KR20070058503A - 병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 - Google Patents

병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플, 바람직하게는 병원체 감염된 개체로부터의 샘플에 존재하는 임의의 병원체의 다중 변이체 (균주)의 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV와 같은 레트로바이러스이다. 증폭된 병원체 핵산은 샘플에 존재하는 병원체 변이체를 확인하거나, 샘플에 존재하는 병원체를 정량화하는데에, 및 핵산 백신으로서, 또는 항원 제시 세포 백신의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산 또는 그에 의해 코딩되는 단백질은 항원 제시 세포를 형질감염/로딩시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염 치료용의 백신으로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포 내로 사전 로딩 없이 핵산 백신으로서 직접적으로 사용될 수 있다.
다중 변이체, 핵산 증폭, 핵산 백신, 항원 제시 세포

Description

병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 {STRAIN INDEPENDENT AMPLIFICATION OF PATHOGENS AND VACCINES THERETO}
본 발명은 병원체의 균주-독립성 증폭 방법 및 환자-특이적 백신 및 관련된 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 HIV 및 HCV와 같은 레트로바이러스에 대한 환자-특이적 백신에 관한 것이다.
많은 병원체는 급속하게 돌연변이되고 재조합되므로, 효과적인 백신의 생산을 곤란하게 한다. 이러한 문제는 바이러스 병원체, 특히 HIV와 같은 RNA 바이러스에서 가장 우세하다. HIV 감염된 개체는 다중 HIV 균주를 가질 수 있으며, 전형적으로 다중 HIV 유사종을 갖는다. HIV-I과 같은 병원체로 감염된 개체의 치료를 목적으로 하는 치료 전략은 항-바이러스에 내성인 바이러스 균주의 발달로부터 상기 약물의 수많은 부작용에 이르기까지 막대한 난점에 직면하며, 이러한 요법의 계속적인 투여가 곤란하고 비싸지게 한다.
몇몇 치료적 HIV 백신이 개발되었으나, 상기 백신의 임상적 시험은 거의 효능을 나타내지 않았다. 상기 백신의 성공 부재에 대한 한 가지 설명은 HIV 바이러스 게놈의 컨센서스 서열을 포함하는 면역원으로서 바이러스 벡터의 사용이다. 컨센서스 서열의 존재는 반드시 이종 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 있어 서 서열의 효능을 입증하지는 않는다. 컨센서스 서열과 자가 감염 HIV 균주 사이의 다양성의 여전히 높고 증대하는 수준 때문에, HIV-I 아형 B 컨센서스 서열을 기재로 한 백신 또는 항-바이러스 시약은 HIV 감염을 적당하게 치료할 수 없다. 더욱이, 상기 바이러스 벡터-기재 백신은 항원 프로세싱 및 제시라는 점에서 면역계의 가장 효과적인 세포, 즉 수지상 세포를 표적화하지 않을 것이다.
다수의 간행물은 HIV에 대한 백신으로서 HIV 핵산 또는 펩티드로 로딩(loading)된 항원 제시 세포의 용도를 암시하였다. 예를 들어 문헌 [Huang et al. J Infect. Dis. 2003 187:315-319]은 리포솜-복합체화된 HFV 단백질로 로딩된 수지상 세포 및 이러한 로딩된 세포의 백신으로서의 가능한 용도를 개시하고 있다. 문헌 [Weissman et al. J Immunol 2000 165:4710-4717]은 단일 클로닝된 HIV gag 서열을 코딩하는 mRNA로 수지상 세포를 형질감염시켜, MHC 부류 I 및 II 분자에 대한 항원성 gag 펩티드의 전달 및 시험관내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 것을 개시하고 있다. 미국 특허 제5,853,719호 및 미국 특허 제6,670,186호 (네어(Nair) 등)는 자가 항원 제시 세포의 시험관내 로딩용으로 환자로부터 단리된 종양 또는 병원체로부터 유래된 RNA의 용도, 및 그의 백신으로서의 용도가 기재되어 있다. 그러나, 총 병원체 RNA로 로딩된 항원 제시 세포를 사용한 환자의 백신화는 환자에서 병원체 로딩 양을 증가시킬 수 있다.
주어진 병원체의 모든 변이체, 특히 HIV의 모든 변이체로부터의 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머를 선택하는데 있어서의 곤란성이 인지되었다. HIV 게놈의 특이적 영역의 증폭은 생체내에서 바이러스의 낮은 정확도 역전사효소 및 면역 선택 에 의해 유발되는 HIV 게놈의 높은 돌연변이율로 인해 복잡해진다. 그럼에도 불구하고, 다중 HFV 변이체로부터의 HIV 게놈의 특정 영역을 증폭할 수 있는 프라이머가 개발되었다. 예를 들어 문헌 [Abravaya et al. J Clinical Microbio 2000 38:716-723]에는 혈장에서 HIV-1 군 M 아형 A, B, C, D, E, F 및 G, 및 군 O 및 HIV-2 RNA를 검출하는 다중 PCR 분석에 사용하기 위한 pol 유전자에 보존된 서열에 표적화된 HIV-1-특이적 및 HIV-2-특이적 프라이머 및 프로브, 및 이러한 분석법을 사용하여 혈액 공급의 안정성을 개선하는 것이 개시되어 있다.
문헌 [Christopherson et al. Nucleic Acids Res 1997 25:654-658]에서는 gag의 142 염기쌍 영역을 증폭하는 RT-PCR에 대한 내부 프라이머-HIV-1 주형 미스매치의 효과를 논의하고 있다. HIV-I 주형 및 프라이머 28 내지 30 염기 길이 사이의 5 내지 6개 (2 내지 4개가 아님)의 미스매치는 RT-PCR의 수율을 유의하게 감소시켰다. 프라이머는 미스매치를 축적하기 위해 전형적으로 사용되는 것보다 길게 설계되었다. 보다 일탈된 HIV-I 아형 A 및 E의 증폭의 감소된 효율은 어닐링 온도를 50℃로 저하시키고, 온도가 점차 증가하는 역전사 단계를 실시함으로써 4배 내지 10배 개선될 수 있었다. 또한, 5-메틸시토신으로 시토신을 치환하거나, 가변 염기의 위치에서 이노신을 치환하면 상동성 및 가장 일탈하는 HIV-I 주형 사이의 생성 수율이 4배 미만의 차이를 초래하였다. T에서 종결된 프라이머는 C, G 또는 T로 매치되거나 미스매치될 경우 증폭을 가능하게 하였다.
문헌 [Michael et al. J Clin Microbiol 1999 37:2557-2563]은 HIV-I gag 유전자의 155 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 프라이머를 개시하고 있다. 프라이 머는 아형 A 내지 G의 30 HIV-I 단리체에 대한 상동성을 최대화하고, 프라이머의 3' 말단 근처의 프라이머 미스매치에 대한 HIV-I을 최소화하도록 선택되었다. 증폭 동안 어닐링 온도를 저하시켜 미스매치 내성을 증가시켰다. 최적화된 프라이머 및 증폭 조건은 이전에 이용가능한 시험에 비해 검출된 HIV-I RNA의 양을 증가시켰지만, 아형 A, D, F 및 G를 과소표시하였고, 아형 H 및 J의 구성원을 함유하지 않았다.
미국 특허 제6,001,558호에는 다중 HIV-I 단리체로부터의 LTR 및 pol 영역, 및 다중 HIV-2 단리체로부터의 LTR, pol 및 env 영역의 짧은 단편 (200 염기쌍 미만)을 증폭하기 위한 다중 프라이머의 용도가 개시되어 있다. 그 후, 다중 프로브를 사용하여 증폭 생성물을 검출하였다. 프라이머/프로브 조합물은 군 M 및 O로부터의 HIV-1 단리체, 및 2가지 HIV-2 단리체를 검출할 수 있었다. HIV-I의 고도로 보존된 서열에 상응하는 프라이머를 하기 범주: 1) 증폭된 PCR 생성물의 길이가 200 염기쌍을 초과할 수 없었는데, 이는 보다 적은 생성물은 보다 큰 생성물에 비해 보다 효과적인 증폭되었기 때문이며, 다른 반응 조건에 대해 덜 민감하기 때문이고; 2) 프라이머 세트는 증폭된 생성물 검출용의 기능적 프로브 영역을 증폭해야만 하고; 3) 프라이머의 3' 말단 근처의 미스매치는 5' 말단 근처의 미스매치보다 훨씬 덜 선호될 것이고; 4) 3' 말단 안정성, 길이 (약 23 내지 31 뉴클레오티드), GC 함량 및 다른 프라이머 및 프로브와의 상호작용에 대한 다른 범주에 의해 선택하였다.
미국 특허 제6,194,142호에는 HIV-I Bru, HIV-I MaI 및 HIV-I Eli, HIV-2 ROD의 gag, pol 및 env 유전자와 SIV MAC 균주 사이, 및 HIV-2 ROD 및 SIV MAC의 nef2, vif2 및 vpx 유전자 또는 HIV-I Bru, HIV-I MaI 및 HIV-I Eli의 env, nefl, vifl 및 vpr 유전자 사이에 보존된 서열에 상응하는 프라이머 상을 사용한 시험관내 진단 HIV-I, HIV-2 및 SIV 감염을 위한 방법이 개시되어 있다. HIV 변이체 및 SIV에 상응하는 변이체 뉴클레오티드와 프라이머의 혼합물을 PCR 반응에 동시에 사용하였다.
미국 특허 제6,232,455호에는 31 HIV-I 군 M (아형 (A, B 및 D) 및 HIV-2 A 및 B 아형의 군 O 단리체 및 14개 단리체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프라이머/프로브 세트가 개시되어 있다. HIV-I 컨센서스 프라이머/프로브 세트는 HIV-I의 검출에 대해 특이적인 반면, HIV-2 컨센서스 프라이머/프로브 세트는 HIV-2의 검출에 대해 특이적이다.
미국 특허 제6,531,588호에는 환자에서 다중 HIV 유사종로부터의 pol의 0.7 kB, 1.57 kb 또는 2.1 kb 영역의 증폭 후, 적절한 요법을 결정하고 약물 내성을 모니터링하는데 사용하기 위한 환자-특이적 HIV 유전자형 정보를 결정하기 위한 시퀀싱을 위한 프라이머가 개시되어 있다.
미국 특허 출원 제2003/0148280호에는 순환 재조합 형태 (아형 사이의 재조합을 지칭하는 CFR)을 비롯한 이른바 모든 HIV-I 군 M, N 및 O 균주의 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 및 군간 재조합이 개시되어 있다. 프라이머는 HIV-I gag p24 (399 bp 앰플리콘), pol 인테그라제 (864 bp 앰플리콘), 및 env gp41 면역우세 영역 (IDR; 369 bp 앰플리콘)에 대해 표적화된다.
항원 제시 세포 백신 또는 핵산 백신의 제조를 위한 개체에 존재하는 병원체의 다중 종으로부터의 특정 폴리펩티드를 코딩하는 증폭된 자가 병원체 핵산을 사용하는 가능성은 상기 간행물의 어디에도 암시되지 않았다. 본 발명은 자가 감염 병원체를 치료하기 위한 환자 특이적 백신을 개발하고, 추가의 이점도 제공하기 위한 오래 느껴져온 필요에 요점을 둔다.
발명의 요약
본 출원인은 샘플, 바람직하게는 병원체 감염된 개체로부터의 샘플에 존재하는 임의의 병원체의 다중 변이체 (균주)의 핵산 증폭 방법을 발견하였다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV와 같은 레트로바이러스이다. 증폭된 병원체 핵산은 샘플에 존재하는 병원체 변이체를 확인하고, 샘플에 존재하는 병원체를 정량화하는 데에, 및 핵산 백신으로서, 또는 항원 제시 세포 백신의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포를 형질감염 (로딩)시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염 치료용의 백신으로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포 내로의 사전 로딩 없이 핵산 백신으로서 직접적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고,
b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이 상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택하는 것을 포함하는, 병원체의 다중 변이체의 증폭에 적합한 프라이머의 선택 방법을 제공한다.
바람직하게는, 후보 전방향 및 역방향 프라이머는 길이가 200 뉴클레오티드 초과인 증폭 생성물, 보다 바람직하게는 길이가 225, 250, 300 이상인 뉴클레오티드를 생성하도록 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 증폭된 핵산은 mRNA를 생성하기 위한 유효한 생체내 또는 시험관내 전사를 위한 전사 및 전사 신호를 함유하고, 그 후 시험관내 또는 생체내에서 번역될 수 있다. 본 출원인은 또한 핵산, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 생산된 mRNA를 사용한, 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포의 로딩 방법을 제공한다. 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염의 치료용의 백신으로서 유용하다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 균주 (변이체)로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산으로 형질감염된 항원 제시 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래될 수 있으며, 상기 병원체 핵산은 상기 포유동물로부터의 것이거나 그로부터 유래된다. 본 발명은 또한 개체를 감염시키는 병원체의 다중 변이체의 대표적인 핵산으로 로딩된 항원 제시 세포의 제조 방법, 및 본 발명의 백신을 사용한 병원체 감염된 개체의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 항원 제 시 세포는 수지상 세포이다.
일 측면에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 뉴클레오티드 서열 변이성을 상쇄하는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 병원체의 제1 및 제2 균주로부터의 폴리펩티드를 배합하여 혼합물을 형성하고; (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터의 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 생성하는 것을 포함하는, 병원체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법을 제공한다. 이러한 앰플리콘은 항원 제시 세포의 형질감염용, 및 시험관내 번역된 병원체 폴리펩티드 생산용의 핵산 백신으로서 사용될 수 있다.
병원체의 다중 균주로부터의 표적화된 병원체 유전자 및 그의 단편을 증폭하는 능력으로 인해 병원체 DNA 또는 RNA 게놈, RNA 바이러스의 전장 cDNA 카피 등과 같은 총 병원체 핵산을 정제하거나 증폭할 필요가 회피된다. 예를 들어, 유전자가 핵산 단편의 형태로 존재하든 인접하는 병원체 게놈으로서 존재하든, 핵산 백신으로서 또는 APC 내로의 로딩용으로 완전 HIV 게놈을 제공하는 것은 감염성 바이러스의 재구축을 초래할 수 있었다. 또한, 특정 병원체 핵산 또는 폴리펩티드 (예를 들어 HIV nef 또는 vpr)는 특히 항원 제시 세포에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 유해한 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리펩티드 또는 핵산은 제거되거나 다른 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대해 보다 적은 몰 비율로 존재할 수 있다. 따라서, 다중 병원체 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 제시하지만 완전한 병원체 게놈보다 덜 제시하거나 병원체 단백질의 전부보다 덜 코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공함으로써, 지속성 감염, 바이러스 유전자 또는 단백질의 구조적 발현과 같은 병원체 감염이 회피될 수 있다. 유해한 병원체 폴리뉴클레오티드 및 단백질이 또한 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드는가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산은 1종 이상의 개체에 존재하는 다중 병원체 균주로부터의 폴리펩티드를 제시할 수 있다. 증폭된 병원체 핵산은 1종 이상의 병원체 감염된 개체로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 병원체 핵산으로부터 직접적으로 생성될 수 있거나, 병원체의 클로닝된 단리체로부터 생성될 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC)를 제공한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 증폭된 병원체 핵산은 시험관내에서 번역되며, 환자를 백신화하는데 직접적으로 사용되거나, APC를 로딩하는데 사용된다. 병원체 폴리펩티드 또는 이러한 펩티드로 로딩된 APC는 제약상 허용되는 담체와 함께 백신으로서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 단리된 APC를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체-감염된 개체로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 개체에 또는 1종 이상의 다른 개체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하는 자가 백신의 제조 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 병원체-감염된 포유동물로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인, 자가 백신의 제조 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 a. 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체를 상기 병원체의 다중 변이체를 증폭하여 증폭된 병원체 DNA를 생성할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하고;
b. 임의로 상기 증폭된 병원체 DNA를 전사하여 병원체 RNA를 생성하고;
c. 상기 병원체 DNA 또는 상기 병원체 RNA를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체 감염된 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 임의의 병원체의 핵산을 증폭하는데 사용될 수 있다. 또한, 증폭된 생성물을 로딩하여 로딩된 병원체 (예를 들어 로딩된 바이러스)를 측정할 수 있으며, 이를 시퀀싱하여 개체 내의 병원체 진화를 결정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HCV의 HIV이다. 본 발명은 서열 1 내지 58, 60 내지 161 및 172 내지 371로 본질적으로 이루어진 HIV의 다중 변이체의 증폭을 위한 프라이머를 제공하며, 프라이머는 서열 1 내지 58, 60 내지 161 및 172 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 대해 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어지고, 프라이머 쌍은 서열 1 내지 58 및 서열 60 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머의 조합물, 및 서열 1 내지 58 및 60 내지 371에 대해 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하며, 이러한 프라이머 쌍을 함유하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 열안정성 DNA 폴리머라제, 역전사효소, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 CD40L mRNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 1종 이상의 시약을 함유할 수 있다. 일 측면에서, 본 발명은 HIV DNA의 다중 변이체를 본 발명의 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 것을 포함하는, HIV 서열의 균주-독립성 증폭 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 감염된 환자의 고유한 바이러스 종(들)에 의해 발현된 다중 한정된 HIV 단백질 변이체에서 지정된 치료적 면역 반응을 유도하는 HIV에 대한 자가 백신을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 자가 바이러스로 부터 유래된 다중 HIV 항원을 코딩하는 RNA로 형질감염된 자가 생체외 생성된 성숙한 수지상 세포로 이루어진 환자-특이적 백신을 제공한다.
도 1. 프라이머 수, 5' 및 3' 서열, 길이 및 Tm의 목록. 프라이머명에서 숫자는 하기 http 주소: //hiv-web.lanl.gov/content/index에서 월드와이드웹 상에서 이용가능한 로스 알라모스 내셔날 래버러토리(Los Alamos National Laboratory)에 의해 제공된 HIV 서열 데이타베이스에서 수탁 번호 NC_001802를 갖는 HIV 게놈에 대한 그의 위치에 상응한다.
도 2. 수탁 번호 NC_OO1802를 갖는 HIV 게놈의 서열, 오픈 리딩 프레임 및 gag, env, rev, vpr 및 nef의 단백질 서열, 및 프라이머의 위치 및 배향. 센스 가닥 (서열 388) 및 상보적 가닥 (서열 389)이 제공된다.
도 3. 설계된 프라이머의 군을 사용한 pBKBHIOS 플라스미드 주형으로부터의 gag 영역의 증폭. 하기 프라이머 군을 사용하였다: 레인 1: FG1:RG1; 레인 2: FG1:RG2; 레인 3: FG1:RG3; 레인 4: FG1:RG4; 레인 5: FG1:RG5; 레인 6: FG2:RG1; 레인 7: FG2:RG2; 레인 8: FG2:RG3; 레인 9: FG2:RG4; 레인 10: FG2:RG5.
도 4. 반응 당 4개의 HIV 아형의 다중 PCR 증폭. A: 60℃, 62℃ 및 65℃에서 수행된 PCR 반응의 아가로스 겔 분리. 각각의 레인에서 프라이머 군은 도 3에 기재된 바와 동일하다. B: 프라이머 32, 33 및 34의 반대 상보체, 역방향 프라이머 군 수 및 Tm. C: 프라이머 32 내지 34에 상응하는 영역의 pBKBHIOS, p93TH253.3, p90CF402.1 및 p93BR029.4 HIV 플라스미드 주형의 정렬. 밑줄친 "A" 는 B에 나타낸 프라이머의 반대 상보체에서 위치 6에 상응한다.
도 5. 다중 RT-PCR을 사용한 비감염성 HIV RNA 주형으로부터의 GAG 영역의 증폭. 일차 PCR 생성물은 이차 PCR 반응에서 네스팅된(nested) 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머 군은 상기 각각의 레인으로 지시된다.
도 6. 다중 HFV 유사종 증폭된 pBKBHIOS, p93TH253.3, p90CF402.1 및 p93BR029.4 HIV 플라스미드 주형의 정렬된 서열. 4개의 고유한 변이체 A, B, C 및 D는 실시예 4에 기재된 PCR 반응에서 증폭되었다.
도 7. (a) 비-감염성 HIV RNA로부터의 HIV VPR, REV 및 NEF 코딩 영역의 RT-PCR 증폭된 아가로스 겔 분할. 일차 PCR 생성물은 네스팅된 프라이머를 사용한 이차 PCR 반응에서 증폭되었다. 증폭에 사용된 프라이머 군은 상기 레인에 지시되었다. (b) 상기 각각의 레인에 서열로 지시된 개별 프라이머 쌍을 사용한 증폭된 gag 영역의 아가로스 겔 분리, (c) 증폭된 nef 영역의 아가로스 겔 분할.
도 8. GAG 코딩 영역의 아가로스 겔 분리는 감염된 HIV 환자의 혈장으로부터 단리된 HIV RNA로부터의 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 일차 PCR 생성물은 네스팅된 프라이머를 사용한 이차 PCR 반응에서 증폭되었다. 증폭에 사용된 프라이머 군은 상기 각각의 레인으로 지시된다.
도 9. 감염된 HIV 환자의 혈장으로부터 단리된 RNA로부터의 RT-PCR에 의해 증폭된 VPR 및 REV 코딩 영역의 아가로스 겔 분리. 일차 PCR 생성물은 네스팅된 프라이머를 사용한 이차 PCR 반응에서 증폭되었다. 증폭에 사용된 프라이머 군은 상기 각각의 레인으로 지시된다.
도 10. 감염된 HIV 환자의 혈장으로부터 단리된 RNA로부터 증폭된 GAG (1OA; 서열 398), REV (1OB; 서열 399) 및 VPR (1OC; 서열 400) 영역에서 검출된 유사종의 정렬. 점은 서열 동일성을 지시한다.
도 11. VPR 코딩 영역에서의 단리된 돌연변이는 HLA 에피토프에서의 단백질 서열에 영향을 준다.
도 12. 성숙한 RNA 형질감염된 수지상 세포의 gag 발현의 검출. 대조군 (MART) 세포 (점선), gag 형질감염된 (굵은 선) 또는 ARCA-gag 형질감염된 (회색 선) 상의 항-gag 모노클로날 항체의 결합의 FACS 분석.
도 13. HeLa 세포에서의 GAG 단백질 발현의 시간 과정. HeLa 세포에서의 GAG 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석. 비형질감염된 (음성 대조군 레인) 또는 HeLa 세포로부터의 용해물은 ARCA (A)64 꼬리 RNA로 형질감염되고, 지시된 시간 기간에서 분석용으로 수거되었다. P24 양성 대조군 레인은 p24 재조합 정제된 gag 단백질 25 ㎍을 함유한다.
도 14. 성숙한 RNA 형질감염된 수지상 세포에서의 REV 발현의 검출. 대조군 (MART) 세포 (채워진 선), rev-형질감염된 (점선) 수지상 세포 상의 항-gag 폴리클로날 항체의 결합의 FACS 분석.
도 15. HeLa 세포에서의 REV 단백질 발현 시간 과정. 비형질감염되거나 ARCA A64 꼬리 REV로 형질감염된 HeLa 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석. 수거의 시간은 상기 레인으로 지시된다.
도 16. 성숙한 RNA 형질감염된 수지상 세포에서의 NEF 발현의 FACS 분석.
도 17. (a) 3명의 HIV 환자로부터의 gag, vpr, rev 및 nef 영역의 아가로스 겔 분리.
각각의 레인에 사용된 프라이머 군은 하기와 같다.
Gag: 레인 1 F124:R1881; 레인 2 F304:R1881; 레인 3 F334:R1881; 레인 4 F124:R1913; 레인 5 F304:R1913; 레인 6 F334:R1913.
Vpr 레인 1 F4995:R5507, 레인 2 F5058:R5507; 레인 3 F4995:R5419; 레인 4 F5058:R5419.
Rev 레인 1 F7750:R8300; 레인 2 F7830:R8300; 레인 3 F7911:R83OO.
Nef 레인 1 F8235:R9069; 레인 2 F8343:R9069. 각각의 프라이머 군의 조성물에 대해서는 실시예 6, 7 및 8을 참조한다. b) 증폭된 HIV RNA로부터 제조된 gag, vpr, rev 및 nef 시험관내 전사체의 아가로스 겔 분리.
도 18. (A) 환자 3으로부터 증폭된 HIV gag 유사종의 계통수. (B) 환자 1로부터 단리된 HIV 유사종으로부터 증폭된 gag pi7에서의 아미노산 치환. (C) 환자 1로부터 증폭된 HIV gag 유사종의 계통수. (A) 환자 1로부터 증폭된 HIV rev 유사종의 계통수. (A) 환자 1로부터 증폭된 HIV vpr 유사종의 계통수.
도 19. 3명의 환자로부터 증폭된 HIV RNA의 시험관내 번역에 의해 제조된 gag, vpr, rev 및 nef 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 분리. 대조군 레인은 대조군 플라스미드 pBKBHIOS로부터 증폭된 Gag RNA의 시험관내 번역에 의해 제조된 gag 단백질을 나타낸다.
도 20. 미성숙 DC를 CD40L을 코딩하는 RNA와 함께 4개의 자가 HIV 유전자 (Vpr, Rev, Nef 및 Gag)로 공동-형질감염시키고, 이어서 IFN-감마의 존재하에서 배양하여 완전한 DC 성숙을 달성하였다. 항원 로딩된 성숙한 DC를 사용하여 자가 HIV 환자 PBMC를 자극하였다. 배양물에서 6일 후, PBMC를 회수하고, Vpr, Rev, Nef 및 gag (2개의 풀)에 대한 컨센서스 서열에 상응하는 4개의 개별 중첩 펩티드로 재자극하였다. IFN-g 양성 세포의 빈도를 각각의 개별 HIV 유전자의 인지에 반응하여 ICS에 의해 측정하였다. DC 제조물을 각각의 4개의 HIV 유전자를 갖는 1 ㎍ RNA/백만 DC로 로딩하고, 병행 실험에서, NEF RNA 로딩량을 0.25 ㎍/백만 DC로 감소시킨 반면, 다른 3개의 유전자는 1 RNA/백만 DC로 각각 형질감염시켰다.
도 21. 미성숙 DC를 단지 5 ㎍ eGFP RNA/백만 DC로 (음성 대조군), 또는 eGFP 형질감염된 DC, 후속으로 2개의 풀로서 gag 컨센서스 펩티드로 펄싱하였다. 별법으로, DC를 자가 Gag RNA (5 ㎍ RNA/백만 DC)로 형질감염시켰다. 모든 경우에, DC를 CD40L RNA로 공동-형질감염시키고, 이어서 IFN-감마를 포함하는 배지에서 배양하여 완전한 성숙을 달성하였다. 항원-로딩된 DC를 CFSE로 앞서 표지된 PBMC와 공동-배양하였다. 6일 후, PBMC를 회수하고, 항원-반응성 (CFSE 저) 세포의 빈도를 측정하였다. 또한, CFSE 저 세포를 CTL 효과기 기능의 마커로서 그란짐(Granzyme) B에 대해 ICS에 의해 염색하였다.
도 22. 임상 시험 절차를 위한 시간 및 사건 스케줄.
본 발명은 샘플에 존재하는 병원체의 대부분 또는 전부의 변이체로부터의 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다. 프라이머 조성물, 증폭된 생성물 및 그의 유도체는 개체에 존재하는 병원체 변이체의 확인 및 정량에서, 및 병원체 감염의 치료 또는 예방용의 핵산 백신 및 세포 기재 백신으로서의 용도를 갖는다.
본 개시사항 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 확인 인용에 의해 참고된다. 상기 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시사항은 본 발명이 관련된 분야의 상태를 보다 완전히 기재하기 위해 본 개시사항에 참고로 도입된다. 그러나, 다른 모순되는 충돌이 있는 경우에는, 본 명세서가 지배할 것이다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면, 당업자의 범위내인 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 상기 방법은 하기 간행물에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds. (1987))]; [the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)]; [PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991))]; [PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (MJ. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))]; [ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1988))]; [USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999))]; 및 [ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. (1987))]을 참조한다.
정의
본원에 사용된 특정 용어는 하기 정의된 의미를 가질 것이다. 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 단수 형태 관사 ("a", "an" 및 "the")는, 내용이 명백히 달리 지시하지 않는다면 복수 참조물을 포함한다. 예를 들어, "세포"라는 용어는 그의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다.
모든 수치적 표시, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량 (범위 포함)은 0.1의 증가량으로 (+) 또는 (-)로 다양하다. 모든 수치적 표시에 "약"이라는 용어가 선행된다고 항상 명백히 언급되지는 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 기재된 시약은 단지 설명적이며 이러한 등가물이 당업계에 공지되었다고 항상 명백히 언급되지는 않는다는 것이 이해되어야 한다.
"증폭"은 표적 핵산 서열의 다중 카피를 생성하는 프라이머 및 핵산 폴리머라제를 사용한 핵산 증폭 절차를 지칭한다. 이러한 증폭 반응은 당업자에게 공지되어 있으며, 중합효소 연쇄 반응 (PCR, 미국 특허 제4,682,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호 참조), RT-PCR (미국 특허 제5,322,770호 및 제5,310,652호 참조), 리가제 연쇄 반응 (LCR, EP 0 320 308 참조), NASBA 또는 유사한 반응, 예를 들어 미국 특허 제5,399,491호에 기재된 TMA 및 gap LCR (GLCR, 미국 특허 제5,427,202호)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 핵산 표적이 RNA일 경우, RNA는 역전사효소를 사용하여 상보적 DNA 가닥 내로 먼저 카피될 수 있다 (미국 특허 제5,322,770호 및 제5,310,652호 참조). "앰플리콘"은 증폭 절차를 사용하여 합성된 핵산을 지칭한다.
"항원"이라는 용어는 당업계에 널리 이해되어 있으며, 면역원성인 물질, 즉 면역원을 포함하며, 면역원 또는 항원의 임의의 다양한 여러 가지 제제를 포함한다. "항원 제시 세포 (APC)"라는 용어는 면역계의 특이적 효과기 T 세포에 의해 인지가능한 항원-MHC 복합체의 형태인 1종 이상의 항원을 제시할 수 있는 세포의 부류를 지칭한다. APC로는 대식세포, B-세포 및 수지상 세포, 예를 들어 미성숙 수지상 세포, 성숙한 수지상 세포, 형질세포형 수지상 세포 및 랑게르한스 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 조합의 임의의 필수적으로 유의한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법, 생물학적 완충제 및 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 인산염 완충 염수, 보존제 등으로부터의 추적성 오염물을 배제하지 않을 것이다. 프라이머 및 참조 올리고뉴클레오티드의 내용에서 사용될 경우, "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 프라이머가 참조 뉴클레오티드의 5' 말단에 10개 초과의 추가의 뉴클레오티드 잔기, 및 참조 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 10개 초과의 추가의 뉴클레오티드 잔기를 갖지 않는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 서열 X의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라이머는 서열 X의 5' 말단에 0 내지 10개의 추가의 뉴클레오티드, 및 서열 X의 3' 말단에 1 내지 10개의 추가의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 바람직하게는, 참조 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라이머는 참조 올리고뉴클레오티드의 각각의 5' 및 3' 말단에 5, 6, 7, 8 또는 9개 이하의 추가의 뉴클레오티드를 갖는다. 가장 바람직하게는, 참조 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라이머는 참조 올리고뉴클레오티드의 각각의 5' 및 3' 말단에 1, 2, 3 또는 4개 이하의 추가의 뉴클레오티드를 갖는다.
본원에 사용된 서열 X, 서열 Y 및 서열 Z로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라이머를 포함하는 조성물은 각각의 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단 상에 0 내지 10개의 추가의 뉴클레오티드를 갖는 서열 X, 서열 Y 및 서열 Z의 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 조성물 자체가 이러한 프라이머를 포함하며, 또한 추가의 요소를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "상응하는 폴리펩티드"는 병원체 유전자의 상이한 대립유전자 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다. 가설적인 예에서, 바이러스의 균주 X는 각각 폴리펩티드 A, B, C 및 D를 코딩하는 4개의 유전자 a, b, c 및 d를 갖는다. 바이러스의 균주 Y는 각각 폴리펩티드 A', B', C' 및 D'를 코딩하는 a', b', c' 및 d'로 표시된 동일한 4개의 유전자의 상이한 대립유전자를 코딩한다. 따라서, A 및 A'는 상응하는 폴리펩티드이며, B 및 B'는 상응하는 폴리펩티드, 등이다. 폴리펩티드라는 용어는 전장 단백질 뿐만 아니라 그의 단편 둘다를 지칭한다.
본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 진핵생물의 게놈 DNA로부터 유래될 경우, 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발현에 필요한 조절 요소는 RNA 폴리머라제에 결합하는 프로모터 서열 및 리보솜 결합을 위한 번역 개시 서열을 포함한다. 예를 들어, 박테리아 발현 벡터는 lac 프로모터 및 전사 개시를 위한 프로모터와 같은 프로모터, 리보솜 결합을 위한 샤인-달가노 서열, 및 번역의 개시를 위한 시작 코돈 AUG를 포함할 수 있다 ([Sambrook et al. (1989)] 상기 문헌). 유사하게, 진핵세포 발현 벡터는 RNA 폴리머라제 II에 대한 이종성 또는 상동성 프로모터, 하류 폴리아데닐화 신호, 시작 코돈 AUG, 및 리보솜의 분리를 위한 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 상업적으로 수득될 수 있거나 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 일반적으로 벡터의 구축에 대해 하기 본원의 방법에 기재된 서열에 의해 조립될 수 있다.
"유전적으로 변형된"이라는 용어는 외래 유전자 또는 핵산 서열을 함유하고/거나 발현하여, 다시 세포 또는 그의 조상의 유전자형 또는 표현형을 변형시키는 것을 의미한다. 다시 말하면, 이는 세포의 내인성 뉴클레오티드에 대한 임의의 추가, 결실 또는 붕괴를 지칭한다.
"HIV RNA"는 게놈 HIV RNA 및 HIV mRNA 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 의해 제조된 HIV 앰플리콘의 전사에 의해 생성된 RNA를 의미한다.
"HIV 변이체" 또는 "HIV의 변이체" 또는 "HIV 균주"는 HIV-I 및 HIV-2, HIV-I 군 M, N 및 O, HIV-I 아형 A1, A2, B, C, C, F1, F2, G, H, J 및 K를 비롯한 모든 HIV 아형 (분기군), 분기군의 변이체, 그의 모든 유사종 및 순환 재조합 형태를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 "균주"라는 용어는 단일 뉴클레오티드에 의해 상이한 2개의 HIV 단리체가 HIV의 2개의 상이한 "균주"로 고려될 것으로 사용된다. 군이라는 용어는 HIV-I 계통 M, N 및 O를 지칭하는데 통상적으로 사용된다. 아형이라는 용어는 군 내의 주요 분기군을 지칭하는데 사용된다. 아형 내의 추가의 서열 변이성이 있다. 순환 재조합 형태 (CRF)는 HIV 유행병에 중요한 역할을 하는 재조합 계통을 기재한다. CRF 구성원은 유사한 또는 동일한 모자이크 구조를 공통적으로 공유하며, 즉 이들은 동일한 재조합 사건(들)로부터 내려간다. HIV의 순환 재조합 형태는 하기를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
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상기 CRF의 기재 및 지도 및 HIV 서열에 대한 링크는 Wv.lanl.gov/content/Hv-db/CRFs/CRF.html에서 발견할 수 있다.
유사하게, "병원체 변이체" 또는 "병원체의 변이체" 또는 "병원체 균주" 또는 "병원체의 균주"는 병원체의 모든 변이체를 지칭하며, 환자에 존재할 수 있는 변이체, 돌연변이체 및 병원체의 재조합을 포함한다. 본원에 사용된 단일 뉴클레오티드에 의해 상이한 병원체의 2가지 변이체는 병원체의 2가지 상이한 균주로 간주된다.
본원에 사용된 "생체내" 유전자 전달, 유전자 전달, 유전자 요법 등은 인간 또는 비-인간 포유동물과 같은 유기체의 신체 내로의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 직접적 도입을 지칭하는 용어이며, 그에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드는 유기체에 생체내로 도입된다.
"단리된"이라는 용어는 구성요소, 세포로부터 분리되고, 다르게는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편이 자연에서 통상적으로 관련되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 대해, 단리된 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 염색체와 관련된 5' 및 3' 서열로부터 분리된 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편은 그의 천연 발생 반대물로부터 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편은 부피당 분자의 농도 또는 수가 그의 천연 발생 반대물의 것보다 초과로 "농축되거나" 덜 "분리된" 그의 천연 발생 반대물로부터 구별가능하다. 그의 일차 서열에서 또는 예를 들어 그의 당화 패턴에 의해 천연 발생 반대물과 상이한 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편은 그의 단리된 형태에 존재할 필요가 없는데, 이는 이것이 그의 일차 서열에 의해, 또는 별법으로 그의 당화 패턴과 같은 또다른 특징에 의해 그의 천연 발생 반대물로부터 구별가능하기 때문이다. 본원에 개시된 각각의 본 발명에 대해 명백히 언급되지는 않았지만, 하기 및 적절한 조건하에서 개시된 각각의 조성물에 대한 상기 실시양태의 전부는 본 발명에 의해 제공된다. 따라서, 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드는 단리된 천연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 별개의 실시양태로서 제공된다. 박테리아 세포에서 생산된 단백질은 천연에서 생산된 진핵 세포로부터 단리된 천연 발생 단백질로부터의 별개의 실시양태로서 제공된다. 항원 제시 세포와 같은 단리된 포유동물 세포는 포유동물에서 그의 정상적인 위치로부터 분리되거나 제거된다.
"항원 제시 세포 (APC)의 로딩"은 항원, 그의 에피토프, 펩티드, 단백질, 또는 상기를 코딩하는 핵산의 APC에 의한 하적을 지칭한다. APC는 시험관내에서 또는 동일계내에서 로딩될 수 있다.
"mRNA"는 번역가능한 RNA이다. mRNA는 리보솜 결합 부위 및 시작 코돈을 함유할 것이다. 바람직하게는, mRNA는 또한 5' 말단, 정지 코돈 및 폴리A 꼬리를 함유할 것이다.
"다중 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)"은 2 이상의 표적 서열이 프라이머의 다중 상을 사용하여 단일 증폭 반응에서 동시에 증폭되는 PCR의 변이체이다. 비-제한적 예로서, 다중 증폭은 상이한 유전자, 단일 유전자의 상이한 대립유전자 및 단일 유전자의 상이한 단편의 증폭 반응을 포함한다. 다중 PCR 조건의 최적화 방법은 문헌 [Abravaya et al. J Clinical Microbiol 2000 38:716-723]; [Kremer at al. J Clin Microbiol 2004 42:3017-3022]; [Garcia-Canas et al. Electrophoresis 2004 25:2219-2226]; 및 [Markoulatos et al. J Clin Lab Anal 2003 17:108-12] (이들의 내용은 참고로 도입됨)에 개시되어 있다.
본원에 사용된 "병원체"는 임의의 질병 유발 유기체 또는 바이러스, 및 그의 약독화된 유도체를 지칭한다.
"제약 조성물"은 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 적합하게 하는 불활성 또는 활성의 담체와 활성 성분의 조합물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 인산염 완충 염수 용액, 물, 및 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 종류의 습윤제와 같은 에멀젼과 같은 임의의 표준 제약 담체를 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해서는 문헌 [Martin REMINGTON'S PHARM. SCL, 18th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990))]을 참조한다.
"유효량"은 유효 이익 또는 목적하는 결과에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"라는 용어는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 그의 유사체를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 예를 들어 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보솜, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 또한, 천연 핵산 분자에 대해, 본 발명의 핵산 분자는 또한 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
"프라이머"는 증폭 반응에 사용될 수 있는, 길이가 9 내지 150 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 서열 X로 본질적으로 이루어진 프라이머는 서열 X의 5' 말단 상에 10개 이하의 추가의 뉴클레오티드, 및 서열 X의 3' 말단 상에 10개 이하의 추가의 뉴클레오티드를 가질 것이다. "전방향 프라이머"는 센스 가닥 또는 번역된 mRNA의 서열에 상응하는 핵산 내로 RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 있는 프라이머를 의미한다. "역방향 프라이머"는 센스 가닥 또는 번역된 mRNA에 상보적인 핵산 내로 RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 있는 프라이머를 의미한다. "프라이머 쌍"은 증폭 반응에 사용되어 앰플리콘을 생성할 수 있는 전방향 및 역방향 프라이머를 지칭한다.
"RNA"라는 용어는 임의의 길이의 리보뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하며, 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 유사체는 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 결합된다. "RNA"라는 용어는 예를 들어 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 일차 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, 시험관내 전사체, 시험관내에서 합성된 RNA, 분지된 폴리리보뉴클레오티드, 임의의 서열의 단리된 RNA 등을 포함한다.
서열 사이의 상동성 또는 서열 동일성 (본원에서 호환적으로 사용되는 용어)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 동일률 (％)을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적으로 정렬한다 (예를 들어, 갭을 제1 및 제2 아미노산 중 하나 또는 둘다, 또는 최적 정렬을 위한 핵산 서열에 도입할 수 있고, 비-상동성 서열을 비교 목적으로 무시할 수 있음). 상이한 길이의 2개의 프라이머 또는 후보 프라이머의 정렬시, 보다 짧은 프라이머의 길이는 보다 긴 서열의 길이의 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％, 80％, 90％, 100％ 이상이어야 한다. 프로모터 프라이머 (예를 들어 T7 프로모터 프라이머) 및 폴리 dT 프라이머 사이의 동일률 (％)를 비교하기 위한 목적으로, 비-코딩 영역을 비교로부터 제외한다. 비-코딩은 오픈 리딩 프레임 밖의 영역을 의미한다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하다 (본원에 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등함). 2개의 서열 사이의 동일률 (％)은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일률 (％)의 결정은 수학적 알고리듬을 사용하여 달성될 수 있으며, 바람직한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일률 (％)은 블로스섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 길이 중량을 사용한 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램 (월드와이드웹 상에서 gcg.com에서 이용가능함)으로 도입된 니들맨 및 운쉬 ([J. Mol. Biol. (1970) 48:444-453]) 알고리듬을 사용하여 측정된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일률 (％)은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램을 사용하여 측정된다. 파라미터 (및 실시자가 무슨 파라미터가 분자가 본 발명 내인지 결정하는데 적용되어야 하는지를 확신하지 못하는 경우 사용되어야 할 것)의 특히 바람직한 세트는 12의 갭 오픈 패널티, 4의 갭 연장 패널티, 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티를 갖는 블로스섬 62 스코어링 매트릭스를 사용하는 것이다.
2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일률 (％)은 PAM 120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용한 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)으로 도입된 이. 마이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리듬을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 공개 데이타베이스에 대한 조사를 수행하기 위해, 예를 들어 다른 족 구성원 또는 관련된 서열을 확인하기 위한 "의문 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 조사는 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 조사를 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행하여 본 발명의 병원체 핵산 분자 및 프라이머에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 조사를 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행하여 본 발명의 EPLIN 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭화 정렬을 수득하기 위해, 갭화 BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) 핵산 Res., 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭화 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
HIV와 같은 급속히 돌연변이되는 병원체는 백신화기에 어려운 표적을 제시한다. 병원체에 대한 이전의 백신화 전략은 공통적인 균주 또는 컨센서스 서열에 대해 지정되었다. 그러나, 상기 전략은 급속하게 돌연변이되거나 재조합되는 병원체에 대한 예방 또는 치료 효과를 제공하는데 실패했으며, 병원체 표적은 고도로 가변성일 수 있다. 자가 HIV 백신, 특히 환자를 감염시키는 모든 변이체를 동시에 표적화할 수 있는 것과 같은 자가 병원체 백신의 개발은 치료제의 새로운 패러다임을 제공한다. 개체에서 특정 병원체 항원 제시에 대한 면역 반응을 지시하는 백신으로 병원체 감염된 개체를 치료하는 능력은, 개체가 바이러스 청소를 매개하거나 바이러스 로딩을 저해하는 능력이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 지금까지 나타난 이전의 HIV 백신과 같은 컨센서스 항원에 대해 지정된 백신보다 유용한 것으로 입증되어야 한다.
본 발명의 목적은 개체 내에 존재하는 병원체 변이성을 상쇄하는 개인화된 세포 또는 핵산 백신을 사용한 병원체의 환자-특이적 백신화 전략을 제공하는 것이다. 상기 전략은 감염된 대상체로부터의 병원체 핵산의 증폭, 및 환자-특이적 백신에서의 이러한 증폭된 병원체 물질 또는 그의 유도체의 용도에 의존한다. 증폭된 병원체 핵산 또는 그의 유도체 (예를 들어 시험관내 전사 생성물, 시험관내 전사/번역 생성물, 또는 이러한 증폭된 핵산을 함유하는 벡터)는 자가 또는 동종간 핵산 백신으로서 사용될 수 있거나, 수지상 세포 (DC)와 같은 자가 항원 제시 세포 (APC) 내로 로딩될 수 있고, 그 후 환자에게 투여된다. 또한, 증폭된 생성물은 감염된 개체에 존재하는 병원체 변이체를 확인하고 치료 개입의 효과를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 다른 핵산 증폭 기술은 관심의 특정 병원체 항원을 코딩하는 DNA를 수득하는 편리하고 효과적인 방법이다. 그러나, 일부 병원체, 특히 HIV와 같은 레트로바이러스 병원체의 높은 돌연변이 빈도 때문에, 이는 본 발명 이전에는 개체 환자에 존재할 수 있는 병원체 변이체의 표적화된 영역을 신뢰할 만하게 증폭할 수 있는 PCR 프라이머를 설계하는 중요한 기회였다. 예를 들어, 코딩 영역을 플랭킹하는 HIV 서열에 상당히 적은 이종성이 있다 하더라도, 절대적으로 보존된 영역은 관심의 각각의 유전자에 대한 단일 유니버셜 프라이머 쌍의 설계를 가능하게 하도록 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심의 병원체 유전자의 핵산 증폭을 위한 전방향 및 역방향 항원-특이적 프라이머의 풀(pool) 또는 그의 일부분을 사용하여, 감염된 개체에 존재하는 병원체의 대부분 또는 전부의 균주가 하나 이상의 전방향 및 역방향 프라이머와 반응하여 다양한 표적 서열의 증폭을 허용하도록 한다.
본 발명은 프라이머 어닐링 부위에서 병원체 핵산 사이의 변이성을 상쇄하는 다중 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 사용한 병원체 핵산의 균주-독립성 핵산 증폭 방법을 제공한다. 상기 방법을 사용하면, 감염된 개체에 존재하는 병원체의 본질적으로 모든 변이체로부터의 모든 또는 표적화된 부분을 증폭할 수 있다. 개체에 존재하는 병원체 변이체의 전부 또는 대부분의 증폭은 감염된 개체에 존재하는 변이체를 확인하고 정량화하는데 사용될 수 있는 앰플리콘을 생성한다. 이러한 앰플리콘 또는 그의 유도체는 병원체 감염을 치료하고/거나 감염된 개체에 존재하는 병원체 변이체를 확인하는 세포-기재 백신 또는 핵산 백신에 사용될 수 있다. 상기 증폭된 생성물 (앰플리콘)은 직접적으로 사용되거나, 동일계내 또는 시험관내에서 APC, 바람직하게는 자가 APC 내로 로딩하기 위한 번역가능한 RNA로 전환될 수 있다. 전사체로부터 제조된 앰플리콘 및 시험관내 전사체는 핵산 백신으로서 사용될 수 있다. 이러한 시험관내 전사체로부터 제조된 시험관내 번역된 폴리펩티드는 폴리펩티드 백신으로서 및 APC의 로딩용으로 사용될 수 있다.
병원체 핵산의 균주-독립성 증폭의 중요한 측면은 프라이머 및 증폭 조건의 선택이다. 본 출원인은 병원체 핵산의 상이한 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 선택 방법을 발견하였다. 균주-독립성 방식으로 HIV와 같은 가변성 병원체로부터의 선택된 표적 항원을 증폭하기 위해, PCR 프라이머의 풀을 전략적으로 선택하여 의도된 표적의 신뢰할 만한 증폭 및 존재하는 변이체의 동시 공동-증폭을 보증할 수 있다.
증폭을 위한 표적에 대한 자가 항원의 수 및 선택은 2가지 주요 인자에 대해 서술될 수 있다: (1) 표적 유전자의 실질적인 영역은 관리가능한 복잡성을 갖는 프라이머의 풀을 사용한 핵산 증폭을 따라야 하며, (2) 바람직하게는, 표적 항원의 발현은 DC와 같은 표적 APC의 생물학에 부정적인 영향을 주지 않는다. 총 병원체 핵산 이외에 병원체 핵산의 특정 영역을 증폭함으로써, 대부분의 면역원성 단편을 코딩하는 영역을 선택하고, 면역계에 대한 부정적인 효과를 가질 수 있는 영역을 회피할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포의 억제에 관여하는 HIV nef 유전자의 일부분은 억제를 담당하는 nef의 영역을 증폭하지 않는 프라이머를 선택함으로써 회피될 수 있다.
병원체의 공지된 변이체에 상응하는 다중 프라이머는 표적 좌위에 혼성화하기 위해 설계될 수 있다. 그러나, 프라이머 복잡성을 관리하기 위해, 먼저 공지된 병원체 변이체 사이의 보존된 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것이 유용하다. 병원체 핵산의 보존된 영역에 혼성화되는 프라이머의 선택은 개체에 존재하는 병원체의 모든 또는 대부분의 변이체의 증폭을 보증하는데 필요한 프라이머의 수를 감소시킨다. 프라이머 선택에서 또다른 중요한 고려사항은 공지된 변이체 어닐링 부위에 프라이머 서열의 3' 반에서 미스매치가 회피되거나 최소화되어야 하지만, 3' 말단 미스매치된 T는 전형적으로 증폭에 나쁜 영향을 갖지 않는다는 점이다. 잔류하는 3' 미스매치는 어닐링 온도의 저하에 의해 상쇄될 수 있다. 프라이머 서열의 5' 반의 미스매치는 내성이며, 어닐링 온도의 저하에 의해 상쇄될 수 있다. 증폭 반응 조건은 비-특이적 증폭을 회피하면서 감염된 개체에 존재하는 모든 병원체 변이체의 증폭을 허용하도록 최적화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 및/또는 방법을 사용한 증폭은 개체에 존재하는 병원체의 모든 변이체의 확인 및 정량을 가능하게 한다. 반대로, 이전의 당분야의 방법은 전형적으로 단일 병원체 변이체가 확인되었기 때문에 존재하는 병원체의 양을 과소평가하였다.
HIV의 다중 변이체를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 선택에 대한 상기 및 하기 실시예에 기재된 방법은 임의의 병원체의 다중 변이체를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 선택하는데 적용가능하다. 본원에 기재된 프라이머 선택 방법은 전방향 프라이머 어닐링에 대한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링에 대한 제2 영역 (여기서, 상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (여기서, 하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 프라이머는 감염된 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 핵산을 증폭하는 상기 방법에 의해 설계된다. 그 후, 증폭된 핵산은 동일한 병원체 감염된 포유동물을 치료하는 자가 핵산 백신에 사용될 수 있다. 별법으로, 증폭된 핵산은 병원체의 의해 감염된 여러가지 포유동물을 치료하는 동종간 핵산 백신으로서, 또는 감염을 예방하는 예방 백신으로서 사용될 수 있다. 예방 용도를 위해, APC 로딩된 핵산 백신 또는 핵산은 하나 이상의 개체로부터 단리되거나 유래된 병원체 핵산으로부터 제조된 앰플리콘을 사용하여 제조될 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 (a) 병원체의 제1 및 제2 균주로부터의 폴리뉴클레오티드를 조합하여 혼합물을 형성하고; (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터의 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 증폭하는 단계를 포함하는, 병원체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법을 제공한다. 예를 들어, 제1 및 제2 균주로부터의 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 병원체 감염된 개체, 1종 이상의 병원체 배양물, 클로닝된 병원체 또는 클로닝된 병원체 핵산으로부터 수득될 수 있다. 이러한 앰플리콘의 시험관내 전사에 의해 생성된 앰플리콘 및 RNA는 핵산 백신으로서 및 항원 제시 세포의 로딩에 유용하다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 핵산 백신을 상기 병원체-감염된 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 감염의 치료 방법을 제공한다.
유사하게, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산을 제약상 허용되는 담체와 배합하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신의 제조 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC)를 제공한다. 가설적인 예에서, 바이러스는 폴리펩티드 A, B 및 C를 코딩하는 총 3개의 유전자, a, b 및 c를 갖는다고 가정한다. 상기 바이러스는 급속하게 돌연변이되며, 바이러스의 2가지 균주는 감염된 환자로부터 단리된 균주 X 및 Y이다. 균주 X는 폴리펩티드 A', B' 및 C를 코딩하는 대립유전자 a', b' 및 c'를 갖는다. 균주 Y는 a*, b* 및 c*로 표시되며 변이체 폴리펩티드 A*, B* 및 C*를 코딩하는 동일한 유전자의 상이한 대립유전자를 갖는다. 상기 구체화된 바와 같이, 상기 항원 제시 세포는 병원체의 다중 균주 (예를 들어 바이러스의 균주 X 및 Y)로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하지만, 1종 이상의 병원체 폴리펩티드는 임의의 균주를 제시하지 않는다. 이는 APC가 3개의 유전자 중 하나 또는 2개의 각각의 대립유전자를 제시하는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, APC는 A', A*, B' 및 B*를 코딩하지만, C 또는 C*는 코딩하지 않는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 여기서, 임의의 균주로부터 제시되지 않는 병원체 폴리펩티드는 C 또는 C*가 제시되지 않는 폴리펩티드 C이다. 본원에 사용된 폴리펩티드라는 용어는 전장 단백질 및 그의 단편 둘다를 지칭한다. APC는 A', A*, B', B*, 및 C 및 C*의 상응하는 단편을 함유할 수 있지만, C 및 C*의 전부는 함유하지 않는다. 모든 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하는데 비해 상기 접근법의 이점은 감염성 병원체의 재구축을 회피한다는 점이다. 추가의 이점은 환자에게 또는 항원 제시 세포에게 유해할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 특이적으로 회피될 수 있다는 점이다.
본 발명의 핵산 백신은 포유동물에게 투여하기에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 영장류이며, 가장 바람직하게는 인간이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 백신은 병원체 폴리뉴클레오티드가 유래된 특정 포유동물에게 투여된다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 병원체 폴리뉴클레오티드는 감염된 환자로부터 단리되며, 핵산 백신은 상기 환자에게 투여된다.
본 발명의 핵산은 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 RNA이며, 가장 바람직하게는 핵산은 mRNA이다. 본 발명의 핵산 백신은 이들이 투여되는 포유동물에서 1종 이상의 세포 유형에서 발현될 수 있어야 한다. 발현은 핵산이 직접적으로 번역될 수 있거나 (예를 들어 번역가능한 RNA), 번역가능한 mRNA를 생성하도록 전사될 수 있고/거나 (예를 들어 프로모터 및 시작 코돈에 이어진 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA), 도입되는 포유동물 세포의 게놈 내로 통합되어 전사될 수 있음 (예를 들어 선형 DNA, DNA 벡터, RNA 바이러스 벡터 및 DNA 바이러스 벡터)을 의미한다. 번역가능한 mRNA는 생체내 전사 (일차 또는 프로세싱된 전사체로서)에 의해, 또는 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신에 사용되는 핵산은 RNA이며, 가장 바람직하게는 mRNA이다.
병원체라는 용어는 질환의 병인에 관여하는 임의의 바이러스 또는 유기체 및 그의 약독화된 유도체를 지칭한다. 이러한 병원체로는 박테리아, 원충, 진균 및 바이러스 병원체, 예를 들어 헬리코박터(Helicobacter), 예를 들어 헬리코박테 파일로리(Helicobacter pylori), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 캄필로박터(Campylobacter), 다양한 미코박테리아, 예를 들어 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라(Brucella) 종, 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 스타필로코커스(Staphylococcus), 예를 들어 에스. 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 클로스트리듐(Clostridum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 플라스모듐(Plasmodium), 레이쉬마니아(Leishmania), 트리파노소마(Trypanosoma), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), HCV, HPV, CMV, HTLV, 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 1형, 단순 헤르페스 바이러스 2형, 코로나바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스 및 풍진 바이러스를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법은 바이러스 병원체, 바람직하게는 레트로바이러스 병원체, 가장 바람직하게는 HIV 및 HCV와 같은 매우 가변성인 병원체로부터의 핵산의 증폭에 특히 유용하다.
병원체의 변이체 또는 균주는 병원체의 임의의 유도체를 지칭한다. 이러한 유도체는 병원체의 돌연변이, 재조합 또는 재조합 조작에 의해 발생할 수 있다 (또는 발생되었을 수 있다). 예를 들어 HVF의 변이체는 공지된 및 비-확인된 HIV 변이체를 포함하며, HIV-I 군 M, N 및 O, HIV-I 분기군 A1, A2, B, C, C, F1, F2, G, H, J 및 K를 비롯한 모든 HIV 아형 또는 분기군, 분기군의 변이체, HIV-2의 모든 변이체, 및 그의 모든 재조합체 및 유사종을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
"병원체의 다중 변이체" 또는 "병원체의 다중 균주"는 감염된 개체에 존재하는 병원체의 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 병원체의 다중 변이체는 개체에 동시에 또는 별개로 도입될 수 있다. 별법으로, 다중 병원체 변이체는 돌연변이 및/또는 재조합을 통해 개체 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 병원체는 레트로바이러스, 바람직하게는 HIV이다. 하나의 감염된 개체에 존재하는 병원체 (HIV)의 다중 변이체는 상기 개체에 존재할 수 있는 임의의 HIV를 포함할 수 있으며, 이러한 경우, HIV의 다중 변이체는 HIV-I 군 M, N 및 O의 임의의 또는 모든 군을 비롯한 HIV-I, 및 그의 아형, 분기군 및 유사-변이체, 뿐만 아니라 HIV-2 및 그의 변이체, 및 아직 확인되지 않은 HIV의 부류를 포함한다.
항원은 1종 이상의 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 증폭된 핵산은 하나 이상의 오픈 리딩 프레임, 또는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임의 일부분을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV이고, 증폭된 핵산은 감염된 개체에 존재하는 HIV의 각각 또는 적어도 대부분의 변이체로부터의 1종 이상의 HIV 폴리펩티드의 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 그의 일부분을 코딩한다. 바람직한 HIV 폴리펩티드는 gag, rev, nef, vpr 및 env 및 그의 단편 또는 에피토프이다. 바람직한 vpr의 단편 (참조 서열로서 NC 001802를 사용함)은 뉴클레오티드 5105 내지 5320 (vpr 아미노산 잔기 1 내지 72를 코딩함); 5138 내지 5320 (vpr 아미노산 잔기 12 내지 72를 코딩함); 5105 내지 5165 (vpr 아미노산 잔기 1 내지 20을 코딩함) 및 5138 내지 5165 (vpr 아미노산 잔기 12 내지 20을 코딩함); 및 다른 HIV 변이체의 상응하는 단편을 코딩한다. 추가의 바람직한 vpr 단편은 잔기 25 내지 40, 29 내지 37, 30 내지 38, 31 내지 39, 31 내지 50, 34 내지 42, 41 내지 49, 52 내지 62, 53 내지 63, 55 내지 70, 59 내지 6 및 62 내지 70이다. 추가의 단편 및 에피토프는 인터넷 http 사이트 상에서 이용가능한 HIV 분자 면역학 데이타베이스에서 발견할 수 있으며, 그 내용은 참고로 도입된다.
병원체 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 병원체 항원 또는 에피토프를 코딩하는 핵산의 증폭을 위한 주형 또는 주형의 공급원이다. 병원체 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 비-제한적 예로서, 병원체 폴리뉴클레오티드는 병원체 게놈과 같은 DNA, DNA 벡터 또는 단편, 또는 병원체의 숙주의 게놈 내로 통합된 병원체 DNA일 수 있다. 병원체 폴리뉴클레오티드가 DNA일 경우, 이는 본 발명의 방법에 따른 증폭을 위한 주형으로서 직접적으로 사용될 수 있다.
병원체 폴리뉴클레오티드는 또한 스플라이싱되거나 비-스플라이싱될 수 있는 병원체 게놈 (예를 들어 레트로바이러스 게놈) 또는 병원체 mRNA의 형태인 RNA일 수 있다. 예를 들어 HIV의 경우, 핵산은 숙주 게놈의 통합된 바이러스 DNA에 상응하거나 숙주 게놈 내로 바이러스 통합 전의 세포에 존재하는 HIV cDNA에 상응하는 DNA일 수 있다. HIV RNA는 바이러스 복제 동안 바이러스 입자 또는 숙주 세포로부터 단리된 바이러스 RNA 게놈의 형태일 수 있으며, 또한 스플라이싱되거나 비-스플라이싱된 HIV mRNA의 형태일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 병원체 RNA는 HIV 비리온으로부터 단리된 게놈 RNA이다. 병원체 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, 이는 역방향으로 전사되어 cDNA를 생성할 수 있고, 이는 그 후 핵산 증폭용의 주형으로서 기능할 수 있다.
바람직하게는, 병원체 폴리뉴클레오티드는 감염된 개체에 존재하는 다중 병원체 변이체로부터의 것이거나, 그로부터 유래된다. 본 내용에서, "으로부터 유래된"은 핵산이 병원체 또는 병원체 핵산을 함유하는 세포(들)로부터 적어도 부분적으로 정제되거나, 핵산이 병원체 핵산으로부터 증폭된 것을 의미한다. 개체에 존재하는 다중 병원체 변이체로부터 핵산을 유도함으로써, 생성된 백신은 개체에 존재하는 병원체의 모든 변이체를 잠재적으로 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 선택된 프라이머를 사용한 핵산 증폭에 의해 생성된 일차 앰플리콘은 병원체 항원 또는 그의 에피토프를 코딩하는 DNA를 포함할 것이다. 일차 앰플리콘은 추가의 변형 없이 핵산 백신에 사용될 수 있다. 별법으로, 일차 앰플리콘은 핵산 백신, 바이러스 백신에 사용하기 위한, 또는 APC 내로 로딩하기 위한 발현 카세트 또는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 일차 DNA 앰플리콘은 시험관내 전사용의 주형으로서 기능하도록 변형된다.
주형 DNA 서열 (예를 들어 PCR 생성물)을 전사하기 위해, 주형은 RNA 폴리머라제 결합 부위 또는 프로모터를 함유해야 한다. 또한, 진핵 세포에서 효과적인 전사를 위해, 전사된 RNA는 바람직하게는 5' 캡, ATG 번역 개시 코돈을 포함하는 코자크 서열 및 3' 말단에 폴리아데닐화된 서열을 함유한다. 바람직하게는, 전사된 RNA는 또한 번역 정지 코돈 (UAA, UAG 또는 UGA)을 함유한다. 프로모터, 코자크 서열, 시작 및 정지 코돈과 같은 상기 전사 및 번역 신호의 일부는 표적 병원체 핵산의 주형에 존재할 수 있으며, PCR 또는 다른 증폭 반응 동안 증폭될 수 있다. 별법으로, 상기 서열은 증폭의 임의의 단계에 사용되는 전방향 및 역방향 프라이머에 포함될 수 있다.
의도되는 백신이 동일계내 투여를 위한, 또는 APC 내로의 로딩을 위한 mRNA 백신일 경우, 5' 네스팅된 프라이머에 함유되는 프로모터 서열은 시험관내 전사에 적합해야 한다. 시험관내 전사에 적합한 프로모터 및 시험관내 전사 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 비-제한적 예로서, 바람직한 프로모터는 T7 프로모터 및 SP6 프로모터와 같은 시판되는 RNA 폴리머라제에 상응하는 것들이다. 다른 유용한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 의도되는 백신이 표적 세포 내에서 전사용으로 의도되는 핵산을 함유할 경우, 5' 프라이머 서열에 함유되는 프로모터는 의도되는 표적 세포에서 활성인 것이어야 한다. 또한, 백신이 표적 세포 내에서 전사용으로 의도되는 핵산을 함유할 경우, 프로모터 및 번역 개시 신호는 전방향 프라이머 내로 혼입된 주형으로부터, 또는 발현 카세트 내로 앰플리콘을 삽입함으로써 증폭될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 시판되는 시험관내 전사 키트를 사용한 효과적인 전사를 허용한다. 시험관내 전사 및 번역 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 U.S. 2003/0194759 참조). 전형적인 시험관내 전사 반응에서, DNA 주형은 모든 4개의 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 m7G(5')ppρ(5')G와 같은 캡 디뉴클레오티드 또는 ARCA와 같은 캡 유사체의 존재하에서 박테리오파지 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사된다.
프로모터 및 번역 개시 신호는 일차 증폭 동안 사용되는 프라이머에, 또는 후속 라운드에 사용되는 네스팅된 프라이머에 포함될 수 있다. 증폭의 임의적인 이차 라운드에 사용되는 프라이머용의 어닐링 표적인 일차 증폭 반응에 사용되는 것과 동일할 수 있거나, 이는 일차 앰플리콘에 대해 부위 내부 ("네스팅")일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 증폭의 일차 또는 이차 (바람직하게는 이차) 라운드에 사용되는 전방향 프라이머는 프로모터 (예를 들어, T7 프로모터)를 코딩하는 5' 비혼성화 영역 ("오버행"), 및 일차 앰플리콘의 안티센스 가닥에 상보적인 3' 영역을 포함할 것이다. 전형적으로, 전방향 프라이머는 또한 코자크 서열, 바람직하게는 최적화된 코자크 서열, 예를 들어 염기 5' CCACCATGG (서열 59)를 함유할 것이며, 밑줄친 ATG는 번역 개시 코돈이다. ATG 시작 코돈을 포함하는 코자크 서열은 이러한 서열이 일차 앰플리콘에 존재하는가에 따라 전방향 프라이머의 5' 오버행 영역내, 또는 프라이머의 3' 어닐링 영역내일 수 있다. 또한, 일차 앰플리콘이 최적 코자크 서열보다 적을 경우, 이는 완전히 상보적인 코자크 서열은 아니지만 최적성을 갖는 전방향 프라이머를 사용함으로써 최적화될 수 있다. 바람직하게는, 전방향 프라이머의 3' 위치는 개시자 ATG 코돈 또는 일차 증폭 동안 증폭된 대부분의 5' 코딩 서열의 바로 하류 서열에 대해 본질적으로 상보적일 것이다. 역방향 프라이머는 바람직하게는 시험관내 전사 동안 폴리아데닐화를 위한 주형으로서 기능할 그의 5' 말단에 5' 폴리T 오버행을 함유한다. 역방향 프라이머의 3' 반은 일차 증폭 반응에서 단리된 센스 서열에 대해 상보적일 것이다. 적절한 번역 정지 코돈이 일차 앰플리콘에 존재하지 않을 경우, 이는 역방향 프라이머의 5' 오버행 부분에 포함될 수 있다. 그 후, 상기 기재된 것과 같은 프라이머를 사용한 증폭에 의해 수득된 이차 앰플리콘은 m7G 캡 또는 ARCA와 같은 그의 유사체의 존재하에서 시험관내 전사 반응에서 주형으로서 기능할 수 있다 (U.S. 2003/0194759 참조).
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 포유동물에 존재하는 변이체의 다중 변이체의 핵산을 병원체의 다중 변이체를 증폭할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하여 증폭된 병원체 DNA를 생성하고;
b. 임의로 상기 증폭된 병원체 DNA를 전사하여 병원체 RNA를 생성하고;
c. 상기 병원체 DNA 또는 병원체 RNA를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체 감염된 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
핵산 백신을 대상체에 제제화하고 전달하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Scheel et al. Eur J Immunol (2204) 34:537-547]; [Hoerr et al. (2000) Eur J Immunol 30:1-7]; [Liu et al (2002) Vaccine 20:42-48]; [Riedl et al. (2002) J Immunol 168:4951]; [Riedel et al. (2004) J Mol Med 82:144]; 미국 특허 제5,783.567호; 미국 특허 제6,603,998호; EP0880360; EP1083232 (이들의 내용은 참고로 도입됨)를 참조한다. 투여 경로는 국소 전달, 피부의 전기천공, 뿐만 아니라 피부, 피하, 진피내, 점막 및 점막내 투여 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일차 또는 이차 앰플리콘, 또는 핵산 백신으로서 시험관내 전사된 RNA를 사용하는데 대한 별법으로서, 이러한 핵산을 항원 제시 세포 내로 시험관내에서 로딩할 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 백신으로서 사용하기에 적합하다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산으로 형질감염된 항원 제시 세포를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래되고, 상기 항원 제시 세포 및 상기 병원체 핵산은 상기 포유동물로부터의 것이거나 그로부터 유래된 것인 조성물을 제공한다.
항원 제시 세포 (APC)로는 대식세포, B-세포 및 수지상 세포, 예를 들어 미성숙 수지상 세포, 성숙한 수지상 세포 및 랑게르한스 세포를 들 수 있다. 전문적인 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포 (DC)는 CD4+ 및 CD8+ T-세포 둘다에 대한 효과를 통해 세포-매개된 면역성의 자극을 위한 강력한 비히클을 제공한다 (문헌 [Banchereau 1998, Banchereau 2000]). 그의 기능에 고유하게, 이들은 MHC 부류 I 및 II 생성물 둘다를 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 제시하기 위한 항원을 효과적으로 프로세싱한다. 표면 항원 풍부화 기술을 통해 말초 혈액 또는 골수로부터 단리되거나 PBMC의 배양물로부터 수거된 수지상 세포는 특정 후보 항원으로 로딩될 수 있으며, 그 후 관련 항원(들)을 원시 또는 휴지 T-세포에 제시할 수 있다. 바람직하게는, 항원 제시 세포는 백신화될 개체에 자가성이며, 병원체 핵산은 또한 환자로부터 단리되거나 유래된다.
항원 제시 세포는 포유동물 대상체에 의해 및 그로 만들어지거나, 포유동물 대상체로부터 단리된 세포로부터 유래되며, 바람직한 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. "수지상 세포 (DC)"라는 용어는 다양한 림프양 및 비-림프양 조직에서 발견되거나 (문헌 [Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296]), 시험관내에서 수지상 세포 전구체로부터 유래된 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단을 지칭한다. 수지상 세포는 가장 강력한 APC이며, T 세포 활성화 및 증식에 필요한 신호를 제공한다. 수지상 세포는 골수 전구 세포로부터 유래되고, 말초 혈액에서 적은 수로 순환하며, 미성숙 랑게르한스 세포 또는 마지막으로 분화된 성숙한 세포로서 나타난다. 바람직한 실시양태에서, 수지상 세포는 단핵구로부터 분화된다. 항원 제시 세포 (APC)의 단리 방법 및 수지상 세포 전구체 및 성숙한 수지상 세포의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Berger et al. J Immunol Methods 2002 268:131-40], 미국 특허 출원 제20030199673호, 제20020164346호 및 제60/522,512호, 및 WO 93/20185 (이들의 내용은 참고로 도입됨)를 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 수지상 세포는 문헌 [Romani et al. (J Exp Med 1994 180:83-93)] 또는 [Sallusto et al. (J Exp Med 1994 179:1109-1118)] (이들의 내용은 참고로 도입됨)에 기재된 방법에 의해 CD 14+ 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)로부터 제조된다. 별법으로, 수지상 세포는 문헌 [Caux et al. (J Exp Med 1996 184:695-706)]의 방법에 의해 CD34+ 세포로부터 제조될 수 있다.
항원 제시 세포의 로딩 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 전기천공, 수동 하적, 리포펙션(lipofection), 양이온성 시약, 바이러스 형질도입, CaPO4 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 PCT/US05/22705 및 미국 특허 출원 제60/583,579호; 미국 특허 공개 제2003/0143743호; 미국 특허 공개 제20050008622호; 미국 특허 공개 제20040235175호; 및 미국 특허 공개 제20040214333호 (이들의 내용은 참고로 도입됨)를 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 항원 제시 세포는 병원체 폴리펩티드의 다중 균주를 코딩하는 CD40L mRNA 및 RNA 둘다로 로딩된다. 항원 제시 세포의 형질감염에 유용한 인간 CD40L cDNA, CD40L 단백질 및 바람직한 CD40L mRNA는 각각 서열 407 및 408로 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, mRNA는 서열 410의 뉴클레오티드 38 내지 877에 상응한다. 바람직하게는, mRNA는 5' 캡핑되며 폴리아데닐화된다. 바람직한 실시양태에서, 캡은 ARCA이다. 바람직한 폴리A 꼬리 길이는 50 내지 1000 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 64 내지 900 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 101 내지 600 뉴클레오티드 범위이다. 추가의 실시양태에서, 항원 제시 세포는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 시험관내 번역에 의해 제조된 폴리펩티드로 로딩된다. 병원체 폴리펩티드는 CD40L mRNA를 갖는 항원 제시 세포 내로 로딩될 수 있다. 수지상 세포는 성숙 또는 미성숙할 경우 시험관내에서 로딩될 수 있다. 로딩된 미성숙 수지상 세포는 백신화 전에 시험관내에서 성숙되거나 백신화 후 생체내에서 (외인성 성숙 자극이 있거나 없이) 성숙될 수 있다. 별법으로, 핵산은 동일계내에서 항원 제시 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al. (Vaccine 2002 20:42-48)], [Lisziewics et al. (Vaccine 2003 21:620-623)] 및 [O'Hagen (Curr Drug Targets Infect Disord 2001 1:273-286)] (이들의 내용은 참고로 도입됨)을 참조한다.
바람직하게는, 상기 조성물에서 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 그 후, 로딩된 수지상 세포는 환자에서 병원체 감염을 치료하는 백신으로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 병원체 및 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)는 치료될 환자에 대해 자가성이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 병원체-감염된 포유동물로부터 수득되거나 그로부터 유래된 항원 제시 세포를 상기 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머를 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인, 자가 백신의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 로딩된 항원 제시 세포를 포함하는 백신을 제공한다. 이러한 백신에서, 로딩된 항원 제시 세포는 환자에 치료적 투여에 적합한 완충제 내에 있을 것이다. 백신은 또한 항원 제시 세포 또는 T 세포의 자극을 위한 인자용의 보조제를 포함한다. 제약 조성물의 제제화 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science]의 최신판을 참조한다.
수지상 세포 백신에 대한 최적 면역화 간격은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 환자는 투여당 1x106 내지 1x107의 살아있는 RNA-로딩된 DC로 5시간 백신화될 것이다. 백신화를 위해 선택된 투여량 수준은 안전하고 잘 내성일 것으로 예상된다.
단리, 제조, 형질감염, 제제화 및 항원 제시 세포의 환자에의 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fay et al. Blood 2000 96:3487]; [Fong et al. J Immunol 2001b 166:4254-4259]; [Ribas et al. Proc Am Soc Clin One 2001 20:1069]; [Schuler-Thurner et al. J Exp Med. 2002 195:1279-88]; [Erratum in: J Exp Med. 2003197:395]; 및 [Stift et al. J Clin Oncol 2003 21: 135-142] (이들의 내용은 참고로 도입됨)을 참조한다.
임상적으로 사용되는 APC 투여 경로는 정맥내 (IV), 피하 (SC), 진피내 (ID), 및 림프내를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 객관적인 임상적 반응은 다른 APC 백신의 IV, SC 및 ID 투여 후에 보고되었다. 현재, ID 투여에 대한 증대되는 선호도가 있는데, 이는 진피가 유출 림프절로 이동하는 것으로 공지된 수지상 세포를 위한 정상적인 거주지이기 때문이다. 뮤린 모델에서, SC-주사된 수지상 세포는 유출 림프절의 T-세포 영역에서 후기에 발견되며, FV 면역화 후의 것보다 우수한 보호 항종양 면역성을 촉발한다. 림프절 내로의 직접적인 수지상 세포 주사가 보호 항종양 면역성 또는 세포독성 T-림프구 (CTL)을 생성하는데 있어서 다른 전달 경로보다 우수하다는 뮤린 증거가 있다 (문헌 [Lambert et al. Cancer Res 2001 61:641-646] (그 내용은 참고로 도입됨) 참조). 이는 전체 수지상 세포가 단일 유출 림프절 또는 바신에 충격을 주도록 전달되어야 함을 암시한다 (가능한 많은 절이 관여하는 다중 부위 사이의 투여량을 나누기보다는).
백신의 면역원성을 평가하기 위해, 백신화된 개체에서 면역 반응은 하기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 성숙 프로파일에 의해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, HIV-특이적 효과기 세포 기능의 회복은 효과기 T-세포의 표현형을 발현하는 세포, CD45 RA+ CCR7"의 존재, 및 IFN-γ 및 그란짐 B의 상승하는 수준의 분비에 의해 결정될 수 있다. HIV-특이적 증식 반응의 회복은 IL-2를 생성하고 CFSE를 낮추고, 이후 HFV-RNA 회복 HIV-특이적 기억 T 세포 구획으로 형질감염된 수지상 세포로 자극함으로써 결정될 수 있다.
백신에 의해 유도된 특이적 T 세포의 성숙은 유동 세포 분석법을 이용하여 표면 및 세포내 마커를 사용하여 측정될 수 있다. CD8+ T 세포는 αβTCR, CD45RA, CCR7 및 CD 107을 비롯한 표면 마커, 또는 그란짐 B 또는 γ-IFN과 같은 세포내 분자에 대한 염색에 의해 모니터링될 것이다. CD3, CD4.CCR7 및 IL-2를 사용하여 CD4+ T 세포를 모니터링할 수 있다. 이러한 분석법을 이용하여 환자로부터의 자가 HIV 서열을 포함하는 펩티드로 인큐베이션한 후 면역 반응을 모니터링할 수 있다. 각각의 새로운 백신화 전의 기준선에서 및 매달의 세포 면역 반응의 비교는 세포 면역 반응의 넓이에 대한 백신의 효과의 측정을 가능하게 한다. 면역 반응의 넓이는 또한 CFSE 증식 분석법을 이용하여 측정될 수 있다.
HIV 항원에 의해 코딩되는 수백의 CTL 에피토프가 기재된 반면, 자가 HIV 백신에 대한 상기 인자의 고려사항은 본 출원인이 백신에 대한 일차 표적으로서 gag (p55), rev, nef 및 vpr을 선택하게 하였다. 그러나, 다른 HIV 항원은 또한 본 발명의 방법을 이용하여 표적화될 수 있다. 상기 기재된 방법은 HFV 감염된 개체로부터의 HFV의 다중 균주를 증폭할 수 있는 프라이머를 선택하는데 사용되었다. 특히, 본 출원인은 다중 HFV 균주로부터의 gag, nef, rev 및 vpr 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 발견하였다. 프라이머 서열, 프라이머 수 및 명칭, Tm 및 길이는 도 1에 나타낸다. 참조 HIV 게놈 (수탁 번호 NCOO1 802)에 대한 상기 프라이머의 위치는 도 2에 나타낸다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 서열 1 내지 20, 206 및 207, 및 서열 1 내지 20, 206 및 207과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
바람직한 gag 전방향 프라이머는 단독 전방향 프라이머 또는 임의의 조합으로서일 수 있는 서열 1, 4, 16, 17, 19 및 20이다. gag 전방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 16 및 17; 및 19 및 20이다.
본 발명은 또한 서열 21 내지 43, 102 내지 113 및 220 내지 232, 및 서열 21 내지 43, 102 내지 113 및 220 내지 232과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
바람직한 gag 역방향 프라이머는 서열 21, 22, 26, 27, 32 내지 34, 36 내지 38, 40 내지 41 및 106 내지 108이다. gag 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 33 및 41; 서열 32, 36, 37 및 40; 서열 21, 26 및 38; 서열 22 및 27; 서열 32, 33 및 34; 서열 36, 37, 38, 40 및 41; 및 서열 106, 107 및 108이다.
본 발명은 또한 서열 44 내지 58, 208 및 209, 및 서열 44 내지 58, 208 및 209와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
바람직한 vpr 전방향 프라이머는 서열 44 내지 52이다. vpr 전방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 44 및 48; 및 서열 57 및 58이다.
본 발명은 또한 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 203, 233 내지 241 및 261 내지 273, 및 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 203, 233 내지 241 및 261 내지 273과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
바람직한 vpr 역방향 프라이머는 서열 196 내지 203 및 269 내지 273이다. vpr 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 196 및 197; 서열 198, 199 및 200; 서열 201 내지 203; 및 서열 269 내지 273이다.
본 발명은 또한 서열 74 내지 88, 183 내지 189, 210 및 211, 및 서열 74 내지 88, 183 내지 189, 210 및 211과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
rev 전방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 87 및 88; 서열 183 및 184; 서열 185, 186 및 187; 및 서열 188 및 189이다.
본 발명은 또한 서열 89 내지 101, 123 내지 129, 190 내지 195, 242 내지 248 및 258 내지 260, 및 서열 89 내지 101, 123 내지 129, 190 내지 195, 242 내지 248 및 258 내지 260과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
rev 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 190, 191 및 192; 및 서열 193, 194 및 195이다.
본 발명은 또한 서열 130 내지 132, 134 내지 136 및 212 내지 214, 및 서열 130 내지 132, 134 내지 136 및 212 내지 214와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
본 발명은 또한 서열 133, 154 내지 159, 249 및 255 내지 258, 및 서열 133, 154 내지 159, 249 및 255 내지 258과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HFV env 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 133, 또는 서열 133과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
본 발명은 또한 서열 138 내지 139, 147, 148, 204 및 215 내지 218, 및 서열 138 내지 139, 147, 148, 204 및 215 내지 218과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
본 발명은 또한 서열 140 내지 143, 및 서열 140 내지 143과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
nef 전방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 138, 139 및 204; 서열 140 내지 143; 서열 147 내지 148; 및 서열 138 및 139이다.
본 발명은 또한 서열 144 내지 146, 149 내지 153 및 250 내지 254, 및 서열 144 내지 146, 149 내지 153 및 250 내지 254와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
nef 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 144 내지 146; 및 서열 149 내지 151이다.
HIV 서열을 증폭하기 위해, 1종 이상의 전방향 프라이머는 1종 이상의 역방향 프라이머와 조합된다. 따라서, 본 발명은 HIV의 다중 변이체의 증폭에 유용한 프라이머 쌍 조합을 제공한다. 상기 프라이머 쌍 조합은 하나의 전방향 프라이머 및 하나의 역방향 프라이머를 함유할 수 있다 (각각의 프라이머는 전형적으로 하나 초과의 카피로 존재할 것임). 그러나, HIV의 다중 변이체의 증폭을 보증하기 위해, 가장 유용한 프라이머 쌍 조합은 다수의 전방향 프라이머 및 다수의 역방향 프라이머를 함유할 것이다.
따라서, 본 발명은 a. 서열 1 내지 20, 162, 164, 168, 169, 206 및 207로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 1 내지 20, 162, 164, 168, 169, 206 및 207과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 gag 전방향 프라이머; 및
b. 서열 21 내지 43, 102 내지 113, 172, 173 및 220 내지 232로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 21 내지 43, 102 내지 113, 172, 173 및 220 내지 232와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 gag 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
gag 전방향 프라이머와 gag 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 1, 32, 33 및 34; 서열 4, 32, 33 및 34; 서열 16, 17, 32, 33 및 34; 서열 1, 36, 37, 38, 40 및 41; 서열 4, 36, 37, 38, 40 및 41; 및 서열 16, 17, 36, 37, 38, 40 및 41이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 a. 서열 44 내지 58, 176, 177, 208 및 209로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 44 내지 58, 176, 177, 208 및 209와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpr 전방향 프라이머; 및
b. 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 200, 233 내지 241 및 261 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 200, 233 내지 241 및 261 내지 273과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpr 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
vpr 전방향 프라이머와 vpr 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 44, 48, 196 및 197, 서열 44, 48, 198, 199 및 200, 서열 49, 196 및 197, 또는 서열 49, 198, 199 및 200이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 a. 서열 138 내지 143, 147, 148, 204 및 215 내지 218로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 138 내지 143, 147, 148, 204 및 215 내지 218과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 전방향 프라이머; 및
b. 서열 144 내지 146, 149 내지 153 및 250 내지 254로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 144 내지 146, 149 내지 153 및 250 내지 254와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
nef 전방향 프라이머와 nef 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 138, 139, 144, 145, 146 및 204, 서열 140 내지 146, 또는 서열 138, 139, 144, 145 및 146이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 a. 서열 130 내지 132, 134 내지 136 및 212 내지 214로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 130 내지 132, 134 내지 136 및 212 내지 214와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 env 전방향 프라이머; 및
b. 서열 133, 154 내지 159, 249 및 255 내지 258로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 133, 154 내지 159, 249 및 255 내지 258과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 env 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
본 발명의 방법의 실시에 있어서, 일차 핵산 증폭에서 주형으로서 사용하기 위한 하기 중 임의의 것을 단리하는 것이 가능하다: 통합된 HIV 프로바이러스, 게놈 HIV RNA (비리온, 또는 HIV 비리온을 복제하는 세포로부터), HIV 일차 전사체 및 HIV 프로세싱된 mRNA. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, HIV RNA 게놈은 혈액에 존재하는 비리온으로부터 단리된다. env 및 rev의 오픈 리딩 프레임은 부분적으로 HIV 게놈과 중첩되며, 정상적인 HIV 발현 과정에서, rev 일차 RNA 전사체 내의 제1 및 제2 rev 엑손은 프로세싱된 rev mRNA를 초래하도록 스플라이싱된다. 바람직한 HIV 주형이 HIV 게놈 RNA이기 때문에, 단지 스플라이싱 후 인-프레임인 전체 rev 유전자보다 제1 및 제2 rev 엑손을 증폭하는 것이 가장 실제적이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 제2 rev 엑손의 증폭에 적합한 rev 전방향 및 역방향 프라이머의 조합을 제공한다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 a. 서열 74 내지 88, 183 내지 189, 210 및 211로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 74 내지 88, 183 내지 189, 210 및 211과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 전방향 프라이머; 및
b. 서열 89 내지 101, 123 내지 129, 190 내지 195, 242 내지 248 및 258 내지 260으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 89 내지 101, 123 내지 129, 190 내지 195, 242 내지 248 및 258 내지 260과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
rev 전방향 및 역방향 프라이머의 바람직한 조합은 서열 183, 184, 190, 191 및 192; 및 서열185, 186, 187, 190, 191 및 192; 및 서열 188 내지 192이다.
본 발명의 일 실시양태에서, rev 전방향 프라이머는 nef 역방향 프라이머와 조합되어 nef 및 rev의 제2 엑손을 코딩하는 단일 앰플리콘을 생성할 수 있다. 그 후, 네스팅된 PCR을 이용하여 별개의 이차 nef 및 rev 앰플리콘을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 a. 서열 74 내지 88, 183 내지 189, 210 및 211로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 74 내지 88, 183 내지 189, 210 및 211과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 전방향 프라이머; 및
b. 서열 144 내지 146, 149 내지 153 및 250 내지 254로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 144 내지 146, 149 내지 153 및 250 내지 254와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
유사하게, 관심의 HIV 유전자의 1종 이상의 연속적인 조합의 다른 일차 앰플리콘을 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, gag 전방향 프라이머를 nef 역방향 프라이머와 조합하여 대부분의 HIV 게놈을 증폭할 수 있다. 다른 비-제한적 예는 vpr 전방향 프라이머와 nef 역방향 프라이머, vpr 전방향 프라이머와 rev 역방향 프라이머 및 env 전방향 프라이머와 nef 역방향 프라이머의 조합이다.
따라서, 본 발명은 또한 a. 서열 1 내지 20, 44 내지 58, 74 내지 88, 130 내지 132, 134 내지 136, 162 내지 188 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 1 내지 20, 44 내지 58, 74 내지 88, 130 내지 132, 134 내지 136, 162 내지 188 및 189와 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 전방향 프라이머; 및
b. 서열 60 내지 73, 89 내지 101, 114 내지 122, 133, 144 내지 146, 190 내지 192, 196 내지 203 및 269 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드, 및 서열 60 내지 73, 89 내지 101, 114 내지 122, 133, 144 내지 146, 190 내지 192, 196 내지 203 및 269 내지 273과 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 서열 동일성은 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상이다.
상기 기재된 프라이머 및 프라이머 쌍은 HIV 핵산을 증폭하여 표적화된 항원을 코딩하는 일차 DNA 앰플리콘을 생성하는데 유용하다.
상기 지침을 기초로, HFV의 다중 변이체의 gag, vpr, env, rev 및 nef 항원의 증폭에 적합한 전방향 및 역방향 네스팅된 프라이머가 제공된다. 상기 프라이머는 일차 증폭 반응, 또는 바람직하게는 일차 증폭 후 핵산 증폭의 제2 라운드에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 일차 증폭은 상기 기재된 HIV 전방향 및 역방향 gag, vpr, rev, env 및/또는 nef 프라이머, 그 후 하기 기재된 네스팅된 프라이머 쌍을 이용한 이차 증폭으로 수행된다.
따라서, 본 발명은 5' 부분 및 3' 부분을 포함하는 전방향 프라이머를 제공하며, 5' 부분은 프로모터 및 최적화된 코자크 서열을 포함하고, 3' 부분은 GTGCGAGAGCGT (서열 206, gag 증폭용), GTGCGAGACCGT (서열 207, gag 증폭용), AACAAGCCCC4G (서열 208, vpr 증폭용), AACAAGCCCCGG (서열 209, vpr 증폭용), ACCC^CCTCCC (서열 210, rev 증폭용), ACCCGCCTCCC (서열 211, rev 증폭용), GAGTGA7X3G (서열 212, env 증폭용), GAGTGA/.GG (서열 213, env 증폭용), GAGTGAGGG (서열 214, env 증폭용), GTGGCAAGTGGTCAAAA/IG (서열 215, nef 증폭용), GTGGCAAGTGGTCAAAACG (서열 216, nef 증폭용), TGGGAGCAGTGTCTCA (서열 217, nef 증폭용) 및 AGGCACAAGAGGAAGAGG (서열 218, nef 증폭용), AGAGTGATGG (서열 372, env 증폭용), AGAGTGAAGG (서열 373, env 증폭용), AGAGTGACG (서열 374, env 증폭용), AGAGTGAGGG (서열 375, env 증폭용), AAACAGATGGCAGGTG (서열 376, vif 증폭용), AAACAGATGGCAGGTA (서열 377, vif 증폭용), AAACAGATGGCAGGCG (서열 378, vif 증폭용), AAACAGATGGCAGGGG (서열 379, vif 증폭용), TCTATCAAAGCAGTAAG (서열 380; vpu 증폭용); TCTATCAAAGCAGTGAG (서열 381; vpu 증폭용); TCTATCAGAGCAGTAAG (서열 382; vpu 증폭용); TCTACCAAAGCAGTAAG (서열 383; vpu 증폭용); GGAAGGCCAGGGAATTTCC (서열 384, pol 증폭용), GGAAGGCCAGGGAATTTTC (서열 385, pol 증폭용), GGAAGGCCAGGGAATTTCC (서열 386, pol 증폭용), 및 GGAAGGCCAGGAAATTTTC (서열 387, pol 증폭용)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 T7 프로모터이다. 상기 프라이머의 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 부분은 서열 TAATACGACTCACTATAGGGAGACC[Lambda]CC[Lambda]rGG (서열219)을 함께 갖는 T7 프로모터 및 최적화된 코자크 서열을 포함하며, T7 프로모터 서열은 표준 폰트로 나타나 있고, 최적화된 코자크 서열은 이탤릭 폰트로 나타나 있다. 바람직한 T7 프로모터/프라이머 실시양태에서, 조합된 5' 및 3' 부분은 함께 서열 19, 20, 57, 58, 87, 88, 134, 135, 136, 147, 148, 160, 161, 290 내지 293, 308 내지 311, 329 내지 332 및 356 내지 360으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 5' 부분 및 3' 부분을 포함하는 역방향 프라이머를 제공하며, 5' 부분은 대략 30 내지 100 T 뉴클레오티드를 갖는 폴리T 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 3' 부분은
Figure 112007020535534-PCT00002
Figure 112007020535534-PCT00003
로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
바람직하게는, 5' 폴리T는 길이로 64 T 뉴클레오티드이다. 바람직한 실시양태에서, 역방향 네스팅된 프라이머 조성물은 서열 102 내지 129, 137, 149 내지 153, 157 내지 159, 193 내지 195, 201 내지 203 및 269 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 1 내지 20, 44 내지 58, 74 내지 88, 130 내지 132, 134 내지 136, 138 내지 143, 147 내지 148, 160 내지 162, 164, 168, 169, 176, 177, 180, 183 내지 189 및 204로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 전방향 프라이머; 및
b) 서열 21 내지 43, 60 내지 73, 89 내지 129, 133, 137, 144 내지 146, 149 내지 159, 163, 167, 172, 173, 178, 179, 181, 182, 190 내지 203 및 220 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, HIV의 다중 변이체의 증폭용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 키트는 또한 열안정성 DNA 폴리머라제, dNTP, 및 증폭 반응에 적합한 완충제 (IX 또는 농축된)를 포함한다. 또한, 키트는 역전사효소 및/또는 증폭을 위한 비-감염성 HFV 대조군 주형을 함유할 수 있다. 또한, 키트는 바람직하게는 일차 앰플리콘의 이차 증폭을 위한 전방향 및 역방향 네스팅된 프라이머의 하나 이상의 쌍을 함유할 것이다. 전방향 네스팅된 프라이머는 5' 프로모터, 및 임의로 번역 개시 코돈을 함유하는 코자크 서열, 뿐만 아니라 관심의 일차 앰플리콘을 표적화하는 3' 서열을 함유할 것이다. 역방향 네스팅된 프라이머는 5' 폴리T 서열 및 관심의 일차 앰플리콘에 상보적인 3' 서열, 및 임의로 번역 정지 코돈을 함유할 것이다. 키트는 병원체의 확인 및 정량, 및 백신의 제조에 유용하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HIV DNA의 다중 변이체를 서열 1 내지 18, 44 내지 56, 74 내지 86, 130 내지 136, 138 내지 143 및 204로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및 서열 21 내지 43, 60 내지 73, 89 내지 101, 133, 144 내지 146, 154 내지 156, 190 내지 102, 196 내지 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 역방향 프라이머로 증폭하는 것을 포함하는, HIV 서열의 균주-독립성 증폭 방법을 제공한다.
HIV DNA는 숙주 세포 게놈 내로 통합된 HIV DNA를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, HIV DNA는 RNA 또는 HIV mRNA의 역전사에 의해 제조된 cDNA이다. 감염된 개체로부터의 통합된 HFV DNA, HIV 게놈 RNA 및 HIV mRNA의 단리 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 유사한 방법은 관심의 다른 병원체의 핵산을 단리하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, HIV 핵산은 본 발명의 백신으로 치료될 HIV로 감염된 개체로부터의 생물학적 샘플로부터 단리되거나 유래된다. 본원에 기재된 "생물학적 샘플"은 병원체, 병원체-감염된 세포 또는 병원체 핵산을 함유할 수 있는 임의의 생물학적 샘플을 지칭하며, 혈액, 혈장, 혈청, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC), 정액, 질 분비물, 안구액, 뇌 축수액, 타액, 유액, 복수액, 윤활막액, 복막액, 양수, 조직, 조직 배양물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
가장 바람직하게는, HIV 게놈 RNA를 함유하는 비리온은 혈액 또는 혈청으로부터 단리된다. 비리온으로부터 수득된 게놈 RNA는 역전사되어 HIV cDNA를 생성한다. 감염된 환자로부터 HIV 비리온을 단리하는 방법, 뿐만 아니라 cDNA의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. HIV RNA의 역전사는 랜덤 헥사머 또는 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 그 후, HIV cDNA를 HIV 서열의 상기 균주-독립성 증폭 방법에서 주형으로서 사용할 수 있다. 상기 동일한 방법을 이용하여 다른 병원체의 mRNA 또는 게놈 DNA로부터 cDNA를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증폭된 DNA는 핵산 백신에 사용될 수 있거나, 항원 제시 세포 내로 로딩되어 그 후 백신으로서 사용될 수 있다. 또한, DNA는 샘플에 존재하거나 환자를 감염시키는 HIV의 변이체를 확인하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 병원체 주형 도는 그의 cDNA 카피로부터 증폭된 DNA는 "일차 앰플리콘"으로 지칭된다. 일차 앰플리콘은 발현 카세트, 발현 벡터 및/또는 전달 벡터 내로 삽입함으로써 변형될 수 있으며, 그 후 핵산 백신, 바이러스 백신 등으로서 사용될 수 있거나, 이러한 벡터는 백신으로서 사용될 수 있는 항원 제시 세포 내로 로딩될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 일차 앰플리콘은 시험관내 발현 및/또는 시험관내 발현에 적합한 전사 및 전사 신호를 함유하는 네스팅된 프라이머를 사용한 증폭의 제2 라운드에 적용된다. 바람직하게는, DNA는 번역 정지 코돈 및 폴리T 꼬리의 상보체를 함유하는 역방향 네스팅된 프라이머와 조합된 1) T7 또는 SP6 프로모터와 같은 시험관내 전사에 적합한 프로모터, 2) ATG 코돈을 포함하는 최적화된 코자크 서열을 함유하는 전방향 네스팅된 프라이머를 사용한 증폭의 제2 라운드에 적용된다. 증폭의 네스팅된 라운드로부터 생성된 이차 앰플리콘은 시험관내 전사 및 5' 캡핑의 주형을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 그 후, 생성된 mRNA는 핵산 백신으로서, 또는 그 후 백신으로서 사용될 수 있는 항원 제시 세포를 로딩하는데 사용될 수 있다.
비-제한적 예로서, 병원체 RNA는 역전사효소, 적절한 반응 완충제 및 랜덤 헥사머를 사용하여 단일-가닥 cDNA로 역전사된다. 그 후, 단일-가닥 cDNA는 다중 프라이머를 사용한 일차 PCR 반응에서 이중-가닥 DNA로 PCR에 의해 증폭된다. 일차 PCR 반응으로부터의 생성물은 제2 라운드 또는 네스팅된 PCR 증폭으로 들어간다. 상기 라운드 증폭에서, 5' 프라이머(들)는 T7 RNA 폴리머라제 결합 서열을 갖는 오버행을 함유하고, 3' 프라이머는 폴리 T 신장물을 갖는 오버행을 함유한다. PCR의 네스팅된 라운드에서 오버행 영역에 의해 도입된 변형은 시험관내에서 PCR 생성물의 전사, 및 DC 내로 전달시 성공적인 번역을 가능하게 한다. 방법은 PCR 증폭의 단계 후에 저지될 수 있으며, PCR 생성물은 추가의 프로세싱을 위해 동결되어 저장될 수 있다. cDNA 물질의 정제는 퀴아퀵(QIAquick)(등록상표) PCR 정제 키트 성분 (퀴아퀵(등록상표) 컬럼, PB 완충제, PE 완충제, 및 EB 완충제)를 사용하여 수행된다. 이중-가닥 DNA는 표준 전사 반응에서 주형으로서 사용된다. 시험관내 전사된 RNA의 청소는 RN이지(RNeasy)(등록상표) 키트 (RN이지(등록상표) 컬럼, RLT 완충제 및 RPE 완충제)에서 성분을 사용하여 수행된다. RNA를 뉴클레아제-무함유 수에서 용리한다. 필요할 경우, 에탄올 침전법을 수행하여 RNA를 농축시킨다. RNA를 뉴클레아제-무함유 수에 재현탁시키고, 0.8/0.2 μM 폴리에테르술폰 (PES) 필터에 통과시킨 후, 0.5 mL 안전-잠금 폴리프로필렌 튜브에 분배하고, -150℃에서 장기간 저장을 위해 저온보존한다.
따라서, 본 발명은 a) HIV DNA의 다중 변이체를 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 증폭함으로써 일차 앰플리콘을 생성하고, 여기서 상기 전방향 프라이머는 서열 1 내지 18, 44 내지 56, 74 내지 86, 130 내지 132, 162 내지 188 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 역방향 프라이머는 서열 60 내지 73, 89 내지 101, 133, 144 내지 146, 190 내지 192 및 196 내지 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하며;
b) 상기 일차 앰플리콘을 전방향 프로모터 프라이머 및 5' 폴리T 꼬리를 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하여 증폭된 발현 카세트를 생성하고;
c) 상기 발현 카세트를 전사하여 HIV RNA를 생성하는 것을 포함하는, HIV RNA의 균주-독립성 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, HIV DNA는 HIV 게놈 RNA 또는 HIV mRNA의 역전사에 의해 제조된 cDNA이다. 바람직한 실시양태에서, 전방향 프로모터 프라이머는 T7 또는 SP6 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 전방향 프라이머는 프로모터에 대해 최적화된 코자크 서열 3'를 추가로 포함한다.
캡핑되고 폴리아데닐화된 RNA는 시험관내 번역 반응에서 네스팅된 후, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포 내로 형질감염될 수 있다. 번역된 단백질의 확인은 특정 항원을 사용한 웨스턴 블롯 분석에서 시험될 수 있다. APC의 성숙에 대한 발현된 개별 항원 뿐만 아니라 그의 조합의 부정적 영향의 부재는 세포외 마커의 분석에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, DC의 성숙하는 능력은 유동 세포 마커 (예를 들어, HLA DR, CD86, CD83, CD14)를 사용한 표현형 분석에 의해 확립될 수 있다. 새롭게 발현된 단백질이 DC의 기능에 영향을 줄 가능성을 제거하기 위해, 항원을 코딩하는 개별 RNA 또는 그의 조합은 Flu RNA와 조합으로 공동-형질감염시킨 후, CTL 분석에서 공동-형질감염된 DC를 시험할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 캡핑되고 폴리아데닐화된 RNA는 시험관내 또는 동일계내에서 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포 내로 형질감염될 수 있다. 그 후, 이러한 시험관내 형질 감염된 항원 제시 세포는 백신으로서 사용될 수 있다. 별법으로, 캡핑되고 폴리아데닐화된 RNA는 시험관내에서 번역된 후, 시험관내에서 항원 제시 세포 내로 로딩되거나, 백신에 직접적으로 사용될 수 있다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 항원 제시 세포를 본 발명의 방법에 의해 생성된 RNA와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원 제시 세포의 로딩 방법을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 비-제한적 실시양태로서 의도된다.
실시예 1
HIV의 다중 변이체의 증폭을 위한 프라이머의 선택
로스 알라모스 내셔날 데이타베이스(Los Alamos National Database)에 기탁된 49개의 전장 HIV 단리체의 분석은 HIV 게놈 내의 고도로 가변성인 영역 뿐만 아니라 보다 낮은 변이성을 갖는 선택된 항원의 코딩 서열 밖의 영역을 밝혀내었다. gag, vpr 및 rev의 오픈 리딩 프레임의 가장 밖의 상기 상대적으로 보존된 영역은 PCR 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 설계를 위한 주형으로서 기능하였다. 로스 알라모스 데이타베이스에 열거된 확인된 서열에 존재하는 것에 추가적인 돌연변이가 개별 환자에서 발생할 수 있기 때문에, 프라이머 어닐링을 위한 다중 영역을 결정하였다. 상기 단리체에 상보적인 프라이머를 분석하였다. 단리체 사이의 상대적 서열 보존성을 갖는 뉴클레오티드 영역은 프라이머 선택을 위해 선호되었다. 하기 파라미터를 프라이머 설계에 적용하였다: 프라이머는 55℃ 내지 62℃의 Tm, 약 17 내지 20 bp의 길이를 가지며, 동종이량체를 형성할 것으로 예측되지 않으며, 이차 구조 및 블라스트(BLAST) 분석에 HIV 이외의 서열에 상동성이 없었다. 사용되는 프라이머의 수를 최소화하기 위해, 프라이머 서열의 5' 반에서의 미스매치는 내성이었던 반면, 3' 반 내의 미스매치는 허용되지 않았다. 임의의 선택된 몇몇 영역의 실패없는 증폭을 보증하기 위해, 관심의 오픈 리딩 프레임 밖의 몇몇 영역을 또한 선택하였다. 도 1은 프라이머 설계를 위해 선택된 영역의 개략적 제시를 개요한다. 프라이머명에서 숫자는 참조로서 선택된 수탁 번호 NC_001802를 갖는 서열 내의 위치에 상응한다. 상기 참조 서열은 대부분의 HIV 서열에 존재하지 않는 VPR을 말단절단하는 돌연변이를 함유한다.
gag의 상류 및 하류에서 선택된 영역에 대한 프라이머 어닐링 (NC_0O18O2 225-1838 밖의)은 gag의 전체 오픈 리딩 프레임의 증폭을 가능하게 할 것이다. 프라이머에 대한 영역을 확인한 후, 각각의 공지된 HIV 서열에 대해 상보적인 각각의 선택된 위치를 결정하였다. 49개의 분석된 단리체에 대한 모든 상보적인 서열을 코딩하는 역방향 프라이머 군 gag 1883에 대한 예는 표 1에 나타낸다.
Figure 112007020535534-PCT00004
표 1. gag를 증폭하기 위해 선택된 NC_001802의 위치 1833에 대한 역방향 프라이머 군. 이것이 프라이머의 역방향 군이기 때문에, 반대 상보체 서열은 여기에 나타낸다. 모든 분석된 HIV 서열에 상보적인 가변 염기는 이탤릭체로 나타내며, 비-컨센서스 변이체는 굵은 이탤릭체로 나타낸다.
사용된 프라이머의 수를 최소화하기 위해, 본 발명자들은 추가의 선택 범주를 적용하였다: 프라이머 서열의 3' 반 내의 미스매치는 가능할 경우 회피되지만, 프라이머 서열의 5' 반에서의 미스매치는 내성이었다. 이러한 미스매치는 PCR 증폭 엄격성의 저하에 의해 상쇄될 수 있다. 상기 선택 범주가 적용될 경우, 상기 군에 대한 프라이머의 목록은 표 2에 나타낸 바와 같이 상당히 짧아졌으며, 이는 그의 3' 반에서 상이한 프라이머를 나타낸다.
Figure 112007020535534-PCT00005
표 2. 영역 gag 1833에 대해 선택된 역방향 프라이머의 서열. 참조 서열 NC_001802에 상보적인 서열은 상부 열에 나타낸다. 별개의 HIV 단리체에서 발견되는 영역에서의 돌연변이는 상부 케이스 굵은 이탤릭체로 지시된다. 참조 서열의 것에 대한 역방향 상보체 서열은 여기에 나타낸다.
하기 표 3은 Rev에 대한 전방향 프라이머의 군에 대한 프라이머 설계를 상세화한다. 가장 공통적인 HIV 분기군으로부터의 다중 HIV 단리체, 뿐만 아니라 가장 덜 공통적인 단리체의 서열 정렬은 위치 7847 및 7848 내의 가변 잔기를 갖는 상대적 보존의 영역을 밝혀내었다. 따라서, 컨센서스 B 서열 (Rev F7830)에 완전히 상보적이지만 상기 빈번한 서열 전위를 수용할 수 있는 프라이머를 설계하기 위해, 추가의 별법의 프라이머를 설계하였다. 상기 별법의 프라이머는 위치 7847 및 7848에서의 빈번히 발견된 돌연변이 (Rev F 7830.1 및 Rev F 7830.2)에 보충적인 돌연변이를 함유한다. 프라이머의 단지 3' 반을 보충적인 돌연변이를 갖도록 설계한 반면, 잔기 7830 내지 7840의 5' 반에서의 미스매치는 허용되었다. 다양한 균주의 "실패 없는" 증폭을 보증하기 위해, 관심의 오픈 리딩 프레임 밖의 하나 초과의 영역을 분석하였다. 예를 들어, 단리체 01A1.CM.CM53122는 표적 영역의 결실 때문에 영역 Rev F7830에 대해 설계된 프라이머를 사용하여 증폭할 수 없을 것이다. 따라서, 이를 상쇄하기 위해, 위치 7550 및 7911에서의 서열을 또한 사용하여 전방향 Rev 프라이머를 설계하였다.
Figure 112007020535534-PCT00006
PCR 단편을 시험관내에서 전사할 수 있기 위해, 단편을 5' 말단에서 T7 RNA 폴리머라제 결합 부위를 삽입하도록 변형하였다. 또한, 성공적인 번역의 개시는 3' 말단에서 코자크 서열 및 폴리(T)64 꼬리를 함유하도록 최적화된 번역 개시자 ATG 코돈 둘다의 첨가를 필요로 했다. 일차 PCR 서열의 변형은 변형된 전방향 및 역방향 프라이머가 사용된 PCR의 추가의 네스팅된 라운드에 대한 일차 PCR 반응에서 수득된 PCR 단편을 적용함으로써 달성되었다. 전방향 프라이머는 T7 RNA 프로모터의 서열을 코딩하는 오버행, 뿐만 아니라 항원에 대한 개시자 ATG 코돈의 -3, -2 및 -1 위치에서 염기 ACC를 함유하였다. 또한, ATG 코돈이 PCR 증폭의 제1 라운드 동안 증폭된 Rev와 같은 HIV 유전자에 대해, ATG 코돈은 또한 네스팅된 PCR 반응 동안 첨가되었다. 네스팅된 전방향 프라이머의 3' 반은 개시자 ATG 코돈의 바로 하류의 서열 또는 일차 PCR 증폭 동안 증폭된 대부분의 5' 코딩 서열에 상보적이었다. 역방향 프라이머는 또한 그의 5' 말단에 폴리(T)64 오버행을 함유하였고, 이는 전사 동안 RNA 분자의 3' 말단에서 폴리아데닐화 (폴리A) 서열에 대한 주형으로서 기능하였다. 역방향 프라이머의 3' 반은 일차 PCR 반응에서 단리된 서열에 상보적이었다.
실시예 2
gag 프라이머에 대한 증폭 조건의 결정
PCR 반응 수의 추가의 감소는 각각의 항원에 대한 PCR 프라이머를 다중화함으로써 달성되었다. PCR 프라이머는 그의 Tm을 기준으로 나누어졌다. 그 후, 각각의 군의 역방향 프라이머와 함께 각각의 군의 전방향 프라이머를 함유하는 과돌연변이를 상이한 온도의 PCR 반응에서 시험하였다. 프라이머의 초기 선택 동안 감염성 물질로 작업하는 위험을 감소시키기 위해, NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램으로부터 수득된 다양한 비-감염성 근접 전장 HIV 클론을 사용하여 프라이머 설계를 시험하고 반응 조건을 최적화하였다.
비-감염성 HIV 클론 pBKBHIOS 플라스미드 주형 (NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 Cat #194) 10 ng을, IX Pfu 완충액, 0.2 mM 각각의 dNTP 최종 농도, 0.4 μM 최종 농도의 각각의 프라이머 및 PFU 핫 스타트(Hot start) (스트라타진(Stratagene)) 폴리머라제 1 단위를 함유하는 PCR 반응물 25 ㎕에 사용하였다. 반응물을 95℃에서 45초 동안 가열한 후, 95℃에서 45초 동안 증폭의 25 라운드를 통해 주었고, 어닐링 온도는 도 3에 지시된 바와 같이 45초 동안 및 72℃에서 3분 동안이었다. 최종 연장은 72℃에서 10분 동안이었다. 프라이머 군은 하기와 같았다: 전방향 군 1 (FG1): 서열 1 및 4를 갖는 프라이머; 전방향 군 2 (FG2): 서열 16 및 17을 갖는 프라이머; 역방향 군 1 (RG1): 서열 33 및 41을 갖는 프라이머, 역방향 군 2 (RG2): 서열 32, 36, 37 및 40을 갖는 프라이머; 역방향 군 3 (RG3): 서열 34를 갖는 프라이머; 역방향 군 4 (RG4): 서열 21, 26, 38을 갖는 프라이머; 역방향 군 5 (RG5): 서열 22 및 27을 갖는 프라이머. 결과는 도 3에 나타낸다. 각각의 어닐링 온도에 대한 레인 1 내지 10은 도면 레전드에 지시된 바와 같은 프라이머의 군으로 수행된 PCR 반응을 함유하였다. 모든 상기 프라이머 군을 사용한 증폭이 허용적인 온도인 54℃ 및 6O℃에서 성공적인 반면, 일부 프라이머 조합물은 보다 높은 온도, 65℃ 및 7O℃에서 앰플리콘을 생성하는데 실패하였다.
실시예 3
반응당 HIV의 다중 변이체의 다중 PCR 증폭
HIV가 상기 개체 (CTL 또는 소분자)에 존재하는 임의의 압력으로부터의 돌연변이 회피의 메카니즘 때문에 발생하는 소수의 형태 또는 유사종으로 단일 개체에 존재한다는 증거가 있다. 또한, 환자가 수퍼감염되고 동일한 시간에 다양한 HIV 균주를 호스팅할 수 있다는 증거가 있다. 현재 기술의 힘은 환자에 존재하는 모든 HIV 변이체를 프라이머와 표적 서열 사이의 단일 염기쌍 뉴클레오티드 미스매치를 허용하기에 충분한 불규칙한 특정 생성물을 증폭하는데 충분한 엄격한 조건을 이용하여 증폭하는 그의 능력이다.
다중 HIV 변이체를 동일한 반응에서 증폭하는 본 발명자들의 능력을 실험적으로 시험하기 위해, 상이한 HIV 주형을 단일 PCR 반응에서 혼합하였다. 본 실험에 사용된 다양한 HIV 단리체를 코딩하는 서열을 코딩하는 분자 클론은 하기에 열거한다.
Figure 112007020535534-PCT00007
따라서, 일단 PCR 증폭을 위한 반응 조건을 실시예 2에서와 같이 결정하면, PCR 반응의 복잡성은 한 PCR 반응 내로 4개의 별개의 단리체의 HIV 게놈을 코딩하는 주형을 공급함으로써 증가되었다. 구체적으로, 각각 상이한 HIV 주형 (각각 HIV AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 Cat #194, 3284, 4009 및 3283으로부터 수득됨)에 상응하는, 각각의 2.5 ng의 플라스미드 주형 pBKBHIOS, p90CF204.1, p93BR029.4 및 p93TH253.3을 PCR 반응물 25 ㎕에 혼합하였다. 반응 조건 및 프라이머 혼합물은 실시예 2 및 도 3에 기재된 바와 동일하였다. 본 실험에서, 어닐링 온도는 지시된 바와 같이 6O℃, 62℃ 및 65℃였다. 결과는 도 4A에 나타낸다. 62℃ 및 65℃에서 실패한 PCR 반응 (레인 A 및 B)은 역방향 프라이머 군 3에서 유일한 프라이머인 공통적인 공분모로서 역방향 프라이머 34를 갖는다. 프라이머-주형 미스매치는 Tm을 6O℃로 저하시킴으로써 상쇄될 수 있다.
4B는 각각 역방향 프라이머 군 2, 1 및 3에 사용된 역방향 프라이머 32, 33 및 34의 반대 상보체의 5' 내지 3' 서열, 뿐만 아니라 각각의 프라이머에 대해 계산된 Tm을 나타낸다. 도 4C는 상기 프라이머에 상응하는 표적 영역 내의 4개의 플라스미드 주형 서열의 정렬을 나타낸다. 서열 분석은 표적 프라이머 서열의 5' 말단으로부터의 위치 6이 반응에 사용된 모든 분자 클론에 아데닌 (a)을 함유함을 밝혀낸다. 그러나, 프라이머 34는 상기 위치에 구아닌 (g)을 함유하며, 프라이머 34와 표적 서열 사이의 상보성의 부재는 엄격한 온도에서 성공적인 증폭을 허용하지 않았다. 프라이머 34의 블라스트 분석은 49개의 전장 HIV 단리체의 본 발명자들의 초기 분석에 포함된, 일본으로부터 단리된 HIV 수탁 번호 AB078005에 대한 상보성을 밝혀낸다. 프라이머와 표적 사이의 미스매치가 엄격한 조건에서 증폭되지 않았지만, PCR 증폭 어닐링 온도의 엄격성을 6O℃로 저하시키는 것은 성공적인 증폭을 초래하였음을 주목하는 것이 중요하다. 프라이머:표적 서열의 미스매치가 불규칙한 PCR 조건에 의해 상쇄될 수 있었음의 입증은 HIV 증폭에 대한 선택된 전략이 성공적일 것임을 먼저 지시하는 것으로서 기능한다. 프라이머 33은 또한 표적 서열에 대해 위치 4에서 미스매치를 함유하지만, 상기 프라이머는 PCR 생성물을 초래하는 표적 서열에 성공적으로 어닐링된 1종 이상의 3가지 다른 구성원을 함유하는 군 RG2의 구성원이다.
요약하면, 코딩 서열 밖의 상이한 영역에 상응하며 그의 서열에서의 다중 서열 변이를 함유하는 다중 PCR 프라이머의 조합물은, Tm을 다양화시킴으로써 PCR 반응에 대한 변경된 엄격성과 함께 이들이 동일한 영역에 표적화될 경우 일차 PCR에서 코딩 서열의 실패 없는 증폭을 보증할 것이다.
실시예 4
다중 PCR을 이용한 비-감염성 HIV RNA 주형으로부터의 GAG 영역의 증폭
비-감염성 근접 전장 HIV 게놈을 함유하는 pBKBHIOS 플라스미드 DNA (NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 Cat #194)를 XbaI로 소화시키고, T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사하였다. 간략히, 플라스미드 DNA 주형 1 ㎍를 최종 반응 부피 20 ㎕로 3 내지 4시간 동안 전사한 후, DNase 터보(Turbo)로 30분 동안 소화시켜 DNA 주형을 제거하였다. RNA를 RN이지 컬럼 (퀴아젠(QIAGEN)) 상에서 정제하고, RNAse-무함유 수에서 용리하고, 분취하고, 액체 질소 동결기에서 저장하였다.
생성된 9.2 kb 시험관내 전사된 RNA 100,000 카피를 IX 센시크립트(Sensiscript)(상표명) 완충액 (퀴아젠(등록상표)), 0.5 mM의 각각의 dNTP 최종 농도, 10 μM의 랜덤 헥사머 최종 농도, RNAse 억제제 10 단위 (암비온(Ambion)(등록상표)) 및 센시크립트(상표명) RT (퀴아젠(등록상표))를 함유하는 제1 가닥 cDNA 합성 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 반응물 20 ㎕를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. cDNA 10,000 카피를 IX PFU 울트라 반응 완충액 (스트라타진(상표명)), 0.2 mM의 각각의 dNTP (스트라타진(상표명)), 핫 스타트 Pfu울트라(Ultra)(상표명) 폴리머라제 (스트라타진(상표명)) 2.5 단위, 실시예 2 및 도 5에 지시된 바와 같은 전방향 역방향 프라이머 군에 기재된 바와 같은 프라이머 군 FG1, FG2, RG1, RG2, RG3 및 RG4에서의 0.4 μM 각각의 전방향 및 역방향 프라이머를 함유하는 각각의 일차 PCR 반응물 내로 취하였다. 반응물의 최종 부피는 25 ㎕였다. 반응물을 95℃에서 2분 동안 변성시킨 후, 하기와 같이 40 사이클을 통해 취하였다: 95℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 3분. 이차 PCR 증폭을 네스팅된 Gag 전방향 T7 프라이머 군 (GAG F T7; 프라이머 19 및 20) 및 Gag 역방향 64T 프라이머 군 (GAG R 64T; 프라이머 106, 107 및 108)으로 일차 증폭으로부터의 주형을 사용하여 수행하였다. 최종 사이클 후, 반응을 72℃에서 10분 동안 완료시킨 후, 4℃로 냉각시켰다. 각각의 샘플 4 ㎕를 비-변성된 1％ 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 도 5에 나타낸 결과는 프라이머 군 조합물 FG1:RG1, FG1:RG2, FG1:RG3, FG2:RG1, FG2:RG2 및 FG2:RG3을 사용한 다중 PCR이 pBKBHIOS에 함유된 HIV 서열로부터의 gag 코딩 서열의 증폭을 허용하였음을 지시한다.
실시예 5
다중 HIV 유사종은 본 발명의 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
4개의 HIV 유사종을 나타내는 각각의 pBKBHIOS, p90CF402.1, p93BR029.4, 및 p93TH253.3 2.5 ng을 IX Pfu 완충액, 0.2 mM의 각각의 dNTP, 프라이머 군 FG2 및 RG2 (0.4 μM 각각의 최종 농도) 및 Pfu 핫 스타트 폴리머라제 (스트라타진) 1 단위를 함유하는 일차 PCR 반응물에 혼합하였다. PCR 반응을 실시예 2에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완료시, 일차 PCR 반응물 1 ㎕를 Ix Pfu 완충액, 0.2 mM의 각각의 dNTP, 0.4 μM 최종 농도의 프라이머 19, 0.4 μM 최종 농도의 프라이머 36 및 Pfu 핫 스타트 폴리머라제 (스트라타진(상표명)) 1 단위를 함유하는 이차 25 ㎕ 반응물 내로 취하였다. 이차 PCR 생성물 2 ㎕를 제로 블런트(Zero Blunt)(등록상표) 토포(TOPO)(등록상표) PCR 클로닝 키트 (인비트로젠(Invitrogen)(상표명))를 사용하여 서브클로닝하였다. 개별 콜로니를 사용하여 박테리아 배양물을 접종하였다. 상기 배양물로부터의 플라스미드 DNA를 퀴아퀵 미니 컬럼 (퀴아젠(등록상표))를 사용하여 단리하고, 삽입물에 플랭킹된 클로닝 벡터의 영역에 존재하는 EcoRI 부위를 사용하여 제한 소화를 통해 분석하였다. 대략 1.65 kb의 삽입물에 함유된 클론을 추가의 시퀀싱을 위해 선택하였다. 상기 분석으로부터 수득된 부분적 서열을 레이저진(Lasergene) 소프트웨어 (DNA스타(DNAStar))를 사용하여 정렬하였다. 상기 정렬의 결과를 도 6에 나타낸다. 서열 분석은 최종 혼합물이 4개의 별개의 클론 (A, B, C 및 D)으로 이루어졌음을 지시하며, 이는 본 발명이 환자에 존재할 수 있는 다중 HIV 변이체 또는 유사종의 단리를 가능하게 함을 지시한다.
실시예 6
비-감염성 HIV RNA로부터의 VPR, REV 및 NEF 코딩 영역의 증폭
근접 전장 비-감염성 HIV RNA의 제1 가닥 cDNA를 실시예 4에 기재된 바와 같이 pBKBHIOS로부터 시험관내 전사된 RNA의 RT-PCR에 의해 합성하였다. HIV RNA 10,000 카피로부터 합성된 cDNA 물질을 nef, vpr 또는 rev에 대한 다중 프라이머를 함유하는 각각의 일차 PCR 반응물 내로 취하였다. 하기에 나타낸 네스팅된 T7 및 64T 프라이머를 사용한 이차 PCR 반응을 주형으로서 일차 PCR 반응의 생성물 (VPR 64 T 프라이머 231 내지 235는 서열 269 내지 273에 상응함)을 사용하여 수행하였다. 반응 조건은 최종 프라이머 농도가 nef에 대해 0.4 μM, rev에 대해 0.2 μM 및 vpr에 대해 0.6 μM인 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 동일하였다. 프라이머 군은 하기 프라이머로 구성되었다.
Figure 112007020535534-PCT00008
전방향 및 역방향 프라이머 조합물은 도 7a에 나타낸다. 각각의 조합물은 증폭을 초래하였다.
도 7b는 vpr 역방향 프라이머 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69 및 70으로 다양한 엄격성 (어닐링 온도)에서 별개의 증폭 반응에서 조합된 전방향 vpr 프라이머 44를 사용하여 시험관내 전사된 pBKBHIOS RNA로부터의 vpr 코딩 영역의 증폭을 입증한다. 예상된 바와 같이, 생성물 수율은 증가된 어닐링 온도와 함께 감소하였고, 일부 프라이머는 보다 높은 온도에서 증폭하는데 실패하였다. 따라서, PCR 엄격성 조건을 저하시키는 것은 주형과 함께 프라이머 미스매치를 상쇄한다.
도 7c는 시험관내 전사된 pBKBHIOS RNA로부터의 nef의 증폭을 입증한다. 시험관내 전사된 RNA를 올리고 dT(20) 프라이머, 수퍼스크립트(상표명) III (인비트로젠(상표명)) 10 단위, RNA시우트(seout)(상표명) (인비트로젠(상표명)) 2 단위, 0.5 mM의 각각의 dNTP (클론텍(Clontech)(상표명)), 5 mM DTT 및 수퍼스크립트(상표명) 제1 가닥 완충액을 함유하는 반응에서 제1 가닥 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 반응물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
그 후, 총 부피 2.5 ㎕의 제1 가닥 cDNA 반응물을 PFU울트라(상표명) HS 5 단위, PFU 완충액 (스트라타진(상표명)), 0.8 mM의 각각의 dNTP (클론텍(상표명)) 및 0.4 mM의 Nef 프라이머 군 NEF F 8235 및 NEF R 9069 (레인 1) 또는 Nef 프라이머 군 NEF F 8343 및 NEF R 9069 (레인 2) (최종 반응 부피 50 ㎕)를 함유하는 일차 PCR 반응물 내로 취하였다. PCR 반응물을 95℃에서 2분 동안 변성시킨 후, 하기와 같이 40 사이클 동안 구동시켰다: 95℃에서 30초, 54℃에서 30초 및 72℃에서 3분. 최종 사이클 후, 연장을 72℃에서 10분 동안 수행하고, 4℃로 냉각시킴으로써 반응을 정지시켰다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다 (도 7c). PCR 반응을 위한 nef 프라이머 군의 조성은 하기와 같다.
Figure 112007020535534-PCT00009
실시예 7
GAG 코딩 영역은 감염된 환자의 혈장으로부터 단리된 HIV RNA로부터 증폭될 수 있다.
HIV 감염된 환자의 혈장을 사용하여 HIV RNA를 단리하였다. 혈장 물질을 청결하게 하기 위한 저속 원심분리 후, 이를 용리 완충액에 희석하고, 뉴클레오스핀(Nucleospin)(등록상표) 컬럼 상에서 제조자의 지시 (마쉐리-나겔(Macherey-Nagel))에 따라 정제하였다. RNA를 뉴클레아제 무함유 수에서 용리하고, 추가로 사용할 때까지 -86℃에서 저장하였다. RNA를 IX 수퍼스크립트(상표명) 제1 표준 합성 완충액 (인비트로젠(상표명)), 5 mM DTT, RNAse 억제제 40 단위, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 최종 1 μM의 프라이머 GAG R1 913 군 및 수퍼스크립트 III(상표명) (인비트로젠) 400 단위를 함유하는 제1 가닥 cDNA 합성 반응물 20 ㎕ 내로 취하였다. 반응물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 7O℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 효소를 불활성화시켰다. RT 반응물 2.5 ㎕를 프라이머를 0.4 μM 최종 농도에서 사용하고, PCR 사이클 동안의 신장 시간이 2분인 것을 제외하고는 상기 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 각각의 PCR 반응물 내로 취하였다. 각각의 PCR 반응을 위한 프라이머 군의 조성은 하기와 같다.
Figure 112007020535534-PCT00010
일차 PCR 앰플리콘 1 ㎕를 IX Pfu 완충액, 0.2 mM 각각의 dNTP, Pfu 핫 스타트 폴리머라제 (스트라타진(상표명)) 및 0.2 μM의 네스팅된 전방향 T7 프로모터 프라이머 GAG F 334 (서열 19) 및 역방향 64T 프라이머 GAG R 1881 (서열 106)을 함유하는 이차 PCR 반응물 내로 취하였다. 결과는 도 8에 나타낸다. 각각의 프라이머 조합물 F124:R1881, F304:R1881, F334:R1881, F304:R1913 및 F334:R1913을 만성적으로 감염된 HIV 환자의 혈장으로부터 단리된 주형 HIV RNA를 사용하여 gag 코딩 영역을 증폭하였다.
실시예 8
VPR 및 REV 코딩 영역은 감염된 HIV 환자의 혈장으로부터 단리된 HIV RNA로부터 증폭될 수 있다.
HIV RNA를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 혈장으로부터 단리하였다. RNA를 IX 제1 표준 합성 완충액 (인비트로젠(상표명)), 5 mM DTT, RNAse 억제제 40 단위, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 1 μM의 프라이머 VPR R5507 또는 Rev R8300 군 (하기 지시된 바와 같음) 및 수퍼스크립트(상표명) III 400 단위를 함유하는 제1 가닥 cDNA 합성 반응물 20 ㎕ 내로 취하였다. 반응물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 7O℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 효소를 불활성화시켰다. RT 반응물 2.5 ㎕를 프라이머를, VPR에 대해 0.6 μM, REV에 대해 0.2 μM의 최종 농도에서 사용하고, PCR 사이클 동안의 신장 시간이 2분인 것을 제외하고는, 상기 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 각각의 PCR 반응물 내로 취하였다. 각각의 PCR 반응에 대한 프라이머 군의 조성은 하기와 같다.
Figure 112007020535534-PCT00011
일차 PCR 1 ㎕를 IX Pfu 완충액, 0.2 mM 각각의 dNTP, Pfu 핫 스타트 폴리머라제 (스트라타진(상표명)) 및 하기와 같은 64T 및 T7 RNA 폴리머라제 결합 부위를 함유하는 프라이머: 0.4 μM VPR 프라이머 VPR F 5090 및 VPR R 5419 및 0.6 μM Rev 프라이머 REV F 7912 및 REV R 8300을 함유하는 이차 PCR 내로 취하였다. 도 9에 나타낸 결과는 각각의 하기 전방향 및 역방향 프라이머 군 VPR F 4995:VPR R 5507, VPR F 5058:VPR R 5507, VPR F 4995.VPR R 5419 및 VPR F 5058:VPR R 5419가 만성적으로 감염된 환자로부터 수득된 HIV RNA로부터의 vpr을 증폭할 수 있음을 입증한다. 유사하게, 각각의 하기 전방향 및 역방향 프라이머 군 REV F 7750:REV R 8300, REV F 7830:REV R 8300 및 REV F 7911 :REV R 8300은 만성적으로 감염된 환자로부터 수득된 HIV RNA로부터의 rev를 증폭할 수 있다.
실시예 9
만성적으로 감염된 환자로부터 수득된 HIV RNA의 NEF 코딩 영역의 증폭
HIV RNA를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 혈장으로부터 단리하였다. RNA를 IX 제1 표준 합성 완충액 (인비트로젠(상표명)), 5 mM DTT, RNAse 억제제 40 단위, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 1 μM의 프라이머 NEF R 9069 (하기 지시된 바와 같음) 및 수퍼스크립트(상표명) III 400 단위를 함유하는 제1 가닥 cDNA 합성 반응물 20 ㎕ 내로 취하였다. 반응물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 7O℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 효소를 불활성화시켰다. RT 반응물 2.5 ㎕를 프라이머를 0.4 μM의 최종 농도 및 PCR 사이클 동안의 신장 시간이 2분에서 사용한 것을 제외하고는 상기 기재된 것과 동일한 조건을 이용하여 각각의 PCR 반응물 내로 취하였다. 각각의 PCR 반응에 대한 nef 프라이머 군의 조성은 하기와 같다.
Figure 112007020535534-PCT00012
일차 PCR 1 ㎕를 IX Pfu 완충액, 0.2 mM 각각의 dNTP, Pfu 핫 스타트 폴리머라제 (스트라타진(상표명)) 2.5 단위, 및 64T 및 T7 RNA 폴리머라제 결합 부위: 프라이머 NEF F 8343 및 NEF R 9069를 함유하는 0.2 μM의 각각의 프라이머를 함유하는 이차 PCR 내로 취하였다.
실시예 10
다중 HIV 유사종은 만성적으로 감염된 HIV 환자로부터 증폭된 gag, rev 및vpr 코딩 서열의 분석에 의해 검출될 수 있다.
Gag 코딩 영역을 상기 기재된 바와 같은 환자 물질로부터 증폭하였다. 다중 프라이머 조합물 (레인 GAG F 124:GAG R 1881, GAG F 304:GAG R 1881, GAG F 334:GAG R 1881, GAG F 304:GAG R 1913 도 8)을 사용한 이차 네스팅된 PCR로부터 수득된 PCR 단편을 서브클로닝하고, 상기 기재된 바와 같이 시퀀싱하였다. 부분적 서열의 정렬은 도 1OC에 나타낸다. 분석은 7개 이상의 별개의 GAG 클론이 상기 환자의 혈장으로부터 회수되었음을 지시한다.
각각 Rev 및 VPR에 대한 코딩 서열의 정렬. Rev 및 VPR에 대한 이차 네스팅된 PCR 반응으로부터의 PCR 생성물을 서브클로닝하고, GAG에 대해 기재된 바와 같이 분석하였다. rev 클론 (도 10B) 및 vpr 클론 (도 10C)의 서열 분석은 다중 HIV 유사종의 증폭을 입증한다.
실시예 11
VPR의 단리된 유사종은 HLA 에피토프의 단백질 서열 영역의 아미노산 변화를 함유한다.
VPR 코딩 서열 (로스 알라모스 내셔날 래버러토리 HIV 서열 데이타베이스)에 대한 예측된 HLA 에피토프 지도를 동일한 만성적으로 감염된 HIV 환자로부터의 HIV RNA의 증폭에 의해 수득된 단리된 VPR 클론의 감소된 단백질 서열과 비교하였다. 2개의 확인된 아미노산 치환은 CTL 에피토프에서의 단백질 조성에 영향을 준다 (도 11).
실시예 12
수지상 세포에서 RNA 코딩된 GAG 발현
인간 수지상 세포의 단리
건강한 자원자로부터의 백혈구성분채집술 샘플을 라이프블러드(Lifeblood) (미국 테네시주 메피스)에 기재된 오토(Auto)PBSC를 사용하여 COBE 스펙트라(COBE Spectra) (갬브로(Gambro) BCT) 상에서 수집하였다. 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 피콜(Ficoll)(상표명) 밀도 구배 (히스토파크(Histoρaque)(등록상표)-1007 하이브리-맥스(Hybri-Max)(등록상표), 시그마(Sigma))를 이용하여 백혈구성분채집술 샘플에 대해 단리하고, 1 내지 2시간 동안 플라스틱 플라스크에서 배양하여 부착 단핵구 (CD14+)를 제공하였다. 비-부착 세포를 버리고, 잔류하는 단핵구를 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터루킨-4 (IL-4)의 존재하에서 X-VIVO-15(TM) 배지 (캄브렉스(Cambrex))에서 6일 동안 배양하였다. 단핵구-유래된 세포는 CD14의 발현을 점진적으로 상실하였고, 수지상 세포의 표현형과 일치하는 CD80 발현을 미성숙 상태로 획득하였다.
7일에, 미성숙 DC를 통상적인 m7G 캡 유사체 및 (A)64 꼬리 또는 ARCA 및 (A)64 꼬리로 변형된 gag RNA의 5 ㎍ RNA/106 세포를 사용한 전기천공에 의해 형질감염시켰다. 구체적으로, 미성숙 수지상 세포를 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척하여 완충액 조건을 교환하고, 완충액에 재현탁시켰다. 수지상 세포를 전기천공에 의해 증폭된 병원체 RNA로 형질감염시켰다. 전기천공은 300 V, 100 Ω 및 150 μF에서 4 x 107 세포/mL을 함유하는 세포 현택액 500 ㎕를 함유하는 4 mm 갭 큐벳에서 수행하였다. 그 후, 세포를 성숙 사이토킨, IL-I β, IL-6, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 및 디노프로스톤 (프로스타글란딘 E2), 및 GM-CSF 및 인터루킨-4 (IL-4)를 함유하는 배지에서 4시간 내지 26시간 동안 배양하였다. 단백질 발현을 허용하기 위한 접종 후, 세포를 수거하고, 고정하고, 투과성으로 만들고, 항-GAG 마우스 모노클로날 항체 (NIH #4121)로 1:20 희석으로 염색하였다. 항체 결합을 당나귀 항-마우스 IgG- PE 이차 항체 (미국 뉴저지주 플란더스에 소재하는 리서치 다이아그노스틱스, 인크.(Research Diagnostics, Inc.))로 검출하였다. 세포를 셀퀘스트(Cellquest)(TM) 분석 프로그램을 이용하여 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACSC알리부르(alibur)(상표명) 유동 세포기 상에서 분석하였다. 도 12에 나타낸 결과는 본 발명의 방법에 따라 제조된 gag mRNA가 형질감염 후 4 및 26시간에 형질감염된 DC에서 발현될 수 있음을 지시한다.
실시예 13
HeLa 세포에서의 GAG 단백질 발현의 시간 과정
5x10s HeLa 세포를 플라스미드 pBKBHIOS로부터 증폭된 GAG에 대한 ARCA 및 (A)64 꼬리 변형된 RNA 2 ㎍을 갖는 트랜스메신저(Transmessenger)(상표명) (퀴아젠(등록상표))를 사용하여 형질감염시켰다. 음성 대조군 세포를 동일한 방법으로 처리하였지만, RNA는 형질감염 동안 첨가하지 않았다. 형질감염 후, 세포를 지시된 시간 기간 동안 배지 내로 정치시키고, 웨트턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. 세포를 등장성 단백질 추출 완충액 (0.01％ 트리톤 X-100, 15O mM NaCl, 10O mM 트리스(Tris) pH 7.6, 5 mM EDTA)에 용해시켰다. 각각의 조건으로부터의 단백질 용해물 25 ㎍을 SDS-PAGE 겔을 사용하여 용해하고, PVDF 막 상에 옮긴 후, 마우스 모노클로날 항-GAG 항체 (NIH AIDS 연구 및 참조 프로그램 Cat #4121)로 1:40 희석으로 접종하였다. 항체의 결합을 이차 염소 항-마우스 항체 (산타 크루즈(Santa Cruz) Cat #sc-2055) 및 ECL(TM) 플러스 시약 (아머샴(Amersham))으로 제조자의 권고사항에 따라 접종함으로써 가시화하였다. 재조합 정제된 GAG p24 200 ng (이뮤노디아그노스틱(Immunodiagnostic))을 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 13에 나타낸 결과는 HeLa 세포에서의 최대 단백질 발현이 형질감염 후 6 내지 15시간에 관찰됨을 지시한다.
실시예 14
수지상 세포에서의 REV 발현
수지상 세포를 수거하고, MART 또는 ARCA (A)64 꼬리 REV RNA의 5 ㎍ RNA/ 106 세포로 형질감염시키고, 신선한 사이토킨 및 성숙 칵테일을 갖는 배양물에 정치시켰다. 4시간에, 형질감염된 세포를 고정하고, 투과성으로 만들고, 항-REV 양 폴리클로날 항체 (노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals), cat.# ab9513)로 1/1000 희석으로 염색하였다. 항체 결합을 당나귀 항-양 IgG-PE 이차 항체 (미국 메사추세츠주 스왐프스코트에 소재하는 유나이티드 스테이츠 바이올로지칼스(United States Biologicals))로 검출하였다. 세포를 셀퀘스트(상표명) 분석 프로그램을 이용하여 벡톤-디킨슨 FACSC알리부르(상표명) 유동 세포기 상에서 분석하였다. 도 14는 형질감염 후 4시간에 DC에서의 rev mRNA의 발현을 나타낸다.
실시예 15
HeLa 세포에서의 REV 단백질 발현 시간 과정
HeLa 세포를 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 위해 ARCA 및 (A)64 꼬리 변형된 RNA로 형질감염시켰다. 단백질 용해물 40 ㎍을 SDS 겔 전기영동 상에 용해시키고, PVDF 막으로 옮겼다. 단백질을 폴리클로날 양 항-REV 항체 (노부스 바이올로지칼스 Cat # ab9513)로 1:1500 희석으로 접종함으로써 검출하였다. 항체의 결합을 이차 항-양 항체 (산타 크루즈 Cat #sc-2701)로 접종함으로써 가시화한 후, ECL 플러스 키트 (아머샴)로 현상하였다. 도 15에 나타낸 결과 및 또다른 독립 실험으로부터의 결과는 REV 단백질의 최대 발현이 형질감염 후 6 내지 20시간임을 지시한다.
실시예 16
수지상 세포에서의 Nef 발현
수지상 세포를 6일에 수거하고, GFP 또는 ARCA (A)64 꼬리 NEF RNA의 RNA/ 106 세포 4 ㎍으로 전기천공하고, 신선한 사이토킨 및 성숙 칵테일을 갖는 배양물에 정치하였다. 4 또는 24시간에, 형질감염된 세포를 고정하고, 투과성으로 만들고, 항-Nef 토끼 폴리클로날 항체로 (알. 세칼리 박사(Dr. R. Sekaly)의 호의로) 1/1000 (4시간) 또는 1/4000 (24시간) 희석으로 염색하였다. 항체 결합을 염소 항-토끼 이차 항체 (미국 알라바마주 버밍엄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠(Southern Biotechnology Associates))로 검출하였다. 세포를 셀퀘스트(상표명) 분석 프로그램을 이용하여 벡톤-디킨슨 FACSC알리부르(상표명) 유동 세포기 상에서 분석하였다. 도 16에 나타낸 결과는 nef가 형질감염후 4 및 24시간 둘다에서 발현됨을 지시한다.
실시예 17
수지상 세포에서 HIV 감염 및 발현된 환자로부터의 다중 HIV RNA 항원 유사종의 성공적인 증폭
본 발명자들의 신규한 다중 RT-PCR 절차를 입증하기 위해, 본 발명자들은 HIV 감염을 갖는 환자의 혈장으로부터의 4가지 항원을 증폭시켰다. HIV 역가가 각각 250,000, 146,148, 및 3,221,835 카피/mL인 3명의 환자의 보관된 동결된 혈장으로부터 추출된 RNA를 각각의 항원에 대해 RT-PCR에 사용하였다. 하기 T7 프로모터 및 64 dT 프라이머 군을 네스팅된 PCR에 사용하였다.
Figure 112007020535534-PCT00013
Figure 112007020535534-PCT00014
도 17A는 모든 3명의 HIV 감염을 갖는 환자에서의 모든 4가지 항원의 성공적인 증폭을 입증한다.
PCR의 네스팅된 라운드로부터의 생성물을 시험관내에서 전사하여 RNA를 생성하고, 모든 4가지 항원을 성공적으로 전사하였다 (도 17b). 이는 모든 PCR 단편이 PCR의 네스팅된 라운드 동안 T7 프로모터로 성공적으로 변형되었음을 지시하였다. 폴리T 64 신장물과 함께 T7 RNA 폴리머라제 결합 부위로의 성공적인 변형의 독립성 형태는 서브클로닝된 이차 PCR 단편으로부터 수득된 서열 데이타의 분석에 의해 제공되었다.
전방향 및 역방향 프라이머의 군을 사용한 본 발명자들의 전략은 HIV 감염을 갖는 각각의 환자에 고유한 다중 HIV 유사종을 증폭하도록 설계되었다. 개별 환자 사이의 HIV 항원 유사종의 변이 때문에, 상이한 프라이머 군은 상이한 유사종 서열을 어닐링하여, 증폭이 각각의 환자에 고유한 패턴으로 발생할 것으로 예상된다. 이는 HIV 감염을 갖는 3명의 환자에서의 Gag의 증폭에 대한 도 17a에서 입증되었다:레인 3의 프라이머 군은 환자 1에 대한 임의의 PCR 생성물을 생성하지 않았지만 환자 2에 대해 깨끗한 생성물을 초래한 반면, 레인 6의 프라이머 군은 환자 2로부터의 물질을 증폭하는데 실패하였지만 환자 1 및 환자 3의 RNA를 성공적으로 증폭하였다.
별개의 프라이머 군이 별개의 HIV 유사종을 포획하는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 매우 바이러스 감염된 환자 3으로부터 수득된 전장 PCR Gag 클론 (역가가 3,221,835 카피/mL인 HIV)을 시퀀싱하고 분석하였다 본 실험에서, Gag에 대한 예상된 크기의 별개의 밴드를 레인 1, 2, 4, 5 및 6에서 수득하였다 (도 17a). 이차 PCR 단편을 클로닝하고, 삽입물의 존재에 대해 스크리닝하고, 시퀀싱하였다. 별개의 프라이머 군 조합물에 의해 증폭된 PCR 생성물을 프라이머의 군당 총 10 양성 클론으로 별개로 클로닝하였다. 뉴클레오티드 서열 분석을 레이저진 소프트웨어 (DNAStar), 로스 알라모스 HIV 서열 데이타베이스 및 블라스트 분석을 이용하여 수행하였다. 새롭게 증폭된 뉴클레오티드 서열의 계통발생 관계를 이미 보고된 것과 상응하는 서열과의 비교에 의해 예측하였다. 공통적인 HIV 분기군의 컨선세스 서열을 로스 알라모스 HIV 서열 데이타베이스로부터 수득하고, 참조물로서 사용하였다. 뉴클레오티드 서열을 클러스탈(Clustal) V 소프트웨어를 이용하여 정렬하였다. 계통수를 레이저진 소프트웨어의 멕얼라인(MegAlign) 모듈을 이용하여 구축하였다. 환자 3으로부터의 별개의 Gag 클론의 계통발생 관계의 분석은 포획된 유사종의 광범위한 다양성을 밝혔다 (도 18A). 보다 중요하고 예측된 바와 같이, 일부 유사종은 특정 프라이머 군을 사용한 증폭에 의해 포획되었으며, 일부는 그렇지 않았다.
본 발명자들의 잠재적으로 중요한 이점은 숙주 CTL 하에서 진화하여 초기 면역 반응에 내성을 유도하는 HIV 이스케이프(escape) 돌연변이를 제시하는 유사종 항원의 증폭 및 항원 제시일 것이다. 환자 1에서, 본 발명자들은 Gag pi7 단백질에서 아미노산 치환을 생성할 수 있는 Gag 유사종에서의 서열 돌연변이를 확인한 후, 상기 돌연변이된 아미노산 서열을 로스 알라모스 분자 면역학 데이타베이스를 이용하여 예측된 HLA 에피토프와 비교하였다. 도 18b에 요약된 상기 데이타는 일부 포획된 돌연변이가 항원 제시와 관련된 HLA 에피토프의 관련 위치에 위치된 아미노산 전위를 초래함을 지시하였다. 이는 CTL 압력에 내성인 HIV 유사종의 진화를 반영할 수 있었다. 반대로, HIV 돌연변이의 결과로서 발생한 새롭고 관련된 면역원성 에피토프를 또한 본 발명자들의 새롭게 개발된 증폭 프로토콜을 이용하여 포획하였다. HIV 감염된 환자 1의 혈장에 대해 증폭된 전장 gag, rev 및 vpr의 계통발생 관계는 도 18C, 18D 및 18E에 나타낸다.
본 발명자들은 형질감염된 진핵 세포에서 RNA의 전사 및 HIV Gag, Vpr, Rev 및 Nef 항원 단백질의 발현을 HIV 감염을 갖는 3명 이상의 환자로부터 단리되고 증폭된 RNA를 사용하여 확인하였다. Gag에 대한 HIV 감염을 갖는 환자로부터 증폭된 캡핑되고 폴리아데닐화된 RNA를 35S 메티오닌의 존재하에서 시험관내에서 번역하였다. Vpr에 대한 증폭된 RNA를 HeLa 세포 내로 형질감염시키고, Rev 및 Nef에 대한 증폭된 RNA를 수지상 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염 12 내지 15시간 후, 세포를 수거하고 용해시켰다. 그의 세포 용해물을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고, PVDF 상으로 옮기고, 각각의 항원에 대한 특정 항체를 사용하여 프로빙하였다. Rev 단백질을 폴리클로날 양 항-Rev 항체 (노부스 바이올로지칼스)를 사용하여 검출하고, Vpr 단백질을 항-HIV-1Nu-3 Vpr 항혈청 (1-46) (NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램)을 사용하여 검출하고, Nef 단백질을 항-Nef 토끼 폴리클로날 항체 (알. 세칼리 박사의 호의로)를 사용하여 검출하였다. 상기 결과는 도 19에 요약하며, 이는 적절한 분자량 (56 kDa)을 갖는 단백질이 주형으로서 Gag RNA을 사용한 시험관내 전사에서 검출되었음을 나타낸다. 대조군 레인은 비-감염성 HIV 클론으로부터 증폭된 상응하는 항원 RNA로 형질감염된 세포로부터 수득된 용해물을 함유한다. NTC 레인은 임의의 RNA의 부재하에서 형질감염된 세포 또는 시험관내 전사 혼합물로부터 수득된 용해물을 함유하였다. 분자 마커의 분자량은 좌측에 지시되어 있다. 발현된 Gag 단백질의 확인은 대조군 플라스미드 pBKBHIOS로부터 증폭된 Gag RNA를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 환자 1 및 환자 3으로부터의 Gag RNA를 HeLa 세포 추출물에서 번역하였다. 다른 항원을 Vpr (10.5 kDa), Rev (11.4 kDa) 및 Nef (23.6 kDa)를 코딩하는 RNA로 형질감염된 수지상 세포 또는 HeLa 세포로부터의 세포 용해물에서 검출하였다. 환자 1에서, 항-Nef 항체으로 인지된 특정 밴드를 확산시키고, 일부 물질은 보다 높은 분자량으로 이동하였다. 한 가지 가능한 설명은 하나 초과의 Nef의 유사종, 또는 번역후 변형을 갖는 Nef의 돌연변이가 존재하며, 이는 분자량의 변이에 따라 이동하는 상이한 단백질을 유발한다는 것이다. 유사한 관찰은 환자 3으로부터의 Rev RNA으로 형질감염된 DC로부터 수득된 용해물에서 이루어졌다. 발현된 Gag 단백질의 확인은 항-Gag 모노클로날 항체 (베크만 코울터(Beckman Coulter))를 사용하여 환자 1로부터의 Gag RNA로 형질감염된 DC의 FACS 분석에 의해 확인하였다. 전기천공후 4시간에 수거된 DC의 세포내 FACS 염색은 양성적으로 세포를 염색하였다. ARCA 유사체로 변형된 RNA로 형질감염된 세포에서 항체의 결합은 통상적인 m7G 캡 유사체로 변형된 RNA로 형질감염된 것보다 높았다. RNA로 변형된 m7G 캡핑된 RNA 또는 ARCA의 동등한 질량을 사용하였고, 이는 ARCA-캡핑된 mRNA가 m7G 캡핑된 gag mRNA의 것과 비교하여 높은 단백질 발현을 초래하였음을 지시한다. 환자로부터 단리된 HIV 균주로부터 증폭된 Vpr은 HeLa 세포 뿐만 아니라 수지상 세포 (도시되지 않음)에서 발현되었다.
상기 실시예에서의 결과는 (1) 제한된 복잡성의 프라이머 군은 상이한 분기군을 스패닝하는 주형의 다양한 군으로부터의 의도된 생성물을 신뢰할 만하게 증폭하도록 엄격히 설계될 수 있음, (2) 네스팅된 PCR은 5' 말단에 대한 T7 프로모터 및 3' 말단에서 올리고-dT 꼬리를 첨가하도록 수행될 수 있음, (3) 환자 혈청에 존재하는 다중 HIV 유사종은 상기 방법에 의해 증폭될 수 있음, (4) 네스팅된 PCR 생성물은 캡핑되고 폴리아데닐화된 RNA로 전사될 수 있음, (5) 수지상 세포는 항원-특이적 RNA로 형질감염되고 FAC 분석에 의해 나타낸 바와 같은 예상된 단백질을 발현할 수 있음, 및 (6) 생성된 단백질은 형질감염된 세포의 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같은 정확한 분자량임을 입증한다. 이와 함께, 상기 관찰은 본 발명자들의 백신 설계 전략이 수지상 세포에 의한 항원 제시를 위한 다중 HFV 유사종의 증폭을 제공한다는 실질적인 증거를 제공한다. 또한, 프라이머의 군을 조합함으로써, AIDS 백신 기술에서 중요한 개발을 제공하는, HIV 감염을 갖는 개체 환자에 고유한 HIV 유사종 및 CTL 레퍼토리의 전체 넓이의 제시를 제공할 수 있다.
실시예 18
환자 혈장으로부터 증폭된 HIV mRNA로 형질감염된 수지상 세포는 자가 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 자극한다.
자가 HIV RNA를 본 발명의 프라이머를 사용하여 환자 혈장에서 HIV 균주를 증폭하여 HFV DNA를 생성한 후, 시험관내에서 전사하여 vpr, rev, nef 및 gag 폴리펩티드를 코딩하는 HIV mRNA를 생성하였다. 미성숙 DC를 CD40L을 코딩하는 RNA와 함께 4개의 자가 HFV 유전자 (Vpr, Rev, Nef 및 Gag)로 공동-형질감염시키고, 이어서 IFN-g의 존재하에서 배양하여 완전한 DC 성숙을 달성하였다. 항원 로딩된 성숙한 DC를 사용하여 자가 HIV 환자 PBMC를 자극하였다. 배양물에서 6일 후, PBMC를 회수하고, Vpr, Rev, Nef 및 gag (2개의 풀)에 대한 컨센서스 서열에 상응하는 펩티드 라이브러리에 중첩하는 4개의 개체로 재자극하였다. IFN-감마 양성 CD8+ T 세포의 빈도를 각각의 4개의 HIV 유전자를 갖는 1 ㎍ RNA/백만 DC로 로딩하고 (도 20, 좌측 컬럼), 병행 실험에서, 로딩된 Nef RNA는 0.25 ㎍/백만 DC로 감소된 반면, 다른 3개의 유전자는 각각 1 ㎍ RNA/백만 DC로 형질감염되었다 (도 20, 우측 컬럼). 결과는 Vpr, Rev 및 Gag mRNA에 대해 로딩된 Nef mRNA를 감소시키는 것이 Nef 항원에 대한 면역 반응을 포함함 없이 전체 면역성을 증진시킴을 나타낸다.
실시예 19
자가 HIC RNA로 형질감염된 성숙한 수지상 세포는 컨센서스 펩티드로 펄싱된 성숙한 DC보다 강한 회수 반응을 유도한다.
미성숙 DC를 단지 5 ㎍ eGFP RNA/백만 DC (음성 대조군), 또는 eGFP 형질감염된 DC로 형질감염시키고, 이어서 2개의 풀로서 gag 컨센서스 펩티드로 펄싱하였다. 별법으로, DC를 자가 Gag RNA (5 ㎍ RNA/백만 DC)로 형질감염시켰다. 모든 경우에, DC를 CD40L RNA로 공동-형질감염시키고, 이어서 IFN-감마에서 배양하여 완전한 성숙을 달성하였다. 항원-로딩된 DC를 CFSE로 이미 로딩된 PBMC로 공동-배양하였다. 6일 후, PBMC를 회수하고, 항원-반응성 (CFSE 저) 세포의 빈도를 측정하였다. 또한, CFSE 저 세포를 CTL 효과기 기능의 마커로서 그란짐 B에 대해 ICS에 의해 염색하였다. 도 21에 나타낸 결과는 gag 컨센서스 펩티드로 펄싱된 DC에 비해 자가 HIV gag RNA로 로딩된 DC에 의해 유도된 우수한 면역 반응을 입증한다.
실시예 19
환자에서 HIV의 다중 균주로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA로 로딩된 자가 수지상 세포 백신의 임상 시험
본 시험의 목적은 안전성, 및 수지상 세포 백신을 HAART 요법을 받은 HIV-감염된 환자에게 투여하는 것의 면역학적 반응을 검사하는 것이다. 본 연구의 일차적인 목적은 하기와 같다.
· HAART 요법을 받은 HIV-감염된 환자에서 RNA-로딩된 DC의 다중 투여의 안전성을 검사하기 위해
· 4, 8, 20, 32주, 및 36주 및/또는 연구/중지 비지트(visit)의 말단에서 5회 백신화의 연구의 과정 동안 8시간에 수집된 혈액 샘플 상에서의 세포내 사이토킨 염색 (ICS) 및 CSFE T 세포 증식 분석법을 이용함으로써 RNA-로딩된 DC 백신하에 대한 T-세포 반응을 평가하기 위해.
시험 설계
예비-치료 단계는 치료 단계의 시작 전에 외래환자를 기초로 수행될 것이다. 환자 적격은 스크리닝 평가를 통해 평가되며 기준선 평가에서 확인되었다. 상기 단계는 하기로 이루어진다.
· 스크리닝 비지트
· 혈액 드로잉
· 백혈구성분채집술 비지트 [관리 의사가 환자가 백혈구성분채집술에 적합한지를 결정한 후 일어남].
· 면역학적 모니터링 (샘플은 비지트 2 (스크리닝), 및 비지트 3 (백신화 이전의 기준선)에서 수집될 것임)
· 기준선 평가 (투여량의 제1 일에 수행되지만, 백신의 초기 투여 전에 수행될 것임).
치료 단계 동안, 환자는 연구 주수 0, 4, 8, 20 및 32에 진피내 백신화를 받을 것이다. 연구의 암(arm) 1에 무작위화된 환자는 0.6 mL의 부피로 1.2 x 107 형질감염된 DC를 받을 것이며, 연구의 암 2에 무작위화된 환자는 0.6 mL의 부피로 1.2 x 106 형질감염된 DC를 받을 것이다. 안전성 평가는 각각의 비지트에서 수행될 것이다. 면역학적 모니터링은 연구 주수 -4, 0, 4, 8, 20, 32의 각각의 후속 투여 및/또는 연구/중지 비지트 (최종 백신의 투여 후 2주의 최소) 후에, (스크리닝), 비지트 3 (백신화 전 기준선)에서 수행될 것이다.
안전성
· 각각의 백신화 전에 수득된 기준선 값으로부터의 생명 징후 (혈압, 심박수, 호흡수 및 체온)의 치료-출현 변화
· 치료-출현 AE의 발생
· 각각의 백신화 후 위치된 백신 주사 부위 반응의 치료-출현 변화
· 각각의 백신화 전후에 평가된 치료-출현 선병증, 압통 또는 염증 (서혜부 및 겨드랑이)
· 각각의 백신화 전에 수득된 임상적 실험 시험에서 기준선 값 (CTC에 의한 등급화 포함)로부터의 치료-출현 변화
· 치료 단계 동안 주기적 간격으로 물리적 실험 및 심전도 (ECG)의 치료-출현 변화
· 치료 단계 동안 주기적 간격으로 임상적 징후 및 증상 (예를 들어, 발진, 혈구감소증, 관절통) 및 실험적 평가 (ANA, RF, 항-dsDNA 항체, CH50, 항-갑상선 항체, 간접적 쿰브스(Coombs) 시험)
대상체의 선택 및 등록
적격을 결정하기 위한 스크리닝 및 평가는 연구 시작 전 2주 내에 완료되어야 한다.
포함 범주
임의의 허가된 ELISA 시험 키트에 의해 기록된 바와 같이, HIV-I 감염을 연구 시작 전 임의의 시간에 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 양성 HIV-I 배양물, HIV-I 항원, 혈장 HIV-I RNA, 또는 ELISA 이외의 방법에 의한 다른 제2 항체 시험은 별도의 증거 시험으로서 적용가능하다.
그의 가장 강력한 ART 처방을 현재 받은 대상체는 연구 시작 전 6개월 이상의 기간 동안 3개 초과의 항레트로바이러스 약물의 조합물로서 한정하였다. 대상체가 가장 강력한 ART 처방이 아닌 강력한 ART 처방을 현재 받고 있을 경우, 대상체는 스크리닝 HIV-I RNA 수준이 수득되는 날의 적어도 4주 전 동안 현재 강력한 ART 처방을 받아야 하고, 바이러스학적 실패 이외의 이유로 현재 강력한 ART 처방으로 변화되어야 한다.
주: 또다른 프로테아제 억제제와 조합으로 리토나비어(Ritonavir)는 하나의 항레트로바이러스 작용제로서 계수될 것이다.
연구 시작 전 6개월 (1개월은 30일과 같음) 이상의 기간 동안 400 카피/mL 이하의 HIV-I RNA 수준의 기록은 서로 별개의 3개 이상의 측정에 의해 적어도 1개월까지 기록되었으며, 제1 측정은 연구 시작 전 적어도 6개월에서 수행되었고, 다른 측정은 연구 시작 6개월 내에 수행되었다.
연구 시작 전 3개월 (1개월은 30일과 같음) 이상의 기간 동안 350 세포/mm3 이상의 현재 저항성 CD4+ T-세포 계수의 기록은 서로 별개의 3개 이상의 측정에 의해 적어도 1개월까지 기록되었으며, 제1 측정은 연구 시작 전 3개월 이상에서 수행되었고, 다른 측정은 연구 시작 1개월 내에 수행되었다.
임의의 AACTG-확인된 유동 실험에서 수득된 CD4+ 세포 계수는 350 세포/mm3 이상이다.
연구 스크리닝에서, HIV-I RNA 수준은 로슈 앰플리코어(Roche Amplicor) HIV-I 모니터(Monitor)(상표명) 초민감성 분석에 의해 200 카피/mL 이하이다.
남성 및 여성 연령은 18세 이상이다.
실험 값은 연구 시작 전 30일 내에 수득되었다.
· 크레아틴은 3 x ULN 이하이다.
· AST (SGOT), ALT (SGPT) 및 알칼리성 포스파타제는 5 x ULN 이하이다.
실험 값은 연구 시작 전 30일 내, 및 연구 시작 전 72 시간 내에 재차 수득되었다. 상기 값은 2개의 별개의 시점에서 수득되어야 한다.
· 절대 중성구 계수 (ANC)는 750/mm3 이상이다.
· 헤모글로빈은 8 g/dL 이상이다.
· 혈소판 계수는 75,000/mm3 이상이다.
· 생식 잠재성을 갖는 모든 여성 대상체에 대한 음성 임신 시험
배제 범위
연구 시작 전 14일 내에 임의의 급성 감염 또는 중증 의학적 질병. 대상체가 치료요법을 완료하거나 임상적으로 치료요법에 안정할 때까지 대상체는 검사자의 의견으로 연구 시작 전 14일 이상 동안 중증 질병 (전신성 치료 및/또는 입원을 요함)에 대해 상기 연구로부터 배재될 것이다.
연구 시작 6개월 내에 수득된 임의의 HIV-I RNA 값은 400 카피/mL 초과이다.
연구 시작 3개월 내에 수득된 임의의 CD4 T-세포 계수는 350 세포/mm3 미만이다.
림프절 조사의 병력
임의의 HIV 백신의 이전 용도.
연구 시작 전 45일 내에 히드록시우레아의 용도.
임신 및 수유.
전신성 코르티코스테로이드; 인터페론; 인터루킨; 탈리도미드; 사르그라모스팀 (과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 [GM-CSF]); 디니트로클로로벤젠 (DNCB); 티모신 알파, 티모펜틴, 이노시플렉스; 폴리리보뉴클레오시드; 디토카르브 나트륨과 같은 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는, 연구 시작 전 30일 내에 임의의 면역 조절제 또는 저해제의 수여
연구 약물(들) 또는 그의 제제에 대한 알러지/민감성.
검사자의 의견으로 활성 약물 또는 알코올 사용 또는 의존성은 연구 요구에 대한 부착을 방해할 것이다.
연구 시작 전 1년 내에 공지된 HIV-I 혈청전환
확장된 접근을 통해 수득되지 않은 임의의 검사적인 항레트로바이러스 작용제.
환자의 치료
연구 의약 및 투여량
백신은 자가 선택된 HIV RNA로 전기천공된 무균 가공된 성숙한 자가 수지상 세포로 이루어진다. 각각의 투여량은 1.2 x 107 세포/mL (암 1) 또는 1.2 x 106 (암 2)의 농도로 현탁된 0.66 cc 냉동보존된 세포를 함유하는 냉동바이알에서 제공되어 열-불활성화된 자가 혈장 중 10％ DMSO 및 5％ 글루코스에 현탁된 자가 증폭된 HIV RNA-로딩된 성숙한 DC를 생성할 것이다.
투여량 이론
상부 투여량 수준의 선택은 단일 백혈구성분채집술로부터 생성될 수 있고 6회 이상의 백신 (투여용으로 5회 및 품질 대조군용으로 1회)으로 제공될 수 있는 RNA 형질도입된 수지상 세포의 참여한 최대 수에 의해 유도되었다. 면역화 간격은 합리적인 시간 프레임 내에서 면역학적 반응을 입증하는데 종종 필요한 다중 면역화를 달성하도록 선택되었다.
투여량 및 투여
투여용 백신의 제조
백신은 환자에게 투여 직전에 극저온 저장으로부터 제거될 것이며, 개방된 팜(palm) 사이의 바이알을 감거나 폐쇄된 피스트(fist) 내의 바이알에 보유함으로써 해동되었다. 생성물은 3 내지 5분 내에 완전히 해동될 것이다. 상기 절차에서, 먼저 건조-쉬퍼로부터 제거될 경우 바이알이 매우 차갑기 때문에 주의를 기울여야 한다.
백신은 해동된 세포의 DMSO에의 노출을 최소화하도록 해동된 직후 투여되어야 한다.
사용 전에, 해동된 세포는 바이알을 탭핑함으로써 부드럽게 혼합되어야 한다. 바이알의 역류는 회피되어야 한다. 혼합 후, 백신은 통합 26-게이지 바늘 (제조자에 의해 공급됨)을 갖는 3개의 1 mL 알러지 주사기 (0.2 mL는 각각의 주사기 내로 드로잉될 것임) 내로 드로잉될 것이다.
백신 투여
백신은 주사기에 정착된 세포에 기인한 비동일한 투여량 전달을 방지하기 위해 주사기를 충전한 직후 투여되어야 한다.
백신은 진피내로 투여될 것이다. 투여는 연구 주수 0, 4, 8, 20 및 32에 일어날 것이다.
각각의 백신 주사 일에, 전체 투여량은 오른쪽 겨드랑이에서 시작된 후, 4개의 해부학적 부위 (오른쪽 겨드랑이, 왼쪽 겨드랑이, 왼쪽 서혜부 및 오른쪽 서혜부) 사이에 시계방향 회전한 단일 림프절 바신으로 표적화될 것이다. 주사는 가능한 가까운 관절에서 사지의 앞안쪽 측면에서 이루어져야 한다. 팔에 대해, 상박에서 팔꿈치의 전방 표면이 사용될 수 있다.
백신의 투여는 0.6 mL의 총 투여량에 대해 백신 0.2 mL를 전달하는 3회의 진피내 주사에 의해 전달되어야 한다. 각각의 주사 부위는 서로로부터 대략 5 cm이어야 한다. 누출을 최소화하도록 천천히 바늘을 빼도록 주의를 기울여야 한다. 누출률 (％)을 평균하고, 3회의 주사에 대해 가장 가까운 1/4에 대해서는 반올림하고, 환자의 CRF에 기록해야 한다. 연구 의약의 투여량 변화는 연구 동안 허용되지 않았다.
연구 치료 평가
환자가 정보 동의서 양식에 사인한 후, 사이트 직원은 스폰서를 갖는 환자를 등록할 것이다. 사이트 직원은 각각의 환자에 고유한 부위별 스크린 수를 스크린 비지트에서 할당할 것이다.
모든 예비-치료 평가가 적용하능한지 확인한 후, 환자는 ID 넘버가 주어지며 등록될 것이다. 최대 20명의 평가가능한 환자가 등록될 것이다. 밸혈구성분채집술 후 백신의 6회 이상의 투여량 (투여용으로 5회 및 품질 대조군용으로 1회)을 생성하기에 불충분한 세포를 갖는 환자는 연구로부터 빠질 것이다. 상기 환자는 제조 실패를 구성할 것이며, 연구에서 대체되지 않을 것이다. 5회 이상의 백신화를 완료하기 전 질환 진행 또는 백신 치료와 무관한 이유로 연구로부터 제거되거나 스스로 빠진 환자 (예를 들어 갑작스런 사망, 추적 소실)는 평가할 수 없고, 대체될 것이다. 검사자의 의견으로, 질환 진행이 제1 백신 주사가 이용가능하기 전에 다른 요법을 요할 경우, 환자는 질환 진행에 대한 연구로부터 계속되지 않을 것이며, 대체될 것이다.
허용되는 동시 의약(들)/치료(들)
환자는 동시 ART, 다른 면역저해제, 또는 임의의 다른 형태의 면역요법의 예외를 갖는 임의의 동시 의약을 취할 수 있다. 연구 동안 취해진 모든 동시 처방 및 방지된 동시 오버-더-카운트(over-the-counter) (OTC) 의약 (예를 들어 국소 스테로이드 등)은 CRF에 기록될 것이다. 비-방지된 동시 OTC 의약은 CRF에 기록되지 않을 것이다.
연구 의약 취급
백신 성분의 수집 및 쉬핑
혈액/혈장 표본 수집
백혈구성분채집술
· 환자는 COBE 스펙트라 백혈구성분채집술 시스템을 이용하여 임상적 부위의 백혈구성분채집술 공여 센터에서 백혈구성분채집술을 받을 것이다. 말초 정맥 접근이 부적당할 경우, 엄격한 이중 루멘 카테터가 목정맥 또는 쇄골하 정맥에 정치될 수 있다. 성분채집술 간호사는 스크리닝 비지트 동안 정맥 접근을 평가할 것이 권고된다.
· 백혈구성분채집술 생성물 대략 180 mL이 백혈구성분채집술 비지트 동안 수집될 것이다.
· 별개의 자가 혈장 대략 150 mL이 백혈구성분채집술 수집 동안 수집될 것이다.
· 환자는 그의 혈압을 기록하고, 혈액은 백혈구성분채집술 전 및 직후 미분을 사용한 완전혈액 세포 계수 (CBC)를 위해 드로잉될 것이다. 미분을 사용한 CBC는 또한 백혈구성분채집술 생성물 상에서 수행될 것이다.
· PBMC는 표준 임상적 실시 및 연구 참조 매뉴얼에서 공급된 지시서에 따라 멸균, 휴대용 일회-사용 세포성분채집술 백에서 수집될 것이다.
· 백혈구성분채집술 표본 및 자가 혈장 표본은 제조자에 의해 제공된 특정 쉬핑 용기에서 추가로 가공 없이 제조 실험실 장비로 옮겨질 것이다. 상기 생성물은 제어되어 유지되고, 모니터링되고, 용기에 분리되고, 시판되는 담체로 밤새 옮겨질 것이다.
· 백혈구성분채집술 생성물은 절차의 날에 연구 참조 매뉴얼의 지시서에 따라 제조자에 대해 쉬핑되어야 한다.
제조 설비에서, 백혈구성분채집술 생성물을 백신 제조에 적용가능한지 점검할 것이다. 생성물이 6가지 이상의 백신을 생성하기에 적합할 경우, 환자를 연구로부터 중단하였다.
백신에 대한 저장 조건
각각의 투여량의 백신은 0.6 mL의 총 부피 (암 1)에서 대략 1.2 x 10 세포 또는 0.6 mL의 총 부피 (암 2)의 1.2 x 106 세포일 것이다. 각각의 투여량의 백신은 냉동보존된 세포를 함유하는 냉동바이알에서 제공되어 열-불활성화된 자가 혈장 중 10％ DMSO 및 5％ 글루코스에 현탁된 자가 증폭된 HIV RNA-로딩된 성숙한 DC를 생성할 것이다. 각각의 치료일의 백신은 개별적으로 쉬핑될 것이다. 연구 의약의 원액은 -150℃ 이하의 온도에서 제어된 조건하에서 액체 질소 건조-쉬퍼에 옮겨질 것이다. 냉동바이알을 사용하기까지 부위에서 상기 건조 쉬퍼에 저장하였다. 쉬퍼는 쉽 후속 투여를 위해 제조자에게 즉시 돌려져야 한다.
시간 및 사건 스케줄
예비-치료 단계는 치료 단계의 시작 전에 외래환자를 기초로 수행될 것이다. 시간 라인은 도 22에 나타낸다. 예비-치료 단계의 총 기간은 6주일 것이다. 예비-치료 단계는 하기 비지트로 이루어진다.
스크린 비지트 (비지트 1)
백혈구성분채집술 비지트 (비지트 2)
기준선 평가 비지트 (비지트 3)
치료 단계
하기 연구 평가는 치료 단계 동안 수행되어야 한다.
면역학적 모니터링
임상적 안정성 종말점 이외에, 면역학적 반응이 평가될 것이다. 면역학적 모니터링은 비지트 1 (스크리닝 비지트), 비지트 3 (백신화 이전의 기준선), 연구 주 4, 8, 20, 32 주에 각각의 후속 백신의 투여 전에, 및 연구/중단 비지트의 마지막에 (최종 백신의 투여 후 최소 2주)에서 수행될 것이다.
혈액 샘플을 7개의 시점에서 수집하고, ICS (IFN-γ 및 IL-2 측정)에 의해 및 하기 방법에 따른 CFSE T 세포 증식에 의해 백신화에 반응하여 t-세포의 존재에 대해 평가하였다.
면역모니터링 분석에 대한 PBMC의 제조
장비/공급
1. 멸균 50 mL 폴리프로필렌 튜브
2. 37℃ 수조
3. 10 및 25 mL 피펫, 개별 포장됨
4. 2 mL 극저온 바이알
5. -8O℃ 동결기
6. 동결 용기 (날진(Nalgene))
7. 액체 질소 동결기
8. 혈구계
시약
1. 인간 AB 혈청 (게미니 바이오프로덕츠(Gemini BioProducts))
2. DMSO (Cat# D2650, 엔도톡신 시험됨, 시그마), DMSO는 개방 후 6개월 후에 끝난다.
3. RPMI 1640 (라이프 테크놀로지스((Life Technologies))
4. 인간 혈청 알부민 (5 g, cat# A5843, 저 엔도톡신, 시그마; 또는 세롤로지칼스 코포레이션(Serologicals Corp.))
12.5％ HSA 용액을 제조하기 위해, 5 g 병에 40 mis RPMI 1640을 첨가하였다. 전도에 의해 부드럽게 혼합하였다. HSA이 발포될 것이기 때문에 볼텍싱하지 않았다. 필터를 멸균하고 4℃에서 6개월 이하로 저장하였다.
5. 분석 매질: MATIS + 10％ 인간 AB 혈청
멸균 500 mL 병 내로 피펫팅하였다.
25O mis RPMI 1640
250 mis EHAA 10 mL 펜/스트렙(Pen/Strep) 용액
25 mis 200 mM L-글루타민
50 ㎕의 0.5 M 2-머캅토에탄올 용액
50 mis 열 불활성화된 인간 AB 혈청
병에 날짜 및 이니셜을 라벨링하였다.
4℃에서 저장하였다.
6. 트리판 블루(Trypan Blue) (PBS 중 0.4％, cat# T8154, 시그마)
절차
PBMC 동결
1. 4℃에서 날진 동결 용기에 정치하였다.
2. 하기로 냉동바이알을 라벨링하였다.
환자 ID
1O x IO6 PBMC
혈액 드로우 날짜 및 테크 이니셜
3. -2O℃ 동결기에서 라벨링된 냉동바이알을 정치하였다.
4. 각각의 냉동바이알에 대해, 총 부피 1 mL를 10 x 106 PMBC 당 첨가하였다.
5. 2X 동결 매질을 20 냉동바이알에 대해 제조하였다.
10 mis 12.5％ HSA 용액
2.5 mis DMSO
최소 30분 동안 혼합하고 얼음 상에서 정치하였다.
6. 냉각된 12.5％ HSA 용액에서 2 x 107 살아있는 림프구/mL에서 피콜 PBMC를 재현탁시켰다.
7. 부드럽게 튜브를 교반하면서, 동결된 2X 동결 매질을 세포 현탁액에 적가하였다.
8. 냉각된 냉동바이알을 -20℃ 및 냉동바이알 당 분취액 1 mL로부터 제거하였다.
9. PBMC이 분취되었을 때 냉동바이알을 얼음 상에 정치하였다.
10. 냉동바이알을 날진 동결 용기로 옮기고, -8O℃ 동결기에 정치하였다.
11. 장기 저장을 위해, cyrovials을 -80℃에서 동결건조 24시간 후 액체 질소 동결기 내로 옮겼다. 세포를 -20℃에서 일시적으로라도 결코 저장하지 않았다.
12. 표본 데이타베이스 및 동결기 결합기 둘다 상에 바이알 위치를 기록하였다 (박스 수 및 슬롯 수).
PBMC 해동
1. 세포 배양물 배지를 37℃ 수조에서 30분 동안 정치하였다.
2. 샘플당 50 mL 원심분리 튜브를 라벨링하고, 가온된 (22℃ 내지 37℃) 분석 매질 8 mis를 첨가하였다.
3. 냉동바이알을 액체 질소 동결기로부터 제거하고, 건조 얼음 상에 직접적으로 정치하였다.
4. 2개 이하의 냉동바이알를 시간에 해동하였다. 냉동바이알를 세포 현탁액이 거의 완전히 용해되거나 소량의 얼음이 잔류할 때까지 37℃ 수조에 정치하였다.
5. 냉동바이알 밖을 건조시키고, 70％ 에탄올로 닦았다.
6. 가온된 (22℃ 내지 37℃) 세포 배양 배지 1 mL을 해동된 세포에 천천히 첨가하였다.
7. 세포 현탁액을 배지 8 mis를 함유하는 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다.
8. 튜브를 칭량하고, 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.
9. 상청액을 흡인하고, 세포를 분석 배지 2 mL에 재현탁시켰다.
10. 수작업 세포 계수를 트리판 블루를 사용하여 수행하여 PBMC 생존성을 측정하였다.
ICS 프로토콜
장비/공급물
멸균 50 mL 폴리프로필렌 튜브
멸균 15 mL 폴리프로필렌 튜브
1 mL, 96 웰 둥근 바닥 플레이트
시약
인간 AB 혈청 (제미니 바이오프로덕츠)
RPMI 1640 (라이프 테크놀로지스)
PBS
PBS 2％ FCS
15 mer HIV 및 대조군 펩티드
브레펠딘 A
항체: CD4 APC-Cy7, CD27-PE, IL-2 FITC, IFN-γ APC, CCR7-PE Cy7, CD28 사이크롬(CyChrome) (BD) 및 CD45 RA ECD (코울터)
HIV 감염된 개체로부터의 PBMC
절차
1. PBMC 해동 (관련된 프로토콜 참조)
2. ICS
- 2.106 세포/1 mL/웰 (96 웰 깊은 둥근 바닥 플레이트)에 분배하였다. 본 발명자들은 6가지 색 염색을 위해 각각의 펩티드에 대해 5개의 웰을 준비하였다.
항-CD28 항체 및 CD49d (미국 캘리포니아주 샌 조스에 소재하는 벡톤 디킨슨)를 공동자극제로서 각각의 샘플에 첨가하였다 (1 ㎍/mL).
- 세포를 SEA (200 ng/mL) 또는
NS (음성 대조군)
펩티드(들) (5 ㎍/ml)
로 활성화시켰다.
- 모든 샘플을 37℃에서 인큐베이션하였다. 총 인큐베이션은 대략 12시간 동안일 것이다.
- 37℃에서 1 내지 1.5시간의 인큐베이션 후, 브레펠딘 A를 최종 농도 10 ㎍/mL로 첨가하였다.
- 세포를 총 12시간의 인큐베이션이 수행되었을 때 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 옮겼다.
- PBS 2％ FCS로 2회 세척하였다.
- 세포 표면 마커에 대해 염색하였다. PBS 2％ FCS 100 ㎕ 중 (CD4 APC-Cy7 (5 ㎕), CD27 PE ( 1O ㎕), CD28 사이크롬 (20 ㎕), CCR7-PE Cy7 (1O ㎕), CD45 RA 사이크롬 (10 ㎕).
- 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
- PBS 2％ FCS로 2회 세척하였다.
- 100 ㎕ PBS 및 100 ㎕ 4％ 파라포름알데히드를 첨가하였다.
- 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
- 투과 완충액 (PBS 중 0.5％ 사포닌. 매 시간에 신선하게 제조됨)으로 2회 세척하였다.
- 50 ㎕ 투과 완충액을 첨가하였다.
- 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
- 투과 완충액 50 ㎕ 중 세포내 사이토킨 IL-2 FITC (1 ㎕), IFN-γ APC (10 ㎕)에 대해 염색하였다.
- 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
- PBS 2％ FCS에서 2회 세척하였다.
- 100 ㎕ PBS 및 100 ㎕ 4％ 파라포름알데히드를 첨가하였다.
- 다음날 세포를 FACS 상에서 분석하였다.
대조군:
- 음성 대조군으로서 비염색된 세포.
- 표면 염색을 위한 이소형 대조군.
- 세포내 염색을 위한 이소형 대조군.
- 양성 대조군.
투과 대조군 (펌-어-슈어(Perm-a-sure) = 구조적으로 발현된 인간 세포 단백질을 인지함): 하나의 샘플은 투과성일 것이며, 하나는 그렇지 않을 것이다.
활성화 대조군: 하나의 샘플은 활성화 배경 대조군이 없는 것으로서 비자극되어 남을 것이다.
CSFE T 증식 분석
시약:
· SEB 또는 SEA 원액 1 mg/mL
· 5-6-카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) (분자 프로브, cat# C-1157)
· 세포 표면 마커: FL2 (PE), FL3 (PerCP 또는 사이크롬) 및 FL4 (APC)-컨쥬게이션된 항체
- PBS
· 염색 세척 완충액: PBS 2％ FCS
· RPMI-10 인간 AB 혈청 (시그마).
절차:
적정
CFSE 무수 시약 등급 DMSO에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. CFSE의 새로운 제조물은 최적 염색 결과를 수득하기 위해 적정되어야 한다. 적정을 위해, 0.5 - 5 μM CFSE 사이의 농도의 동등한 부피를 PBMC (1 x 1O7/mL)에 첨가하고, 실온에서 8분 동안 혼합하면서 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. HS 동일한 부피를 1분 동안 첨가함으로써 반응을 켄칭하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 37℃에서 5％ CO2에서 10％ HS를 함유하는 RPMI 중 1 x 1O6/mL에서 밤새 배양하고, 다양한 농도로 처리된 세포의 형광 강도를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 최적 CFSE 농도는 모든 세포를 유동 세포기 (FL1 채널)에서 103 및 104 로그 단위의 형광 강도에서 염색한 것으로서 정의된다. 본 발명자들은 염색한 시간과 다음날 사이에 형광 강도가 감소하는 것을 관찰하여, 모든 적정 결과 및 실험 데이타를 상기 언급된 조건에서 접종 후 24시간만에 수집하였다. FL2 (PE) 및 FL3 (PerCP 또는 사이크롬)-컨쥬게이션된 표면 마커를 시험될 모든 CFSE 농도에서 전압을 설정하고 보정하기 위해 첨가해야 한다 (CFSE 형광이 매우 높을 경우, FL2 및 FL3를 상쇄하는 것이 거의 불가능하다). 본 발명자들의 실험에서, 통상적으로 사용된 최종 CFSE 농도는 0.5 내지 1.25 μM로 다양하다.
염색
1) PBS 중 10 백만/mL에서 PBMC를 재현탁하였다.
2) 2X CFSE 용액을 제조하였다 (최종 작업 용액이 1.5 μM일 경우, 3 μM 용액을 제조하였다).
3) 2X CFSE 1 부피를 PBMC에 첨가하였다.
4) 빛이 없는 후드하에서 부드럽게 혼합하면서 8 내지 10분 동안 인큐베이션하였다.
5) 튜브 부피를 RPMI 10％ HS로 완료시킴으로써 켄칭하였다.
6) 세포를 수집하고 (7분, 1400 PRM), 완료 배지로 mL 당 1백만에서 재현탁하였다.
7) 세포를 96 깊은-웰 플레이트 (1 내지 2백만/웰)에 분배하고, 증식을 위한 양성 대조군으로서 SEB (1 ㎍/mL 또는 SEA 50 내지 100 ng/mL), 단일 펩티드 1O ㎍/mL, 펩티드 풀을 사용할 경우 2 ㎍/mL/펩티드, 재조합 단백질 2 ㎍/mL로 자극하였다.
8) 37℃에서 4 내지 7일 동안 인큐베이션하였다.
9) 상청액 800 ㎕을 취하고, 세포를 바닥에 두었다. 세포를 멀티채널 피펫맨을 사용하여 96 V 바닥 플레이트 내로 옮겼다.
10) PBS 2％ FCS (10O ㎕)로 세척하였다.
11) PBS 2％ FCS 중 표면 마커 50 ㎕에 대해 염색하였다.
12) 실온에서 20분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다.
13) PBS 2％ FCS (150 ㎕)로 세척하였다.
14) PBS 2％ FCS 중 2％ 포름알데히드 400 ㎕에 재현탁하였다.
15) 유동 세포기 상에서 데이타를 얻었다.
안전성 평가
환자 안전성은 의학적 병력, 임상적 실험실 시험, ECG, 생명 징후 측정 및 AE 평가를 비롯한 물리적 실험에 의해 평가될 것이다. 안전성 변수는 혈액학적 및 혈액 화학 파라미터를 비롯한 수지상 세포의 투여와 관련된 부작용의 발생 및 중증도의 등급을 포함할 것이다. 상기 변수는 또한 자가면역성 평가, 선병증 평가, 및 위치화된 백신 주사 부위 반응에 대한 평가를 포함할 것이다. 모든 안전성 절차 및 평가의 결과는 연구 전반에 걸쳐 모니터링될 것이다.
물리적 실험 및 의학적 병력
스크린 비지트 동안, 의학적 병력은 1) 신체 시스템의 점검 및 2) ART를 비롯한 처방 의약의 사용에 특별한 주의가 기울여질 것이다. 스크리닝 비지트에서, 성분채집술 간호사는 환자의 정맥 접근을 가시적으로 평가할 것이 권고된다.
물리적 실험은 치료 단계 동안 스크린 비지트, 기준선 평가 비지트, 및 각각의 후속 비지트에서 수행될 것이다. 물리적 실험은 또한 연구 중단에서 수행될 것이다. 하기 카테고리 내의 물리적 발견이 평가될 것이다: 신경학적, 심혈관, 호흡, 림프, 피부, 복부, 머리, 귀, 눈, 코, 목구멍 및 알러지.
임상적 실험실 평가
임상적 화학, 혈액학 및 뇨검사 파라미터의 측정 및 평가에 대한 혈액 및 뇨 표본은 연구 동안의 다양한 시점에서 수집될 것이다. 하기 파라미터에 대한 값이 수득될 것이다.
임상적 화학 평가
나트륨
칼륨
염화물
크레아티닌
칼슘
SGOT (AST) (혈청 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나제) SGPT (ALT) (혈청 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제)
알칼리성 포스파타제
빌리루빈 (총)
LDH (스크린만) (락트산 데히드로게나제)
혈청 알부민
혈액학 평가
미분을 사용한 완전 혈액 세포 계수
혈소판 계수
헤모글로빈 (Hgb)
적혈구용적물
프로트롬빈 시간 (PT) (단지 스크린)
부분적 트롬보플라스틴 시간 (PTT) (단지 스크린)
뇨검사
단지 계량봉 (단백질, 글루코스, 헤모글로빈, pR 및 케톤 포함), 및 임상적으로 지시될 경우 현미경
연구 동안 수행된 임상적 실험실 시험의 결과를 검사자에 의해 평가하여 연구에 참여하기 위한 각각의 환자의 계속되는 적격을 결정해야 한다. 값이 정상적인 참조 범위 밖일 경우, 검사자는 CTC 당 독성 등급을 할당하고, 값이 연구의 내용 내에서 임상적으로 유의한지 여부를 평가해야 한다. 검사자에 의해 임상적으로 유의하게 여겨진 모든 비정상적 실험실 값은 CRF의 AE 페이지에 나타내어져야 한다. 실험실 비정상치가 의학적으로 정의된 진단 또는 증후군과 명백히 관련될 경우, 진단 또는 증후군은 개별 실험실 값이 아닌 AE 페이지에 기록될 것이다. 비정상적 값이 진단 또는 증후군과 관련될 경우, 실험실 값은 AE 페이지에 기록될 것이다.
생명 징후 및 체중
생명 징후는 수축기 혈압 및 확장기 혈압, 심박수, 호흡수 및 체온을 포함한다. 환자의 체중과 함께 상기 측정치는 스크린 비지트, 백혈구성분채집술 비지트 (단지 예비- 및 후기-백혈구성분채집술 혈압), 기준선 평가 비지트에서, 모든 투여량 비지트에서 (백신화 및 제1 시간 후-백신화에 대한 모든 15분 전, 및 생명 징후에 대한 후-백신화 제2 시간 동안 매 30분), 및 연구 중단에서 측정될 것이다. 생명 징후 측정은 시팅 위치에서 5분 후에 수행될 것이다. 다른 측정 또는 절차는 상기 5분 기간 동안 수행되지 않을 것이다.
자가면역성 평가
자가면역성 평가는 임상적 징후 및 증상 (예를 들어 발진, 저혈소판증, 관절통) 및 ANA, RF, 항-dsDNA 항체, CHso, 항-갑상선 항체의 실험실 평가, 및 간접 쿰브스 시험에 의해 측정될 것이다. 평가는 스크린 비지트, 및 각각의 후속 비지트에서 일어날 것이다. 상기 측정은 또한 연구 중단에서 반복될 것이다.
선병증 평가
배수 림프절 (겨드랑이 및 서혜부)은 크기, 유연성 또는 염증의 변화에 대해 평가될 것이다. 평가는 기준선 평가 비지트, 및 각각의 후속 비지트에서 수행될 것이다. 또한, 환자는 비지트 사이에 집에서 절간(nodal) 불편함을 기록할 것이다.
백신 주사 부위 반응 평가
백신 주사 부위 반응 평가는 제1 시간 후-백신화에 대해 매 15분, 제2 시간 후-백신화에 대해 매 30분, 및 환자에 의한 48시간 후-백신화에서 수행될 것이다. 환자는 그의 48시간 관찰을 기록하는 카드를 받을 것이다. 사이트 직원은 각각의 백신화 후 2 내지 6일 내에 상기 정보를 회수하기 위해 환자에게 전화할 것이다. 등급 2의 부위 주사 반응을 보고한 환자에 대해, 주요 검사자 또는 설계자는 환자에게 훈련된 직원에 의해 부위 주사 반응의 평가에 대한 클리닉을 돌려줄 것을 요구할 것이다. 반응은 CTC에 따라 등급화될 것이며, 이는 CRF의 AE로 기록될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Argos Therapeutics, Inc. Nicolette, Charles Tcherepanova, Irina Harris, Jason Healey, Don <120> STRAIN-INDEPENDENT AMPLIFICATION OF PATHOGENS AND VACCINES THERETO <130> MER029WO <150> US 60/522,310 <151> 2004-09-14 <150> US 60/665,130 <151> 2005-03-25 <160> 408 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 actctggtaa ctagagatcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 actctgataa ctagagatcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 actctggtag ctagagatcc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 4 aattttgact agcggaggc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 5 aaattttgac tagcggaggc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 6 aaatttttga 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tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatgtgta cttctga 87 <210> 362 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 362 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatgtgta cttccga 87 <210> 363 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 363 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatgtgta tttctga 87 <210> 364 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 364 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatgtgca cttctga 87 <210> 365 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 365 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatatgta cttctga 87 <210> 366 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 366 tttttttttt 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taccaatcta gcatccccta gtgggatgtg tacttctgaa 4440 cttattcttg gatgagggct ttcatagtga tgtctataaa accatcccct agctttccct 4500 gaaacataca tatggtgttt tactaaactt ttccatgttc taatcctcat cctgtctact 4560 tgccacacaa tcatcacctg ccatctgttt tccataatcc ctaatgatct ttgcttttct 4620 tcttggcact acttttatgt cactattatc ttgtattact actgcccctt cacctttcca 4680 gaggagcttt gctggtcctt tccaaagtgg atttctgctg tccctgtaat aaacccgaaa 4740 attttgaatt tttgtaattt gtttttgtaa ttctttagtt tgtatgtctg ttgctattat 4800 gtctactatt ctttcccctg cactgtaccc cccaatcccc ccttttcttt taaaattgtg 4860 gatgaatact gccatttgta ctgctgtctt aagatgttca gcctgatctc ttacctgtcc 4920 tataattttc tttaattctt tattcataga ttctactact ccttgacttt ggggattgta 4980 gggaattcca aattcctgct tgattcccgc ccaccaacag gcggccctaa ccgtagcacc 5040 ggtgaaattg ctgccattgt cagtatgtat tgtttttact ggccatcttc ctgctaattt 5100 taaaagaaaa tatgctgttt cctgccctgt ttctgctgga ataacttctg cttctatata 5160 tccactggct acatgaactg ctaccaggat aacttttcct tctaaatgtg tacaatctag 5220 ttgccatatt cctggactac 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ggccttgccc ctgcttctgt atttctgcta ttaagtcttt 6120 tgatgggtca taatacactc catgtactgg ttcttttaga atctctctgt tttctgccag 6180 ttctagctct gcttcttctg ttagtggtat tacttctgtt agtgctttgg ttcctctaag 6240 gagtttacat aattgcctta ctttaatccc tgggtaaatc tgacttgccc aattcaattt 6300 ccccactaac ttctgtatgt cattgacagt ccagctgtct ttttctggca gcactatagg 6360 ctgtactgtc catttatcag gatggagttc ataacccatc caaaggaatg gaggttcttt 6420 ctgatgtttt ttgtctggtg tggtaagtcc ccacctcaac agatgttgtc tcagctcctc 6480 tatttttgtt ctatgctgcc ctatttctaa gtcagatcct acatacaaat catccatgta 6540 ttgatagata actatgtctg gattttgttt tctaaaaggc tctaagattt ttgtcatgct 6600 actttggaat attgctggtg atcctttcca tccctgtgga agcacattgt actgatatct 6660 aatccctggt gtctcattgt ttatactagg tatggtaaat gcagtatact tcctgaagtc 6720 ttcatctaag ggaactgaaa aatatgcatc acccacatcc agtactgtta ctgatttttt 6780 cttttttaac cctgcgggat gtggtattcc taattgaact tcccagaagt cttgagttct 6840 cttattaagt tctctgaaat ctactaattt tctccattta gtactgtctt ttttctttat 6900 ggcaaatact ggagtattgt atggattttc aggcccaatt tttgaaattt tcccttcctt 6960 ttccatctct gtacaaattt ctactaatgc ttttattttt tcttctgtca atggccattg 7020 tttaactttt gggccatcca ttcctggctt taattttact ggtacagtct caatagggct 7080 aatgggaaaa tttaaagtgc aaccaatctg agtcaacaga tttcttccaa ttatgttgac 7140 aggtgtaggt cctactaata ctgtacctat agctttatgt ccacagattt ctatgagtat 7200 ctgatcatac tgtcttactt tgataaaacc tccaattccc cctatcattt ttggtttcca 7260 tcttcctggc aaactcattt cttctaatac tgtatcatct gctcctgtat ctaatagagc 7320 ttcctttagt tgccccccta tctttattgt gacgaggggt cgttgccaaa gagtgacctg 7380 agggaagtta aaggatacag ttccttgtct atcggctcct gcttctgagg gggagttgtt 7440 gtctctaccc cagacctgaa gctctcttct ggtggggctg ttggctctgg tctgctctga 7500 agaaaattcc ctggccttcc cttgtaggaa ggccagatct tccctaaaaa attagcctgt 7560 ctctcagtac aatctttcat ttggtgtcct tcctttccac atttccaaca gccctttttc 7620 ctaggggccc tgcaatttct ggctgtgtgc ccttctttgc cacaattgaa acacttaaca 7680 atctttcttt ggttcctaaa attgcctctc tgcatcatta tggtagctga atttgttact 7740 tggctcattg cttcagccaa aactcttgcc ttatggccgg gtcctcctac tccctgacat 7800 gctgtcatca tttcttctag tgtagccgct ggtcccaatg cttttaaaat agtcttacaa 7860 tctgggttcg cattttggac caacaaggtt tctgtcatcc aattttttac ctcctgtgaa 7920 gcttgctcgg ctcttagagt tttatagaac cggtctacat agtctctaaa gggttccttt 7980 ggtccttgtc ttatgtccag aatgctggta gggctataca ttcttactat tttatttaat 8040 cccaggatta tccatctttt ataaatttct cctactggga taggtggatt atttgtcatc 8100 catcctattt gttcctgaag ggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc ccttggttct 8160 ctcatctggc ctggtgcaat aggccctgca tgcactggat gcactctatc ccattctgca 8220 gcttcctcat tgatggtctc ttttaacatt tgcatggctg cttgatgtcc ccccactgtg 8280 tttagcatgg tgtttaaatc ttgtggggtg gctccttctg ataatgctga aaacatgggt 8340 atcacttctg ggctgaaagc cttctcttct actactttta cccatgcatt taaagttcta 8400 ggtgatatgg cctgatgtac catttgcccc tggatgttct gcactatagg gtaattttgg 8460 ctgacctgat tgctgtgtcc tgtgtcagct gctgcttgct gtgctttttt cttacttttg 8520 ttttgctctt cctctatctt gtctaaagct tccttggtgt cttttatctc tatcctttga 8580 tgcacacaat agagggttgc tactgtatta tataatgatc taagttcttc tgatcctgtc 8640 tgaagggatg gttgtagctg tcccagtatt tgtctacagc cttctgatgt ttctaacagg 8700 ccaggattaa ctgcgaatcg ttctagctcc ctgcttgccc atactatatg ttttaattta 8760 tattttttct ttccccctgg ccttaaccga attttttccc atcgatctaa ttctcccccg 8820 cttaatactg acgctctcgc acccatctct ctccttctag cctccgctag tcaaaatttt 8880 tggcgtactc accagtcgcc gcccctcgcc tcttgccgtg cgcgcttcag caagccgagt 8940 cctgcgtcga gagagctcct ctggtttccc tttcgctttc aggtccctgt tcgggcgcca 9000 ctgctagaga ttttccacac tgactaaaag ggtctgaggg atctctagtt accagagtca 9060 cacaacagac gggcacacac tacttgaagc actcaaggca agctttattg aggcttaagc 9120 agtgggttcc ctagttagcc agagagctcc caggctcaga tctggtctaa ccagagagac 9180 ccct 9184 <210> 390 <211> 87 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 390 aaaataggag gacaactgaa agaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta 60 gaagatataa atttgccagg gaaatgg 87 <210> 391 <211> 87 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 391 aaagtaggag gacagctaaa agaagctcta ttagacacag gagcagatga tacagtatta 60 gaagacataa atttgccagg aaaatgg 87 <210> 392 <211> 87 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 392 aagatagggg ggcaactaaa ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta 60 gaagaaatga gtttgccagg aagatgg 87 <210> 393 <211> 185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 393 tycttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa 60 cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc 120 aggagccgat agacaaggar mtgtatcctt trrcttccct cagatcactc tttggcaacg 180 acccc 185 <210> 394 <211> 185 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 394 ttcttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa 60 cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc 120 aggagccgat agacaaggag atgtatcctt tggcttccct cagatcactc tttggcaacg 180 acccc 185 <210> 395 <211> 185 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 395 ttcttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa 60 cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc 120 aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt taacttccct cagatcactc tttggcaacg 180 acccc 185 <210> 396 <211> 149 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 396 tccttcagag cagaccagag ccaacagccc caccagcaga gagcttcagg tttggggaag 60 aggtaacaac tccctctcag aaacaggagc cgatagacaa ggagatgtat cctttggctt 120 ccctcagatc actctttggc aacgacccc 149 <210> 397 <211> 149 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 397 tccttcagag cagaccagag ccaacagccc caccagaaga gagcttcagg tctggggtag 60 agacaacaac tccccctcag aagcaggagc cgatagacaa ggaactgtat cctttaactt 120 ccctcagatc actctttggc aacgacccc 149 <210> 398 <211> 100 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 398 ttagataaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa agacacagca agcagcagct 60 gacacaggaa acagcagcaa gcaggtcagc caaaattacc 100 <210> 399 <211> 100 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 399 atggacccac ctcccaaccc cgagggaacc cgacaggccc gaaggaatcg aagaagaagg 60 tggagagaga gacagagaca catccggaag attagtggat 100 <210> 400 <211> 180 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 400 gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcccaggcc atggcttcat 60 ggattggggc agcatatcta tgaaacttat ggggatactt ggacaggagt ggaagccata 120 ataagaattc tgcaacaact gctgtttatc catttcagaa ttgggtgtcg acatagcaga 180 <210> 401 <211> 96 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 401 Met Glu Gln Ala Pro Glu Asp Gln Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn 1 5 10 15 Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Glu Ala Val Arg 20 25 30 His Phe Pro Arg Ile Trp Leu His Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu 35 40 45 Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala Gly Val Glu Ala Ile Ile Arg Ile Leu 50 55 60 Gln Gln Leu Leu Phe Ile His Phe Arg Ile Gly Cys Arg His Ser Arg 65 70 75 80 Ile Gly Val Thr Arg Gln Arg Arg Ala Arg Asn Gly Ala Ser Arg Ser 85 90 95 <210> 402 <211> 40 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 402 Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Glu Ala Val Arg His Phe Pro Arg 1 5 10 15 Pro Trp Leu His Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu Thr Tyr Gly Asp 20 25 30 Thr Trp Thr Gly Val Glu Ala Ile 35 40 <210> 403 <211> 21 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 403 Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His 1 5 10 15 Ile Val Trp Ala Ser 20 <210> 404 <211> 21 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 404 Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Arg Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His 1 5 10 15 Ile Val Trp Ala Ser 20 <210> 405 <211> 18 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 405 Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Cys <210> 406 <211> 18 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 406 Thr Gly Ser Glu Glu Phe Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Cys <210> 407 <211> 1816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 407 cttctctgcc agaagatacc atttcaactt taacacagca tgatcgaaac atacaaccaa 60 acttctcccc gatctgcggc cactggactg cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta 120 cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat 180 agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa 240 acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatcct tactgaactg tgaggagatt 300 aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa 360 gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata 420 agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc 480 atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga 540 ctctattata tctatgccca agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct 600 ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc cccggtagat tcgagagaat cttactcaga 660 gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct tgcgggcaac aatccattca cttgggagga 720 gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg 780 agccatggca ctggcttcac gtcctttggc ttactcaaac tctgaacagt gtcaccttgc 840 aggctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcacagcggt taagcccacc 900 ccctgttaac tgcctattta taaccctagg atcctcctta tggagaacta tttattatac 960 actccaaggc atgtagaact gtaataagtg aattacaggt cacatgaaac caaaacgggc 1020 cctgctccat aagagcttat atatctgaag cagcaacccc actgatgcag acatccagag 1080 agtcctatga aaagacaagg ccattatgca caggttgaat tctgagtaaa cagcagataa 1140 cttgccaagt tcagttttgt ttctttgcgt gcagtgtctt tccatggata atgcatttga 1200 tttatcagtg aagatgcaga agggaaatgg ggagcctcag ctcacattca gttatggttg 1260 actctgggtt cctatggcct tgttggaggg ggccaggctc tagaacgtct aacacagtgg 1320 agaaccgaaa cccccccccc cccccccgcc accctctcgg acagttattc attctctttc 1380 aatctctctc tctccatctc tctctttcag tctctctctc tcaacctctt tcttccaatc 1440 tctctttctc aatctctctg tttccctttg tcagtctctt ccctccccca gtctctcttc 1500 tcaatccccc tttctaacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1560 acacacacac acacacacac agagtcaggc cgttgctagt cagttctctt ctttccaccc 1620 tgtccctatc tctaccacta tagatgaggg tgaggagtag ggagtgcagc cctgagcctg 1680 cccactcctc attacgaaat gactgtattt aaaggaaatc tattgtatct acctgcagtc 1740 tccattgttt ccagagtgaa cttgtaatta tcttgttatt tattttttga ataataaaga 1800 cctcttaaca ttaaaa 1816 <210> 408 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 408 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260

Claims (80)

1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC).
제1항에 있어서, 상기 핵산이 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래된 것인 APC.
제2항에 있어서, 상기 병원체 폴리뉴클레오티드가 상기 병원체의 다중 균주 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계된 프라이머를 사용하여 증폭된 것인 APC.
제2항에 있어서, 상기 핵산이 RNA인 APC.
제3항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 전사된 RNA인 APC.
제1항에 있어서, 상기 APC가 수지상 세포인 APC.
제1항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스인 APC.
제6항에 있어서, 상기 병원체가 레트로바이러스인 APC.
제7항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV, HTLV 및 HCV로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 APC.
제9항에 있어서, 상기 병원체가 HIV이고, 상기 병원체 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드, rev 폴리펩티드, vpr 폴리펩티드, env 폴리펩티드, nef 폴리펩티드, vpu 폴리펩티드, vif 폴리펩티드 및 pol 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터의 2종 이상을 포함하는 것인 APC.
제1항에 있어서, 상기 APC가 상기 대상체로부터의 것이거나 상기 대상체로부터 유래된 것인 APC.
제1항에 있어서, 시험관내 전사된 CD40L mRNA를 추가로 포함하는 APC.
1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC).
제13항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 APC.
제13항에 있어서, 병원체가 바이러스인 APC.
제15항에 있어서, 상기 바이러스가 레트로바이러스인 APC.
제16항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV, HTLV 및 HCV로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 APC.
제17항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV인 APC.
제18항에 있어서, 상기 병원체 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드, rev 폴리펩티드, vpr 폴리펩티드, env 폴리펩티드, nef 폴리펩티드, vpu 폴리펩티드, vif 폴리펩티드 및 pol 폴리펩티드로 이루어진 HFV 폴리펩티드 군으로부터의 2종 이상을 포함하는 것인 APC.
제1항의 APC 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신.
제13항의 APC 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신.
제20항의 백신을 병원체-감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체- 감염된 환자의 치료 방법.
제21항의 백신을 병원체-감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체-감염된 환자의 치료 방법.
1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체-감염된 개체로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 개체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하는 자가 백신의 제조 방법.
제24항에 있어서, 상기 핵산이 상기 병원체의 다중 균주 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 프라이머가 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고,
b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택함으로써 선택되는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 방법.
제27항에 있어서, 상기 수지상 세포가 미성숙 수지상 세포인 방법.
제28항에 있어서, 형질감염에 이어 상기 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 수지상 세포가 성숙 수지상 세포인 방법.
제24항에 있어서, 상기 핵산이 CD40L을 코딩하는 mRNA를 추가로 포함하는 것인 방법.
서열 2, 3, 5 내지 15 또는 18의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 전방향 프라이머; 및
서열 23 내지 25, 28 내지 31, 35, 39, 42, 43, 102 내지 105, 109 내지 112 또는 113의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 역방향 프라이머;
서열 45, 46, 47, 50 내지 52, 54 또는 55의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 전방향 프라이머;
서열 62, 63, 71 내지 73, 114 내지 120, 201 내지 203, 264 내지 272 또는 273의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 역방향 프라이머;
서열 75, 78 또는 85의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 전방향 프라이머;
서열 92, 93, 97, 99 내지 101, 123 내지 125, 193, 194 또는 195의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 역방향 프라이머;
서열 274 내지 279, 290 내지 292 또는 293의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 전방향 프라이머;
서열 157 내지 159, 280 내지 289, 294 내지 298 또는 299의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방향 프라이머;
서열 367 내지 370 또는 371의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머;
서열 300 내지 310 또는 311의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vif 전방향 프라이머;
서열 312 내지 319, 329 내지 331 또는 332의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpu 전방향 프라이머;
서열 320 내지 328, 333 내지 335 또는 336의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpu 역방향 프라이머;
서열 337 내지 344, 356 내지 359 또는 360의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV pol 전방향 프라이머; 및
서열 345 내지 355, 361 내지 365 또는 366의 올리고뉴클레오티드로 본질적 으로 이루어진 HIV pol 역방향 프라이머
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 조성물.
a. 서열 1 내지 20, 162, 164, 168 및 169로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 gag 전방향 프라이머; 및
b. 서열 21 내지 43, 102 내지 113, 172 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 gag 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 44 내지 58, 176 및 177로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpr 전방향 프라이머; 및
b. 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 203 및 264 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpr 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 138 내지 143, 147 내지 148, 160 내지 161, 204 및 367 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 전방향 프라이머; 및
b. 서열 144 내지 146, 149 내지 153, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 130 내지 132, 134 내지 136, 274 내지 279 및 290 내지 293으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 env 전방향 프라이머; 및
b. 서열 133, 154 내지 159, 280 내지 289 및 294 내지 299로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 env 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 74 내지 88, 180 및 183 내지 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 전방향 프라이머; 및
b. 서열 89 내지 101, 123 내지 129 및 190 내지 192로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 74 내지 88, 180 및 183 내지 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 전방향 프라이머; 및
b. 서열 144 내지 146, 149 내지 153, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 300 내지 311로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vif 전방향 프라이머; 및
b. 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 203 및 264 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpr 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 312 내지 319 및 329 내지 332로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpu 전방향 프라이머; 및
b. 서열 320 내지 328 및 333 내지 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpu 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
a. 서열 337 내지 344 및 356 내지 360으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 pol 전방향 프라이머; 및
b. 서열 345 내지 355 및 361 내지 366으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 pol 역방향 프라이머
를 포함하는 조성물.
프로모터 및 코자크(Kozak) 서열을 포함하는 5' 부분, 및 서열 206 내지 218, 372 내지 386 및 387로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 본질적으로 이루어진 3' 부분을 포함하는 프라이머.
제41항에 있어서, 상기 프로모터가 T7 프로모터 또는 SP6 프로모터인 프라이머.
대략 30 내지 100 T 뉴클레오티드를 갖는 폴리T 올리고뉴클레오티드를 포함하는 5' 부분, 및 서열 220 내지 268로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 프라이머.
a. 제33항 내지 제40항 및 제41항 중 어느 한 항의 조성물; 및
b. 열안정성 DNA 폴리머라제, 역전사효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 CD40L mRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약
을 포함하는, HIV의 다중 변이체의 증폭용 키트.
HIV DNA의 다중 변이체를 제33항 내지 제40항 및 제41항 중 어느 한 항의 프라이머 조성물을 사용하여 증폭하는 것을 포함하는, HIV 앰플리콘의 균주-독립성 제조 방법.
제46항에 있어서, 상기 HIV DNA가 HIV 게놈 RNA 또는 HIV mRNA의 역전사에 의해 제조된 cDNA를 포함하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 HIV DNA의 다중 변이체가 단일 HIV-감염된 인간으로부터 단리되거나 유래된 것인 방법.
a. 서열 1 내지 18, 162, 164, 168 및 169로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 gag 전방향 프라이머; 및
서열 21 내지 43, 172 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 gag 역방향 프라이머;
서열 44 내지 56, 176 및 177로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpr 전방향 프라이머; 및
서열 60 내지 73, 196 내지 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpr 역방향 프라이머;
서열 138 내지 143, 160 내지 161, 204, 367 내지 370 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 nef 전방향 프라이머; 및
서열 144 내지 146, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 nef 역방향 프라이머;
서열 130 내지 132, 274 내지 278 및 279로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 env 전방향 프라이머; 및
서열 133, 154 내지 156, 280 내지 288 및 289로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 env 역방향 프라이머;
서열 74 내지 86, 180 및 183 내지 188 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 rev 전방향 프라이머; 및
서열 89 내지 101, 190, 191 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 rev 역방향 프라이머;
서열 74 내지 86, 180 및 183 내지 188 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 rev 전방향 프라이머; 및
서열 144 내지 146, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 nef 역방향 프라이머;
서열 300 내지 306 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vif 전방향 프라이머; 및
서열 60 내지 73, 196 내지 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpr 역방향 프라이머;
서열 312 내지 318 및 319로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpu 전방향 프라이머; 및
서열 320 내지 327 및 328으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpu 역방향 프라이머; 및
서열 337 내지 343 및 344로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 pol 전방향 프라이머; 및
서열 345 내지 354 및 355로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 pol 역방향 프라이머
로 이루어진 군으로부터 선택된 전방향 및 역방향 프라이머 쌍을 사용하여 HFV DNA의 다중 변이체를 증폭시킴으로써 일차 앰플리콘을 생성하고;
b. 상기 일차 앰플리콘을 전방향 프로모터 프라이머, 및 5' 폴리T 꼬리를 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 증폭시켜 증폭된 발현 카세트를 생성하고;
c. 상기 발현 카세트를 전사하여 HIV RNA를 생성하는 것
을 포함하는, HIV RNA의 균주 독립성 제조 방법.
제49항에 있어서, 상기 HIV DNA가 HIV 게놈 RNA 또는 HIV mRNA의 역전사에 의해 제조된 cDNA인 방법.
제49항에 있어서, 상기 프로모터가 T7 프로모터 또는 SP6 프로모터인 방법.
제49항에 있어서, 상기 전방향 프로모터 프라이머가 상기 프로모터에 대해 최적화된 코자크 서열 3'를 포함하는 것인 방법.
제52항에 있어서, 상기 최적화된 코자크 서열이 CCACCAATGG (서열 59)인 방법.
항원 제시 세포를 제49항의 방법에 의해 생성된 RNA와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원 제시 세포의 로딩(loading) 방법.
1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주에 의해 제시되지 않는, 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 백신.
제55항에 있어서, 상기 핵산이 RNA인 핵산 백신.
제55항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 핵산 백신.
제55항에 있어서, CD40L을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 핵산 백신.
제55항에 있어서, 상기 핵산이 제49항의 방법에 따라 제조된 것인 핵산 백신.
제55항에 있어서, 상기 핵산이 상기 병원체의 다중 균주 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신.
제55항에 있어서, 병원체가 바이러스인 핵산 백신.
제61항에 있어서, 상기 바이러스가 레트로바이러스인 핵산 백신.
제62항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV, HTLV 및 HCV로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 핵산 백신.
제63항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV인 핵산 백신.
제64항에 있어서, 상기 병원체 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드, rev 폴리펩티드, vpr 폴리펩티드, env 폴리펩티드, nef 폴리펩티드, vpu 폴리펩티드, vif 폴리펩티드 및 pol 폴리펩티드로 이루어진 HFV 폴리펩티드 군으로부터의 2종 이상을 포함하는 것인 핵산 백신.
제60항에 있어서, 상기 프라이머가 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고,
b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택함으로써 선택되는 것인 핵산 백신.
제55항의 핵산 백신을 병원체-감염된 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 감염의 치료 방법.
제66항에 있어서, 상기 병원체가 HIV인 방법.
제66항에 있어서, 상기 병원체가 HCV인 방법.
a. 병원체의 제1 균주 및 제2 균주로부터의 폴리뉴클레오티드를 조합하여 혼합물을 형성하고;
b. 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터의 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 생성하는 것
을 포함하는, 병원체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법.
제70항에 있어서, 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는 것인 방법.
제70항에 있어서, 상기 병원체가 레트로바이러스인 방법.
제72항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV인 방법.
제70항에 있어서, 상기 병원체가 HIV이고, 상기 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드인 방법.
제70항에 있어서, 상기 병원체가 HIV이고, 상기 폴리펩티드가 vpr 폴리펩티드인 방법.
제70항의 방법에 의해 생성된 병원체 앰플리콘을 포함하는 조성물.
제70항에 있어서, 상기 증폭이 상기 병원체의 다중 균주 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 프라이머를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제77항에 있어서, 상기 프라이머가 서열 1, 4, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 26, 27, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 40, 41, 44, 48, 49, 53, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 76, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 94, 95, 96, 98, 106, 107, 108, 121, 122, 126 내지 156, 160 내지 167, 175, 177, 178, 183 내지 192, 196 내지 200 및 204의 프라이머로부터 선택된 것인 방법.
서열 1, 4, 16, 17, 19 또는 20의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 전방향 프라이머;
서열 21, 22, 26, 27, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 40, 41, 106, 107 또는 108의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 역방향 프라이머;
서열 44, 48, 49, 53, 56, 57 또는 58의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 전방향 프라이머;
서열 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 121, 122, 196 내지 199 또는 200의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 역방향 프라이머;
서열 74, 76, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 183 내지 188 또는 189의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 전방향 프라이머;
서열 89, 90, 91, 94, 95, 96, 98, 126 내지 129, 190, 191 또는 192의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 역방향 프라이머;
서열 130 내지 132, 134, 135 또는 136의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 전방향 프라이머;
서열 154, 155 또는 156의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방향 프라이머;
서열 133의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방향 프라이머;
서열 138 내지 139, 147 내지 148, 160 내지 161 또는 204의 올리고뉴클레오 티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머;
서열 140 내지 142 또는 143의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머; 및
서열 144 내지 146, 149 내지 152 또는 153의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 역방향 프라이머
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 조성물.
서열 16 및 17의 프라이머를 포함하는 gag 전방향 프라이머 조성물; 서열 32, 33 및 34의 프라이머를 포함하는 gag 역방향 프라이머 조성물; 서열 36 내지 38, 40 및 41의 프라이머를 포함하는 gag 역방향 프라이머 조성물; 서열 138, 139 및 204의 프라이머를 포함하는 nef 전방향 프라이머 조성물; 서열 140 내지 143의 프라이머를 포함하는 nef 전방향 프라이머 조성물; 및 서열 144 내지 146의 프라이머를 포함하는 nef 역방향 프라이머 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 HFV 프라이머 조성물.
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