物を最終的に、５分、７０℃で処
理し、負荷するまで４℃で貯蔵する。反応産物が可視化されるように、停止／負
荷溶液（９５％ホルムアルデヒドを加えた色素材料）の等量を加える。１．５μ
ｌをとり、２つの色素のＭｉｃｒｏＧｅｎｅ Ｂｌａｓｔｅｒ自動ＤＮＡシーケ
ンサー（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）の単
一レーンにかける。
２℃、１５秒、７０℃、１分間。完了後、混合物を最終的に、５分、７０℃で処
理し、負荷するまで４℃で貯蔵する。反応産物が可視化されるように、停止／負
荷溶液（９５％ホルムアルデヒドを加えた色素材料）の等量を加える。１．５μ
ｌをとり、２つの色素のＭｉｃｒｏＧｅｎｅ Ｂｌａｓｔｅｒ自動ＤＮＡシーケ
ンサー（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）の単
一レーンにかける。
【００３６】 両標識プライマーの反応産物を、２つの分離された痕跡としてＭＩＣＲＯＧＥ
ＮＥ ＢＬＡＳＴＥＲで検出し、ＧＥＮＥＯＢＪＥＣＴＳソフトウエアで表示す
る。
ＮＥ ＢＬＡＳＴＥＲで検出し、ＧＥＮＥＯＢＪＥＣＴＳソフトウエアで表示す
る。
【００３７】 各プライマーから得られた塩基で示した結果を、ＧＥＮＥＬＩＢＲＡＲＩＡＮ
［ＧＥＮＥＯＢＪＥＣＴＳ（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔ
ｏｒｏｎｔｏ）の１部分］によってＨＩＶ−１および−２の既知のプロテアーゼ
遺伝子配列と比較した。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のサブタイプを決定し、薬
剤耐性コドンの存在を決定する。ＨＩＶサブタイプの配列が１度決まると、定量
データと共に、患者ファイルに報告される。
［ＧＥＮＥＯＢＪＥＣＴＳ（Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｔ
ｏｒｏｎｔｏ）の１部分］によってＨＩＶ−１および−２の既知のプロテアーゼ
遺伝子配列と比較した。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のサブタイプを決定し、薬
剤耐性コドンの存在を決定する。ＨＩＶサブタイプの配列が１度決まると、定量
データと共に、患者ファイルに報告される。
【００３８】 実施例３ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、ＴｉｔａｎTMＯｎｅＴｕｂｅＲ
Ｔ−ＰＣＲシステムを用いて、ＨＩＶ−１ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行う。このＲ
Ｔ−ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社のＡｍｐｌｉｃｏｎTMＨＩ
Ｖモニターテストを用いて、得られたＲＮＡ調製物について行う。Ｏｒｇａｎｏ
ｎ Ｔｅｋｎｉｃａ社のＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅTM（以前はＮＡＳＢＡとして知ら
れていた）ＨＩＶ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄに対するＲＮＡ抽出物についても行う
ことができる。
Ｔ−ＰＣＲシステムを用いて、ＨＩＶ−１ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行う。このＲ
Ｔ−ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社のＡｍｐｌｉｃｏｎTMＨＩ
Ｖモニターテストを用いて、得られたＲＮＡ調製物について行う。Ｏｒｇａｎｏ
ｎ Ｔｅｋｎｉｃａ社のＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅTM（以前はＮＡＳＢＡとして知ら
れていた）ＨＩＶ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄに対するＲＮＡ抽出物についても行う
ことができる。
【００３９】 全ての試薬、チューブ、チップ、その他の材料は、ＲＮアーゼフリーであるこ
とが必要である。処理は、１０％の余分を含めて、８反応（８チューブの１片）
について行う。アンプリコンＨＩＶモニターテストからＲＮＡ試料を溶かし出し
、氷上に保持する。このものは、「検体の調製」、セクションＢのステップ１４
で得られた材料である。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅ Ａｓｓａｙ用に調製されたＲＮ
Ａを使用するなら、同様に操作を進める：溶かし、氷上に保持する。
とが必要である。処理は、１０％の余分を含めて、８反応（８チューブの１片）
について行う。アンプリコンＨＩＶモニターテストからＲＮＡ試料を溶かし出し
、氷上に保持する。このものは、「検体の調製」、セクションＢのステップ１４
で得られた材料である。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅ Ａｓｓａｙ用に調製されたＲＮ
Ａを使用するなら、同様に操作を進める：溶かし、氷上に保持する。
【００４０】 ０．２ｍｌ容、滅菌、ＲＮアーゼフリーの遠心チューブをとり、以下の成分を
記載順に加えて、ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物Ｉを（１０％余分を含めて、８チ
ューブ分に充分なだけ）調製する： ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物Ｉ ３５μｌ、１００ｍＭ、ＤＴＴ １３μｌ、ＲＮアーゼフリーｄＮＴＰ＠１０ｍＭ各ｄＮＴＰ １３μｌ、１０μＭフォワードＰＣＲプライマー １３μｌ、１０μＭリバースＰＣＲプライマー
記載順に加えて、ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物Ｉを（１０％余分を含めて、８チ
ューブ分に充分なだけ）調製する： ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物Ｉ ３５μｌ、１００ｍＭ、ＤＴＴ １３μｌ、ＲＮアーゼフリーｄＮＴＰ＠１０ｍＭ各ｄＮＴＰ １３μｌ、１０μＭフォワードＰＣＲプライマー １３μｌ、１０μＭリバースＰＣＲプライマー
【００４１】 ０．２ｍｌ容、滅菌、ＲＮアーゼフリーの遠心チューブをとり、ＲＴ−ＰＣＲ
マスター混合物ＩＩ（２０％余分を含め８チューブ分に充分なだけ）を、以下の
成分を記載順に加えて、調製する。 ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物ＩＩ ６０μｌ、Ｔｉｔａｎ５Ｘバッファー ５μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤＠４０Ｕ／μｌ １０μｌ、Ｔｉｔａｎ酵素 １８μｌ、ＲＮアーゼフリー、２５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ７μｌ、ＲＮアーゼフリー水。
マスター混合物ＩＩ（２０％余分を含め８チューブ分に充分なだけ）を、以下の
成分を記載順に加えて、調製する。 ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物ＩＩ ６０μｌ、Ｔｉｔａｎ５Ｘバッファー ５μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤＠４０Ｕ／μｌ １０μｌ、Ｔｉｔａｎ酵素 １８μｌ、ＲＮアーゼフリー、２５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ７μｌ、ＲＮアーゼフリー水。
【００４２】 ８つの薄壁のチューブの１つをとる。各チューブにマスター混合物Ｉ、８．５
μｌを加える。 各チューブに試料（ＲＮＡ）１１．５μｌを加える。実験に際し、陰性対照を加
えたければ加えてもよい。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅ Ａｓｓａｙ用に抽出したＲＮ
Ａを使用するなら、ＲＮアーゼフリー水で１：５に試料を稀釈し、この稀釈物１
１．５μｌを使用する。
μｌを加える。 各チューブに試料（ＲＮＡ）１１．５μｌを加える。実験に際し、陰性対照を加
えたければ加えてもよい。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅ Ａｓｓａｙ用に抽出したＲＮ
Ａを使用するなら、ＲＮアーゼフリー水で１：５に試料を稀釈し、この稀釈物１
１．５μｌを使用する。
【００４３】 ＲＮＡ試料を９０℃、３分、以下のプログラムを用い加熱する：５０℃に冷却
、各チューブにマスター混合物ＩＩ、１０μｌを加える（以下のプログラムのス
テップ２）。試料間の交差汚染が起こらないように注意する。
、各チューブにマスター混合物ＩＩ、１０μｌを加える（以下のプログラムのス
テップ２）。試料間の交差汚染が起こらないように注意する。
【００４４】 ＲＴ−ＰＣＲを開始する。加熱したフタを使用する。ＭＪプレートを使用する
時は、チューブはＰＴＣ−２００を使う場合に使用されることが提示される。以
下はＰＴＣ２００用のプログラミングである。 計算値 １＝９０．０°で３：００ ２＝５０．０°で５：００ ３＝４２．０°で１：００：００ ４＝９４．０°で３：００ ５＝１．０°／秒で９４．０°まで ６＝９４．０°で０：２０ ７＝１．０°／秒で５７．０°まで ８＝５７．０°で０：３０ ９＝１．０°／秒で６８．０°まで １０＝６８．０°で２：３０ １１＝５に戻り１９回繰り返す １２＝１．０°／秒で９４．０°まで １３＝９４．０°で０：２０ １４＝１．０°／秒で５７．０°まで １５＝５７．０°で０：３０ １６＝１．０°／秒で６８．０°まで １７＝６８．０°で３：００ １８＝１２へ戻り２４回繰り返す １９＝６８．０°で７：００ ２０＝４．０°で継続 ２１＝終了
時は、チューブはＰＴＣ−２００を使う場合に使用されることが提示される。以
下はＰＴＣ２００用のプログラミングである。 計算値 １＝９０．０°で３：００ ２＝５０．０°で５：００ ３＝４２．０°で１：００：００ ４＝９４．０°で３：００ ５＝１．０°／秒で９４．０°まで ６＝９４．０°で０：２０ ７＝１．０°／秒で５７．０°まで ８＝５７．０°で０：３０ ９＝１．０°／秒で６８．０°まで １０＝６８．０°で２：３０ １１＝５に戻り１９回繰り返す １２＝１．０°／秒で９４．０°まで １３＝９４．０°で０：２０ １４＝１．０°／秒で５７．０°まで １５＝５７．０°で０：３０ １６＝１．０°／秒で６８．０°まで １７＝６８．０°で３：００ １８＝１２へ戻り２４回繰り返す １９＝６８．０°で７：００ ２０＝４．０°で継続 ２１＝終了
【００４５】 −２０℃で貯蔵、または４℃で保存し直ちに使用する。
【００４６】 実施例４ アンプリコンの配列を決定するために、各ターミネーター混合物７μｌ（単一
色素機器を使用した場合は３２混合物、２色素機器を使用した場合は４）を、以
下のマスター混合物５μｌと合わせる。
色素機器を使用した場合は３２混合物、２色素機器を使用した場合は４）を、以
下のマスター混合物５μｌと合わせる。
【００４７】 マスター混合物（単一色素システム） ３７μｌ、バッファー（２６０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３２．５
ｍＭ、ＭｇＣｌ2） １４５μｌ、滅菌水 ８μｌ、非稀釈ＴＡＱＦＳ、１２Ｕ／μｌ １０μｌ、実施例３からのＰＣＲ産物。
ｍＭ、ＭｇＣｌ2） １４５μｌ、滅菌水 ８μｌ、非稀釈ＴＡＱＦＳ、１２Ｕ／μｌ １０μｌ、実施例３からのＰＣＲ産物。
【００４８】 マスター混合物（２色素システム） １８．５μｌ、バッファー ７２．５μｌ、滅菌水 ４μｌ、非稀釈ＴＡＱＦＳ、１２Ｕ／μｌ ５μｌ、実施例３からのＰＣＲ産物。
【００４９】 ２つの混合物をピペットチップで、ゆるやかに混合する。各チューブにオイル
８μｌを加える（所望による）、熱サイクル反応を開始する。以下はＰＴＣ−２
００用のプログラミングである： 計算値 １＝９４．０°で５：００ ２＝１．０°／秒で９４．０°まで ３＝９４．０°で０：２０ ４＝１．０°／秒で５６．０°まで ５＝５６．０°で０：２０ ６＝１．０°／秒で７０．０°まで ７＝７０．０°で１：３０ ８＝２に戻り４７回繰り返す ９＝７０．０°で５：００ １０＝４．０°で継続 １１＝終了
８μｌを加える（所望による）、熱サイクル反応を開始する。以下はＰＴＣ−２
００用のプログラミングである： 計算値 １＝９４．０°で５：００ ２＝１．０°／秒で９４．０°まで ３＝９４．０°で０：２０ ４＝１．０°／秒で５６．０°まで ５＝５６．０°で０：２０ ６＝１．０°／秒で７０．０°まで ７＝７０．０°で１：３０ ８＝２に戻り４７回繰り返す ９＝７０．０°で５：００ １０＝４．０°で継続 １１＝終了
【００５０】 以下のマスター混合物が、本実施例で使用される。 プロテアーゼ−単一色素システムのための終結混合物 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各対の１つのプライマーは、標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各対の１つのプライマーは、標識される。
【００５１】 逆転写酵素−（単一色素システム）の第１領域のための終結混合物 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各対の１つのプライマーは、標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各対の１つのプライマーは、標識される。
【００５２】 逆転写酵素−（単一色素システム）の第２領域のための終結混合物 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各対の１つのプライマーは、標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各対の１つのプライマーは、標識される。
【００５３】 逆転写酵素−（単一色素システム）の第３領域のための終結混合物 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各反応の１つの色素は、標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 各反応の１つの色素は、標識される。
【００５４】 二色素システムのための終結混合物 プロテアーゼ Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
【００５５】 第１逆転写酵素領域 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
【００５６】 第２逆転写酵素領域 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
【００５７】 第３逆転写酵素領域 Ａ−混合物：１．０７μＭｄｄＡＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｃ−混合物：２．１４μＭｄｄＣＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｇ−混合物：２．１４μＭｄｄＧＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー Ｔ−混合物：２．１４μＭｄｄＴＴＰ；６４３μＭｄＡＴＰ；６４３μＭｄＣＴ
Ｐ；６４３μＭｄＧＴＰ；６４３μＭｄＴＴＰ；各３３０ｎＭのフォワードおよ
びリバースプライマー 両プライマーは、例えばＣｙ５．０およびＣｙ５．５でそれぞれ標識される。
【００５８】
【配列表】
【図１】 ＦＩＧ．１は本発明の図式的な提示である。
【図２Ａ】 ＦＩＧ．２ＡはＨＩＶ−１のプロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子の既知の突
然変異において変化した塩基を示す。
然変異において変化した塩基を示す。
【図２Ｂ】 ＦＩＧ．２ＢはＨＩＶ−１のプロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子の既知の突
然変異において変化した塩基を示す。
然変異において変化した塩基を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 CA20 DA20 HA19 4B063 QA01 QA13 QQ10 QQ42 QQ52 QR32 QR62 QR66 QS03 QS16 QS25 QS36 QX02
Claims (10)
- 【請求項１】 ＨＩＶ−１を含有する試料に存在するＨＩＶ−１の遺伝子型
を決定する方法であって、 （ａ）プロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子内のＡおよびＴヌクレオチドのみの
位置を決定し、これらの位置を、公知の遺伝子型中のＡおよびＴヌクレオチドの
位置と比較し； （ｂ）もし、ステップ（ａ）が明確な同定を与えない場合、全ての４塩基の位置
を決定する、更なる配列決定反応を実施する、 ステップを含む方法。 - 【請求項２】 ＡおよびＴヌクレオチドのみの位置が、各プライマーが、異
なった、そして区別し検出し得る標識で標識されている、２つのプライマーを用
いて、フォワードおよびリバース配列決定断片の両者を生じるサイクル反応を実
施することにより決定される、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 標識が、蛍光標識である請求項２記載の方法。
- 【請求項４】 ＨＩＶ−１遺伝子におけるＡおよびＴ配列決定を行うための
キットであって、複数のＡまたはＴ終結混合物、またはＡおよびＴ終結混合物の
両者を含み、Ｇ終結混合物またはＣ終結混合物はなく、該ＡおよびＴ終結混合物
の各々は複数のプライマー対の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった
領域に隣接しており、対は、共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子の実質
的に全てに隣接しており、そして各対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識
されている上記キット。 - 【請求項５】 階層アッセイを用いる、試料中のＨＩＶ−１遺伝子の遺伝子
型を解析するためのキットであって、別々にセットになった組み合わせにおいて
： （ａ）複数のＡまたはＴ終結混合物、またはＡおよびＴ終結混合物の両者を含み
、Ｇ終結混合物またはＣ終結混合物はなく、該ＡおよびＴ終結混合物の各々は複
数のプライマー対の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった領域に隣接
しており、対は、共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子の実質的に全てに
隣接しており、そして各対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識されている
、ＨＩＶ−１におけるＡおよびＴ配列決定を行うための第１のサブキット；およ
び （ｂ）複数のＡ、Ｃ、ＧおよびＴ終結混合物を含み、該終結混合物の各々は複数
のプライマー対の１つを含み、各対はＨＩＶ−１ゲノムの異なった領域に隣接し
ており、対は、共に、プロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子の実質的に全てに隣
接しており、そして各対の少なくとも１つが検出し得る標識で標識されている、
ＨＩＶ−１における４つの塩基配列決定を行うための第２のサブキット、 を含む上記キット。 - 【請求項６】 プライマーが、配列 【化１】 のフォワードプライマー および 【化２】 の中から選択されたリバースプライマーを含む、プロテアーゼ遺伝子の配列決定
のためのプライマー対を包含している、請求項４または５記載のキット。 - 【請求項７】 プライマーが、 【化３】 の中から選択されたフォワードプライマー および、配列 【化４】 を有するリバースプライマーを含む、逆転写酵素遺伝子の１部の配列決定のため
の、プライマー対を包含している、請求項４ないし６のいずれか一項に記載のキ
ット。 - 【請求項８】 プライマーが、配列 【化５】 を有するフォワードプライマー および、 【化６】 の中から選択されたリバースプライマーを含む、逆転写酵素遺伝子の１部の配列
決定のためのプライマー対を包含している、請求項４ないし７のいずれか一項に
記載のキット。 - 【請求項９】 プライマーが、配列 【化７】 を有するフォワードプライマー および、配列 【化８】 を有するリバースプライマー を含む、逆転写酵素遺伝子の１部の配列決定のためのプライマー対を包含してい
る、請求項４ないし８のいずれか一項に記載のキット。 - 【請求項１０】 各プライマー対におけるプライマーが、異なった、分光学
的に区別し得る蛍光標識で標識されている請求項４−９のいずれか一項に記載の
キット。
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|---|---|---|---|
| US08/938,641 US6007983A (en) | 1995-12-22 | 1997-09-26 | Method and kit for evaluation of HIV mutations |
| US08/938,641 | 1997-09-26 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
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|---|---|---|---|
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