CN116042928A - 用于扩增和检测消化道病毒核酸序列的引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于扩增和检测消化道病毒核酸序列的引物组，本发明提供了一种用于扩增消化道病毒的引物组，以及一种消化道病毒核酸序列的扩增和检测方法。本发明设计的引物组具有良好的兼容性并且对消化道病毒具有较高的特异性和灵敏度，能够对消化道病毒进行快速、大规模筛查，为病原体鉴定、临床疾病诊断、环境监测、进出口食品检疫、流行病学调查和卫生监督等提供高效的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及用于扩增和检测消化道病毒核酸序列的引物组。
背景技术
消化道感染是一种常见疾病，发病率呈逐年增高趋势，仅次于呼吸系统感染，多因细菌、病毒、真菌或寄生虫等病原体感染导致。消化道感染引起的病症是感染性腹泻，如轮状病毒常引起婴幼儿腹泻；诺如病毒是世界范围内最常见引起病毒性胃肠炎的病毒，伴有腹痛、腹泻、呕吐等临床症状。这些消化道病毒大都具有感染力强、发病急、潜伏期短等特点，严重危害人类健康。
及时准确地判断出消化道感染病毒的种类，对于传染源的早期发现、流行病的控制及临床治疗的有效开展均具有重要意义。
近年来，分子生物学技术如实时荧光PCR技术等的引入，很大程度上改善了检测和鉴定病原体的现状。普通荧光PCR检测具有较好的灵敏度和特异性，提高了临床鉴定水平，但实际应用过程中该技术多是针对单项或几项病原体，想要同步检测多种病原体就需要多种检测试剂盒搭配，操作不便且成本较高。针对消化道感染病原体的特点，建立起高效、快速、简便、特异的检测方法，以适应疫情筛查和临床检测的需求，是当前消化道感染性疾病防治工作的重点。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种用于扩增消化道病毒的引物组及消化道病毒的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种引物组，所述引物组包括长度为15到40个核苷酸的用于扩增不同消化道病毒的核酸序列。
进一步，所述引物组包括与SEQ ID NO.1-2所示的引物对、SEQ ID NO.3-4所示的引物对、SEQ ID NO.5-6所示的引物对、SEQ ID NO.7-8所示的引物对、SEQ ID NO.9-10所示的引物对、SEQ ID NO.11-12所示的引物对、SEQ IDNO.13-14所示的引物对、SEQ ID NO.15-16所示的引物对、SEQ ID NO.17-18所示的引物对、SEQ ID NO.19-20所示的引物对、SEQ IDNO.21-22所示的引物对和/或SEQ ID NO.23-24所示的引物对的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
进一步，所述引物组包括SEQ ID NO.1-2所示的引物对、SEQ ID NO.3-4所示的引物对、SEQ ID NO.5-6所示的引物对、SEQ ID NO.7-8所示的引物对、SEQ ID NO.9-10所示的引物对、SEQ ID NO.11-12所示的引物对、SEQ ID NO.13-14所示的引物对、SEQ ID NO.15-16所示的引物对、SEQ ID NO.17-18所示的引物对、SEQ ID NO.19-20所示的引物对、SEQ IDNO.21-22所示的引物对和/或SEQ ID NO.23-24所示的引物对的核酸序列。
进一步，所述引物对包括正向引物和反向引物。
进一步，正向引物和反向引物中的至少一者用标记物质标记。
进一步，所述标记物质包括荧光物质、放射性同位素或酶。
进一步，所述荧光物质包括TAMRATTM、Alexa555、Alexa647、花青染料系列的Cy3、Cy5、荧光素。
进一步，所述放射性同位素包括32P、33P、35S。
进一步，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
进一步，所述引物组包括至少一个修饰核苷酸。
进一步，所述修饰核苷酸包括2'-修饰核苷酸或5-甲基胞嘧啶。
进一步，所述2'-修饰核苷酸包括2'-O-甲基修饰核苷酸或2'-氟修饰核苷酸。
进一步，所述5-甲基胞嘧啶包括5-甲基-脱氧胞嘧啶。
进一步，所述5-甲基-脱氧胞嘧啶包括5-Me-dC、5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。
进一步，所述引物组中如果存在除了3'末端胞嘧啶以外的胞嘧啶，则每个胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。
进一步，所述引物组包括简并位置。
进一步，所述简并位置包括R、W、M、Y、K、B、D、H、N、S或V，其中，R包括A或G，W包括A或T，M包括A或C，Y包括C或T，K包括G或T，B包括A、G或T，D包括A、G或T，H包括A、C或T，N包括A、G、C或T，S包括G或C，V包括A、C或G。
本发明的第二方面提供了一种扩增消化道病毒核酸序列的引物组，所述引物组包括：
(1)与本发明第一方面所述的引物组互补的核酸序列；
(2)在严格条件下与(1)所述的核酸序列杂交的核酸序列。
本发明的第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面、第二方面所述的引物组。
进一步，所述引物组被提供在单个容器或单独的容器中。
进一步，所述试剂盒还包括至少一种反应混合物，其中所述至少一种反应混合物包括以下一种或多种：用于PCR的酶、dNTPs、缓冲溶液、Mg2+；
进一步，所述用于PCR的酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
进一步，所述DNA聚合酶包括Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段。
进一步，所述缓冲液包括聚合酶缓冲液、Tris盐酸缓冲液。
进一步，Mg2+的来源包括MgCl2、MgSO4。
进一步，所述试剂盒还包括荧光色素。
进一步，所述试剂盒还包括说明书。
本发明的第四方面提供了一种消化道病毒核酸序列的扩增方法，所述方法包括使用本发明第一方面、第二方面所述的引物组或本发明第三方面所述的试剂盒进行扩增反应。
进一步，所述扩增反应通过包括LCR、NASBA、SDA、TMA、bDNA、PCR方法进行。
进一步，所述扩增反应通过PCR方法进行。
进一步，所述PCR包括实时PCR、多重PCR。
进一步，所述PCR选自多重PCR。
进一步，所述扩增反应在相似的扩增条件下进行。
本发明的第五方面提供了一种检测样品中消化道病毒的方法，所述方法包括使用本发明第一方面、第二方面所述的引物组、本发明第三方面所述的试剂盒或根据本发明第四方面所述的方法进行扩增，获得扩增产物，使用扩增产物进行测序。
进一步，所述引物组浓度为0.05-0.8μmol/L。
进一步，所述引物组浓度为0.05-0.4μmol/L。
进一步，所述引物组浓度为0.1-0.2μmol/L。
进一步，所述引物组浓度为0.1μmol/L。
进一步，所述方法还包括添加混合模板进行扩增。
进一步，所述模板浓度为9×100-9×103copies/mL。
进一步，所述模板浓度为9×102-9×103copies/mL。
进一步，所述测序的技术包括二代测序技术、三代测序技术。
进一步，所述三代测序技术包括HeliScope单分子测序技术、实时单分子测序技术、纳米孔测序技术、Geno Care单分子测序技术。
进一步，所述三代测序技术选自纳米孔测序技术。
进一步，所述样品包括来自土壤、食物、水或纯病毒培养物。
进一步，所述方法为非诊断目的的方法。
本发明的第六方面提供了一种检测消化道病毒的文库，所述文库包括本发明第一方面、第二方面所述的引物组。
进一步，所述文库包括使用Ligation sequencing kit、Native BarcodingExpansion 1-12或nanopore RBK096构建。
进一步，所述文库使用nanopore RBK096构建。
本发明的第七方面提供了本发明第一方面、第二方面所述的引物组在制备扩增或检测消化道病毒核酸序列的试剂盒中的应用。
本发明的第八方面提供了本发明第一方面、第二方面所述的引物组或本发明第三方面所述的试剂盒在制备检测消化道病毒的产品中的应用。
进一步，所述消化道病毒包括人腺病毒40型、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、札如病毒I型、札如病毒II型、札如病毒IV型、星状病毒、双埃柯病毒、肠道病毒、轮状病毒A型、轮状病毒B型和/或轮状病毒C型。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的引物组具有较高的特异性和良好的兼容性，具有较高的检测灵敏度，具有快速、高效、高通量的优势，实现了对12种常见的消化道病毒中的一种或多种进行同时检测，可以对消化道病毒进行快速、大规模筛查，为病原体鉴定、环境监测、进出口食品检疫、流行病学调查和卫生监督等提供高效的检测方法。
附图说明
图1是12种消化道病毒单引物单模板PCR扩增结果图；
图2是12种消化道病毒混合引物单模板PCR扩增结果图；
图3是不同浓度混合引物池的消化道病原体鉴定图；
图4是12种消化道病原体检测结果图，其中，4A是Human adenovirus 40检测结果图，4B是Norovirus GI检测结果图，4C是Norovirus GII检测结果图，4D是Sapovirus I检测结果图，4E是Astrovirus检测结果图，4F是Parechovirus检测结果图，4G是Enterovirus检测结果图，4H是Rotavirus A检测结果图，4I是Rotavirus B检测结果图，4J是Rotavirus C检测结果图，4K是Sapovirus II检测结果图，4L是Sapovirus IV检测结果图；
图5是轮状病毒假病毒检测结果图，其中，5A是Rotavirus A检测结果图，5B是Rotavirus B检测结果图，5C是Rotavirus C检测结果图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了一种引物组，所述引物组包括长度为15到40个核苷酸的用于扩增不同消化道病毒的核酸序列。
所述引物组包括与SEQ ID NO.1-2所示的引物对、SEQ ID NO.3-4所示的引物对、SEQ ID NO.5-6所示的引物对、SEQ ID NO.7-8所示的引物对、SEQ IDNO.9-10所示的引物对、SEQ ID NO.11-12所示的引物对、SEQ ID NO.13-14所示的引物对、SEQ ID NO.15-16所示的引物对、SEQ ID NO.17-18所示的引物对、SEQ ID NO.19-20所示的引物对、SEQ IDNO.21-22所示的引物对和/或SEQ IDNO.23-24所示的引物对的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
在本发明中，核酸序列或核酸分子是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括但不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成的(例如化学合成的)DNA或RNA。核酸可以是双链(ds)或单链(ss)的。当核酸是单链时，可以是正义链或反义链。核酸可以包括天然核苷酸(例如A、T/U、C和G)，可以包含天然核苷酸的类似物，例如标记的核苷酸。
在本发明中，扩增是指通常从少量多核苷酸(例如，单个多核苷酸分子)开始的多拷贝的多核苷酸或多核苷酸的一部分的产生，获得的扩增产物也称为扩增子，扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促过程。
在本发明中，同一性/相似性是指两个或多个核酸序列，或两个或多个氨基酸序列之间的同一性/相似性，根据序列之间的同一性或相似性来表示。序列同一性可以根据百分同一性来度量；百分率越高，序列越一致。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物，具有相对高水平的序列同一性/相似性。本发明公开的引物不限于显示的精确序列，正如本领域技术人员将会认识到的，如果需要，可以对序列进行改变，而不显著影响引物发挥作用的能力。例如，在本发明中提供了与SEQ ID NO：1-24中的任一个具有至少90％的同一性，优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，例如100％序列同一性的序列。本领域技术人员将会认识到，这些提供的序列同一性范围仅仅是指导的目的；不在这些范围内的引物可能也可以使用。
用于比对序列进行比较的方法在本技术领域是众所周知的。比对后，通过对两个序列中存在一致的核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行计数，确定匹配数。通过用匹配数除以在鉴定的序列中提出的序列长度，或除以明确指定的长度(例如来自在鉴定的序列中提出的序列的100个连续的核苷酸或氨基酸残基)，然后将得到的值乘以100，来确定百分序列同一性。例如，当核酸序列与具有1554个核苷酸的测试序列比对时，具有1166个匹配，则与测试序列的百分同一性是75.0(1166÷1554*100＝75.0)。百分序列同一性值被约到最接近的小数点后1位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14被约到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19被约到75.2。长度值总是整数。在另一个例子中，含有20个核苷酸区域的靶序列与如下所示的来自被鉴定序列的20个连续的核苷酸进行比对，含有与该被鉴定序列具有75百分序列同一性的区域(即15÷20*100＝75)。
在本发明中，引物是指短的核酸分子，本发明公开的引物长度在15到40个核苷酸之间，优选的长度为20-30个核苷酸，更优选的为20-25个核苷酸。例如长度可以为20、21、22、23、24或25个核苷酸，可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的，因此例如引物将在非常高严紧性杂交条件下与靶核酸分子杂交。
靶核酸分子是指打算对其进行检测、定量、定性检测或其组合的核酸分子。核酸分子不是必须处于纯化的形式。各种不同的其它核酸分子也可以与靶核酸分子共存。例如，靶核酸分子可以是意在对其进行扩增的特异性核酸分子(可以包括RNA例如消化道病毒RNA，或DNA例如消化道病毒DNA)。如果需要，靶核酸分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法来进行，例如使用可商购的纯化试剂盒等。在一个实施方案中，靶核酸分子是消化道病毒核酸序列。
在本发明中，引物与引物对可以互换使用，引物组至少包括一组引物或引物对，这样的引物对包含至少一个正向引物和至少一个反向引物，其中引物对于消化道病毒核酸分子的扩增是特异性的。正向或上游引物是相对于核酸序列上的参比点5’方向的引物；反向或下游引物是相对于核酸序列上的参比点3’方向的引物。一般来说，在扩增反应中包含至少一个正向和一个反向引物。
本发明的正向引物和反向引物中的至少一者用标记物质标记。
所述标记物质包括但不限于荧光物质、放射性同位素或酶。
其中，荧光物质包括但不限于TAMRATTM、Alexa555、Alexa647、花青染料系列的Cy3、Cy5、荧光素。
放射性同位素包括但不限于32P、33P、35S。
酶包括但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
用标记物质标记的本发明所涉及的引物中，标记物质可以与引物直接结合，也可以经由连接体结合。作为连接体，只要是在该领域中通常使用的连接体即可，具体而言，例如，优选1～3个碱基的核酸，更优选1～3个碱基的DNA，进一步优选2个碱基的DNA，尤其优选腺嘌呤(A)-腺嘌呤(A)这2个碱基。
作为用荧光物质标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出根据本身公知的方法将用荧光素标记的核苷酸掺入到引物中的方法等。
作为用放射性同位素标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出通过掺入用放射性同位素标记的核苷酸来标记的方法等。具体而言，可举出随机引物法、缺口平移法、基于T4多核苷酸激酶的5’末端标记法、基于末端脱氧核苷酸转移酶的3’末端标记法等。所述引物组包括至少一个修饰核苷酸。
作为用酶标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与要标记的引物直接共价结合的直接标记法等。
所述引物组包括至少一个修饰核苷酸。
在本发明中，修饰核苷酸包括但不限于2'-修饰核苷酸或5-甲基胞嘧啶。其中，2'-修饰核苷酸包括但不限于2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟修饰的寡核苷酸；5-甲基胞嘧啶包括但不限于5-甲基-脱氧胞嘧啶；5-甲基-脱氧胞嘧啶包括但不限于5-Me-dC，5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。在一些实施方案中，所述引物可以包括两个或更多个修饰核苷酸。两个或更多个修饰核苷酸可以具有相同或不同的修饰。在一些实施方案中，所述引物组可以包括一个或多个5-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶包括。所述引物组可以具有0、1、2、3、4、5、6、7、8或更多的2'-O-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸，5-甲基胞嘧啶或其组合。
所述引物组包括简并位置。
在本发明中，简并位置是指可以有多种可供选择的碱基序列上的位置，所述简并位置包括0、1、2、3、4或5个简并位置，简并位置包括但不限于R、W、M、Y、K、B、D、H、N、S或V，其中，R包括A或G，W包括A或T，M包括A或C，Y包括C或T，K包括G或T，B包括A、G或T，D包括A、G或T，H包括A、C或T，N包括A、G、C或T，S包括G或C，V包括A、C或G。对于具有两个或更多个简并位置的寡核苷酸，在任何给定位置的简并与在另一位置的简并无关。
本发明提供了一种扩增消化道病毒的引物组，所述引物组包括：
(1)与上述引物组互补的核酸序列；
(2)在严格条件下与(1)所述的核酸序列杂交的核酸序列。
在本发明中，互补的核酸序列是由双链DNA或RNA链由碱基对的两条互补链构成。当一个核酸分子的碱基与另一个核酸分子的碱基形成氢键时，发生了互补性结合。一般来说，碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互补，而胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)互补。例如，一个ssDNA分子的序列5'-ATCG-3'可以与另一个ssDNA的3'-TAGC-5'成键，形成dsDNA。在该例子中，序列5'-ATCG-3'与3'-TAGC-5'反向互补。核酸分子甚至在每个分子的所有碱基没有完全形成氢键的情况下，也可以彼此互补。例如，与互补核酸序列的杂交可以在不同严紧性的条件下发生，其中互补链将在某些但不是所有的核苷酸位点处结合。
在本发明中，严格条件是指形成特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。例如，可以举出如下条件：相对于由SEQ ID NO.1-24所示的序列组成的DNA具有高同一性性(同一性为90％以上，优选为95％以上)的DNA和由与SEQ IDNO.1-24所示的序列所组成的DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交的条件。通常是指在低于完全杂交的熔解温度(Tm)约5℃～约30℃、优选为约10℃～约25℃的温度下形成杂交的情况。关于严格条件，可以使用J.Sambrook等在Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，特别是11.45节“Conditions forHybridization ofOligonucleotide Probes”中所记载的条件等。
在本发明中，杂交意指两条完全或部分互补的核酸序列在特定的杂交试验条件下以平行或反平行的方向结合在一起，从而形成具有双链区的稳定结构的能力。这种双链结构的两条组成链(有时被称为杂交链)通过氢键结合在一起。尽管这些氢键最常见形成于单个核酸链上含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间，但碱基配对还可以在不是这些“经典”对的成员的碱基之间形成。非规范碱基配对在本领域中是众所周知的。(参见，例如，R.L.P.Adams等人，《核酸的生物化学(TheBiochemistry of the Nucleic Acids)》)(第11版，1992)。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
在本发明中，适合量的一种或多种引物被提供在一个或多个容器中，或固定在基质上，引物可以被提供成悬浮在水溶液中，或例如作为冷冻干燥的或冻干的粉末。其中提供有核酸的容器可以是任何能够容纳所提供的形式的常规容器，例如微量离心管、安瓿瓶或瓶。试剂盒可以包含标记的或未标记的、用于检测消化道病毒核苷酸序列的探针。
在某些应用中，一个或多个引物(如上所述)，可以预先测量好的单次使用量提供在独立的、典型情况下用后即可抛弃的管或相当的容器中。使用这样的设置，用于测试消化道病毒的存在的样品，可以加入到独立的管中，直接进行扩增。
试剂盒中提供的核酸引物的量，可以是任何适合的量，可以依赖于产品所针对的靶市场。例如，如果试剂盒适用于研究或临床应用，提供的每种核酸引物的量，可以是足够引发几个PCR扩增反应的量。确定适合的量的一般性指导，可以在Innis等、Sambrook等和Ausubel等的文献中发现。试剂盒可以包含两个以上的引物，以便于较大量消化道病毒核苷酸序列的PCR扩增。
在某些实施方案中，试剂盒可以含有执行PCR扩增反应所必需的反应试剂，包括DNA样品制备试剂、用于PCR的酶、缓冲液、Mg2+和脱氧核糖核苷酸(dNTPs)。
其中，PCR的酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
所述DNA聚合酶包括但不限于Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段。
缓冲液是为了将提供给PCR分析的试样调整为pH＝7.0～10.0(更优选为pH8.0～9.0)而使用的。
缓冲液包括但不限于聚合酶缓冲液、Tris盐酸缓冲液。
dNTP是为了进行基于PCR的DNA扩增的核苷源，dATP、dGTP、dCTP、dTTP这4种是必要的。另外，关于dNTP，可使用为了用于热启动法而进行了化学修饰的物质，例如可使用TriLink BioTechnologies，Inc.制CleanAmpTM dNTP。
在基于PCR的DNA扩增中，Mg2+是必要的。作为Mg2+源，包括但不限于MgCl2、MgSO4等。优选的是MgCl2。
所述试剂盒还包括荧光色素。
在本发明中，可使用多种已知的荧光色素。例如，可举出使用具有标识功能的嵌入剂(intercalator)的方法、使用在相对扩增的DNA序列特异性地杂交的核苷酸上结合荧光物质的探针的方法等。作为嵌入剂，可举出作为不饱和型荧光色素的溴化乙锭、SYBRGreenI、作为饱和型荧光色素的Resolight(Roche公司制)、EvaGreen(Biotim公司制)。优选的嵌入剂为作为不饱和型荧光色素的SYBR Green I、作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight，更优选为作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight。对于使用量而言，按照使用的荧光色素的制造销售厂商的推荐。
所述试剂盒还包括说明书，说明书可以包括关于获得样品、处理样品的指导。
此外，试剂盒中可包含作为PCR的阳性对照而使用的细菌的基因组DNA、作为阴性对照而使用的无菌水。
实施本发明时，作为另外的必要的器具，可举出移液器、移液器用枪头、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物学的实验中广泛使用的器具类，作为装置类，可举出PCR、净化台、管用离心机等在分子生物学的实验中广泛使用的仪器。
本发明提供了一种消化道病毒核酸序列的扩增方法，所述方法包括使用上述引物组或上述试剂盒进行扩增反应。
在本发明中，所述扩增反应通过包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、分支DNA信号扩增(bDNA)、聚合酶链式反应(PCR)的方法进行。
优选的，所述扩增反应通过PCR方法进行。
所述PCR包括但不限于实时PCR、多重PCR、装配PCR、序列间特异性PCR、反向PCR、连接介导的PCR、数字PCR、嵌套PCR、重叠延伸PCR。
更优选的，所述PCR选自多重PCR。
所述扩增反应在相似的扩增条件下进行。
本发明实施例部分提供了扩增条件的示例性实施方案。然而，在此所使用的术语“扩增条件”涉及适合于获得靶的可检测量的温度和/或孵育时间。因此，术语“相似的扩增条件”意指若是期望，可以对各靶在相似的温度下进行化验。术语“相似的扩增条件”还指若是期望，可以对各靶在相似的孵育时间下进行化验。在一些情况下，术语“相似的扩增条件”还涉及扩增循环的次数。然而，本领域内熟知，循环的次数并不总是严格的。例如，一些样品可以在其他样品之前被移除或被留下进行附加扩增循环。在其他情况下，术语“相似的扩增条件”还涉及所使用的缓冲液和扩增试剂(酶、核苷酸、盐等)的性质。术语“相似的扩增条件”还指条件(例如,时间、缓冲液、循环次数、温度等)可以稍微改变或可以相同。
本发明提供了一种检测样品中消化道病毒的方法，所述方法包括使用上述引物组、上述试剂盒或根据上述的方法进行扩增，获得扩增产物，使用扩增产物进行测序。
所述方法还包括添加混合模板进行扩增，所述模板浓度为9×100-9×103copies/mL。
优选的，所述模板浓度为9×102-9×103copies/mL。
在本发明中，当模板添加浓度为9×102时，消化道病毒Human adenovirus 40(人腺病毒40型)、Norovirus GII(诺如病毒GII型)、Parechovirus(副肠孤病毒)、Rotavirus C(轮状病毒C型)的检测灵敏度具有统计学意义。
当模板添加浓度为9×103时，Norovirus GI(诺如病毒GI型)、Astrovirus(星状病毒)、Enterovirus(肠道病毒)、Rotavirus A(轮状病毒A型)、Rotavirus B(轮状病毒B型)、Sapovirus II(札如病毒II型)、Sapovirus IV(札如病毒IV型)、SapovirusⅠ(札如病毒I型)的检测灵敏度具有统计学意义。
在本发明中，单位“拷贝/mL”即“copies/mL”。
本发明的检测方法是非诊断目的的检测方法，本发明的方法可以在实验室或任何常规的环境中检测样品中的消化道病毒，所述样品的来源包括但不限于土壤、食物、水、纯病毒培养物。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1
1.1实验方法
1.1.1引物设计
下载各消化道病毒参考基因组的编码序列文件，对全部病毒的所有编码序列进行筛选，构建相似性矩阵，找出每种病毒的特异性区域。用primer3软件设计每种病毒的扩增引物，MFEprimer软件和Dimer check软件检查引物的特异性和二聚化情况。Blast分析检查扩增子特异性情况。引物序列见表1，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成。
表1 12对消化道病原体引物序列
1.1.2引物特异性验证
合成12段消化道病毒扩增靶序列DNA片段，以上下游各延伸200bp作为模板构建DNA质粒(北京擎科生物科技有限公司)。此质粒为扩增模板，单重PCR验证表1中12对引物的特异性。PCR反应体系：2x PCR mix 25μL，正反引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板10μL，H2O 13μL，共计50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。取25μLPCR扩增产物用于1％琼脂糖凝胶电泳分析，另取25μL进行sanger测序以验证扩增的准确性。
1.1.3多重引物兼容性验证
将表1中12对引物等比例混合，以此混合引物池分别进行12种消化道病原体的单模板混合引物PCR实验，确认各引物的兼容性。PCR反应体系：2x PCR mix 25μL，混合引物池(10μmol/L)2μL，DNA模板10μL，H2O13μL，共计50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。取25μLPCR扩增产物用于1％琼脂糖凝胶电泳分析，另取25μL进行sanger测序以验证扩增的准确性。
1.1.4多重PCR引物浓度优化
通过不同引物浓度梯度的多重扩增实验，确认最优引物扩增浓度。将表1中12对引物等比例混合(每条引物终浓度都为10μmol/L)，混合引物稀释为以下浓度：6.4μmol/L，3.2μmol/L，1.6μmol/L，1.2μmol/L，0.8μmol/L，0.4μmol/L，0.2μmol/L，0.1μmol/L，0.05μmol/L，0.025μmol/L和0.0125μmol/L。多重PCR反应体系：2XPhusion U Multiplex PCR MasterMix 5μL，混合引物2.5μL，混合模板2.5μL。PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min。PCR产物进行三代测序，见步骤1.1.7。
1.1.5多重PCR体系灵敏度验证
以步骤1.1.4中的最优引物浓度探索DNA模板检测灵敏度。混合模板倍比稀释至9×103拷贝/mL，9×102拷贝/mL，9×101拷贝/mL和9×100拷贝/mL。多重PCR反应体系：2×Phusion U Multiplex PCR Master Mix 5μL，混合引物2.5μL，混合模板2.5μL，其中阴性对照组(Negative Control，NC)模板为水。PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min。PCR产物进行三代测序，见步骤1.1.7。
1.1.6多重PCR检测方法初步应用
委托通用生物构建包含轮状病毒A、B、C靶序列的的假病毒，提取假病毒RNA后倍比稀释至4×104拷贝/mL，4×103拷贝/mL，4×102拷贝/mL和4×101拷贝/mL。逆转录反应条件：23℃10min，50℃20min，80℃10min。多重PCR反应体系：2×Phusion U Multiplex PCRMaster Mix 5μl，混合引物2.5μl(每条引物浓度为0.1μmol/L)，混合模板2.5μl，其中阴性对照组(Negative Control，NC)模板为水。PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min。PCR产物进行三代测序，见步骤1.1.7。1.1.7nanopore RBK096试剂盒测序
按照纳米孔快速建库试剂盒RBK096的protocol进行文库构建，测序平台为MinIONMK1C测序仪搭配R9.4.1Flowcell芯片。简要步骤为，准备9μLPCR产物，加入1μL对应的barcode条码，30℃孵育2min，80℃孵育2min后置于冰上冷却。将所有条码标记的文库混合，用AMpure XP beads纯化，纯化产物加入测序接头后进行上机测序。
1.1.8数据分析
测序数据经过测序仪内置的Guppy软件进行Barcode拆分，使用BLAST分析软件对下机数据进行物种鉴定，统计各病原体的序列数量，并进行方差分析(Analysis ofVariance)。
1.2实验结果
1.2.1引物特异性
琼脂糖凝胶电泳结果显示，12种消化道病毒DNA均扩增出特异性条带(见图1)。将另一部分PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行sanger测序。测序结果与参考基因序列比对，结果显示PCR产物与目的基因序列高度一致，相似率均可达98％以上。
1.2.2多重PCR引物兼容性
分别以12种消化道病毒DNA为模板，将表1中12对引物等比例混合，进行单模板混合引物PCR实验。结果显示，虽然混合引物会形成引物二聚体，但是12种消化道病毒DNA均扩增出预期的特异性条带(见图2)。Sanger测序结果表明扩增产物与目的基因序列一致。
1.2.3多重PCR引物浓度优化
结果如图3所示，当引物添加浓度为0.1μmol/L时，测序reads数及病毒检出种类数均最多。因此，选择0.1μmol/L作为本研究多重PCR体系的添加引物浓度。
1.2.4多重PCR法检测灵敏度评价-混合DNA模板
在引物浓度为0.1μmol/L时，对不同浓度混合DNA模板进行多重PCR扩增，扩增产物进行基因序列分析。结果如图4所示，与对照组相比，序列分析得到的Human adenovirus 40(人腺病毒40型)、Norovirus GII(诺如病毒GII型)、Parechovirus(副肠孤病毒)、Rotavirus C(轮状病毒C型)序列数在模板浓度为9×102拷贝/mL时具有统计学差异(P<0.05)，其他8种消化道病原体在模板浓度为9×103拷贝/mL时均具有统计学差异(P<0.001)。
1.2.5多重PCR法检测灵敏度评价-混合假病毒
在引物浓度为0.1μmol/L时，对不同浓度轮状病毒A、B、C的假病毒进行多重PCR扩增，探究RNA水平的测序检测灵敏度。如图5所示，与对照组相比，在假病毒浓度为4×103拷贝/mL时，轮状病毒A、B、C均具有统计学差异(P<0.01)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种引物组，其特征在于，所述引物组包括长度为15到40个核苷酸的用于扩增不同消化道病毒的核酸序列；
优选的，所述引物组包括与SEQ ID NO.1-2所示的引物对、SEQ ID NO.3-4所示的引物对、SEQ ID NO.5-6所示的引物对、SEQ ID NO.7-8所示的引物对、SEQ ID NO.9-10所示的引物对、SEQ ID NO.11-12所示的引物对、SEQ IDNO.13-14所示的引物对、SEQ ID NO.15-16所示的引物对、SEQ ID NO.17-18所示的引物对、SEQ ID NO.19-20所示的引物对、SEQ IDNO.21-22所示的引物对和/或SEQ ID NO.23-24所示的引物对的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列；
优选的，所述引物组包括SEQ ID NO.1-2所示的引物对、SEQ ID NO.3-4所示的引物对、SEQ ID NO.5-6所示的引物对、SEQ ID NO.7-8所示的引物对、SEQ ID NO.9-10所示的引物对、SEQ ID NO.11-12所示的引物对、SEQ ID NO.13-14所示的引物对、SEQ ID NO.15-16所示的引物对、SEQ ID NO.17-18所示的引物对、SEQ ID NO.19-20所示的引物对、SEQ IDNO.21-22所示的引物对和/或SEQ ID NO.23-24所示的引物对的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物；
优选的，正向引物和反向引物中的至少一者用标记物质标记；
优选的，所述标记物质包括荧光物质、放射性同位素或酶；
优选的，所述荧光物质包括TAMRATTM、Alexa555、Alexa647、花青染料系列的Cy3、Cy5、荧光素；
优选的，所述放射性同位素包括32P、33P、35S；
优选的，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶；
优选的，所述引物组包括至少一个修饰核苷酸；
优选的，所述修饰核苷酸包括2'-修饰核苷酸或5-甲基胞嘧啶；
优选的，所述2'-修饰核苷酸包括2'-O-甲基修饰核苷酸或2'-氟修饰核苷酸；
优选的，所述5-甲基胞嘧啶包括5-甲基-脱氧胞嘧啶；
优选的，所述5-甲基-脱氧胞嘧啶包括5-Me-dC、5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶；
优选的，所述引物组中如果存在除了3'末端胞嘧啶以外的胞嘧啶，则每个胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶；
优选的，所述引物组包括简并位置；
优选的，所述简并位置包括R、W、M、Y、K、B、D、H、N、S或V，其中，R包括A或G，W包括A或T，M包括A或C，Y包括C或T，K包括G或T，B包括A、G或T，D包括A、G或T，H包括A、C或T，N包括A、G、C或T，S包括G或C，V包括A、C或G。
3.一种扩增消化道病毒核酸序列的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
(1)与权利要求1或2所述的引物组互补的核酸序列；
(2)在严格条件下与(1)所述的核酸序列杂交的核酸序列。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物组；
优选的，所述引物组被提供在单个容器或单独的容器中；
优选的，所述试剂盒还包括至少一种反应混合物，其中所述至少一种反应混合物包括以下一种或多种：用于PCR的酶、dNTPs、缓冲溶液、Mg2+；
优选的，所述用于PCR的酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶；
优选的，所述DNA聚合酶包括Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段；
优选的，所述缓冲液包括聚合酶缓冲液、Tris盐酸缓冲液；
优选的，Mg2+的来源包括MgCl2、MgSO4；
优选的，所述试剂盒还包括荧光色素；
优选的，所述试剂盒还包括说明书。
5.一种消化道病毒核酸序列的扩增方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒进行扩增反应；
优选的，所述扩增反应通过包括LCR、NASBA、SDA、TMA、bDNA、PCR方法进行；
优选的，所述扩增反应通过PCR方法进行；
优选的，所述PCR包括实时PCR、多重PCR；
优选的，所述PCR选自多重PCR；
优选的，所述扩增反应在相似的扩增条件下进行。
6.一种检测样品中消化道病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3任一项所述的引物组、权利要求4所述的试剂盒或根据权利要求5所述的方法进行扩增，获得扩增产物，使用扩增产物进行测序；
优选的，所述引物组浓度为0.05-0.8μmol/L；
优选的，所述引物组浓度为0.05-0.4μmol/L；
优选的，所述引物组浓度为0.1-0.2μmol/L；
优选的，所述引物组浓度为0.1μmol/L；
优选的，所述方法还包括添加混合模板进行扩增；
优选的，所述模板浓度为9×100-9×103copies/mL；
优选的，所述模板浓度为9×102-9×103copies/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述测序的技术包括二代测序技术、三代测序技术；
优选的，所述三代测序技术包括HeliScope单分子测序技术、实时单分子测序技术、纳米孔测序技术、Geno Care单分子测序技术；
优选的，所述三代测序技术选自纳米孔测序技术。
8.一种检测消化道病毒的文库，其特征在于，所述文库包括权利要求1-3任一项所述的引物组；
优选的，所述文库包括使用Ligation sequencing kit、Native Barcoding Expansion1-12或nanopore RBK096构建；
优选的，所述文库使用nanopore RBK096构建。
9.权利要求1-3任一项所述的引物组在制备扩增或检测消化道病毒核酸序列的试剂盒中的应用。
10.权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在制备检测消化道病毒的产品中的应用；
优选的，所述消化道病毒包括人腺病毒40型、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、札如病毒I型、札如病毒II型、札如病毒IV型、星状病毒、副肠孤病毒、肠道病毒、轮状病毒A型、轮状病毒B型和/或轮状病毒C型。
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|---|---|
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103210093A (zh) * | 2011-01-26 | 2013-07-17 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种检测消化道病原体的方法 |
| US20140315750A1 (en) * | 2011-11-15 | 2014-10-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health | Selective detection of norovirus |
| CN109680100A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-26 | 深圳市刚竹医疗科技有限公司 | 检测肠道病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
| US20190211408A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-11 | Quest Diagnostics Investments Llc | Methods for detecting norovirus |
| CN112501358A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-03-16 | 爱科睿特生物医疗科技(南京)有限公司 | 一种用于检测9种儿童消化道病原体的引物探针组合及试剂盒 |
| CN112593015A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-04-02 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种引物组合物、测序试剂盒及检测方法 |
| US20210381067A1 (en) * | 2020-06-08 | 2021-12-09 | Ampliwise Inc. | Nucleic acid amplification and detection with attenuaiting probe |
| CN115261499A (zh) * | 2022-08-14 | 2022-11-01 | 中国人民解放军总医院 | 耐力相关的肠道微生物标记物及其应用 |
-
2023
- 2023-02-22 CN CN202310151239.8A patent/CN116042928B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103210093A (zh) * | 2011-01-26 | 2013-07-17 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种检测消化道病原体的方法 |
| US20140315750A1 (en) * | 2011-11-15 | 2014-10-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health | Selective detection of norovirus |
| US20190211408A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-11 | Quest Diagnostics Investments Llc | Methods for detecting norovirus |
| CN109680100A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-26 | 深圳市刚竹医疗科技有限公司 | 检测肠道病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法 |
| US20210381067A1 (en) * | 2020-06-08 | 2021-12-09 | Ampliwise Inc. | Nucleic acid amplification and detection with attenuaiting probe |
| CN112593015A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-04-02 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种引物组合物、测序试剂盒及检测方法 |
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| CN115261499A (zh) * | 2022-08-14 | 2022-11-01 | 中国人民解放军总医院 | 耐力相关的肠道微生物标记物及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘冉等: "多重PCR和纳米孔测序结合检测消化道病原体方法及其评价", 《军事医学》, vol. 47, no. 8, pages 590 - 595 * |
| 徐德顺等: "依赖核酸扩增技术在轮状病毒检测中的应用", 《中国预防医学杂志》, no. 4, pages 41 - 44 * |
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