ES2610781T3 - Amplificación de patógenos independiente de la cepa y vacunas para estos - Google Patents

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    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
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Abstract

Una célula dendrítica aislada que comprende una pluralidad de ARNm transcritos in vitro, que codifican cada uno una variante alélica de un polipéptido de múltiples cepas de HIV presentes en un sujeto individual, en donde dicha pluralidad de ARNm codifican múltiples variantes alélicas de dicho polipéptido y no codifican el genoma completo del HIV, y comprende, además, ARNm de CD40L transcrito in vitro.

Description

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Vpr Carril 1 F4995:R5507, Carril 2 F5058:R5507; Carril 3 F4995:R5419; Carril 4 F5058:R5419. Rev Carril 1 F7750:R8300; Carril 2 F7830:R8300; Carril 3 F7911:R8300. Nef Carril 1 F8235:R9069; Carril 2 F8343:R9069. Ver los Ejemplos 6, 7 y 8 para la composición de cada grupo de cebadores. b) Resolución en gel de agarosa de transcritos de gag, vpr, rev y nef preparados in vitro a partir de ARN de HIV amplificado.
Figura 18. (A) Árbol filogenético de cuasiespecies de gag de HIV amplificadas a partir del Paciente 3. (B) Sustitucionesde aminoácidos en gag p17 amplificada a partir de cuasiespecies de HIV aisladas a partir del Paciente 1. (C) Árbolfilogenético de cuasiespecies de gag de HIV amplificadas a partir del Paciente 1. (A) Árbol filogenético de cuasiespeciesde rev de HIV amplificadas a partir del Paciente 1. (A) Árbol filogenético de cuasiespecies de vpr de HIV amplificadas a partir del Paciente 1.
Figura 19. Resolución en gel de poliacrilamida de las proteínas gag, vpr, rev y nef preparadas mediante la traducción in vitro de ARN de HIV amplificado a partir de tres pacientes. El carril del control muestra la proteína gag preparada mediante la traducción in vitro del ARN de Gag amplificado apartir del plásmido pBKBH10S de control.
Figura 20. Las DC inmaduras se cotransfectaron con cuatro genes autólogos de HIV (Vpr, Rev, Nef, y Gag) junto con ARN que codifica CD40L, y posteriormente se cultivaron en presencia de IFN-gamma para lograr la maduración completa de las DC. Las DC maduras cargadas con antígeno se usaron para estimular PBMC autólogas de pacientes con HIV. Después de 6 días en cultivo, se recuperaron las PBMC, y se reestimularon con cuatro librerías de péptidos superpuestos individuales correspondientes a las secuencias consenso para Vpr, Rev, Nef y gag (dos grupos). La frecuencia de células positivas para IFN-g se determinó por ICS en respuesta al reconocimiento de cada gen de HIV individual. Las preparaciones de DC se cargaron con 1 µg de ARN/millón de DC con cada uno de los cuatro genes de HIV, y en un experimento paralelo, la carga útil de ARN de NEF se redujo a 0,25 µg/millón de DC, mientras quelos otros tres genes se transfectaron cada uno a 1 µg de ARN/millón de DC.
Figura 21. Se transfectaron DC inmaduras con 5 µg de ARN de eGFP/millón de DC solamente (control negativo), o las DC transfectadas con eGFP se pulsaron posteriormente con péptidos gag consenso como dos grupos. Alternativamente, las DC se transfectaron con ARN de Gag autólogo (5 ug de ARN/millón de DC). En todos los casos, las DC se cotransfectaron con ARN de CD40L, y posteriormente se cultivaron en medio que comprende IFN-gamma para lograr la maduración completa. Las DC cargadas con antígeno se cocultivaron con PBMC marcadas previamente con CFSE. Después de 6 días, las PBMC se recuperaron y se determinó la frecuencia de células reactivas al antígeno (bajas en CFSE). Además, las células bajas en CFSE se tiñeron por ICS para Granzima B como unmarcador defunción efectora de CTL.
Figura 22. Calendario de tiempo y eventos para los procedimientos de ensayos clínicos.
Descripción detallada dela invención
La invención se refiere a una célula dendrítica aislada que comprende una pluralidad de ARNm transcritos in vitro, que codifican cada uno una variantealélica deun polipéptido de múltiples cepas deHIV presentes en un sujeto individual, en donde dicha pluralidad de ARNm codifican múltiples variantes alélicas de dicho polipéptido y no codifican el genoma completo del HIV, y comprende, además, ARNm de CD40L transcrito in vitro, vacunas que comprenden tales células y tales células para su uso en el tratamiento de un paciente infectado con HIV.
A lo largo de esta descripción, varias publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas se refieren mediante una cita de identificación. Las descripciones de estas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas se incorporan de esta manera como referencia en la presente descripción para una descripción más completa del estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Sin embargo, en el caso de un conflicto irreconciliable de cualquier otramanera, la presente especificación prevalecerá.
La práctica dela presenteinvención emplea, amenos quese indiquedecualquier otramanera, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran dentro de las habilidades de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Estos métodos se describen en las publicaciones siguientes. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2da edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.
M. Ausubel y otros eds. (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson y otros IRL Press en Oxford University Press (1991)); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH
(M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow y Lane eds. (1988)); USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow y Lane eds. (1999)); y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. (1987)).
Definiciones
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señal de poliadenilación corriente abajo, el codón de iniciación AUG, y un codón de terminación para la separación del ribosoma. Tales vectores pueden obtenerse comercialmente o ensamblarse mediante las secuencias descritas en métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los métodos más abajo en la presente descripción para la construcción de vectores en general.
El término "modificado genéticamente" significa que contiene y/o expresa un gen o secuencia de ácido nucleico foráneo que a su vez, modifica el genotipo o el fenotipo de la célula o su progenie. En otras palabras, se refiere a cualquier adición, eliminación o interrupción en los nucleótidos endógenos de una célula.
"ARN de HIV" significa ARN genómico de HIV y ARNm de HIV, así como también el ARN producido por la transcripción de amplicones de HIV preparados mediantelosmétodos de la invención.
"Variantes del HIV" o "variantes de HIV" o "cepa de HIV" se refiere a cualquiera de las variedades de HIV existentes o nuevas, e incluye, pero no se limita a, HIV-1 y HIV-2, los grupos M, N y O de HIV-1, todos los subtipos de HIV (clados), que incluyen los subtipos A1, A2, B, C, C, F1, F2, G, H, J y K de HIV-1, variantes de clados, todas las cuasiespecies de estos y formas recombinantes circulantes. Como se usa en la presente descripción el término "cepa", dos aislados de HIV que se diferencian en un solo nucleótido se consideran dos "cepas" de HIV diferentes. El término grupos se usa comúnmente para referirse a los linajes M, N y O del HIV-1. El término subtipos se usa para referirse a los clados principales dentro de un grupo. Existe, además, variabilidad de secuencias dentro de los subtipos. Forma recombinante circulante (CRF) describe un linaje recombinante, que desempeña una función importante en la pandemia del HIV. Los miembros de CRF comúnmente comparten una estructura en mosaico similar o idéntica es decir, descienden del(de los) mismo(s) evento(s) de recombinación. Las formas recombinantes circulantes del HIV incluyen, pero no se limitan a:
Nombre
Cepa de referencia Subtipos
CRF01_AE
CM240 A, E
CRF02 AG
IbNG A, G
CRF03 AB
Kal153 A, B
CRF04_cpx
94CY032 A, G, H, K, U
CRF05_DF
VI1310 D, F
CRF06_cpx
BFP90 A, G, J, K
CRF07 BC
CN54 B', C
CRF08 BC
GX-6F B', C
CRF09_cpx
96GH2911 aún sin publicar
CRF_10_CD
TZBF061 C, D
CRF_11_cpx
GR17 A, CRF01_AE, G, J
CRF12 BF
ARMA159 B, F
CRF_13_cpx
96CM-1849 A, CRF01_AE, G, J, U
CRF14 BG
X397 B, G
CRF_15_01B
99TH.MU2079 CRF01_AE, B
CRF_16_A2D
KISII5009 A2, D
Las descripciones y los mapas de las CRF anteriores y los vínculos a las secuencias de HIV pueden encontrarse en hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CRFs/CRF.html.
De manera similar, "variantes depatógeno" o "variantes deun patógeno" o "cepas patógenas" o "cepas deun patógeno" se refieren a todas las variantes de un patógeno, e incluyen variantes, mutantes y recombinantes de un patógeno que pueden estar presentes en un paciente. Como se usa en la presente descripción, dos variantes de un patógeno que se diferencian en un solo nucleótido se consideran dos cepas diferentes del patógeno.
Suministro génico "in vivo", transferencia de genes, terapia génica y similares como se usa en la presente descripción, son términos que se refieren a la introducción de un vector que comprende un polinucleótido exógeno directamente en el cuerpo de un organismo, tal como un ser humano o un mamífero no humano, de manera que el polinucleótido exógeno se introduce a un organismo in vivo.
El término "aislado" significa separado de constituyentes, celulares y de otro tipo, con los cuales el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, o fragmentos de estos, se asocian normalmente en la naturaleza. Por
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contra antígenos consenso, tales como vacunas previas contra el HIV, las que hasta el momento han demostrado poca
o ninguna capacidad demediar la eliminación del virus o la supresión de las cargas virales.
Es un objetivo de la invención proporcionar una estrategia de vacunación específica de paciente para el tratamiento de patógenos con el uso de vacunas celulares o de ácidos nucleicos personalizadas que compensen la variabilidad del patógeno presente dentro de un individuo. Esta estrategia se basa en la amplificación del ácido nucleico del patógeno de un sujeto infectado, y el uso de dicho material de patógeno amplificado, o derivados de este, en una vacuna específica de paciente. Los ácidos nucleicos de patógeno amplificados, o derivados de estos (por ejemplo, productos de transcripción in vitro, productos de transcripción/traducción in vitro, o vectores que contienen tales ácidos nucleicos amplificados), pueden usarse como una vacuna de ácidos nucleicos autóloga o alogénica, o cargarse en células presentadoras de antígeno (APC) autólogas, tales como células dendríticas (DC), que se administran después al paciente. Además, los productos amplificados pueden usarse para identificar variantes de patógeno presentes en un individuo infectado y controlar los efectos de la intervención terapéutica.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos ofrecen una manera conveniente y eficiente de obtener ADN que codifica los antígenos específicos del patógeno de interés. Sin embargo, debido a la elevada frecuencia de mutación de algunos patógenos, particularmente de los patógenos retrovirales, tales como el HIV, antes de la presente invención era un reto importante diseñar cebadores de PCR que pudieran amplificar demanera confiable regiones objetivos de variantes de patógeno que pueden estar presentes en un paciente individual. Por ejemplo, aun cuando existe una heterogeneidad considerablementemenor en las secuencias de HIV que flanquean regiones codificantes, no existen regiones absolutamente conservadas que permitan el diseño de un solo par de cebadores universales para cada gen de interés. Por lo tanto, los métodos de la invención emplean grupos de cebadores directos e inversos específicos de antígeno para la amplificación de ácidos nucleicos de genes de patógeno de interés, o porciones de estos, de manera que la mayoría o todas las cepas de un patógeno presentes en un individuo infectado reaccionan con al menos un cebador directo y uno inverso para permitir la amplificación de diversas secuencias objetivos.
En la presente descripción se describen métodos para la amplificación de ácidos nucleicos independiente de la cepa de ácidos nucleicos de patógeno con el uso de múltiples pares de cebadores y condiciones de amplificación que compensan la variabilidad entre los ácidos nucleicos de patógeno en los sitios de hibridación de los cebadores. Con el uso de estos métodos, es posible amplificar la totalidad o porciones objetivos de esencialmente todas las variantes de un patógeno presentes en un individuo infectado. La amplificación de todas o la mayoría de las variantes de patógeno presentes en un individuo produce amplicones que pueden usarse para identificar y cuantificar las variantes presentes en un individuo infectado. Tales amplicones o derivados de estos pueden usarse en vacunas basadas en células o vacunas de ácidos nucleicos para tratar la infección del patógeno y/o identificar las variantes de patógeno presentes en un individuo infectado. Estos productos amplificados (amplicones) pueden usarse directamente, o pueden convertirse en ARN traducibles, para cargarlos en APC, preferentemente, APC autólogas, ya sea in situ o in vitro. Los amplicones y transcritos in vitro preparados a partir del transcrito pueden usarse como vacunas de ácidos nucleicos. Los polipéptidos traducidos in vitro preparados a partir de tales transcritos in vitro pueden usarse como vacunas de polipéptidos y para cargar APC.
Un aspecto importante para la amplificación de ácidos nucleicos de patógeno independiente de la cepa es la selección de los cebadores y las condiciones de amplificación. Los solicitantes han descubierto métodos para seleccionar pares de cebadores capaces de amplificar regiones divergentes de ácidos nucleicos de patógeno. Para amplificar antígenos objetivos seleccionados a partir de un patógeno variable, tal como el HIV, de una manera independiente de la cepa, grupos de cebadores de PCR pueden seleccionarse estratégicamente para garantizar la amplificación confiable de los objetivos previstos yla coamplificación simultánea de las variantes existentes.
El número y selección de cuáles antígenos autólogos usar como objetivos para la amplificación pueden basarse en dos factores principales: (1) regiones sustanciales del gen objetivo deben ser susceptibles a la amplificación de ácidos nucleicos con el uso de grupos de cebadores con complejidades manipulables, y (2) preferentemente, la expresión del antígeno objetivo no afecta negativamente la biología de la APC objetivo, tal como DC. Al amplificar regiones específicas de ácidos nucleicos de patógeno, en lugar de los ácidos nucleicos de patógeno totales, es posible seleccionar regiones que codifican los fragmentos más inmunogénicos, y evitar las regiones que pueden tener efectos negativos sobre el sistema inmunológico. Por ejemplo, las porciones del gen nef de HIV involucradas en la inhibición de células dendríticas pueden evitarse mediante la selección de cebadores que no amplifican la región de nef responsable de la inhibición.
Múltiples cebadores que corresponden a variantes conocidas de un patógeno pueden diseñarse para la hibridación en un locus objetivo. Sin embargo, para manipular la complejidad de los cebadores, es útil determinar primero las secuencias de nucleótidos conservadas entre variantes de patógeno conocidas. La selección de cebadores que se hibridan a regiones conservadas de ácido nucleico del patógeno reduce el número de cebadores necesarios para garantizar la amplificación de todas o la mayoría de las variantes de patógeno presentes en un individuo. Otra consideración importante en la selección de los cebadores es que el error de apareamiento en la mitad 3' de una secuencia de cebador para sitios de hibridación variantes conocidos debe evitarse o minimizarse, sin embargo una T 3' terminal desapareada no tendrá, típicamente, un efecto negativo sobre la amplificación. Los errores de apareamiento en
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preferentemente, una secuencia de Kozak optimizada, por ejemplo, las bases 5' CCACCATGG (sec. con núm. de ident.: 59), en donde el ATG subrayado es el codón de iniciación de la traducción. La secuencia de Kozak que incluye el codón de iniciación ATG puede encontrarse en la región saliente en 5' del cebador directo, o en la región de hibridación en 3' del cebador, en dependencia de si estas secuencias están presentes en el amplicón primario. Además, si el amplicón primario contiene una secuencia de Kozak inferior a la óptima, esta puede optimizarse con el uso de un cebador directo con una secuencia de Kozak óptima, aunque no completamente complementaria. Preferentemente, la porción 3' del cebador directo será esencialmente complementaria a la secuencia inmediatamente corriente abajo del codón iniciador ATG o la secuencia codificante más cercana al extremo 5' amplificada durante la amplificación primaria. El cebador inverso contiene, preferentemente, un saliente de poliT en 5' como su extremo 5' que servirá como un molde para la poliadenilación durante la transcripción in vitro. La mitad 3' del cebador inverso será complementaria a la secuencia codificante aislada en la reacción de amplificación primaria. Si un codón de terminación de la traducción adecuado no está presente en el amplicón primario, este puede incluirse en la porción saliente en 5' del cebador inverso. El amplicón secundario obtenido por amplificación con el uso de cebadores tales como los descritos anteriormente puede servir después como un molde en una reacción de transcripción in vitro en presencia de caperuza m7G o un análogo de este, tal como ARCA (ver la patente de los Estados Unidos U.S. 2003/0194759).
Así, en otra modalidad, en la presente descripción se describe un método para tratar un mamífero infectado con patógeno, que comprende:
a.
amplificar ácidos nucleicos de múltiples variantes de un patógeno presentes en un mamífero con el uso de una pluralidad de pares de cebadores que pueden amplificar múltiples variantes de dicho patógeno para producir ADN de patógeno amplificado;
b.
opcionalmente transcribir dicho ADN de patógeno amplificado para producir ARN de patógeno; y
c.
administrar dicho ADN de patógeno o dicho ARN de patógeno a dicho mamífero.
Los métodos para formular y suministrar vacunas de ácidos nucleicos a un sujeto son conocidos para los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Scheel y otros Eur J Immunol (2204) 34:537-547; Hoerr y otros (2000) Eur J Immunol 30:1-7; Liu y otros (2002) Vaccine 20:42-48; Riedl y otros (2002) J Immunol 168:4951; Riedel y otros (2004) J Mol Med 82:144; la patente de los Estados Unidos U.S. 5.783.567; la patente de los Estados Unidos U.S. 6.603.998; el documento EP0880360; el documento EP1083232. Las rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, suministro tópico, electroporación de la piel, así como también administración cutánea, subcutánea, intradérmica, mucosal e intramuscular, y similares.
Como una alternativa al uso del amplicón primario o secundario o un ARN transcrito in vitro como una vacuna de ácidos nucleicos, tales ácidos nucleicos pueden cargarse en células presentadoras de antígeno in vitro. Después, las células presentadoras de antígeno cargadas son adecuadas para suuso como una vacuna.
Así, en otra modalidad, se describe una composición que comprende: una célula presentadora de antígeno transfectada con una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican uno o más antígenos de múltiples variantes de un patógeno presentes en un mamífero, en donde dichos ácidos nucleicos se derivan de la amplificación de ácidos nucleicos de polinucleótidos de patógeno con el uso de una pluralidad de pares de cebadores que pueden compensar la variabilidad entre dichas variantes de patógeno, y dicha célula presentadora de antígeno y dichos ácidos nucleicos de patógeno son de o se derivan de dichomamífero.
Las células presentadoras de antígeno (APC) incluyen, pero no se limitan a, macrófagos, células B y células dendríticas, tales como células dendríticas inmaduras, células dendríticas maduras y células de Langerhans. Las células presentadoras de antígeno profesionales, particularmente las células dendríticas (DC), proporcionan un vehículo poderoso para la estimulación de la inmunidad mediada por células a través de los efectos sobre las células T CD4+ y CD8+ (Banchereau 1998, Banchereau 2000). Intrínsecamente a su función, procesan eficientemente antígenos para la presentación en productos de MHC tanto de clase I como II a células T CD4+ y CD8+. Las células dendríticas, aisladas a partir de sangre periférica o médula ósea a través de técnicas de enriquecimiento de antígenos de superficie o cosechadas de cultivos de PBMC, pueden cargarse con antígenos candidatos específicos y después son capaces de presentar el(los) antígeno(s) relevante(s) a células T vírgenes o en reposo (Heiser 2000, Mitchell 2000). Preferentemente, las células presentadoras de antígeno son autólogas al individuo a vacunar, y el ácido nucleico de patógeno también se aísla o se deriva del paciente.
Las células presentadoras de antígeno se producen en el sujeto mamífero, o se derivan de células aisladas del sujeto mamífero. En una modalidad preferida, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica. El término "células dendríticas (DC)" se refiere a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides (Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296) o se derivan de precursores de células dendríticas in vitro. Las células dendríticas son las más potentes de las APC, y proporcionan las señales necesarias para la activación y proliferación de células T. Las células dendríticas se derivan de células progenitoras de la médula ósea, circulan en pequeños números en la sangre periférica y aparecen ya sea como células de Langerhans inmaduras o como células maduras diferenciadas terminalmente. En modalidades preferidas, las células dendríticas se diferencian a partir de monocitos. Los métodos para el aislamiento de células presentadoras de antígeno (APC), y para la producción de precursores de células dendríticas y células dendríticas maduras son conocidos para los
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Los cebadores inversos de vpr preferidos son las sec. con núm. de ident.: 196-203 y 269-273. Las combinaciones preferidas de cebadores inversos de vpr son las sec. con núm. de ident.: 196 y 197; las sec. con núm. de ident.: 198, 199 y 200; las sec. con núm. deident.: 201-203; ylas sec. con núm. deident.: 269-273.
En la presente descripción se describe una composición que comprende un cebador directo de rev de HIV que consiste esencialmente en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 74-88, 183189, 210 y 211 y los oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 74-88, 183-189, 210 y 211. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80 %, 85 %, 90 %, o al menos 95%.
Las combinaciones preferidas de cebadores directos de rev son las sec. con núm. de ident.: 87 y 88; las sec. con núm. de ident.: 183 y 184; las sec. con núm. de ident.: 185, 186 y 187; y las sec. con núm. deident.: 188 y 189.
En la presente descripción se describe una composición que comprende un cebador inverso de rev de HIV que consiste esencialmente en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 89-101, 123129, 190-195, 242-248 y 258-260 y los oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 y 258-260. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80 %, 85%, 90 %, o al menos 95 % e describe en la presente.
Las combinaciones preferidas de cebadores inversos de rev son las sec. con núm. de ident.: 190, 191 y 192; y las sec. con núm. de ident.: 193, 194 y 195.
En la presente descripción se describe una composición que comprende un cebador directo de env de HIV que consiste esencialmente en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 130-132, 134136 y 212-214 y los oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 130-132, 134-136 y 212-214. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80 %, 85 %, 90 %, o al menos 95%.
En la presente descripción se describe una composición quecomprende un cebador inverso de env de HIV que consiste esencialmente en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 133, 154-159, 249 y 255-258 y los oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 133, 154-159, 249 y 255-258.
En la presente descripción se describe una composición quecomprende un cebador inverso de env de HIV que consiste en el oligonucleótido de sec. con núm. de ident.: 133 o el oligonucleótido que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 133. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80 %, 85 %, 90 %, o al menos 95%.
En la presente descripción se describe una composición que comprende un cebador directo de nef de HIV que consiste esencialmente en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 138-139, 147, 148, 204 y 215-218 y oligonucleótido que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 138-139, 147, 148, 204 y 215-218. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80 %, 85 %, 90 %, o al menos 95 %.
Además, en la presente descripción se describe una composición que comprende un cebador directo de nef de HIV que consiste en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 140-143 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 140-143. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80%, 85 %, 90 %, o al menos 95 %.
Las combinaciones preferidas decebadores directos denef son las sec. con núm. deident.: 138, 139 y 204; las sec. con núm. deident.: 140-143; las sec. con núm. de ident.: 147-148; ylas sec. con núm. de ident.: 138 y 139.
En la presente descripción se describe una composición que comprende un cebador inverso de nef de HIV que consiste esencialmente en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: las sec. con núm. de ident.: 144-146, 149153 y 250-254 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 144-146, 149-153 y 250-254. Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80 %, 85 %, 90 %, o al menos 95 %.
Las combinaciones preferidas de cebadores inversos de nef son las sec. con núm. de ident.: 144-146; y las sec. con núm. deident.: 149-151.
Para amplificar una secuencia de HIV, uno o más cebadores directos se combinan con uno o más cebadores inversos. Así, en la presente descripción se describen combinaciones de pares de cebadores útiles para la amplificación de múltiples variantes de HIV. Estas combinaciones de pares de cebadores pueden contener un cebador directo y un cebador inverso (cada cebador estará presente típicamente en más de una copia). Sin embargo, para garantizar la
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genómico de HIV, lo más práctico es amplificar el primer o segundo exón de rev, en lugar del gen rev completo, el cual solo se encuentra en marco después del corte y empalme. En consecuencia, en modalidades preferidas, en la presente descripción se describen combinaciones de cebadores directos e inversos de rev adecuados para la amplificación del segundo exón de rev.
Así, aún en otro aspecto, en la presente descripción se describe una composición que comprende:
a.
un cebador directo de rev que comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident.: 74-88, 183-189, 210 y 211 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia conlas sec. con núm. de ident.: 74-88, 183-189, 210 y 211; y
b.
un cebador inverso de rev que comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident.: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 y 258-260 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia conlas sec. con núm. de ident.: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 y 258-260.
Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80%, 85 %, 90 %, o al menos 95 %.
Las combinaciones preferidas de cebadores directos e inversos de rev son las sec. con núm. de ident.: 183, 184, 190, 191 y 192; y las sec. con núm. deident.: 185, 186, 187, 190, 191 y 192; y las sec. con núm. deident.: 188-192.
En una modalidad, los cebadores directos de rev pueden combinarse con cebadores inversos de nef para producir un solo amplicón que codifica nef y el segundo exón de rev. Después, la PCR anidada se usaría para producir amplicones secundarios de nef y rev separados.
En consecuencia, en la presente descripción se describe una composición que comprende:
a.
un cebador directo de rev que comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident.: 74-88, 183-189, 210 y 211 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia conlas sec. con núm. de ident.: 74-88, 183-189, 210 y 211; y
b.
un cebador inverso de nef que comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en y las sec. con núm. de ident.: 144-146, 149-153 y 250-254 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia conlas sec. con núm. de ident.: 144-146, 149-153y 250-254.
Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80%, 85 %, 90 %, o al menos 95 %.
De manera similar, es posible producir otros amplicones primarios de una o más combinaciones consecutivas de genes de HIV de interés. Por ejemplo, un cebador directo de gag puede combinarse con un cebador inverso de nef para amplificar la mayor parte del genoma del HIV. Otros ejemplos no limitantes son la combinación de un cebador directo de vpr con un cebador inverso de nef, un cebador directo de vpr con un cebador inverso de rev y un cebador directo de env con un cebador inverso de nef.
Así, en la presente descripción se describe una composiciónque comprende:
a.
un cebador directo que comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident.: 1-20, 44-58, 74-88, 130-132, 134-136, 162-188 y 189 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. deident.: 1-20, 44-58, 74-88, 130-132, 134-136, 162-188 y 189; y
b.
un cebador inverso que comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en y las sec. con núm. de ident.: 60-73, 89-101, 114-122, 133, 144-146, 190-192, 196-203 y 269-273 y oligonucleótidos que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 60-73, 89-101, 114-122, 133, 144-146, 190-192, 196-203 y 269-273.
Preferentemente, la identidad de secuencia es al menos 80%, 85 %, 90 %, o al menos 95 %.
Los cebadores y pares de cebadores descritos anteriormente son útiles para la amplificación de ácidos nucleicos de HIV para producir amplicones primarios de ADN que codifican antígenos objetivos.
En base a estas directrices, se proporcionan cebadores directos e inversos anidados adecuados para la amplificación de los antígenos gag, vpr, env, rev y nef demúltiples variantes de HIV. Estos cebadores pueden usarse en una reacción de amplificación primaria o, preferentemente, en una segunda ronda de amplificación nucleica después de la amplificación primaria. En modalidades preferidas, la amplificación primaria se realiza con los cebadores directos e inversos de gag, vpr, rev, env y/o nef del HIV descritos anteriormente, seguida de una amplificación secundaria con el uso delos pares de cebadores anidados que se describen más abajo.
Así, en la presente descripción se describe un cebador directo que comprende una porción 5' y una porción 3', en donde la porción 5' comprende un promotor y una secuencia de Kozak optimizada y la porción 3' comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GTGCGAGAGCGT (sec. con núm. de ident.: 206, para la amplificación de gag), GTGCGAGACCGT (sec. con núm. de ident.: 207, para la amplificación de gag), AACAAGCCCCAG (sec. con núm. de
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