PT1794327T

PT1794327T - Amplificação independente de estirpes de patogénios e vacinas para os mesmos

Info

Publication number: PT1794327T
Application number: PT57979718T
Authority: PT
Inventors: Nicolette Charles; Tcherepanova Irina; Harris Jason; Healey Donald
Original assignee: Argos Therapeutics Inc
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2005-09-14
Publication date: 2017-01-24
Also published as: EP1794327A2; KR101450497B1; ES2610781T3; EP2742951B1; CN101374550B; WO2006031870A3; WO2006031870A2; US9085807B2; JP5058804B2; EP2742951A2; CN101374550A; WO2006031870A9; AU2005284922B2; AU2005284922A1; US20150252083A1; US9879053B2; PL1794327T3; CA2577320C; KR20130072273A; KR101390072B1

Description

DESCRIÇÃO "AMPLIFICAÇÃO INDEPENDENTE DE ESTIRPES DE PATOGÉNIOS E VACINAS PARA OS MESMOS"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a células dendriticas isoladas e à sua utilização como vacinas especificas para pacientes contra o HIV bem como a métodos de preparação de tais vacinas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Muitos patogénios sofrem mutação e recombinação rapidamente, dificultando a produção de vacinas eficazes. Este problema é muito predominante com patogénios virais e, em particular, com virus de RNA, tais como o HIV. Indivíduos infetados com o HIV podem albergar múltiplas estirpes do HIV e tipicamente albergam múltiplas quasiespécies do HIV. Estratégias terapêuticas com o objetivo de tratar indivíduos infetados com patogénios tais como o HIV-1 enfrentam enormes dificuldades, que variam desde o desenvolvimento de estirpes virais que são resistentes aos antivirais até aos numerosos efeitos secundários destes fármacos, o que torna a administração continuada destas terapias extremamente difícil e dispendiosa.

Foram desenvolvidas várias vacinas terapêuticas contra o HIV, no entanto, os ensaios clínicos destas vacinas têm revelado pouca eficácia. Uma explicação para a ausência de sucesso destas vacinas é a utilização de vetores virais como imunogénios que abrangem sequências de consenso do genoma viral do HIV. A presença de sequências de consenso não é necessariamente um ponto a favor da eficácia das sequências na indução de respostas imunológicas contra um virus heterólogo. Devido ao nivel ainda elevado e crescente de divergência entre a sequência de consenso e a estirpe infeciosa e autóloga do HIV, vacinas ou reagentes antivirais com base na sequência de consenso do subtipo B do HIV-1 são incapazes de tratar adequadamente infeção pelo HIV. Além disso, é provável que aquelas vacinas à base de vetores virais não visem as células mais eficientes do sistema imunológico em termos de processamento e apresentação de antigénios, nomeadamente células dendriticas.

Algumas publicações sugeriram a utilização de células apresentadoras de antigénios carregadas com ácidos nucleicos ou péptidos do HIV como vacina contra o HIV. Por exemplo, Huang et al. (J Infect. Dis. 2003 187: 315-319) revelam células dendriticas carregadas com proteínas do HIV complexadas com lipossomas e a possível utilização de tais células carregadas como vacina. Weissman et al. (J Immunol 2000 165: 4710-4717) revelam transfeção de células dendriticas com mRNA que codifica uma única sequência gag do HIV clonada, o que leva à distribuição de péptidos gag antigénicos para moléculas MHC de classe I e II e à indução de respostas de células T CD4+ e CD8+ in vitro. Os documentos U.S. 5,853,719 e U.S. 6,670,186 (Nair et al.) descrevem a utilização de RNA derivado de um tumor ou patogénio isolado de um paciente para a carga in vitro de células apresentadoras de antigénios autólogas, e sua utilização como vacina. No entanto, a vacinação de pacientes com células apresentadoras de antigénios carregadas com RNA do patogénio total pode aumentar a carga do patogénio no paciente. A dificuldade de selecionar iniciadores capazes de amplificar os ácidos nucleicos de todas as variantes de um determinado patogénio e, em particular, todas as variantes do HIV é reconhecida desde há muito tempo. A amplificação de regiões especificas do genoma do HIV é complicada pela elevada taxa de mutação do genoma do HIV causada pela transcriptase reversa de baixa fidelidade do virus e seleção imunológica in vivo. Ainda assim têm sido desenvolvidos iniciadores que conseguem amplificar determinadas regiões do genoma do HIV a partir de múltiplas variantes do HIV. Por exemplo, Abravaya et al. (J Clinical Microbio 2000 38: 716-723) revelam iniciadores e sondas específicos para o HIV-1 e específicos para o HIV-2 dirigidos para sequências conservadas no gene pol destinados a utilização em ensaios de PCR multiplex para detetar RNA de HIV-1 grupo M, subtipos A, B, C, D, E, F e G, e grupo O e HIV-2 em plasma, e a utilização de tais ensaios para melhorar a segurança do fornecimento de sangue.

Christopherson et al. (Nucleic Acids Res 1997 25: 654-658) discutem o efeito de emparelhamentos defeituosos internos iniciador-modelo de HIV-1 em RT-PCR para amplificar uma região de gag de 142 pares de bases. Cinco até seis emparelhamentos defeituosos, mas não dois até quatro emparelhamentos defeituosos, entre o modelo do HIV-1 e iniciadores com 28-30 bases de comprimentos diminuíram significativamente o rendimento de RT-PCR. Os iniciadores foram concebidos para serem maiores do que é tipicamente utilizado para acomodar emparelhamentos defeituosos. A eficiência reduzida da amplificação dos subtipos A e E do HIV-1 mais divergentes pôde ser melhorada 4 vezes até 10 vezes por diminuição da temperatura de hibridização para 50°C e implementação de um passo de transcrição reversa que aumenta gradualmente a temperatura. Além disso, a substituição de citosina por 5-metilcitosina, ou de inosina em posições de bases variáveis originou uma diferença inferior a 4 vezes no rendimento do produto entre os modelos do HIV-1 homólogo e o mais divergente. Iniciadores que terminaram num T permitiram amplificação quando correspondentes ou emparelhando defeituosamente com C, G ou T.

Michael et al. (J Clin Microbiol 1999 37: 2557-2563) revelam iniciadores para a amplificação de uma sequência de 155 nucleótidos do gene gag do HIV-1. Os iniciadores foram selecionados para maximizar a homologia com 30 isolados do HIV-1 dos subtipos A até G e para minimizar emparelhamentos defeituosos entre o HIV-1 e iniciador perto da extremidade 3' do iniciador. A temperatura de hibridização durante a amplificação foi diminuída para aumentar a tolerância a emparelhamentos defeituosos. Os iniciadores e condições de amplificação otimizados aumentaram a quantidade de RNA do HIV-1 detetado em comparação com testes previamente disponíveis, mas subrepresentaram os subtipos A, D, F e G e não continham membros dos subtipos H e J. O documento U.S. 6,001,558 revela a utilização de múltiplos iniciadores para amplificar fragmentos curtos (<200 pares de bases) das regiões LTR e pol de múltiplos isolados do HIV-1 e das regiões LTR, pol e env de múltiplos isolados do HIV- 2. Depois utilizaram múltiplas sondas para detetar os produtos de amplificação. As combinações iniciador/sonda conseguiram detetar cinco isolados do HIV 1 dos grupos M e O, e dois isolados do HIV-2. Iniciadores correspondentes a sequências altamente conservadas do HIV-1 foram selecionados pelos seguintes critérios: 1) os comprimentos dos produtos de PCR amplificados não podem exceder 200 pares de bases, pois produtos mais pequenos são mais eficientemente amplificados do que produtos maiores e são menos sensíveis a outras condições reacionais; 2) conjuntos de iniciadores devem amplificar uma região de sonda funcional para a deteção do produto amplificado; 3) um emparelhamento defeituoso perto da extremidade 3' do iniciador é bastante menos preferencial do que emparelhamentos defeituosos perto da extremidade 5', e 4) outros critérios quanto à estabilidade da extremidade 3', comprimento (cerca de 23-31 nucleótidos), teor de GC e interações com outros iniciadores e sondas. O documento U.S. 6,194,142 revela métodos para diagnóstico in vitro de infeção por HIV-1, HIV-2 e SIV utilizando pares de iniciadores correspondentes a sequências que estão conservadas entre os genes gag, pol e env de estirpes do HIV-1 Bru, HIV-1 Mal e HIV-1 Eli, HIV-2 ROD e SIV MAC, e entre os genes nef2, vif2 e vpx de HIV-2 ROD e SIV MAC, ou os genes env, nefl, vifl e vpr de HIV-1 Bru, HIV-1 Mal e HIV-1 Eli. Utilizaram misturas de iniciadores com nucleótidos variantes correspondentes a variantes do HIV e SIV simultaneamente numa reação de PCR. O documento U.S. 6,232,455 revela conjuntos de iniciador/sonda derivados de sequências de consenso de 31 isolados do HIV-1 grupo M (subtipos A, B e D) e grupo O e 14 isolados dos subtipos A e B do HIV-2. Conjuntos de iniciador/sonda de consenso do HIV-1 são específicos para a deteção de HIV-1, ao passo que conjuntos de iniciador/sonda de consenso do HIV-2 são específicos para a deteção do HIV-2 . 0 documento U.S. 6,531,588 revela iniciadores para a amplificação de regiões de pol de 0,7 kB, 1,57 kb ou 2,1 kb de múltiplas quasiespécies do HIV num paciente, seguido de sequenciação para determinar informações de genótipos do HIV especificas de pacientes para utilização na determinação da terapia apropriada e monitorização da resistência a fármacos. O documento U.S. 2003/0148280 revela conjuntos de iniciadores e sondas para a deteção de intencionalmente todas as estirpes do HIV-1 grupo Μ, N e O incluindo formas recombinantes em circulação (CRF, que se refere a recombinantes entre subtipos) e recombinantes intergrupos. Os iniciadores são dirigidos para gag p24 (produto de amplificação de 399 pb) , integrase de pol (produto de amplificação de 864 pb) e região imunodominante de env gp41 (IDR; produto de amplificação de 369 pb) do HIV-1.

Nenhuma destas publicações sugere a possibilidade de utilizar ácidos nucleicos autólogos amplificados de patogénios que codificam polipéptidos específicos de múltiplas espécies de um patogénio presente num indivíduo para a preparação de vacinas de células apresentadoras de antigénios ou vacinas de ácidos nucleicos. A presente invenção aborda a necessidade sentida desde há muito tempo de desenvolver vacinas específicas para pacientes para tratar patogénios infeciosos autólogos e também oferece vantagens adicionais.

RESUMO DA INVENÇÃO

Os Requerentes descobriram métodos para a amplificação de ácidos nucleicos de múltiplas variantes (estirpes) de qualquer patogénio presente numa amostra e, preferencialmente, numa amostra de um indivíduo infetado com um patogénio. Em formas de realização preferenciais, o patogénio é um retrovirus, tal como o HIV. 0 ácido nucleico de patogénio amplificado pode ser utilizado para identificar as variantes do patogénio presentes numa amostra, para quantificar o patogénio presente numa amostra e como uma vacina de ácido nucleico, ou na preparação de vacinas de células apresentadoras de antigénios. Ácidos nucleicos produzidos pelos métodos revelados no presente documento podem ser utilizados para transfetar (carregar) células apresentadoras de antigénios. As células apresentadoras de antigénios carregadas podem depois ser utilizadas como vacina para o tratamento de infeção causada por um patogénio. Ácidos nucleicos produzidos pelos métodos revelados no presente documento podem ser utilizados diretamente como vacinas de ácidos nucleicos sem carga prévia em células apresentadoras de antigénios. A presente invenção refere-se a uma célula dendrítica isolada que compreende uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes num sujeito individual, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV, e que compreende adicionalmente mRNA de CD40L transcrito in vitro. A presente invenção também se refere a uma vacina que compreende a célula dendrítica da presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de preparação de uma vacina autóloga, que compreende: transfetar células dendriticas obtidas ou derivadas de um indivíduo infetado com o HIV com mRNA de CD40L e uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes no referido indivíduo, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o HIV completo. A presente invenção também se refere a uma célula dendrítica isolada da presente invenção para utilização no tratamento de um paciente infetado com genoma do HIV.

No presente documento são revelados métodos de seleção de iniciadores adequados para a amplificação de múltiplas variantes de um patogénio, que compreendem: a. escolher uma primeira região para hibridização de um iniciador direto e uma segunda região para hibridização de um iniciador reverso, em que as referidas primeira e segunda regiões flanqueiam uma fase de leitura aberta e/ou um epítopo de um patogénio, e b. escolher candidatos a iniciadores diretos e reversos para as referidas primeira e segunda regiões, em que pelo menos um dos referidos iniciadores é concebido para compensar a variabilidade de sequências entre múltiplas variantes de um patogénio.

Preferencialmente, os candidatos a iniciadores diretos e reversos são escolhidos para produzir um produto de amplificação com mais do que 200 nucleótidos de comprimento, mais preferencialmente pelo menos 225, 250, 300 ou mais nucleótidos de comprimento.

Adequadamente, o ácido nucleico amplificado pode conter sinais de transcrição e tradução para transcrição eficiente in vivo ou in vitro, com a finalidade de produzir um mRNA que depois possa ser traduzido in vitro ou in vivo. Os requerentes também revelam no presente documento métodos de carga de células apresentadoras de antigénios, preferencialmente células dendriticas, utilizando ácidos nucleicos, preferencialmente mRNA produzido pelos métodos da invenção. As células apresentadoras de antigénios carregadas são úteis como vacinas para o tratamento de infeção causada por um patogénio.

Assim, noutro aspeto, é revelada uma composição que compreende: uma célula apresentadora de antigénios transfetada com uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios de múltiplas estirpes (variantes) de um patogénio presentes num mamífero. Os ácidos nucleicos podem ser derivados de amplificação de ácidos nucleicos de polinucleótidos de um patogénio utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores concebidos para compensar a variabilidade entre as referidas variantes do patogénio, e a referida célula apresentadora de antigénios e os referidos ácidos nucleicos de patogénios provêm ou são derivados do referido mamífero. A invenção revela adicionalmente métodos de preparação de células apresentadoras de antigénios carregadas com ácidos nucleicos representativos de múltiplas variantes de um patogénio que infeta um indivíduo, e métodos de tratamento de indivíduos infetados com um patogénio utilizando as vacinas da invenção. Células apresentadoras de antigénios preferenciais são células dendriticas.

Também é revelada uma vacina de ácido nucleico, que compreende uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios de múltiplas variantes de um patogénio presentes num mamífero e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que os referidos ácidos nucleicos são derivados por amplificação de ácidos nucleicos de polinucleótidos de um patogénio utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores que compensam a variabilidade de sequências de nucleótidos entre as referidas variantes do patogénio. É adicionalmente revelado um método de produção de produtos de amplificação de um patogénio que representam um ou mais polipéptidos de pelo menos duas estirpes de um patogénio, que compreende: (a) combinar polinucleótidos de uma primeira e de uma segunda estirpe de um patogénio para formar uma mistura, e (b) amplificar os referidos polinucleótidos para produzir um primeiro produto de amplificação e um segundo produto de amplificação; em que o referido primeiro produto de amplificação codifica um polipéptido da referida primeira estirpe e o referido segundo produto de amplificação codifica o polipéptido correspondente da referida segunda estirpe. Tais produtos de amplificação podem ser utilizados como vacinas de ácidos nucleicos, para a transfeção de células apresentadoras de antigénios e para a produção de polipéptidos de patogénios traduzidos in vitro. A capacidade de amplificar genes de patogénios visados e seus fragmentos de múltiplas estirpes de um patogénio rodeia a necessidade de purificar ou amplificar ácidos nucleicos totais de patogénios, tais como um genoma de DNA ou RNA de um patogénio, uma cópia de cDNA completo de um vírus de RNA, etc. Por exemplo, proporcionar um genoma completo do HIV como vacina de ácido nucleico ou para carga em APCs, quer os genes estejam presentes na forma de fragmentos de ácidos nucleicos ou como um genoma de patogénio contíguo, pode levar à reconstituição de vírus infeciosos. Além disso, certos ácidos nucleicos ou polipéptidos de patogénios (por exemplo, nef ou vpr do HIV) podem ter efeitos prejudiciais, particularmente no que se refere a células apresentadoras de antigénios. Polipéptidos ou ácidos nucleicos que codificam polipéptidos com efeitos prejudiciais podem ser eliminados ou estar presentes em razões molares menores relativamente a ácidos nucleicos que codificam outros polipéptidos do patogénio. Em conformidade, ao proporcionar vacinas que compreendem ácidos nucleicos que representam polipéptidos de um patogénio de múltiplas estirpes do patogénio mas que não representam a totalidade do genoma do patogénio ou não codificam a totalidade de todas proteínas do patogénio, podem ser evitados os efeitos negativos de infeção causada por um patogénio, tais como infeção persistente, expressão constitutiva de genes ou proteínas virais. Também podem ser evitados polinucleótidos e proteínas prejudiciais de patogénios. Assim, são reveladas no presente documento composições que compreendem ácidos nucleicos que codificam um ou mais polipéptidos de múltiplas estirpes presentes de um patogénio, em que um ou mais polipéptidos do patogénio não são representados de nenhuma estirpe. Os ácidos nucleicos podem representar polipéptidos de múltiplas estirpes de patogénio presentes num ou mais indivíduos. Os ácidos nucleicos de patogénios amplificados podem ser produzidos diretamente a partir de ácidos nucleicos de patogénio presentes numa amostra biológica de um ou mais indivíduos infetados com um patogénio, ou podem ser produzidos a partir de isolados clonados de um patogénio. Assim, num aspeto, é revelada no presente documento uma célula apresentadora de antigénios (APC) isolada que compreende ácidos nucleicos que codificam um ou mais polipéptidos de múltiplas estirpes de um patogénio presentes num sujeito individual, em que um ou mais polipéptidos de patogénio não são representados de nenhuma estirpe.

Noutra forma de realização, os ácidos nucleicos de patogénio amplificados são traduzidos in vitro e utilizados para vacinar pacientes diretamente, ou para carregar APCs. Os polipéptidos de patogénio ou APCs carregadas com tais péptidos em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável podem ser administrados como vacina. Em conformidade, é revelada no presente documento uma composição que compreende polipéptidos de patogénio de múltiplas estirpes de um patogénio, em que um ou mais polipéptidos de patogénio não são representados de nenhuma estirpe. É adicionalmente revelada uma APC isolada que compreende polipéptidos de patogénio de múltiplas estirpes de um patogénio presentes num sujeito individual, em que um ou mais polipéptidos de patogénio não são representados de nenhuma estirpe.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um método de preparação de uma vacina autóloga, que compreende: transfetar células dendriticas obtidas ou derivadas de um indivíduo infetado com o HIV com mRNA de CD4 0L e uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes no referido indivíduo, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV. É revelado no presente documento a titulo de referência um método de tratamento de um mamífero infetado com um patogénio, que compreende: a. amplificar ácidos nucleicos de múltiplas variantes de um patogénio presentes num mamífero utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores que conseguem amplificar múltiplas variantes do referido patogénio para produzir DNA amplificado do patogénio; b. opcionalmente transcrever o referido DNA amplificado do patogénio para produzir RNAs do patogénio, e c. administrar ao referido mamífero o referido DNA do patogénio ou o referido RNA do patogénio.

Os métodos revelados no presente documento podem ser utilizados para amplificar o ácido nucleico de qualquer patogénio. Além disso, o produto amplificado pode ser quantificado para determinar a carga do patogénio (por exemplo, carga virai) e pode ser sequenciado para determinar a evolução do patogénio num indivíduo. Numa forma de realização preferencial, o patogénio é HIV de HCV. No presente documento são revelados iniciadores para a amplificação de múltiplas variantes do HIV, que consistem essencialmente nas SEQ ID NO: 1-58, 60-161 e 172-371; iniciadores que consistem essencialmente num oligonucleótido que tem pelo menos 75% de identidade de sequências com ácido nucleico selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1-58, 60-161 e 172-371, e pares de iniciadores que compreendem combinações de iniciadores selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1-58 e 60-371 e ácidos nucleicos que têm pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 1-58 e 60-371; bem como estojos que contêm tais pares de iniciadores. Os estojos podem adicionalmente conter um ou mais reagentes, incluindo mas não se limitando a uma DNA polimerase termoestável, transcriptase reversa, desoxirribonucleótido trifosfatos e mRNA de CD40L. No presente documento é revelado um método independente de estirpes de amplificação de sequências do HIV, que compreende: amplificar múltiplas variantes de DNA do HIV com um iniciador direto e um iniciador reverso revelados no presente documento. É adicionalmente revelada uma vacina autóloga contra o HIV que induz uma resposta imunológica terapêutica dirigida a múltiplas variantes de proteínas do HIV definidas expressas por espécie(s) de vírus única(s) de um paciente infetado. Numa forma de realização preferencial é revelada uma vacina específica para pacientes composta por células dendríticas maduras autólogas geradas ex vivo transfetadas com RNA que codifica múltiplos antigénios do HIV derivados do vírus autólogo.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

Figura 1. Lista de iniciadores: número, sequência 5' para 3', comprimento e Tf. Os números nos nomes dos iniciadores correspondem à sua posição relativamente ao genoma do HIV com o número de acesso NC_001802 na Base de Dados de Sequências do HIV proporcionada pelo Los Alamos National Laboratory e disponibilizada na "word wide web" no seguinte endereço http: //hiv-web.lanl. gov/content/index .

Figura 2. Sequência do genoma do HIV com o número de acesso NC_001802, fases de leitura aberta e sequências de proteínas de gag, env, rev, vpr e nef, e posição e orientação de iniciadores. São proporcionados o filamento sentido (SEQ ID NO: 388) e filamento complementar (SEQ ID NO: 389).

Figura 3. Amplificação de regiões gag do modelo plasmídico pBKBHlOS utilizando grupos de iniciadores concebidos. Utilizaram-se os seguintes grupos de iniciadores: Via 1: FG1: RG1; Via 2: FG1: RG2; Via 3: FG1: RG3; Via 4: FG1: RG4; Via 5: FG1: RG5; Via 6: FG2: RG1; Via 7: FG2: RG2; Via 8: FG2: RG3; Via 9: FG2: RG4; Via 10: FG2: RG5.

Figura 4. Amplificação por PCR Multiplex de quatro subtipos do HIV por reação. A: resolução em gel de agarose de reações de PCR conduzidas a 60°C, 62°C e 65°C. Os grupos de iniciadores em cada via são iguais aos descritos na Figura 3. B: Complemento inverso dos iniciadores 32, 33 e 34, número do grupo do iniciador reverso e Tf. C: Alinhamento dos modelos plasmídicos pBKBHlOS, p93TH253.3, p90CF402.1 e p93BR029.4 do HIV na região correspondente aos iniciadores 32-34. O "A" sublinhado corresponde à posição 6 no complemento inverso dos iniciadores mostrados em B.

Figura 5. Amplificação da região GAG de modelo de RNA do HIV não infecioso utilizando RT-PCR multiplex. O produto de PCR primário foi amplificado utilizando iniciadores encaixados numa reação de PCR secundária. Os grupos de iniciadores utilizados para amplificação estão indicados acima de cada via.

Figura 6. Sequências alinhadas de modelos plasmídicos do HIV amplificados pBKBHlOS, p93TH253.3, p90CF402.1 e p93BR029.4 de múltiplas quasiespécies do HIV. Quatro variantes únicas A, B, C e D foram amplificadas na reação de PCR descrita no Exemplo 4.

Figura 7. (a) Resolução em gel de agarose de RT-PCR amplificado de regiões codificadoras de VPR, REV e NEF do HIV de RNA do HIV não infecioso. 0 produto de PCR primário foi amplificado numa reação de PCR secundária utilizando iniciadores encaixados. Os grupos de iniciadores utilizados para amplificação estão indicados acima das vias. (b) Resolução em gel de agarose de regiões gag amplificadas utilizando pares de iniciadores individuais indicados por SEQ ID NOs acima de cada via. (c) Resolução em gel de agarose de regiões nef amplificadas.

Figura 8. A resolução em gel de agarose da região codificadora de GAG foi amplificada por RT-PCR de RNA do HIV isolado do plasma de um paciente infetado com o HIV. 0 produto de PCR primário foi amplificado numa reação de PCR secundária utilizando iniciadores encaixados. Os grupos de iniciadores utilizados para amplificação estão indicados acima de cada via.

Figura 9. Resolução em gel de agarose de regiões codificadoras de VPR e REV amplificadas por RT-PCR de RNA isolado do plasma de um paciente infetado com o HIV. 0 produto de PCR primário foi amplificado numa reação de PCR secundária utilizando iniciadores encaixados. Os grupos de iniciadores utilizados para amplificação estão indicados acima de cada via.

Figura 10. Alinhamento de quasiespécies detetadas nas regiões de GAG (10A; SEQ ID NO: 398), REV (10B; SEQ ID NO: 399) e VPR (IOC; SEQ ID NO: 400) amplificadas de RNA isolado do plasma de um paciente infetado com o HIV. Os pontos indicam identidade de sequências.

Figura 11. Mutações isoladas na região codificadora de VPR afetam a sequência de proteína em epítopos de HLA.

Figura 12. Deteção da expressão de gag em células dendríticas maduras transfetadas com RNA. Análise FACS da ligação de um anticorpo monoclonal anti-gag em células de controlo (MART) (linha tracejada), transfetadas com gag (linha contínua) ou transfetadas com ARCA-gag (linha cinzenta).

Figura 13. Progressão temporal da expressão da proteína GAG em Células HeLa. Análise de Transferência Western da expressão da proteína GAG em células HeLa. Lisatos de Células não transfetadas (Via de Controlo negativo) ou HeLa foram transfetados com RNA com ARCA cauda (A)64 e recolhidos para análise nos períodos de tempo indicados. A via de controlo positivo P24 contém 25 yg de proteína gag recombinante p24 purificada.

Figura 14. Deteção de expressão de REV em células dendríticas maduras transfetadas com RNA. Análise FACS da ligação de um anticorpo policlonal anti-rev em células de controlo (MART) (preenchida), células dendríticas transfetadas com rev (linha tracejada).

Figura 15. Progressão temporal da expressão da proteína REV em Células HeLa. Análise de transferência Western de lisatos de células HELA não transfetadas ou transfetadas com ARCA cauda A64 de REV. O instante da recolha está indicado acima das vias.

Figura 16. Análise FACS da expressão de NEF em células dendriticas maduras transfetadas com RNA.

Figura 17. (a) Resolução em gel de agarose de regiões de gag, vpr, rev e nef de 3 pacientes com HIV. Os grupos de iniciadores utilizados em cada via são os seguintes:

Gag: via 1 F124: R1881; Via 2 F304: R1881; Via 3 F334: R1881; Via 4 F124: R1913; Via 5 F304: R1913; Via 6 F334: R1913.

Vpr Via 1 F4995: R5507, Via 2 F5058: R5507; Via 3 F4995: R5419; Via 4 F5058: R5419.

Rev Via 1 F7750: R8300; Via 2 F7830: R8300; via 3 F7911: R8300 .

Nef Via 1 F8235: R9069; Via 2 F8343: R9069. Ver os Exemplos 6, 7 e 8 quanto à composição de cada grupo de iniciadores. b) Resolução em gel de agarose de transcritos de gag, vpr, rev e nef in vitro preparados a partir de RNA do HIV amplificado.

Figura 18. (A) Árvore filogenética de quasiespécies de gag do HIV amplificadas do Paciente 3. (B) Substituições de aminoácidos em gag pl7 amplificada de quasiespécies do HIV isoladas do Paciente 1. (C) Árvore filogenética de quasiespécies de gag do HIV amplificadas do Paciente 1. (A) Árvore filogenética de quasiespécies de rev do HIV amplificadas do Paciente 1. (A) Árvore filogenética de quasiespécies de vpr do HIV amplificadas do Paciente 1.

Figura 19. Resolução em gel de poliacrilamida de proteínas gag, vpr, rev e nef preparadas por tradução in vitro de RNA do HIV amplificado de três pacientes. A via de controlo mostra a proteína gag preparada por tradução in vitro do RNA de Gag amplificado do plasmídeo de controlo pBKBHlOS.

Figura 20. DCs imaturas foram cotransfetadas com quatro genes do HIV autólogo (Vpr, Rev, Nef e Gag) juntamente com RNA que codifica CD40L e foram subsequentemente cultivadas na presença de IFN-gama para atingir maturação completa das DCs. As DCs maduras carregadas com antigénio foram utilizadas para estimular PBMCs de pacientes com HIV autólogo. Após 6 dias em cultura, PBMCs foram recuperadas e novamente estimuladas com quatro bibliotecas de péptidos sobrepostos individuais correspondentes a sequências de consenso para Vpr, Rev, Nef e gag (duas reuniões) . A frequência de células positivas para IFN-g foi determinada por ICS em resposta ao reconhecimento de cada gene do HIV individual. Preparações de DCs foram carregadas com 1 yg de RNA/milhão de DCs com cada um dos quatro genes do HIV e, numa experiência paralela, a carga útil de RNA de NEF foi reduzida para 0,25 yg/milhão de DCs, ao passo que cada um dos outros três genes foi transfetado a 1 yg de RNA/milhão de DCs.

Figura 21. DCs imaturas foram transfetadas apenas com 5 yg de RNA de eGFP/milhão de DCs (controlo negativo) ou DCs transfetadas com eGFP subsequentemente pulsadas com péptidos de consenso de gag na forma de duas reuniões. Alternativamente, DCs foram transfetadas com RNA de Gag autólogo (5 ug de RNA/milhão de DCs). Em todos os casos, DCs foram cotransfetadas com RNA de CD40L e subsequentemente cultivadas em meio compreendendo IFN-gama para atingir a maturação completa. DCs carregadas com antigénio foram cocultivadas com PBMCs previamente etiquetadas com CFSE. Passados 6 dias, PBMCs foram recuperadas e determinou-se a frequência de células reativas com antigénio (CFSE baixo). Além disso, células com baixo CFSE foram coradas por ICS quanto a Granzima B como marcador da função efetora de CTLs.

Figura 22. Calendário temporal e de eventos para procedimentos de ensaios clínicos.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA A invenção refere-se a uma célula dendrítica isolada que compreende uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes num sujeito individual, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV, e que compreende adicionalmente mRNA transcrito in vitro de CD40L, vacinas que compreendem tais células e tais células para utilização no tratamento de um paciente infetado com HIV.

Ao longo desta revelação, várias publicações, patentes e especificações de patentes publicadas são referidas por uma citação identificadora. As revelações destas publicações, patentes e especificações de patentes publicadas são deste modo incorporadas a título de referência na presente revelação para descrever de modo mais completo a técnica atual à qual pertence esta invenção. No entanto, no caso de conflito irreconciliável, a presente especificação prevalece. A prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que pertencem ao âmbito da área. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Estes métodos são descritos nas seguintes publicações. Ver, por exemplo, Sambrook et al. "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 2a edição (1989); "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" (F. M. Ausubel et al. editores (1987)); a série "METHODS IN ENZYMOLOGY" (Academic Press, Inc.); "PCR: A PRACTICAL APPROACH" (M. MacPherson et al. IRL Press na Oxford University Press (1991)); "PCR 2: A PRACTICAL APPROACH" (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor editores (1995)); "ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL" (Harlow e Lane editores (1988)); "USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL" (Harlow e Lane editores (1999)), e "ANIMAL CELL CULTURE" (R.I. Freshney editor (1987)).

Definições

Como usados no presente documento, certos termos podem ter os seguintes significados definidos. Como usada na especificação e reivindicações, a forma singular "um", "uma" e "o", "a" inclui referências plurais a menos que o contexto claramente imponha de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.

Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo intervalos, são aproximações que são variadas ( + ) ou ( -) por incrementos de 0,1. Deve ser entendido, se bem que nem sempre seja explicitamente afirmado, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". Também deve ser entendido, se bem que nem sempre seja explicitamente afirmado, que os reagentes descritos no presente documento são meramente exemplificativos e que equivalentes dos mesmos são conhecidos na área. "Amplificação" refere-se a procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos utilizando iniciadores e ácido nucleico polimerase que geram múltiplas cópias de uma sequência de ácido nucleico alvo. Tais reações de amplificação são conhecidas dos profissionais e incluem a reação em cadeia de polimerase (PCR, ver U.S. 4,682,195, 4,683,202 e 4,965,188), RT-PCR (ver U.S. 5,322,770 e 5,310,652), a reação em cadeia de ligase (LCR, ver EP 0 320 308), NASBA ou reações semelhantes, tais como TMA descrito em U.S. 5,399,491 e LCR de hiato (GLCR, ver U.S. 5,427,202) . Se o alvo do ácido nucleico for RNA, RNA pode ser primeiramente copiado para um filamento de DNA complementar utilizando uma transcriptase reversa (ver U.S. 5,322,770 e 5,310,652). Um "produto de amplificação" refere-se a ácidos nucleicos que foram sintetizados utilizando procedimentos de amplificação. O termo "antigénio" é bem compreendido na área e inclui substâncias que são imunogénicas, isto é, imunogénio, e inclui qualquer uma de uma variedade de formulações diferentes de imunogénio ou antigénio. O termo "células apresentadoras de antigénios (APC)" refere-se a uma classe de células capazes de apresentar um ou mais antigénios na forma de um complexo antigénio-MHC que pode ser reconhecido por células T efetoras especificas do sistema imunológico. APCs incluem macrófagos, células B e células dendriticas, tais como células dendriticas imaturas, células dendríticas maduras, células dendríticas plasmacitoides e células de Langerhans.

Como usado no presente documento, o termo "que consiste essencialmente em" significa a exclusão de outros elementos de qualquer importância essencial para a combinação. Assim, uma composição que consiste essencialmente nos elementos como definido no presente documento não exclui contaminantes vestigiais do método de isolamento e purificação, tampões biológicos e transportadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato, conservantes e semelhantes. Quando usado no contexto de um iniciador e um oligonucleótido de referência, o termo "que consiste essencialmente em" significa que o iniciador não terá mais do que 10 resíduos de nucleótidos adicionais na extremidade 5' de um nucleótido de referência nem mais do que 10 resíduos de nucleótidos adicionais na extremidade 3' de um oligonucleótido de referência. Por exemplo, um iniciador que consiste essencialmente num oligonucleótido da SEQ ID NO: X pode ter desde 0 até 10 nucleótidos adicionais na extremidade 5' da SEQ ID NO: X e desde 1 até 10 nucleótidos adicionais na extremidade 3' da SEQ ID NO: X. Preferencialmente, um iniciador que consiste essencialmente num oligonucleótido de referência não tem mais do que 5, 6, 7, 8 ou 9 nucleótidos adicionais em cada uma das extremidades 5' e 3' do oligonucleótido de referência. Muito preferencialmente, um iniciador que consiste essencialmente num oligonucleótido de referência não tem mais do que 1, 2, 3 ou 4 nucleótidos adicionais em cada uma das extremidades 5' e 3' do oligonucleótido de referência.

Como usado no presente documento, uma composição que compreende um iniciador que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste na: SEQ ID NO: X, SEQ ID NO: Y e SEQ ID NO: Z, pode conter um ou qualquer combinação dos oligonucleótidos da SEQ ID NO: X, SEQ ID NO: Y e SEQ ID NO: Z, com desde 0 até 10 nucleótidos adicionais na extremidade 5' e/ou 3' de cada oligonucleótido. A própria composição compreende tais iniciadores e, portanto, também pode conter um elemento adicional. "Polipéptidos correspondentes", como usado no presente documento, são polipéptidos codificados por diferentes alelos de um gene de um patogénio ou seu fragmento. Como exemplo hipotético, a estirpe X de um vírus tem quatro genes, a, b, c e d, que codificam os polipéptidos A, B, C e D, respetivamente. A estirpe Y do vírus codifica diferentes alelos dos mesmos quatro genes, designados a' , b' , c' e d', que codificam os polipéptidos A' , B' , C' e D' , respetivamente. Assim, A e A' são polipéptidos correspondentes, B e B' são polipéptidos correspondentes, etc. O termo polipéptido refere-se a uma proteína completa bem como a um seu fragmento.

Como usado no presente documento, "expressão" refere-se ao processo pelo qual polinucleótidos são transcritos em mRNA e traduzidos em péptidos, polipéptidos ou proteínas. Se o polinucleótido for derivado de DNA genómico de um eucariota, a expressão pode incluir encadeamento do mRNA. Elementos reguladores requeridos para a expressão incluem sequências promotoras para a ligação de RNA polimerase e sequências de iniciação da tradução para a ligação de ribossomas. Por exemplo, um vetor de expressão bacteriano pode incluir um promotor tal como o promotor de lac e, para iniciação da transcrição, uma sequência Shine-Dalgarno para a ligação de ribossomas e o codão de início AUG para iniciação da tradução (Sambrook et al. (1989) supra). De modo semelhante, um vetor de expressão eucariótico pode incluir um promotor heterólogo ou homólogo para RNA polimerase II, um sinal de poliadenilação a jusante, o codão de inicio AUG e um codão de terminação para separação do ribossoma. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente ou montados pelas sequências descritas em métodos conhecidos na área, por exemplo, os métodos no presente documento abaixo para a construção de vetores em geral. 0 termo "geneticamente modificado" significa que contém e/ou expressa um gene ou sequência de ácido nucleico estranho que, por sua vez, modifica o genótipo ou fenótipo da célula ou da sua progenitura. Por outras palavras, refere-se a qualquer adição, deleção ou disrupção de nucleótidos endógenos a uma célula. "RNA do HIV" significa RNA genómico do HIV e mRNA do HIV, bem como RNA produzido por transcrição de produtos de amplificação do HIV preparados pelos métodos da invenção. "Variantes do HIV" ou "estirpe do HIV" refere-se a quaisquer variedades existentes ou novas do HIV e inclui mas não se limita a HIV-1 e HIV-2, Grupos Μ, N e 0 do HIV-1, todos os subtipos (ciados) do HIV, incluindo os subtipos do HIV-1 Al, A2, B, C, C, Fl, F2, G, H, J e K, variantes de ciados, todas as suas quasiespécies e formas recombinantes em circulação. Tal como o termo "estirpe" é usado no presente documento, dois isolados do HIV que diferem num único nucleótido são considerados duas "estirpes" diferentes do HIV. 0 termo grupos é habitualmente usado para referir as linhagens do HIV-1 Μ, N e 0. 0 termo subtipos é usado para referir os principais ciados dentro de um grupo. Há variabilidade de sequências adicional dentro de subtipos. Forma Recombinante em Circulação (CRF) descreve uma linhagem recombinante que desempenha um papel importante na pandemia do HIV. Os membros de CRF partilham habitualmente uma estrutura em mosaico semelhante ou idêntica, isto é, descendem do(s) mesmo(s) evento(s) de recombinação. Formas recombinantes em circulação do HIV incluem mas não estão limitadas a:

Descrições e mapas das CRFs acima e ligações a sequências do HIV podem ser encontrados em hiv.lanl. gov/content/hivdb/CRFs/CRF.html.

De modo semelhante, "variantes de um patogénio" ou "estirpes de um patogénio" referem-se a todas as variantes de um patogénio e incluem variantes, mutantes e recombinantes de um patogénio que possam estar presentes num paciente. Como usado no presente documento, duas variantes de um patogénio que diferem num único nucleótido são consideradas duas estirpes diferentes do patogénio.

Administração de genes, transferência de genes, terapia genética "in vivo" e semelhantes, como usados no presente documento, são termos que se referem à introdução de um vetor que compreende um polinucleótido exógeno diretamente no corpo de um organismo, tal como um humano ou mamífero não humano, de modo que o polinucleótido exógeno é introduzido num organismo in vivo. 0 termo "isolado" significa separado de constituintes, celulares e outros, aos quais o polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo, ou seus fragmentos, está normalmente associado na natureza. Por exemplo, relativamente a um polinucleótido, um polinucleótido isolado é tal que está separado das sequências 5' e 3' às quais está normalmente associado no cromossoma. Como é claro para os profissionais, um polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo de ocorrência não natural, ou seu (s) fragmento(s), não requer "isolamento" para distingui-lo do seu correspondente de ocorrência natural. Além disso, um polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo "concentrado", "separado" ou "diluído", ou seu (s) fragmento(s), pode ser distinguido do seu correspondente de ocorrência natural pelo facto de a concentração ou número de moléculas por volume ser maior do que "concentrado" ou menor do que "separado" relativamente ao seu correspondente de ocorrência natural. Não é necessário que um polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo, ou seu (s) fragmento(s), que difira do correspondente de ocorrência natural no que se refere à sua sequência primária ou, por exemplo, pelo seu padrão de glicosilação esteja presente na sua forma isolada uma vez que pode ser distinguido do seu correspondente de ocorrência natural pela sua sequência primária ou, alternativamente, por outra caracteristica, tal como o seu padrão de glicosilação. Apesar de não ser explicitamente afirmado para cada uma das invenções reveladas no presente documento, deve ser entendido que todas as formas de realização acima para cada uma das composições reveladas abaixo e sob as condições apropriadas, são proporcionadas por esta invenção. Assim, um polinucleótido de ocorrência não natural é proporcionado como uma forma de realização separada do polinucleótido de ocorrência natural isolado. Uma proteína produzida numa célula bacteriana é proporcionada como uma forma de realização separada da proteína de ocorrência natural isolada de uma célula eucariótica onde é produzida na natureza. Uma célula de mamífero, tal como uma célula apresentadora de antigénios, isolada é separada ou removida da sua localização normal no mamífero. "Carga de células apresentadoras de antigénios (APCs)" refere-se à captação pelas APCs de um antigénio, seu epítopo, péptido, proteína, ou de um ácido nucleico que codifica os anteriores. APCs podem ser carregadas in vitro ou in situ. "mRNA" significa um RNA apto a ser traduzido. 0 mRNA conterá um sítio de ligação de ribossoma e codão de início. Preferencialmente, o mRNA também conterá uma cobertura 5' , codão de terminação e cauda poliA. "Reação em cadeia polimerase (PCR) multiplex" é uma variante de PCR na qual duas ou mais sequências alvo são simultaneamente amplificadas numa única reação de amplificação utilizando múltiplos pares de iniciadores. Como exemplos não limitadores, amplificação multiplex inclui reações de amplificação de diferentes genes, diferentes alelos de um único gene e diferentes fragmentos de um único gene. Métodos de otimização de condições de PCR multiplex são revelados em Abravaya et al. J Clinical Microbiol 2000 38: 716-723; Kremer at al. J Clin Microbiol 2004 42: 3017-3022; Garcia-Canas et al. Electrophoresis 2004 25: 2219-2226, e Markoulatos et al. J Clin Lab Anal 2003 17: 108-12, cujo conteúdo é incorporado a titulo de referência. "Patogénio", como usado no presente documento, refere-se a qualquer organismo ou virus causador de doença e também a seus derivados atenuados. É pretendido que uma "composição farmacêutica" inclua a combinação de um agente ativo com um transportador, inerte ou ativo, que torna a composição adequada para utilização em diagnóstico ou terapêutica in vitro, in vivo ou ex vivo.

Como usado no presente documento, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer um dos transportadores farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, e emulsões, tais como uma emulsão óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes humedecedores. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes. Quanto a exemplos de transportadores, estabilizadores e adjuvantes, ver Martin "REMINGTON'S PHARM. SCI.", 18a Edição (Mack Publ. Co., Easton (1990)).

Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para produzir resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada numa ou mais administrações, aplicações ou dosagens.

Os termos "polinucleótido" e "molécula de ácido nucleico" são usados indistintamente para referir formas poliméricas de nucleótidos de qualquer comprimento. Os polinucleótidos podem conter desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos e/ou seus análogos. Os nucleótidos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. 0 termo "polinucleótido" inclui, por exemplo, moléculas de filamentação simples, filamentação dupla e em hélice tripla, um gene ou fragmento de um gene, exões, intrões, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plasmideos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores. Para além de uma molécula de ácido nucleico nativo, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção também pode compreender moléculas de ácido nucleico modificado.

Por "iniciador" pretende-se significar um oligonucleótido com 9 até 150 nucleótidos de comprimento que pode ser utilizado numa reação de amplificação. Um iniciador que consiste essencialmente na SEQ ID NO: X não terá mais do que nucleótidos adicionais na extremidade 5' da SEQ ID NO: X, nem mais do que 10 nucleótidos adicionais na extremidade 3' da SEQ ID NO: X. Por "iniciador direto" pretende-se significar um iniciador que pode ser estendido por uma RNA polimerase ou DNA polimerase num ácido nucleico que corresponde à sequência de um filamento sentido ou mRNA traduzido. Por "iniciador reverso" pretende-se significar um iniciador que pode ser estendido por uma RNA polimerase ou DNA polimerase num ácido nucleico que é complementar ao filamento sentido ou mRNA traduzido. "Par de iniciadores" refere-se a iniciadores direto e reverso que podem ser utilizados em reações de amplificação para produzir um produto de amplificação. 0 termo "RNA" refere-se a formas poliméricas de ribonucleótidos de qualquer comprimento, em que os ribonucleótidos ou análogos de ribonucleótidos são unidos em conjunto por ligações fosfodiéster. 0 termo "RNA" inclui, por exemplo, moléculas de filamentação simples, filamentação dupla e em hélice tripla, transcritos primários, mRNA, tRNA, rRNA, transcritos in vitro, RNA sintetizado in vitro, polirribonucleótidos ramificados, RNA isolado de qualquer sequência e semelhantes. Cálculos de homologia ou identidade de sequências entre sequências (os termos são usados indistintamente no presente documento) são realizados do modo seguinte. Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos, ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidos hiatos numa ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequências de aminoácidos ou ácido nucleico para alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser descartadas para fins comparativos) . No alinhamento de dois iniciadores ou candidatos a iniciadores de diferentes comprimentos, o comprimento do iniciador mais curto deve ser pelo menos 60% e ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da sequência mais longa. Para a finalidade de comparar a percentagem de identidade entre iniciadores promotores (por exemplo, iniciadores promotores de T7) e iniciadores poli dT, as regiões não codificadoras são omitidas da comparação. Por não codificador pretende-se significar regiões fora de uma fase de leitura aberta. Os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos em posições de aminoácidos ou posições de nucleótidos correspondentes são depois comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido da posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como usado no presente documento, "identidade" de aminoácidos ou ácidos nucleicos é equivalente a "homologia" de aminoácidos ou ácidos nucleicos). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tomando em consideração o número de hiatos, e o comprimento de cada hiato, que é necessário introduzir para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser efetuadas utilizando um algoritmo matemático. Numa forma de realização preferencial, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1970) 48: 444-453) que foi incorporado no programa GAP do pacote de "software" GCG (disponível na "world-wide web" em gcg.com), utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de hiatos de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimentos de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Ainda noutra forma de realização preferencial, a percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos é determinada utilizando o programa GAP do pacote de "software" GCG (disponível na "world-wide web" em gcg.com), utilizando uma matriz NWSgap-dna. CMP e um peso de hiatos de 40, 50, 60, 70 ou 80 e peso de comprimentos de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjunto particularmente preferencial de parâmetros (e o que deve ser utilizado se o técnico não tiver a certeza de quais os parâmetros que devem ser aplicados para determinar se uma molécula pertence à invenção) emprega uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade por abertura de hiato de 12, uma penalidade por extensão de hiato de 4 e uma penalidade de hiato por deslocamento do quadro de leitura de 5. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduos de pesos PAM120, uma penalidade de comprimento de hiatos de 12 e uma penalidade de hiatos de 4.

As sequências de ácidos nucleicos e proteínas descritas no presente documento podem ser utilizadas como "sequência de busca" para efetuar uma pesquisa contra bases de dados públicas com a finalidade, por exemplo, de identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser efetuadas utilizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-10. Pesquisas de nucleótidos por BLAST podem ser efetuadas com o programa NBLAST, pontuação=l00, comprimento de palavras=12 para se obterem sequências de nucleótidos homólogas a moléculas de ácidos nucleicos de patogénios e iniciadores da invenção. Pesquisas de proteínas por BLAST podem ser efetuadas com o programa XBLAST, pontuação=50, comprimento de palavras=3 para se obterem sequências de aminoácidos homólogas a moléculas da proteína EPLIN da invenção. Para obter alinhamentos com hiatos para fins comparativos, pode utilizar-se Gapped BLAST como descrito em Altschul et ai., (1997) Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser utilizados os parâmetros por defeito dos respetivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Ver ncbi.nlm.nih.gov.

Patogénios em mutação rápida, tais como o HIV, apresentam um alvo difícil para vacinação. Estratégias prévias de vacinação contra patogénios foram dirigidas contra estirpes comuns ou sequências de consenso. No entanto, estas estratégias não conseguiram proporcionar proteção ou efeito terapêutico contra patogénios em mutação ou recombinação rápida, em que o alvo do patogénio pode ser altamente variável. O desenvolvimento de uma vacina contra um patogénio autólogo, como uma vacina contra o HIV autólogo, particularmente uma que possa visar simultaneamente todas as variantes que infetam o paciente, representa um paradigma novo em terapêutica. A capacidade de tratar um indivíduo infetado com um patogénio com uma vacina que dirige a resposta imunológica contra antigénios de patogénios específicos presentes nesse indivíduo deve demonstrar ser mais eficaz do que vacinas dirigidas contra antigénios de consenso, tais como vacinas prévias contra o HIV, que até à data têm exibido pouca ou nenhuma capacidade de mediar a eliminação virai ou suprimir cargas virais.

Um objetivo da invenção é proporcionar uma estratégia de vacinação específica para pacientes para o tratamento de patogénios utilizando vacinas celulares ou de ácidos nucleicos personalizadas que compensem a variabilidade de um patogénio presente num indivíduo. Esta estratégia baseia-se na amplificação de ácido nucleico de um patogénio de um sujeito infetado e utilização de tal material patogénico amplificado, ou seus derivados, numa vacina específica para pacientes. Os ácidos nucleicos do patogénio amplificados, ou seus derivados (por exemplo, produtos de transcrição in vitro, produtos de transcrição/tradução in vitro ou vetores que contêm tais ácidos nucleicos amplificados), podem ser utilizados como uma vacina de ácido nucleico autóloga ou alogénica ou carregados em células apresentadoras de antigénios (APCs) autólogas, tais como células dendríticas (DCs), que depois são administradas ao paciente. Além disso, os produtos amplificados podem ser utilizados para identificar variantes do patogénio presentes num indivíduo infetado e para monitorizar os efeitos da intervenção terapêutica. A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e outras técnicas de amplificação de ácidos nucleicos oferecem um modo conveniente e eficiente de obter DNA que codifica os antigénios específicos de patogénio de interesse. No entanto, devido à elevada frequência de mutação de alguns patogénios, particularmente de patogénios retrovirais, tais como o HI V, antes da presente invenção foi um desafio significativo conceber iniciadores de PCR que pudessem amplificar fiavelmente regiões visadas de variantes do patogénio que pudessem estar presentes num paciente individual. Por exemplo, mesmo apesar de haver consideravelmente menos heterogeneidade em sequências do HIV que flanqueiam regiões codificadoras, não existem regiões absolutamente conservadas que permitam a conceção de um único par de iniciadores universal para cada gene de interesse. Em consequência, os métodos da invenção empregam reuniões de iniciadores diretos e reversos específicos para antigénios para a amplificação de ácidos nucleicos de genes de interesse, ou suas porções, do patogénio de modo que a maior parte ou todas as estirpes de um patogénio presentes num indivíduo infetado reajam com pelo menos um iniciador direto e um reverso para permitir a amplificação de sequências alvo diversificadas. São revelados no presente documento métodos para a amplificação de ácidos nucleicos independente de estirpes de ácidos nucleicos de um patogénio utilizando múltiplos pares de iniciadores e condições amplificação que compensam a variabilidade entre ácidos nucleicos do patogénio nos sítios de hibridização dos iniciadores. Utilizando estes métodos é possível amplificar todas as porções ou porções visadas de essencialmente todas as variantes de um patogénio presentes num indivíduo infetado. A amplificação de todas ou da maior parte das variantes do patogénio presentes num indivíduo gera produtos de amplificação que podem ser utilizados para identificar e quantificar as variantes presentes num indivíduo infetado. Tais produtos de amplificação ou seus derivados podem ser utilizados em vacinas à base de células ou vacinas de ácidos nucleicos para tratar infeção causada por um patogénio e/ou para identificar as variantes do patogénio presentes num indivíduo infetado. Estes produtos amplificados (produtos de amplificação) podem ser utilizados diretamente ou podem ser convertidos em RNAs aptos a serem traduzidos, para carga em APCs, preferencialmente APCs autólogas, in situ ou in vitro. Os produtos de amplificação e transcritos in vitro preparados a partir do transcrito podem ser utilizados como vacinas de ácidos nucleicos.

Polipéptidos traduzidos in vitro preparados a partir de tais transcritos in vitro podem ser utilizados como vacinas de polipéptidos e para carga de APCs.

Um aspeto importante para a amplificação independente de estirpes de ácidos nucleicos de patogénios é a seleção de iniciadores e condições de amplificação. Os requerentes descobriram métodos para selecionar pares de iniciadores capazes de amplificar regiões divergentes de ácidos nucleicos de patogénios. Para amplificar antigénios alvo selecionados de um patogénio variável, tal como o HIV, de um modo independente de estirpes, reuniões de iniciadores de PCR podem ser estrategicamente selecionadas para assegurar uma amplificação fiável de alvos pretendidos e coamplificação simultânea de variantes existentes. 0 número e escolha de quais antigénios autólogos serão visados para amplificação podem basear-se em dois fatores principais: (1) regiões substanciais do gene alvo devem ser propensas a amplificação de ácidos nucleicos utilizando reuniões de iniciadores com complexidades manejáveis, e (2) preferencialmente, a expressão do antigénio alvo não afeta adversamente a biologia das APCs alvo, tais como DCs. Ao amplificar regiões especificas de ácidos nucleicos de patogénios, em vez de ácidos nucleicos totais de patogénios, é possível selecionar regiões que codificam os fragmentos mais imunogénicos e evitar regiões que possam ter efeitos negativos no sistema imunológico. Por exemplo, podem evitar-se porções do gene nef do HIV envolvidas na inibição de células dendríticas ao escolher iniciadores que não amplificam a região de nef responsável pela inibição. Múltiplos iniciadores que correspondem a variantes conhecidas de um patogénio podem ser concebidos para hibridização num sítio alvo. No entanto, para gerir a complexidade dos iniciadores, é útil determinar em primeiro lugar as sequências de nucleótidos conservadas entre variantes conhecidas do patogénio. A seleção de iniciadores que hibridizam com regiões conservadas de ácidos nucleicos de patogénios reduz o número de iniciadores necessários para assegurar a amplificação de todas ou da maior parte das variantes de um patogénio presentes num indivíduo. Outra consideração importante na seleção de iniciadores é que o emparelhamento defeituoso na metade 3' de uma sequência de iniciador com sítios de hibridização de variantes conhecidos deve ser evitado ou minimizado, no entanto, um T com emparelhamento defeituoso 3' terminal tipicamente não terá um efeito adverso na amplificação. Os restantes emparelhamentos defeituosos 3' podem ser compensados diminuindo a temperatura de hibridização. 0 emparelhamento defeituoso na metade 5' de uma sequência de iniciador é tolerado e pode ser compensado diminuindo a temperatura de hibridização. As condições reacionais de amplificação podem ser otimizadas para permitir a amplificação de todas as variantes do patogénio presentes num indivíduo infetado ao mesmo tempo evitando amplificação inespecífica. Em conformidade, a amplificação utilizando os iniciadores e/ou métodos da invenção permite a identificação e quantificação de todas as variantes de um patogénio presentes num indivíduo. Em contraste, métodos da técnica anterior tipicamente subestimaram a quantidade de patogénio presente, pois só foi identificada uma única variante do patogénio.

Os métodos descritos acima e nos exemplos abaixo para a seleção de pares de iniciadores capazes de amplificar múltiplas variantes do HIV são aplicáveis à seleção de pares de iniciadores capazes de amplificar múltiplas variantes de qualquer patoqénio. 0 processo de seleção de iniciadores descrito no presente documento compreende os passos de escolher uma primeira região para hibridização de um iniciador direto e uma segunda região para hibridização de um iniciador reverso, em que as referidas primeira e segunda regiões flanqueiam uma fase de leitura aberta e/ou um epítopo de um patogénio, e escolher candidatos a iniciadores diretos e reversos para as referidas primeira e segunda regiões, em que pelo menos um dos referidos iniciadores é concebido para compensar a variabilidade de sequências entre múltiplas variantes de um patogénio.

Numa forma de realização, iniciadores são concebidos pelo método acima para amplificar ácidos nucleicos de múltiplas variantes de um patogénio presentes num mamífero infetado. Os ácidos nucleicos amplificados podem depois ser utilizados numa vacina autóloga de ácido nucleico para tratar o mesmo mamífero infetado com o patogénio. Alternativamente, o ácido nucleico amplificado pode ser utilizado como uma vacina alogénica de ácido nucleico para tratar um mamífero diferente infetado com o patogénio, ou como uma vacina profilática para prevenir infeção. Para utilizações profiláticas, vacinas de ácidos nucleicos ou APCs carregadas com ácidos nucleicos podem ser preparadas utilizando produtos de amplificação preparados a partir de ácidos nucleicos de patogénios isolados ou derivados de um ou mais indivíduos.

Assim, numa forma de realização, é revelado no presente documento um método de produção de produtos de amplificação de patogénios que representam um ou mais polipéptidos de pelo menos duas estirpes de um patogénio, que compreende: (a) combinar polinucleótidos de uma primeira e de uma segunda estirpe de um patogénio para formar uma mistura, e (b) amplificar os referidos polinucleótidos para produzir um primeiro produto de amplificação e um segundo produto de amplificação; em que o referido primeiro produto de amplificação codifica um polipéptido da referida primeira estirpe e o referido segundo produto de amplificação codifica o polipéptido correspondente da referida segunda estirpe. Por exemplo, os polinucleótidos da primeira e segunda estirpes podem ser obtidos de amostras biológicas de um ou mais indivíduos infetados com um patogénio, de uma ou mais culturas do patogénio, de patogénios clonados ou ácidos nucleicos de patogénios clonados. Os produtos de amplificação e RNA produzido por transcrição in vitro de tais produtos de amplificação são úteis como vacinas de ácidos nucleicos e para carga de células apresentadoras de antigénios. É revelada uma vacina de ácido nucleico que compreende uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios de múltiplas variantes de um patogénio presentes num mamífero e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que os referidos ácidos nucleicos são derivados por amplificação de ácidos nucleicos de polinucleótidos do patogénio utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores que conseguem compensar a variabilidade entre as referidas variantes do patogénio.

Noutra forma de realização, é revelado no presente documento, a título de referência, um método de tratamento de infeção, que compreende administrar a vacina de ácido nucleico acima ao referido mamífero infetado com um patogénio.

De modo semelhante, é revelado no presente documento um método de preparação de uma vacina de ácido nucleico, que compreende: combinar uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios de múltiplas variantes de um patogénio presentes num mamífero com um transportador farmaceuticamente aceitável, em que os referidos ácidos nucleicos são derivados por amplificação de ácidos nucleicos de polinucleótidos de um patogénio utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores que conseguem compensar a variabilidade entre as referidas variantes do patogénio.

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona uma célula dendrítica isolada que compreende uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HI V presentes num sujeito individual, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV, e que compreende adicionalmente mRNA de CD40L transcrito in vitro. Como exemplo hipotético, presuma-se que um vírus tem um total de três genes, a, b, e c, que codificam os polipéptidos A, B e C. Este vírus sofre mutação rápida e duas estirpes do vírus são isoladas de um paciente infetado, as estirpes X e Y. A estirpe X tem os alelos a', b', e c', que codificam os polipéptidos A' , B' e C' . A estirpe Y tem alelos diferentes dos mesmos genes, que são designados a*, b* e c* e codificam os polipéptidos variantes A*, B* e C*. Como especificado acima, a célula dendrítica acima compreende ácidos nucleicos que codificam um ou mais polipéptidos de patogénio de múltiplas estirpes de um patogénio (por exemplo, as estirpes X e Y do vírus), mas pelo menos um polipéptido de patogénio não é representado de nenhuma estirpe. Tal significa que a APC pode conter polinucleótidos que representam cada alelo de um ou dois dos três genes. Por exemplo, a APC pode conter polinucleótidos que codificam A', A*, B' e B*, mas não C' nem C* . Aqui, o polipéptido de patogénio não representado de nenhuma estirpe é o polipéptido C, em que nem C' nem C* são representados. 0 termo polipéptido, como usado no presente documento, refere-se a proteínas completas e seus fragmentos. Assim, a APC pode conter ácidos nucleicos que codificam A', A*, B', B* e correspondentes fragmentos de C' e C*, mas não todos de C' e C*. A vantagem desta abordagem relativamente à utilização de ácidos nucleicos que codificam todos os polipéptidos de patogénio é que evita a reconstituição do patogénio infecioso. Uma vantagem adicional é que podem ser especificamente evitados ácidos nucleicos que codificam polipéptidos que podem ser nocivos para um paciente ou para uma célula apresentadora de antigénios.

As vacinas de ácidos nucleicos da invenção são adequadas para administração a um mamífero. Em formas de realização preferenciais, o mamífero é um primata e muito preferencialmente um humano. Muito preferencialmente, as vacinas de ácidos nucleicos da invenção são administradas ao mamífero específico de onde foram derivados os polinucleótidos de patogénio. Por exemplo, numa forma de realização preferencial, os polinucleótidos de patogénio são isolados de um paciente infetado e a vacina de ácido nucleico é administrada a esse paciente.

As vacinas da invenção compreendem uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios de múltiplas variantes de um patogénio. 0 ácido nucleico pode ser RNA ou DNA de filamentação simples ou dupla. Numa forma de realização preferencial, o ácido nucleico é um RNA, muito preferencialmente o ácido nucleico é um mRNA. As vacinas de ácidos nucleicos da invenção devem poder ser expressas num ou mais tipos de células do mamífero ao qual são administradas. Por expresso pretende-se significar que o ácido nucleico pode ser traduzido diretamente (por exemplo, um RN A apto a ser traduzido) ou pode ser transcrito para produzir um mRNA apto a ser traduzido (por exemplo, um DNA que compreende um promotor e a codão de início seguido de uma fase de leitura aberta) e/ou pode ser transcrito depois de integrado no genoma da célula de mamífero no qual é introduzido (por exemplo, DNA linear, vetores de DNA, vetores virais de RNA e vetores virais de DNA). Um mRNA apto a ser traduzido pode ser produzido por transcrição in vivo (como um transcrito primário ou processado) ou por transcrição in vitro. Em formas de realização preferenciais, o ácido nucleico utilizado nas vacinas da invenção é um RNA, muito preferencialmente um mRNA. 0 termo patogénio refere-se a qualquer vírus ou organismo que está envolvido na etiologia de uma doença e também a seus derivados atenuados. Tais patogénios incluem mas não se limitam a patogénios bacterianos, de protozoários, fúngicos e virais, tais como Helicobacter, tal como Helicobacter pylori, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Campylobacter, várias micobactérias, tais como Mycobacterium leprae, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, espécies de Brucella, Leptospira interrogans, Staphylococcus, tal como S. aureus, Streptococcus, Clostridum, Candida albicans, Plasmodium, Leishmania, Trypanosoma, vírus da imunodeficiência humana (HIV), HCV, HPV, CMV, HTLV, virus herpes (por exemplo, virus herpes simplex do tipo 1, virus herpes simplex do tipo 2, coronavírus, vírus varicela zoster e virus Epstein-Barr), vírus papiloma, vírus influenza, vírus da hepatite B, vírus da poliomielite, vírus do sarampo, vírus da papeira e vírus da rubéola. Os métodos revelados no presente documento são particularmente úteis para amplificação de ácidos nucleicos de patogénios altamente variáveis, tais como patogénios virais, preferencialmente patogénios retrovirais e muito preferencialmente HIV e HCV.

Variantes ou estirpes de um patogénio referem-se a quaisquer derivados de um patogénio. Tais derivados podem ocorrer (ou podem ter ocorrido) por mutação ou recombinação ou manipulação recombinante de um patogénio. Por exemplo, variantes do HIV abrangem variantes novas e não identificadas do HIV, e incluem mas não estão limitadas a HIV-1 Grupos M, N e 0, todos os subtipos ou ciados do HIV, incluindo HIV-1 ciados Al, A2, B, C, C, Fl, F2, G, H, J e K, variantes de ciados, todas as variantes do HIV-2 e todos os seus recombinantes e quasiespécies. É pretendido que "múltiplas variantes de um patogénio" ou "múltiplas estirpes de um patogénio" incluam variantes de um patogénio que estão presentes num indivíduo infetado. Múltiplas variantes de um patogénio podem ter sido introduzidas num indivíduo de modo concomitante ou separado. Alternativamente, múltiplas variantes de um patogénio podem surgir num indivíduo através de mutação e/ou recombinação. Por exemplo, numa forma de realização preferencial, o patogénio é um retrovirus, preferencialmente o HIV. Múltiplas variantes de um patogénio (HIV) presentes num indivíduo infetado podem incluir qualquer HIV que possa estar presente nesse indivíduo. Em tais casos, as múltiplas variantes do HIV podem incluir HIV-1, incluindo quaisquer ou todos os grupos do HIV-1 Μ, N e 0, e seus subtipos, ciados e quasivariantes, bem como o HIV-2 e suas variantes, e classes do HIV ainda não identificadas.

Por antigénio pretende-se significar um polipéptido que compreende um ou mais epitopos imunogénicos. Por exemplo, os ácidos nucleicos amplificados da invenção podem codificar uma ou mais fases de leitura aberta ou porções de uma ou mais fases de leitura aberta. Por exemplo, numa forma de realização preferencial, o patogénio é o HIV e os ácidos nucleicos amplificados codificam uma ou mais fases de leitura aberta, ou suas porções, de um ou mais polipéptidos do HIV de cada uma ou pelo menos da maior parte das variantes do HIV presentes no indivíduo infetado. Polipéptidos do HIV preferenciais são gag, rev, nef, vpr e env e seus fragmentos ou epitopos. Fragmentos preferenciais de vpr (utilizando NC_001802 como sequência de referência) são codificados pelos nucleótidos 5105-5320 (que codificam os resíduos de aminoácidos de vpr 1-72); 5138-5320 (que codificam os resíduos de aminoácidos de vpr 12-72); 5105-5165 (que codificam os resíduos de aminoácidos de vpr 1-20) e 5138-5165 (que codificam os resíduos de aminoácidos de vpr 12-20), e fragmentos correspondentes de outras variantes do HIV. Fragmentos de vpr preferenciais adicionais são os resíduos 25-40, 29-37, 30-38, 31-39, 31-50, 34-42, 41-49, 52-62, 53-63, 55-70, 59-67 e 62-70. Fragmentos e epitopos adicionais podem ser encontrados na Base de Dados de Imunologia Molecular do HIV disponibilizada no sítio da "internet" http: (//hiv.lanl.gov/content/imunology/).

Polinucleótidos de patogénio são o modelo ou são a fonte do modelo para amplificação dos ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios ou epitopos do patogénio. O polinucleótido de patogénio pode ser DNA ou RNA. Como exemplos não limitadores, o polinucleótido de patogénio pode ser um DNA, tal como o genoma de um patogénio, um vetor ou fragmento de DNA ou um DNA de patogénio integrado no genoma do hospedeiro do patogénio. Quando o polinucleótido de patogénio é um DNA, pode ser utilizado diretamente como modelo para amplificação de acordo com os métodos revelados no presente documento. 0 polinucleótido de patogénio também pode ser um RNA na forma de genoma de um patogénio (por exemplo, genomas retrovirais) ou mRNA de patogénio, que podem estar encadeados ou não encadeados. Por exemplo, no caso do HIV, o ácido nucleico pode ser DNA correspondente ao DNA virai integrado no genoma do hospedeiro ou correspondente a cDNA do HIV presente numa célula antes da integração viral no genoma do hospedeiro. RNA do HIV pode estar na forma de um genoma de RNA virai, isolado de partículas virais ou de células hospedeiras durante a replicação virai, e também pode estar na forma de mRNA do HIV, encadeado ou não encadeado. Numa forma de realização preferencial, o RNA de patogénio é RNA genómico do HIV isolado de viriões do HIV. Nos casos em que o polinucleótido de patogénio é um RNA, pode ser transcrito de forma reversa para produzir um cDNA que depois pode servir de modelo para a amplificação de ácido nucleico.

Preferencialmente, o polinucleótido de patogénio provém ou é derivado de múltiplas variantes do patogénio presentes num indivíduo infetado. Neste contexto, por "derivado de" pretende-se significar que o ácido nucleico é pelo menos parcialmente purificado do patogénio ou célula (s) que contém(contêm) o ácido nucleico de patogénio ou que o ácido nucleico é amplificado de ácido nucleico de patogénio. Por derivação do ácido nucleico de múltiplas variantes do patogénio presentes num indivíduo, a vacina resultante pode induzir uma resposta imunológica a potencialmente todas as variantes do patogénio presentes num indivíduo. 0 produto de amplificação primário produzido por amplificação de ácido nucleico utilizando iniciadores selecionados de acordo com os métodos da invenção compreenderá um DNA que codifica um antigénio de patogénio ou seu epítopo. Os produtos de amplificação primários podem ser utilizados numa vacina de ácido nucleico sem modificações adicionais. Alternativamente, o produto de amplificação primário pode ser inserido numa cassete de expressão ou vetor de expressão para utilização numa vacina de ácido nucleico, vacina virai ou para carga em APCs. Numa forma de realização preferencial, o produto de amplificação de DNA primário é modificado para atuar como modelo para transcrição in vitro.

Para transcrever uma sequência de DNA modelo (por exemplo, um produto de PCR), o modelo deve conter um sítio de ligação ou promotor de RNA polimerase. Além disso, para tradução eficiente em células eucarióticas, o RNA transcrito contém preferencialmente uma Cobertura 5' , uma sequência de Kozak incluindo um codão de iniciação da tradução ATG e uma sequência poliadenilada na sua extremidade 3'. Preferencialmente, o RNA transcrito também conterá um codão de terminação da tradução (UAA, UAG ou UGA) . Alguns destes sinais de transcrição e de tradução, tais como o promotor, sequência de Kozak, codões de início e terminação, podem estar presentes no modelo do ácido nucleico de patogénio alvo e podem ser amplificados durante PCR ou outra reação de amplificação. Alternativamente, estas sequências podem ser incluídas em iniciadores diretos e reversos utilizados em qualquer fase da amplificação.

Se a vacina pretendida for uma vacina de mRNA para administração in situ ou para carga em APCs, então a sequência promotora contida no iniciador 5' encaixado deve ser adequada para transcrição in vitro. Promotores adequados para transcrição in vitro e métodos de transcrição in vitro são conhecidos dos profissionais. Como exemplo, promotores preferenciais são os correspondentes a RNA polimerases comercialmente disponíveis, tais como o promotor de T7 e o promotor de SP6. Outros promotores úteis são conhecidos dos profissionais. Se a vacina pretendida contiver um ácido nucleico destinado a transcrição numa célula alvo, o promotor contido na sequência de iniciador 5' deve ser tal que é ativo na célula alvo pretendida. Além disso, em casos em que a vacina contém um ácido nucleico destinado a transcrição na célula alvo, o promotor e sinais de iniciação da tradução podem ser amplificados a partir do modelo, incorporados num iniciador direto ou através de inserção do produto de amplificação numa cassete de expressão. Preferencialmente, o promotor permite uma transcrição eficiente utilizando estojos de transcrição in vitro comercialmente disponíveis. Métodos de transcrição e tradução in vitro são conhecidos dos profissionais (ver, por exemplo, U.S. 2003/0194759). Em reações de transcrição in vitro típicas, um modelo de DNA é transcrito utilizando uma RNA polimerase de bacteriófago na presença dos quatro ribonucleósidos trifosfato e de um dinucleótido de cobertura tal como m7G (5' ) ppp (5' ) G, ou um análogo de cobertura, tal como ARCA. O promotor e sinais de iniciação da tradução podem ser incluídos num iniciador utilizado durante a amplificação primária ou num iniciador encaixado utilizado numa ronda subsequente. O alvo de hibridização para os iniciadores utilizados numa ronda secundária opcional de amplificação pode ser igual ao utilizado na reação de amplificação primária ou pode ser um sitio interno ("encaixado") ao produto de amplificação primário. Numa forma de realização preferencial, o iniciador direto utilizado na ronda de amplificação primária ou secundária (preferencialmente secundária) compreenderá uma região não de hibridização 5' (uma "protuberância") que codifica um promotor (por exemplo, promotor de T7) e uma região 3' complementar ao filamento antissentido do produto de amplificação primário. Tipicamente, o iniciador direto também conterá uma sequência de Kozak, preferencialmente uma sequência de Kozak otimizada, por exemplo, bases 5' CCACCATGG (SEQ ID NO: 59), em que o ATG sublinhado é o codão de iniciação da tradução. A sequência de Kozak que inclui o codão de inicio ATG pode estar na região de protuberância 5' do iniciador direto ou na região de hibridização 3' do iniciador, dependendo de tais sequências estarem presentes no produto de amplificação primário. Além disso, se o produto de amplificação primário contiver uma sequência de Kozak que não é ótima, pode ser otimizada por utilização de um iniciador direto com uma sequência de Kozak ótima, se bem que não totalmente complementar. Preferencialmente, a porção 3' do iniciador direto será essencialmente complementar à sequência imediatamente a jusante do codão iniciador ATG ou à sequência codificadora mais a 5' amplificada durante a amplificação primária. 0 iniciador reverso contém preferencialmente uma protuberância 5' poliT na sua extremidade 5' que irá servir de modelo para a poliadenilação durante a transcrição in vitro. A metade 3' do iniciador reverso será complementar à sequência sentido isolada na reação de amplificação primária. Se um codão de terminação da tradução apropriado não estiver presente no produto de amplificação primário, pode ser incluído na porção de protuberância 5' do iniciador reverso. 0 produto de amplificação secundário obtido por amplificação utilizando iniciadores tais como os descritos acima pode então servir de modelo numa reação de transcrição in vitro na presença de m7G de cobertura ou um seu análogo, tal como ARCA (ver U.S. 2003/0194759).

Assim, noutra forma de realização, é revelado no presente documento um método de tratamento de um mamífero infetado com um patogénio, que compreende: a. amplificar ácidos nucleicos de múltiplas variantes de um

patogénio presentes num mamífero utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores que conseguem amplificar múltiplas variantes do referido patogénio para produzir DNA amplificado do patogénio; b. opcionalmente transcrever o referido DNA amplificado do patogénio para produzir RNAs do patogénio, e c. administrar o referido DNA do patogénio ou o referido RNA do patogénio ao referido mamífero. Métodos de formulação e administração de vacinas de ácidos nucleicos a um sujeito são conhecidos dos profissionais. Ver, por exemplo, Scheel et al. Eur J Immunol (2204) 34: 537-547; Hoerr et al. (2000) Eur J Immunol 30: 1-7; Liu et al (2002) Vaccine 20: 42-48; Riedl et al. (2002) J Immunol 168: 4951; Riedel et al. (2004) J Mol Med 82: 144; U.S. 5,783.567; U.S. 6,603,998; EP0880360; EP1083232. Vias de administração incluem mas não estão limitadas a administração tópica, eletroporação da pele, bem como administração cutânea, subcutânea, intradérmica, por mucosa e intramuscular e semelhantes.

Como alternativa à utilização do produto de amplificação primário ou secundário ou de um RNA transcrito in vitro como vacina de ácido nucleico, tais ácidos nucleicos podem ser carregados em células apresentadoras de antigénios in vitro. As células apresentadoras de antigénios carregadas são depois adequadas para utilização como vacina.

Assim, noutra forma de realização, é revelada uma composição que compreende: uma célula apresentadora de antigénios transfetada com uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam um ou mais antigénios de múltiplas variantes de um patogénio presentes num mamífero, em que os referidos ácidos nucleicos são derivados de amplificação de ácido nucleico de polinucleótidos de patogénio utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores que conseguem compensar a variabilidade entre as referidas variantes de patogénio, e a referida célula apresentadora de antigénios e os referidos ácidos nucleicos de patogénios provêm ou são derivados do referido mamífero. Células apresentadoras de antigénios (APC) incluem mas não estão limitadas a macrófagos, células B e células dendríticas, tais como células dendríticas imaturas, células dendríticas maduras e células de Langerhans. Células apresentadoras de antigénios profissionais, em particular células dendríticas (DCs), proporcionam um veiculo poderoso para estimulação de imunidade mediada por células através de efeitos em células T CD4+ e CD8+ (Banchereau 1998, Banchereau 2000) . De modo intrínseco à sua função, processam eficientemente antigénios para apresentação em produtos de MHC de classe I e II a células T CD4 + e CD8+. Células dendríticas, isoladas de sangue periférico ou medula óssea através de técnicas de enriquecimento de antigénios de superfície ou recolhidas de culturas de PBMCs, podem ser carregadas com candidatos a antigénios específicos e depois são capazes de apresentar o(s) antigénio(s) relevante(s) a células T não manipuladas ou em repouso (Heiser 2000, Mitchell 2000) . Preferencialmente, as células apresentadoras de antigénios são autólogas ao indivíduo a ser vacinado, e o ácido nucleico de patogénio também é isolado ou derivado do paciente.

As células apresentadoras de antigénios são produzidas e encontram-se no sujeito mamífero ou são derivadas de células isoladas do sujeito mamífero. Numa forma de realização preferencial, a célula apresentadora de antigénios é uma célula dendrítica. O termo "células dendríticas (DC)" refere-se a uma população diversificada de tipos de células morfologicamente semelhantes presentes numa variedade de tecidos linfoides e não linfoides (Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296) ou derivadas de precursores de células dendríticas in vitro. Células dendríticas são as mais potentes das APCs e proporcionam os sinais necessários para ativação e proliferação de células T. Células dendríticas são derivadas de células progenitoras da medula óssea, circulam em pequenos números no sangue periférico e aparecem como células de Langerhans imaturas ou células maduras terminalmente diferenciadas. Em formas de realização preferenciais, células dendríticas são diferenciadas de monócitos. Métodos para o isolamento de células apresentadoras de antigénios (APCs) e para a produção de precursores de células dendríticas e células dendríticas maduras são conhecidos dos profissionais. Ver, por exemplo, Berger et ai. J Immunol Methods 2002 268: 131-40, Pedidos de Patentes U.S. 20030199673, 20020164346 e 60/522,512 e WO 93/20185, cujo conteúdo é incorporado a título de referência.

Numa forma de realização preferencial, células dendríticas são preparadas a partir de células monocíticas do sangue periférico (PBMCs) CD 14+ por métodos descritos em Romani et al. (J Exp Med 1994 180: 83-93) ou Sallusto et al. (J Exp Med 1994 179: 1109-1118). Alternativamente, células dendríticas podem ser preparadas a partir de células CD34+ pelo método de Caux et al. {J Exp Med 1996 184: 695-706). Métodos de carga de células apresentadoras de antigénios são conhecidos dos profissionais e incluem mas não estão limitados a eletroporação, captação passiva, lipofeção, reagentes catiónicos, transdução virai, CaPCR e semelhantes. Ver, por exemplo, PCT/US05/22705 e U.S. No. Ser. No. 60/583.579; U.S. Pub. No. 2003/0143743; U.S. Pub. No. 20050008622; U.S. Pub. No. 20040235175, e U.S. Pub. No. 20040214333, cujo conteúdo é incorporado a título de referência. Em formas de realização preferenciais, as células apresentadoras de antigénios são carregadas com mRNA de CD40L e RNA que codifica múltiplas estirpes de polipéptidos de patogénio. O cDNA de CD40L humano, proteína CD40L e um mRNA de CD40L preferencial úteis para transfeção de células apresentadoras de antigénios estão apresentados na SEQ ID NO: 407 e 408, respetivamente. Em formas de realização preferenciais, um mRNA correspondente aos nucleótidos 38-877 da SEQ ID NO: 410. Preferencialmente, o mRNA é recoberto em 5' e poliadenilado. Em formas de realização preferenciais, a cobertura é ARCA. Comprimentos de caudas poliA preferenciais situam-se no intervalo de 50-1000 nucleótidos, mais preferencialmente 64-900 nucleótidos e muito preferencialmente 101-600 nucleótidos. Numa forma de realização adicional, células apresentadoras de antigénios são carregadas com polipéptidos preparados por tradução in vitro dos RNAs que codificam polipéptidos de patogénio de múltiplas estirpes de um patogénio. Os polipéptidos de patogénio podem ser carregados em células apresentadoras de antigénios com mRNA de CD40L. Células dendríticas podem ser carregadas in vitro quando maduras ou imaturas. Células dendríticas imaturas carregadas podem ser amadurecidas in vitro antes da vacinação ou in vivo (com ou sem um estímulo de maturação exógeno) após a vacinação. Alternativamente, ácidos nucleicos podem ser administrados em células apresentadoras de antigénios in situ. Ver, por exemplo, Liu et al. (Vaccine 2002 20: 42-48), Lisziewics et al. (Vaccine 2003 21: 620-623) e O'Hagen (Curr Drug Targets Infect Disord 2001 1: 273-286), cujo conteúdo é incorporado a título de referência.

Preferencialmente, a célula apresentadora de antigénios na composição acima é uma célula dendrítica. A célula dendrítica carregada pode depois ser utilizada como vacina para tratar a infeção causada por um patogénio num paciente. Preferencialmente, o patogénio e célula apresentadora de antigénios (por exemplo, célula dendrítica) são autólogos ao paciente tratado.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de preparação de uma vacina autóloga, que compreende: transfetar células dendríticas obtidas ou derivadas de um indivíduo infetado com o HIV com mRNA de CD40L e uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes no referido indivíduo, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV, em que os referidos ácidos nucleicos são derivados por amplificação de ácido nucleico de polinucleótidos do patogénio utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores concebidos para compensar a variabilidade entre as referidas variantes do patogénio. A invenção proporciona adicionalmente uma vacina que compreende as células apresentadoras de antigénios carregadas descritas acima. Em tais vacinas, as células apresentadoras de antigénios carregadas estarão num tampão adequado para administração terapêutica a um paciente. A vacina pode compreender adicionalmente um adjuvante para fatores para a estimulação de células apresentadoras de antigénios ou células T. Métodos de formulação de composições farmacêuticas são conhecidos dos profissionais. Ver, por exemplo, a última versão de "Remington's Pharmaceutical Science". 0 intervalo ótimo de imunização para vacinas de células dendriticas pode ser determinado pelo profissional. Numa forma de realização preferencial, os pacientes serão vacinados 5 vezes com lxlO6 até lxlO7 DCs carregadas com RNA viável por dose. É esperado que o nivel de dose selecionado para a vacinação seja seguro e bem tolerado. Métodos de isolamento, preparação, transfeção, formulação e administração de células apresentadoras de antigénios a pacientes são conhecidos na área. Ver, por exemplo, Fay et al. Blood 2000 96: 3487; Fong et al. J Immunol 2001b 166: 4254-4259; Ribas et al. Proc Am Soc Clin One 2001 20: 1069; Schuler-Thurner et al. J Exp Med. 2002 195: 1279-88. Errata em: J Exp Med. 2003197: 395; e Stift et al. J Clin Oncol 2003 21: 135-142.

Vias de administração de APCs empregues clinicamente incluem mas não estão limitadas a intravenosa (IV), subcutânea (SC), intradérmica (ID) e intralinfática. Foram relatadas respostas clinicas objetivas após dosagem IV, SC e ID de outras vacinas de APCs. Presentemente está-se a desenvolver uma preferência para administração ID uma vez que a derme é uma residência normal de células dendriticas, de onde é conhecido que migram para nodos linfáticos de drenagem. Em modelos murinos, células dendriticas injetadas SC são posteriormente encontradas em áreas de células T de nodos linfáticos de drenagem e desencadeiam imunidade antitumoral protetora que é superior à subsequente a imunização IV. Há evidências murinas de que a injeção de células dendriticas diretamente num nodo linfático é superior a outras vias de administração na geração de imunidade antitumoral protetora ou linfócitos T citotóxicos (CTLs) (Lambert et al. Cancer Res 2001 61: 641-646). Tal sugere que deve ser administrada uma dose completa de células dendriticas de modo a ter impacto num único nodo ou cadeia de drenagem linfática (em vez de dividir a dose entre múltiplos sítios para recrutar tantos nodos quanto possível).

Para avaliar a imunogenicidade da vacina, as respostas imunológicas em indivíduos vacinados podem ser monitorizadas seguindo os perfis de maturação de células T CD4+ e CD8+. Por exemplo, o restabelecimento da função de células efetoras específica para o HIV pode ser determinado pela presença de células que expressam o fenótipo de células T efetoras, CD45 RA+ CCR7~, e secreção de níveis elevados de IFN-γ e granzima B. O restabelecimento de respostas proliferativas específicas para o HIV pode ser determinado pela capacidade de células de produzirem IL-2 e se tornarem pobres em CFSE após estimulação com células dendriticas transfetadas com o compartimento de células T de memória especificas para o HIV de Restabelecimento de RNAs do HIV. A maturação de células T especificas induzidas pela vacina pode ser medida utilizando marcadores de superfície e intracelulares utilizando um ensaio de citometria de fluxo. Células T CD8+ serão monitorizadas por coloração quanto a marcadores de superfície incluindo apTCR, CD45RA, CCR7 e CD107, ou moléculas intracelulares tais como granzima B ou γ-IFN. CD3, CD4,CCR7 e IL-2 podem ser utilizados para monitorizar células T CD4+. Tais ensaios podem ser utilizados para monitorizar a resposta imunológica após incubação com péptidos que abrangem as sequências do HIV autólogas do paciente. A comparação das respostas imunológicas celulares na referência e mensalmente antes de cada nova vacinação permite a determinação do impacto da vacina na amplitude da resposta imunológica celular. A amplitude da resposta imunológica também pode ser medida utilizando o ensaio de proliferação com CFSE. Não obstante terem sido descritos centenas de epítopos de CTLs codificados por antigénios do HIV, a consideração dos fatores acima para uma vacina de HIV autóloga conduziu os requerentes à seleção de gag (p55) , rev, nef e vpr como alvos primários para a vacina. No entanto, também podem ser visados outros antigénios do HIV utilizando os métodos da invenção. 0 método descrito acima foi utilizado para selecionar iniciadores capazes de amplificar múltiplas estirpes do HIV de um indivíduo infetado com o HIV. Em particular, os requerentes descobriram iniciadores capazes de amplificar os genes gag, nef, rev e vpr de múltiplas estirpes do HIV. As sequências dos iniciadores, números e nomes dos iniciadores, Tf e comprimento são mostrados na Figura 1 . As posições destes iniciadores relativamente a um genoma de referência do HIV (número de Acesso NC001802) são mostradas na Figura 2 .

Assim, num aspeto, é revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador direto de gag do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-20, 206 e 207 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NO: 1-20, 206 e 207. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Iniciadores diretos de gag preferenciais são as SEQ ID NOs: 1, 4, 16, 17, 19 e 20, que podem ser utilizados como único iniciador direto ou em qualquer combinação. Uma combinação preferencial de iniciadores diretos de gag consiste nas SEQ ID NOs: 16 e 17, e 19 e 20. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador reverso de gag do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 21-43, 102-113 e 220-232 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 21-43, 102-113 e 220-232. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Iniciadores reversos de gag preferenciais são as SEQ ID NOs: 21, 22, 26, 27, 32-34, 36-38, 40-41 e 106-108. Combinações preferenciais de iniciadores reversos de gag são as SEQ ID NOs: 33 e 41; SEQ ID NOs: 32, 36, 37 e 40; SEQ ID NOs: 21, 26 e 38; SEQ ID NOs: 22 e 27; SEQ ID NOs: 32, 33 e 34; SEQ ID NOs: 36, 37, 38, 40 e 41, e SEQ ID NOs: 106, 107 e 108. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador direto de vpr do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44-58, 208 e 209 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 44-58, 208 e 209. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Iniciadores diretos de vpr preferenciais são as SEQ ID NOs: 44-52. Combinações preferenciais de iniciadores diretos vpr são as SEQ ID NOs: 44 e 48, e SEQ ID NOs: 57 e 58. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador reverso de vpr do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 60-73, 114-122, 196-203, 233-241 e 261-273 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 60-73, 114-122, 196-203, 233-241 e 261-273. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Iniciadores reversos de vpr preferenciais são as SEQ ID NOs: 196-203 e 269-273. Combinações preferenciais de iniciadores reversos de vpr são as SEQ ID NOs: 196 e 197; SEQ ID NOs: 198, 199 e 200; SEQ ID NOs: 201-203, e SEQ ID NOs: 269-273. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador direto de rev do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 74-88, 183-189, 210 e 211 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 74-88, 183-189, 210 e 211. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Combinações preferenciais de iniciadores diretos de rev são as SEQ ID NOs: 87 e 88; SEQ ID NOs: 183 e 184; SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, e SEQ ID NOs: 188 e 189. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador reverso de rev do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 e 258-260 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 e 258-260. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Combinações preferenciais de iniciadores reversos de rev são as SEQ ID NOs: 190, 191 e 192, e SEQ ID NOs: 193, 194 e 195. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador direto de env do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 130-132, 134-136 e 212-214 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 130-132, 134-136 e 212-214. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador reverso de env do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 133, 154-159, 249 e 255-258 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NO: 133, 154-159, 249 e 255-258. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador reverso de env do HIV que consiste no oligonucleótido da SEQ ID NO: 133 ou oligonucleótido com pelo menos 75% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 133. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador direto de nef do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 138-139, 147, 148, 204 e 215-218 e oligonucleótido com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 138-139, 147, 148, 204 e 215-218. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Além disso, é revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador direto de nef do HIV que consiste num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 140-143 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 140-143. Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Combinações preferenciais de iniciadores diretos de nef são as SEQ ID NOs: 138, 139 e 204; SEQ ID NOs: 140-143; SEQ ID NOs: 147-148, e SEQ ID NOs: 138 e 139. É revelada no presente documento uma composição que compreende um iniciador reverso de net do HIV que consiste essencialmente num oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 144-146, 149-153 e 250-254 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 144-146, 149-153 e 250-254.

Preferencialmente, a identidade de sequências é pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%.

Combinações preferenciais de iniciadores reversos de nef são as SEQ ID NOs: 144-146, e SEQ ID NOs: 149-151.

Para amplificar uma sequência do HIV, um ou mais iniciadores diretos são combinados com um ou mais iniciadores reversos. Assim, são reveladas no presente documento combinações de pares de iniciadores úteis para a amplificação de múltiplas variantes do HIV. Estas combinações de pares de iniciadores podem conter um iniciador direto e um iniciador reverso (cada iniciador estará tipicamente presente em mais do que uma cópia). No entanto, para assegurar a amplificação de múltiplas variantes do HIV, as combinações mais úteis de pares de iniciadores conterão uma pluralidade de iniciadores diretos e uma pluralidade de iniciadores reversos.

Assim, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. um iniciador direto de gag que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-20, 162, 164, 168, 169, 206 e 207 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NO: 1-20, 162, 164, 168, 169, 206 e 207 e b. um iniciador reverso de gag que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 21-43, 102-113, 172, 173 e 220-232 e oligonucleótido com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 21-43, 102-113, 172, 173 e 220-232.

Combinações preferenciais de iniciadores diretos de gag com iniciadores reversos de gag são as SEQ ID NOs: 1, 32, 33 e 34; SEQ ID NOs: 4, 32, 33 e 34; SEQ ID NOs: 16, 17, 32, 33 e 34; SEQ ID NOs: 1, 36, 37, 38, 40 e 41; SEQ ID NOs: 4, 36, 37, 38, 40 e 41, e SEQ ID NOs: 16, 17, 36, 37, 38, 40 e 41.

Noutro aspeto, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. um iniciador direto de vpr que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44-58, 176, 177, 208 e 209 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 44-58, 176, 177, 208 e 209, e b. um iniciador reverso de vpr que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 60-73, 114-122, 196-200, 233-241 261-273 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 60-73, 114-122, 196-200, 233-241 e 261-273.

Combinações preferenciais de iniciadores diretos e reversos de vpr são: SEQ ID NOs: 44, 48, 196 e 197 ou SEQ ID NOs: 44, 48, 198, 199 e 200 ou SEQ ID NOs: 49, 196 e 197 ou SEQ ID NOs: 49, 198, 199 e 200.

Ainda noutro aspeto, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. um iniciador direto de nef que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 138-143, 147, 148, 204 e 215-218 e oligonucleótido com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 138-143, 147, 148, 204 e 215-218, e b. iniciadores reversos de nef que compreendem um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 144-146, 149-153 e 250-254 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 144-146, 149-153 e 250-254.

Combinações preferenciais de iniciadores diretos e reversos de nef são: SEQ ID NOs: 138, 139, 144, 145, 146 e 204 ou SEQ ID NOs: 140-146 ou SEQ ID NOs: 138, 139, 144, 145 e 146.

Ainda noutro aspeto, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. Um iniciador direto de env que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 130-132, 134-136 e 212-214 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 130-132, 134-136 e 212-214, e b. um iniciador reverso de env que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 133, 154-159, 249 e 255-258 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NO: 133, 154-159, 249 e 255-258.

Na prática dos métodos da invenção, é possível isolar quaisquer dos seguintes para utilização como modelo na amplificação primária de ácidos nucleicos: pró-vírus do HIV integrado, RNA genómico do HIV (de viriões ou células que replicam viriões do HIV), transcritos primários do HIV e mRNA processado do HIV. No entanto, numa forma de realização preferencial da invenção, genomas de RNA do HIV são isolados de viriões presentes no sangue. As fases de leitura aberta de env e rev sobrepõem-se parcialmente no genoma do HIV e, no decurso normal da expressão do HIV, o primeiro e segundo exões de rev no transcrito de RNA primário de rev são encadeados, originando um mRNA de rev processado. Uma vez que o modelo preferencial do HIV é RNA genómico do HIV, é muito prático amplificar o primeiro ou segundo exão de rev em vez do gene rev completo, que só fica na estrutura após o encadeamento. Em conformidade, em formas de realização preferenciais, são reveladas no presente documento combinações de iniciadores diretos e reversos de rev adequadas para amplificação do segundo exão de rev.

Assim, ainda noutro aspeto, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. um iniciador direto de rev que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 74-88, 183-189, 210 e 211 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 74-88, 183-189, 210 e 211, e b. um iniciador reverso de rev que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 e 258-260 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 89-101, 123-129, 190-195, 242-248 e 258-260.

Combinações preferenciais de iniciadores diretos e reversos de rev são as SEQ ID NOs: 183, 184, 190, 191 e 192, e SEQ ID NOs: 185, 186, 187, 190, 191 e 192, e SEQ ID NOs: 188-192.

Numa forma de realização, iniciadores diretos de rev podem ser combinados com iniciadores reversos de nef para produzir um único produto de amplificação que codifica nef e o segundo exão de rev. PCR encaixado pode depois ser utilizado para produzir produtos de amplificação de nef e rev secundários separados.

Em conformidade, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. um iniciador direto de rev que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 74-88, 183-189, 210 e 211 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 74-88, 183-189, 210 e 211, e b. um iniciador reverso de nef que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 144-146, 149-153 e 250-254 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 144-146, 149-153 e 250-254.

De modo semelhante, é possível produzir outros produtos de amplificação primários de uma ou mais combinações consecutivas de genes do HIV de interesse. Por exemplo, um iniciador direto de gag pode ser combinado com um iniciador reverso de nef para amplificar a maior parte do genoma do HIV. Outros exemplos não limitadores são a combinação de um iniciador direto de vpr com um iniciador reverso de nef, um iniciador direto de vpr com um iniciador reverso de rev e iniciador direto de env com um iniciador reverso de nef.

Assim, é revelada no presente documento uma composição que compreende: a. um iniciador direto que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-20, 44-58, 74-88, 130-132, 134-136, 162-188 e 189 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 1-20, 44-58, 74-88, 130-132, 134-136, 162-188 e 189, e b. um iniciador reverso que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 60-73, 89-101, 114-122, 133, 144-146, 190-192, 196-203 e 269-273 e oligonucleótidos com pelo menos 75% de identidade de sequências com as SEQ ID NOs: 60-73, 89-101, 114-122, 133, 144-146, 190-192, 196-203 e 269-273.

Os iniciadores e pares de iniciadores descritos acima são úteis para a amplificação de ácidos nucleicos do HIV para produzir produtos de amplificação de DNA primários que codificam antigénios visados.

Com base nestas diretrizes são proporcionados iniciadores encaixados diretos e reversos adequados para amplificação dos antigénios de gag, vpr, env, rev e nef de múltiplas variantes do HIV. Estes iniciadores podem ser utilizados numa reação de amplificação primária ou, preferencialmente, numa segunda ronda de amplificação de ácidos nucleicos após a amplificação primária. Em formas de realização preferenciais, a amplificação primária é realizada com os iniciadores diretos e reversos de gag, vpr, rev, env e/ou nef do HIV descritos acima, seguido de uma amplificação secundária utilizando os pares de iniciadores encaixados descritos abaixo.

Assim, é revelado no presente documento um iniciador direto que compreende uma porção 5' e uma porção 3', em que a porção 5' compreende um promotor e uma sequência de Kozak otimizada e a porção 3' compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em GTGCGAGAGCGT (SEQ ID NO: 206, para amplificação de gag), GTGCGAGACCGT (SEQ ID NO: 207, para amplificação de gag), AACAAGCCCCAG (SEQ ID NO: 208, para amplificação de vpr), AACAAGCCCCGG (SEQ ID NO: 209, para amplificação de vpr), ACCCACCTCCC (SEQ ID NO: 210, para amplificação de rev), ACCCGCCTCCC (SEQ ID NO: 211, para amplificação de rev) , GAGTGATGG (SEQ ID NO: 212, para amplificação de env) , GAGTGAAGG (SEQ ID NO: 213, para amplificação de env), GAGTGAGGG (SEQ ID NO: 214, para amplificação de env), GTGGCAAGTGGTCAAAAAG (SEQ ID NO: 215 para amplificação de nef), GTGGCAAGTGGTCAAAACG (SEQ ID NO: 216, para amplificação de nef), TGGGAGCAGTGTCTCA (SEQ ID NO: 217, para amplificação de nef) e AGGCACAAGAGGAAGAGG (SEQ ID NO: 218, para amplificação de nef), AGAGTGATGG (SEQ ID NO: 372, para amplificação de env), AGAGTGAAGG (SEQ ID NO: 373, para amplificação de env), AGAGTGACG (SEQ ID NO: 374, para amplificação de env), AGAGTGAGGG (SEQ ID NO: 375, para amplificação de env), AAACAGATGGCAG GTG (SEQ ID NO: 376, para amplificação de vif), AAACAGATGGCAGGTA (SEQ ID NO: 377, para amplificação de vif), AAACAGATGGCAGGCG (SEQ ID NO: 378, para amplificação de vif), AAACAGATGGCAGGGG (SEQ ID NO: 379, para amplificação de vif), TCTATCAAAGCAGTAAG (SEQ ID NO: 380; para amplificação de vpu); TCTATCAAAGCAGTGAG (SEQ ID NO: 381; para amplificação de vpu); TCTATCAGAGCAGTAAG (SEQ ID NO: 382; para amplificação de vpu); TCTACCAAAGCAGTAAG (SEQ ID NO: 383; para amplificação de vpu); GGAAGGCCAGGGAATTTCC (SEQ ID NO: 384, para amplificação de pol) , GGAAGGCCAGGGAATTTTC (SEQ ID NO: 385, para amplificação de pol), GGAAGGCCAGGGAATTTCC (SEQ ID NO: 386, para amplificação de pol), e GGAAGGCCAGGAAATTTTC (SEQ ID NO: 387, para amplificação de pol). Preferencialmente, o promotor é o promotor de T7. Em formas de realização preferenciais dos iniciadores acima, a porção 5' do oligonucleótido compreende um promotor de T7 e uma sequência de Kozak otimizada, em conjunto com a sequência TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG (SEQ ID NO: 219), em que a sequência promotora de T7 está mostrada na fonte regular e a sequência de Kozak otimizada está mostrada na fonte em itálico. Em formas de realização preferenciais de promotor de T7/iniciador, as porções 5' e 3' combinadas em conjunto compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 19, 20, 57, 58, 87, 88, 134, 135, 136, 147, 148, 160, 161, 290-293, 308-311, 329-332 e 356-360.

Também são revelados iniciadores reversos que compreendem uma porção 5' e uma porção 3', em que a porção 5' compreende um oligonucleótido poliT possuindo aproximadamente 30-100 nucleótidos Tea porção 3' compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: 5'GTGACGAGGGGTCGTTG (SEQ ID NO: 220), 5' GTGACGAGGGGTCGCTG (SEQ ID NO: 221), 5'GTAACGAGGGGTCGTTG (SEQ ID NO: 222), 5'GTGTCGAGGGGGCGTTG (SEQ ID NO: 223), 5'GCTCCTGTATCTAATAGAGC (SEQ ID NO: 224), 5'GCTCCTGTATCTAATAAAGC (SEQ ID NO: 225), 5'GCTCCTGTATCTAACAGAGC (SEQ ID NO: 226), 5'GGTTTCCATCTTCCTGG (SEQ ID NO: 227), 5' GGTTTCCATCTTCCTGC (SEQ ID NO: 228), 5'GGCTTCCATCTCCCTGG (SEQ ID NO: 229), 5'GGTTTCCATTTCCCTGG (SEQ ID NO: 230), 5' GGTTTCCATTTTCCTGG (SEQ ID NO: 232), 5'GGATAAACAGCAGTTGTTGC (SEQ ID NO: 2 33), 5'GAATAAACAGCAGTTGTTGT (SEQ ID NO: 2 34), 5'GAATAAACAGCAGCTGTTGC (SEQ ID NO: 2 35), 5'ATTCTGCTATGTCGACACCC (SEQ ID NO: 236), 5'ATTCTGCTATGTCGGCGCCC (SEQ ID NO: 237), 5'ATTCTGCTATGTCGGCACCC (SEQ ID NO: 238), 5'ATTCTGCTATGTTGACACCC (SEQ ID NO: 239), 5'CTCCATTTCTTGCTCTCCTC (SEQ ID NO: 240), 5'CTCCATTTCTTGCTCTTCTC (SEQ ID NO: 241), 5'CCTGACTCCAATACTGTAGG (SEQ ID NO: 242), 5'CCTGACTCCAATACTGCAGG (SEQ ID NO: 243), 5'CCTGACTCCAATATTGTAGG (SEQ ID NO: 244), 5'GCATTGAGCAAGCTAACAGC (SEQ ID NO: 245), 5'GCATTGAGCAAGCTAACTGC (SEQ ID NO: 24 6), 5'GCATTGAGCAAGTTAACAGC (SEQ ID NO: 247), 5'GCATTAAGCAAACTAACAGC (SEQ ID NO: 248), 5'ATAGCAAAGCCCTTTC (SEQ ID NO: 249), 5' CCAGTACAGGCAAAAAGC (SEQ ID NO: 250), 5'CAGTACAGGCGAAAAGC (SEQ ID NO: 251), 5'CCAGTACAGGCAAGAAGC (SEQ ID NO: 252), 5'GTCAGCAGTCTTT (SEQ ID NO: 253), 5'GTCAGCAGTCTCA (SEQ ID NO: 254), 5'GACCACTTGCCACCC (SEQ ID NO: 255), 5'GACCACTTGCCACTC (SEQ ID NO: 256), 5'GACCACTTGCCCCCC (SEQ ID NO: 257), 5'CCCTGTCTTATTCTTCTAGG (SEQ ID NO: 258), 5'CCCTGTCTTATTCTTACAGG (SEQ ID NO: 259), 5'CCCTGTCTTATTCTTGTAGG (SEQ ID NO: 260), 5'GCAGTTGTAGGCTGACTTCC (SEQ ID NO: 261), 5'GCAGTTGTAGGCTGACTCCC (SEQ ID NO: 262), 5'GCAGTTGTAGGCTGGCTTCC (SEQ ID NO: 263), 5' AGCGAACAAACAGTAGTTGTTGCAG (SEQ ID NO: 264), 5'AGCGAACAAACAGTAGTTGTTGCAA (SEQ ID NO: 265) e 5'AGCGATCAAACAGCAGTTGTTGCAG (SEQ ID NO: 266), AGCGAACAAACAGTAGTTGTTGAAG (SEQ ID NO: 267), AGCGATCAAACAGTAGTTGTTGCAG (SEQ ID NO: 268).

Preferencialmente, a porção 5' poliT tem 64 nucleótidos T de comprimento. Em formas de realização preferenciais, a composição de iniciadores encaixados reversos compreende um ou mais oligonucleótidos selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 102-129, 137, 149-153, 157-159, 193-195, 201-203 e 269-273.

Ainda noutra forma de realização, é revelado no presente documento um estojo para a amplificação de múltiplas variantes do HIV, que compreende: a) um iniciador direto que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-20, 44- 58, 74-88, 130-132, 134-136, 138-143, 147-148, 160-162, 164, 168, 169, 176, 177, 180, 183-189 e 204, e b) um iniciador reverso que compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em 21-43, 60-73, 89-129, 133, 137, 144-146, 149-159, 163, 167, 172, 173, 178, 179, 181, 182, 190-203 e 220-273.

Preferencialmente, o estojo contém adicionalmente uma DNA polimerase termoestável, dNTPs e um tampão (IX ou concentrado) adequados para reações de amplificação. Além disso, o estojo também pode conter uma transcriptase reversa e/ou modelos de controlo do HIV não infeciosos para amplificação. O estojo também conterá preferencialmente pelo menos um par de iniciadores encaixados direto e reverso para amplificação secundária do produto de amplificação primário. O iniciador direto encaixado conterá um promotor 5' e, opcionalmente, uma sequência de Kozak que contém um codão de iniciação da tradução, bem como uma sequência 3' que visa um produto de amplificação primário de interesse. O iniciador encaixado reverso conterá uma sequência 5' poliT e uma sequência 3' complementar a um produto de amplificação primário de interesse e, opcionalmente, um codão de terminação da tradução. Os estojos são úteis para a identificação e quantificação de variantes de patogénios e para a preparação de vacinas.

Noutro aspeto, é revelado no presente documento a titulo de referência um método independentes de estirpes de amplificação de sequências do HIV, que compreende: amplificar múltiplas variantes de DNA do HIV com um ou mais iniciadores diretos que compreendem um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1-18, 44-56, 74-86, 130-136, 138-143 e 204 e com um ou mais iniciadores reversos que compreendem um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 21-43, 60-73, 89-101, 133, 144-146, 154-156, 190-102, 196-199 e 200. O DNA do HIV pode compreender DNA do HIV integrado no genoma de uma célula hospedeira. No entanto, em formas de realização preferenciais, o DNA do HIV é um cDNA preparado por transcrição reversa de RNA genómico do HIV ou mRNA do HIV. Métodos de isolamento de DNA do HIV integrado, RNA genómico do HIV e mRNA do HIV de um indivíduo infetado são conhecidos dos profissionais. Métodos semelhantes podem ser utilizados para isolar ácidos nucleicos de outros patogénios de interesse.

Preferencialmente, o ácido nucleico do HIV é isolado ou derivado de uma amostra biológica de um indivíduo infetado com o HIV que será tratado com uma vacina da invenção. "Amostra biológica", como usado no presente documento, refere-se a qualquer amostra biológica que possa conter um patogénio, células infetadas com um patogénio ou ácido nucleico de um patogénio, e inclui mas não se limita a sangue, plasma, soro, células mononucleares do sangue periférico (PBMC), fluido seminal, secreções vaginais, fluido do cristalino, fluido cerebroespinal, saliva, leite, fluido de ascites, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico, tecido, cultura de tecido e semelhantes.

Muito preferencialmente, viriões que contêm RNA genómico do HIV são isolados de sangue ou soro. O RNA genómico obtido dos viriões pode ser sujeito a transcrição reversa para produzir um cDNA do HIV. Métodos de isolamento de viriões do HIV de pacientes infetados, bem como métodos de preparação de cDNA, são conhecidos dos profissionais. A transcrição reversa de RNA do HIV pode ser iniciada utilizando hexâmeros aleatórios ou iniciadores de oligonucleótidos específicos. 0 cDNA do HIV pode depois ser utilizado como modelo no método acima de amplificação independente de estirpes de sequências do HIV. Estes mesmos métodos podem ser utilizados para preparar um cDNA a partir do mRNA ou RNA genómico de outros patogénios. 0 DNA amplificado pelos métodos revelados no presente documento pode ser utilizado numa vacina de ácido nucleico ou pode ser carregado em células apresentadoras de antigénios que depois podem ser utilizadas como vacina. Além disso, o DNA pode ser sequenciado para identificar as variantes do HIV presentes numa amostra ou que infetam um paciente. DNA amplificado de um modelo de patogénio ou sua cópia de cDNA é referido como "produto de amplificação primário". 0 produto de amplificação primário pode ser modificado inserindo-o numa cassete de expressão, vetor de expressão e/ou vetor de distribuição, que depois pode ser utilizado como vacina de ácido nucleico, vacina de vetor virai, etc., ou tais vetores podem ser carregados em células apresentadoras de antigénios que podem ser utilizadas como vacina.

Numa forma de realização preferencial, o produto de amplificação primário é sujeito a uma segunda ronda de amplificação utilizando iniciadores encaixados que contêm sinais de transcrição e tradução adequados para expressão in vitro e/ou expressão in vitro. Preferencialmente, o DNA é sujeito a uma segunda ronda de amplificação utilizando um iniciador direto encaixado que contém: 1) um promotor adequado para transcrição in vitro, tal como o promotor de T7 ou SP6, 2) uma sequência de Kozak otimizada incluindo um codão ATG; em combinação com um iniciador reverso encaixado que contém o complemento de um codão de terminação da tradução e uma cauda poliT. 0 produto de amplificação secundário resultante da ronda encaixada de amplificação pode ser utilizado como modelo para transcrição in vitro e cobertura 5' . 0 mRNA resultante pode depois ser utilizado numa vacina de ácido nucleico, ou para carregar células apresentadoras de antigénios que depois podem ser utilizadas como vacina.

Por exemplo, RNA de patogénio é transcrito de forma reversa em cDNA de filamentação simples utilizando uma transcriptase reversa, tampões reacionais apropriados e hexâmeros aleatórios. 0 cDNA de filamentação simples é depois amplificado por PCR em DNA de filamentação dupla numa reação de PCR primária utilizando iniciadores multiplex. 0 produto de uma reação de PCR primária é conduzido para uma segunda ronda de amplificação por PCR encaixada. Nesta ronda de amplificação, iniciador(es) 5' contém(contêm) uma protuberância com sequências de ligação de RNA polimerase de T7 e o iniciador 3' contém uma protuberância com extensões poli T. As modificações introduzidas por regiões de protuberância numa ronda de PCR encaixada permitem a transcrição do produto de PCR in vitro e tradução bem-sucedida por distribuição nas DCs. 0 processo pode ser interrompido após qualquer um dos passos de amplificação por PCR e produtos de PCR podem ser armazenados congelados para processamento adicional. A purificação de material de cDNA é efetuada utilizando os componentes do estojo de Purificação de PCR QIAquick® (Colunas QIAquick®, tampão PB, tampão PE e tampão EB) . 0 DNA de filamentação dupla é utilizado como modelo numa reação de transcrição padrão. A limpeza do RNA transcrito in vitro é efetuada utilizando componentes do estojo RNeasy® (Coluna RNeasy®, tampão RLT e tampão RPE). 0 RN A elui em água desprovida de nucleases. Se necessário é conduzida precipitação com etanol para concentrar o RNA. 0 RNA é ressuspenso em água desprovida de nucleases e é passado por um filtro de poliétersulfona (PES) de 0,8/0,2 ym, depois é distribuído em tubos de polipropileno com fecho de segurança de 0,5 mL e crioconservado a d -150 °C para armazenamento de longa duração.

Em conformidade, é revelado no presente documento um método independente de estirpes de preparação de RNA do HIV, que compreende: a) produzir um produto de amplificação primário por amplificação de múltiplas variantes do DNA do HIV utilizando um iniciador direto e um iniciador reverso, em que o referido iniciador direto compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1-18, 44-56, 74-86, 130-132, 162-188 e 189, e o referido iniciador reverso compreende um oligonucleótido selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 60-73, 89-101, 133, 144-146, 190-192, e 196-200; b) amplificar o referido produto de amplificação primário utilizando um iniciador promotor direto e um iniciador reverso que compreende uma cauda 5' poliT para produzir uma cassete de expressão amplificada, e c) transcrever a referida cassete de expressão para produzir um RNA do HIV.

Preferencialmente, o DNA do HIV é um cDNA preparado por transcrição reversa de RNA genómico do HIV ou mRNA do HIV. Numa forma de realização preferencial, o iniciador promotor direto compreende um promotor de T7 ou SP6.

Preferencialmente, o iniciador direto também compreende uma sequência de Kozak otimizada 3' ao promotor. RNAs recobertos e poliadenilados podem ser testados numa reação de tradução in vitro e/ou seguido de transfeção em células dendriticas ou outras células apresentadoras de antigénios. A identidade das proteínas traduzidas pode ser testada em análise de transferência Western utilizando anticorpos específicos. A ausência de impacto negativo de antigénios individuais expressos bem como a sua combinação na maturação de APCs podem ser testadas por análise de marcadores extracelulares. Por exemplo, a capacidade de DCs de amadurecer pode ser estabelecida por análise fenotípica utilizando marcadores de citometria de fluxo (por exemplo, HLA DR, CD86, CD83, CD14). Para eliminar a possibilidade de proteínas expressas de novo afetarem a função de DCs, RNAs individuais que codificam antigénios ou sua combinação podem ser cotransfetados em combinação com RNA de Flu seguido de teste das DCs cotransfetadas em ensaios de CTL. Tais métodos são conhecidos dos profissionais. RNAs recobertos e poliadenilados preparados de acordo com os métodos revelados no presente documento podem ser transfetados em células dendriticas ou outras células apresentadoras de antigénios, in vitro ou in situ. Tais células apresentadoras de antigénios transfetadas in vitro podem depois ser utilizadas como vacina. Alternativamente, RNA recoberto e poliadenilado pode ser traduzido in vitro e depois carregado em células apresentadoras de antigénios in vitro, ou utilizado diretamente numa vacina. Assim, noutra forma de realização, é revelado um método de carga de uma célula apresentadora de antigénios, que compreende contactar uma célula apresentadora de antigénios com um RNA produzido pelo método revelado no presente documento.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Seleção de iniciadores para amplificação de múltiplas variantes do HIV A análise dos 49 isolados do HIV completos depositados na Base de Dados Nacional de Los Alamos revelou regiões altamente variáveis nos genomas do HIV bem como regiões fora de sequências codificadoras de antigénios selecionados com menor variabilidade. Aquelas regiões relativamente conservadas, maioritariamente fora das fases de leitura aberta de gag, vpr e rev, serviram de modelo para a conceção de oligonucleótidos a serem utilizados em amplificação por PCR. Uma vez que mutações para além das presentes em sequências identificadas listadas na Base de Dados de Los Alamos podem ocorrer num paciente individual, determinaram-se múltiplas regiões para hibridização de iniciadores. Analisaram-se iniciadores complementares a estes isolados. Preferiram-se regiões de nucleótidos com conservação relativa de sequências entre isolados para a seleção de iniciadores. Aplicaram-se os seguintes parâmetros na conceção de iniciadores: iniciadores deviam ter uma Tf de 55°C-62°C, um comprimento de cerca de 17-20 pb, não era previsto que formassem homodímeros, deviam estar desprovidos de estrutura secundária e homologia com sequências diferentes do HIV numa análise de BLAST. Para minimizar o número de iniciadores utilizado foi tolerado um emparelhamento defeituoso na metade 5' de uma sequência de iniciador, ao passo que não foi permitido um emparelhamento defeituoso na metade 3' . Para assegurar amplificação sem falhas de qualquer antigénio escolhido, também foram escolhidas várias regiões de antigénios fora de fases de leitura aberta de interesse. A Figura 1 esboça uma representação esquemática das regiões selecionadas para a conceção de iniciadores. 0 número no nome do iniciador corresponde à posição dentro da sequência com o número de acesso NC_001802 escolhida como referência. Esta sequência de referência contém uma mutação que trunca VPR que não está presente na maior parte das sequências do HIV.

Iniciadores que hibridizam com as regiões selecionadas a montante e a jusante de gag (fora de NC_001802 225-1838) irão permitir amplificação da totalidade da fase de leitura aberta de gag. Após terem sido identificadas regiões para iniciadores, determinaram-se os iniciadores para cada localização escolhida complementares a cada sequência conhecida do HIV. Um exemplo de um grupo de iniciadores reversos gag 1883 que codificam todas as sequências complementares às 49 analisadas isoladas é mostrado na Tabela 1.

Tabela 1. Grupo de iniciadores reversos para a localização 1833 de NC 001802 selecionados para amplificar gag. Uma vez que este é um grupo de iniciadores reversos, apresentam-se aqui sequências complementares inversas. Bases variáveis complementares a todas as sequências do HIV analisadas são mostradas em itálico, em que a variante não de consenso está em negrito itálico.

Para minimizar o número de iniciadores utilizados aplicámos outros critérios de seleção: emparelhamento defeituoso na metade 3' de uma sequência de iniciador é evitado quando possível, no entanto, emparelhamento defeituoso na metade 5' da sequência de iniciador é tolerado. Tal emparelhamento defeituoso pode ser compensado diminuindo a restrição da amplificação de PCR. Quando foram aplicados aqueles critérios de seleção, a lista de iniciadores para esse grupo foi consideravelmente reduzida, como mostrado na Tabela 2, que mostra iniciadores divergentes na sua metade 3'.

Tabela 2. Sequência de iniciadores reversos selecionados para a região gag 1833. A sequência complementar à sequência de referência NC_001802 está mostrada na linha de cima. Mutações na região encontrada em isolados distintos do HIV estão indicadas em maiúsculas em itálico e negrito. A sequência do complemento reverso à da sequência de referência é mostrada aqui.

A Tabela 3, abaixo, pormenoriza a conceção de iniciadores para um grupo de iniciadores diretos para Rev. 0 alinhamento de sequências de múltiplos isolados do HIV dos ciados do HIV mais comuns, bem como de isolados menos comuns, revelou uma região de conservação relativa com resíduos variáveis nas posições 7847 e 7848. Em consequência, para conceber um iniciador perfeitamente complementar à sequência de consenso B (Rev F7830) mas que também pudesse acomodar esta frequente transição de sequência, conceberam-se iniciadores alternativos adicionais. Estes iniciadores alternativos contêm mutações que compensam as mutações frequentemente encontradas nas posições 7847 e 7848 (Rev F 7830.1 e Rev F 7830.2). Apenas a metade 3' dos iniciadores foi concebida para conter mutações compensadoras, ao passo que foi permitido o emparelhamento defeituoso na metade 5' dos resíduos 7830-7840. Para assegurar a amplificação "sem falhas" de várias estirpes analisou-se mais do que uma região fora de uma fase de leitura aberta de interesse. Por exemplo, o isolado 01A1. CM.CM53122 não seria amplificado utilizando iniciadores concebidos para a região Rev F7830 devido à deleção da região alvo. Em consequência, para compensar isto, também foram utilizadas sequências nas posições 7550 e 7911 para conceber iniciadores diretos de Rev.

Tabela 3 SEG ID ΝΟΊ85 liSV F 1 830 5' TGAFA.GTAGG AGGCFTQGTB GS-3' T? . ; „

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Al.C .IN, 95IN21 301 ..................................A.....BA........... BF,AR , ARMAOOi --------------------—

Para permitir a transcrição de um fragmento de PCR in vitro, o fragmento foi modificado para inserir um sitio de ligação de RN A polimerase de T7 na extremidade 5'. Além disso, a iniciação bem-sucedida da tradução requereu a adição, na sua extremidade 3', do codão ATG iniciador da tradução otimizado para conter uma sequência de Kozak e uma cauda poli (T)64. A modificação de sequências PCR primárias foi obtida sujeitando fragmentos de PCR obtidos na reação de PCR primária a uma ronda encaixada adicional de PCR na qual se utilizaram iniciadores diretos e reversos modificados. 0 iniciador direto continha uma protuberância que codifica a sequência de um promotor de RNA de T7, bem como as bases ACC numa posição -3, -2 e -1 do codão ATG iniciador para o antigénio. Além disso, para genes do HIV tais como Rev, em que o codão ATG não havia sido amplificado durante a primeira ronda de amplificação por PCR, o codão ATG também foi adicionado durante a reação de PCR encaixada. A metade 3' do iniciador direto encaixado era complementar à sequência imediatamente a jusante do codão ATG iniciador ou da sequência codificadora mais a 5' amplificada durante a amplificação de PCR primária. 0 iniciador reverso também continha uma protuberância poli(T)64 na sua extremidade 5', que serviu de modelo para uma sequência de poliadenilação (poliA) na extremidade 3' da molécula de RNA durante a transcrição. A metade 3' do iniciador reverso era complementar à sequência isolada numa reação de PCR primária.

Exemplo 2

Determinação de condições de amplificação para iniciadores de gag

Obteve-se redução adicional do número de reações de PCR efetuando multiplex de iniciadores de PCR para cada antigénio. Os iniciadores de PCR foram agrupados com base na sua Tf. Depois testaram-se permutações contendo cada grupo de iniciadores diretos com cada grupo de iniciadores reversos em reações de PCR a diferentes temperaturas. Para reduzir o risco de trabalhar com material infecioso durante a seleção inicial de iniciadores utilizaram-se clones do HIV quase completos não infeciosos e divergentes obtidos do NIH AIDS Research and Reference Reagent Program para testar as conceções dos iniciadores e otimizar condições reacionais.

Utilizaram-se 10 ng de modelo plasmidico pBKBHlOS de clone do HIV não infecioso (NIH AIDS Research & Reference Reagent program Cat #194) numa reação de PCR de 25 yL que continha IX tampão Pfu, concentração final de 0,2 mM de cada dNTP, concentração final de 0,4 μΜ de cada iniciador e 1 unidade de polimerase PFU Hot start (Stratagene) . A reação foi aquecida a 95°C durante 45 segundos e depois foi conduzida através de 25 rondas de amplificações a 95°C durante 45 s, temperatura de hibridização como indicado na Figura 3 durante 45 s e 72°C durante 3 min. A extensão final ocorreu a 72°C durante 10 min. Os grupos de iniciadores foram os seguintes: direto grupo 1 (FG1): iniciadores com as SEQ ID NOs: 1 e 4; direto grupo 2 (FG2) : iniciadores com as SEQ ID NOs: 16 e 17; reverso grupo 1 (RG1): iniciadores com as SEQ ID NOs: 33 e 41, reverso grupo 2 (RG2): iniciadores com as SEQ ID NOs: 32, 36, 37 e 40; reverso grupo 3 (RG3) : iniciadores têm a SEQ ID NO: 34; reverso grupo 4 (RG4): iniciadores com as SEQ ID NOs: 21, 26, 38; reverso grupo 5 (RG5): iniciadores com as SEQ ID NOs: 22 e 27. Os resultados estão apresentados na Figura 3. As vias 1-10 para cada temperatura de hibridização continham reações de PCR realizadas com grupos de iniciadores como indicado na legenda da figura. Não obstante a amplificação utilizando todos estes grupos de iniciadores ter sido bem-sucedida a temperaturas permissivas, 54°C e 60 °C, algumas combinações de iniciadores não conseguiram produzir produtos de amplificação a temperaturas mais elevadas, 65°C e 70°C.

Exemplo 3

Amplificação por PCR multiplex de múltiplas variantes do HIV por reação Há evidências de que o HIV está presente num único indivíduo nalgumas formas ou quasiespécies que surgem devido a um mecanismo de escape mutacional de qualquer pressão presente neste indivíduo (CTL ou molécula pequena). Também existem evidências de que pacientes podem estar sobreinfetados e hospedar várias estirpes do HIV ao mesmo tempo. O poder da tecnologia corrente reside na sua capacidade de amplificar todas as variantes do HIV presentes no paciente utilizando condições suficientemente restritas para amplificar um produto específico mas ainda assim suficientemente promíscuas para permitir o emparelhamento defeituoso de nucleótidos de um único par de bases entre iniciador e sequência alvo.

Para testar experimentalmente a nossa capacidade de amplificar múltiplas variantes do HIV na mesma reação, diferentes modelos do HIV foram misturados numa única reação de PCR. Clones moleculares que codificam sequências que codificam vários isolados do HIV utilizados nesta experiência estão listados abaixo.

Assim, depois de determinadas as condições reacionais para amplificação por PCR tal como no Exemplo 2, a complexidade de uma reação de PCR foi aumentada fornecendo modelos que codificam genomas do HIV de quatro isolados distintos numa reação de PCR. Especificamente, misturaram-se 2,5 ng de cada modelo plasmídico pBKBHlOS, p90CF204.1, p93BR029.4 e p93TH253.3, cada um correspondente a diferentes modelos do HIV (obtidos do HIV AIDS research and reference reagent program Cat #194, 3284, 4009 e 3283, respetivamente), numa reação de PCR de 25 yL. Condições reacionais e misturas de iniciadores foram iguais às descritas no Exemplo 2 e Figura 3. Nesta experiência, as temperaturas de hibridização foram 60°C, 62°C e 65°C, como indicado. Os resultados estão apresentados na Figura 4A. As reações de PCR que falharam (vias A e B) a 62°C e 65°C têm o iniciador reverso 34 como denominador comum, que é o único iniciador no grupo de iniciadores reversos 3. Emparelhamentos defeituosos iniciador-modelo podem ser compensados diminuindo a Tf para 60 °C. 4B mostra as sequências 5' para 3' do complemento inverso dos iniciadores reversos 32, 33 e 34 utilizados nos grupos de iniciadores reversos 2, 1 e 3, respetivamente, bem como a Tf calculada para cada iniciador. A Figura 4C mostra um alinhamento das quatro sequências de modelo plasmídico na região alvo correspondente a estes iniciadores. A análise de sequências revela que a posição 6 desde a extremidade 5' da sequência de iniciador alvo contém adenina (a) em todos os clones moleculares utilizados na reação. No entanto, o iniciador 34 contém guanina (g) nesta posição e a ausência de complementaridade entre o iniciador 34 e a sequência alvo não permitiu amplificação bem-sucedida a temperaturas restritas. A análise de BLAST do iniciador 34 revela complementaridade com o HIV isolado do Japão, número de acesso AB078005, incluído na nossa análise inicial de 49 isolados completos do HIV. É importante notar que, apesar de o emparelhamento defeituoso entre iniciador e alvo não ter sido amplificado a condições restritas, a diminuição da restrição da temperatura de hibridização da amplificação por PCR para 60 °C originou um evento de amplificação bem-sucedido. A demonstração de que o emparelhamento defeituoso em iniciador: sequências alvo pode ser compensado por uma condição de PCR promíscua é a primeira indicação de que a estratégia escolhida para amplificação do HIV será bem-sucedida. O iniciador 33 também contém um emparelhamento defeituoso na posição 4 relativamente à sequência alvo; no entanto, este iniciador é um membro do grupo RG2 que contém mais 3 membros diferentes, um ou mais dos quais hibridizaram com êxito com a sequência alvo, originando um produto de PCR.

Em resumo, a combinação de iniciadores de PCR multiplex que correspondem a diferentes regiões fora de sequências codificadoras e contêm múltiplas variações de sequência na sua sequência, se visarem a mesma região juntamente com restrição alterada da reação de PCR por variação da Tf, irá assegurar amplificação sem falhas de sequências codificadoras na PCR primária.

Exemplo 4

Amplificação da região de GAG de modelo de RNA do HIV não infecioso utilizando PCR multiplex 0 DNA plasmídico pBKBHlOS que contém um genoma do HIV quase completo não infecioso (NIH AIDS Research & Reference Reagent program Cat #194) foi digerido com Xbal e transcrito in vitro utilizando RNA polimerase de T7. Em resumo, 1 pg de modelo de DNA plasmídico foi transcrito durante 3 até 4 horas num volume reacional final de 20 pL, seguido de uma digestão durante 30 minutos com DNase Turbo para remover o modelo de DNA. O RNA foi purificado numa coluna RNeasy™ (QIAGEN), eluiu em água desprovida de RNAse, foi transferido em alíquotas e armazenado num congelador de azoto líquido.

Utilizaram-se 100 000 cópias do RNA transcrito in vitro de 9,2 kb resultante como modelo para a reação de síntese do primeiro filamento de cDNA que continha IX tampão Sensiscript™ (QIAGEN®), concentração final de 0,5 mM de cada dNTP, concentração final de 10 μΜ de hexâmeros aleatórios, 10 unidades de inibidor de RNAse (Ambion®) e Sensiscript™ RT (QIAGEN®) . A reação de 20 pL foi incubada a 37 °C durante 1 hora. Adicionaram-se 10 000 cópias de cDNA a cada reação de PCR primária que continha IX tampão de reação PFU ultra (Stratagene™), 0,2 mM de cada dNTP (Stratagene™), 2,5

Unidades de polimerase Hot Start PfuUltra™ (Stratagene™), 0,4 pM de cada iniciador direto e reverso nos grupos de iniciadores FG1, FG2, RG1, RG2, RG3 e RG4 como descrito no Exemplo 2 e nos grupos de iniciadores diretos e reversos indicados na Figura 5. O volume final da reação foi 25 pL. A reação foi desnaturada a 95°C durante 2 min e depois foi processada ao longo de 40 ciclos do modo seguinte: 95°C durante 30 s, 54°C durante 30 s, 72°C durante 3 min. Realizou-se uma amplificação por PCR secundária utilizando 0 modelo da amplificação primária com o grupo de iniciadores de T7 diretos de Gag encaixados (GAG F T7; iniciadores 19 e 20) e grupo de iniciadores de 64T reversos de Gag (GAG R 64T; iniciadores 106, 107 e 108) . Após o ciclo final, a reação foi deixada completar a 72°C durante 10 min e depois foi arrefecida para 4°C. Carregaram-se 4 pL de cada amostra em gel agarose 1% não desnaturante. Os resultados mostrados na Figura 5 indicam que PCR multiplex utilizando as combinações de grupos de iniciadores FG1: RG1, FG1 : RG2, FG1: RG3, FG2: RG1, FG2: RG2 e FG2: RG3 permitiu a amplificação da sequência codificadora de gag a partir da sequência do HIV contida em pBKBHlOS.

Exemplo 5 Múltiplas guasiespécies do HIV podem ser amplificadas utilizando os iniciadores da invenção.

Misturaram-se 2,5 ng de cada um de pBKBHlOS, p90CF402.1, p93BR029.4 e p93TH253.3, que representam quatro quasiespécies do HIV, na reação de PCR primária que continha IX tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, grupo de iniciadores FG2 e RG2 à concentração final de 0,4 μΜ cada e 1 unidade de polimerase Pfu Hot start (Stratagene). A reação de PCR foi iniciada como descrito no Exemplo 2. Depois de completada, 1 pL da reação de PCR primária foi transferido para uma reação secundária de 25 pL que continha lx tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, concentração final de 0,4 μΜ de iniciador 19, concentração final de 0,4 μΜ de iniciador 36 e 1 unidade de polimerase Pfu hot start (Stratagene™) . 2 pL de um produto de PCR secundário foram subclonados utilizando o estojo de clonagem de PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen™). Utilizaram-se colónias individuais para inocular culturas bacterianas. Isolou-se DNA plasmídico daquelas culturas utilizando uma minicoluna QIAquick (QIAGEN®) e foi analisado via digesto de restrição utilizando o sítio EcoRI presente em regiões do vetor de clonagem que flanqueiam a inserção. Clones que continham uma inserção de aproximadamente 1,65 kb foram selecionados para sequenciação adicional. Sequências parciais obtidas desta análise foram alinhadas utilizando "software" Lasergene (DNAStar) . Os resultados de tal alinhamento estão mostrados na Figura 6. A análise de sequências indica que a mistura final é composta por quatro clones distintos (A, B, C e D), o que indica que a invenção permite o isolamento de múltiplas variantes ou quasiespécies do HIV que possam estar presentes num paciente.

Exemplo 6

Amplificação de regiões codificadoras de VPR, REV e NEF de RNA do HIV não infecioso 0 primeiro filamento de cDNA de RNA do HIV quase total não infecioso foi sintetizado por RT-PCR de RNA transcrito in vitro de pBKBHlOS como descrito no Exemplo 4. 0 material de cDNA sintetizado a partir de 10 000 cópias de RNA do HIV foi transferido para cada reação de PCR primária que continha iniciadores multiplex para nef, vpr ou rev. Foi realizada uma reação de PCR secundária utilizando os grupos de iniciadores T7 e 64T encaixados mostrados abaixo utilizando o produto da reação de PCR primária como modelo. (Os iniciadores VPR 64 T 231 até 235 correspondem às SEQ ID NOs: 269-273.) As condições reacionais foram iguais às descritas acima com a exceção de a concentração final de iniciadores ter sido 0,4 μΜ para nef, 0,2 μΜ para rev e 0, 6 μΜ para vpr. Os grupos de iniciadores consistiram nos seguintes iniciadores:

As combinações de iniciadores diretos e reversos estão mostradas na Figura 7a. Cada combinação originou amplificação. A Figura 7b demonstra amplificação da região codificadora de vpr de RNA pBKBHlOS transcrito in vitro utilizando o iniciador direto de vpr 44 combinado, em reações de amplificação separadas a várias restrições (temperaturas de hibridização), com os iniciadores reversos de vpr 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69 e 70. Como esperado, o rendimento de produtos diminuiu com temperatura de hibridização aumentada e alguns iniciadores não conseguiram amplificar a temperaturas mais elevadas. Assim, a diminuição das condições de restrição de PCR compensa o emparelhamento defeituoso do iniciador com o modelo. A Figura 7c demonstra a amplificação de nef a partir de RNA de pBKBHlOS transcrito in vitro. O RNA transcrito in vitro foi utilizado como modelo para a síntese do primeiro filamento de cDNA numa reação que continha iniciador de oligo dT(20), 10 unidades de Superscript™ III (Invitrogen™), 2 unidades de RNAseout™ (Invitrogen™), 0,5 mM de cada dNTP (Clontech™), DTT 5 mM e tampão do primeiro filamento Superscript™. A reação foi incubada a 55°C durante 1 hora.

Um volume total de 2,5 pL da reação do primeiro filamento de cDNA foi depois transferido para uma reação de PCR primária que continha 5 unidades de tampão PFUultra™ HS, PFU (Stratagene™), 0,8 mM de cada dNTP (Clontech™) e 0,4 mM de grupos de iniciadores de Nef NEF F 8235 e NEF R 9069 (via 1) ou grupos de iniciadores de Nef NEF F 8343 e NEF R 9069 (via 2), num volume reacional final de 50 pL. A reação de PCR foi desnaturada a 95°C durante 2 minutos e depois foi processada durante 40 ciclos do modo seguinte: 95°C durante 30 segundos, 54 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 3 minutos. Após o último ciclo, foi realizada uma extensão a 72°C durante 10 minutos e a reação foi terminada por arrefecimento para 4°C. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (Figura 7c) . A composição dos grupos de iniciadores de nef para a reação de PCR foi a seguinte:

Exemplo 7 A região codificadora de GAG pode ser amplificada a partir de RNA do HIV isolado de plasma de um paciente infetado

Plasma de um paciente infetado com o HIV foi utilizado para isolar RN A do HIV. Após centrifugação a baixa velocidade para clarificar o material de plasma, foi diluído em tampão de lise e purificado numa coluna de purificação Nucleospin® de acordo com as instruções do fabricante (Macherey-Nagel). O RN A eluiu em água desprovida de nucleases e foi armazenado a -86°C até ser utilizado novamente. O RNA foi transferido para uma reação de síntese do primeiro filamento de cDNA de 20 pL que continha tampão de síntese do primeiro filamento IX Superscript™ (Invitrogen™) , DTT 5 mM, 40 unidades de inibidor de RNAse, 0,5 mM de cada dNTP, final 1 μΜ do grupo R1913 de iniciadores de GAG e 400 unidades de Superscript III™ (Invitrogen). A reação foi incubada a 55°C durante 1 hora e depois a 70°C durante 15 minutos para inativar a enzima. Transferiram-se 2,5 uL da reação RT para cada reação de PCR utilizando as mesmas condições descritas acima com a exceção de os iniciadores terem sido utilizados a 0,4 μΜ de concentração final e o tempo de alongamento durante os ciclos de PCR ter sido 2 min. A composição dos grupos de iniciadores para cada reação de PCR foi a seguinte:

Transferiu-se 1 yL do produto de amplificação de PCR primário para uma reação de PCR secundário que continha IX tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 2,5 unidades de Polimerase Pfu Hot Start (Stratagene™) e 0,2 μΜ de cada iniciador de promotor de T7 direto encaixado GAG F 334 (SEQ ID NO: 19) e iniciador de 64T reverso GAG R 1881 (SEQ ID NO: 106) . Os resultados estão apresentados na Figura 8. Cada uma das combinações de iniciadores F124: R1881, F304: R1881, F334: R1881, F304: R1913 e F334: R1913 amplificou a região codificadora de gag utilizando um RNA do HIV modelo isolado do plasma de um paciente cronicamente infetado com o HIV.

Exemplo 8

Regiões codificadoras de VPR e REV podem ser amplificadas a partir de RNA do HIV isolado do plasma de um paciente infetado com o HIV O RNA do HIV foi isolado de plasma como descrito no exemplo acima. O RNA foi transferido para uma reação de síntese do primeiro filamento de cDNA de 20 yL que continha IX tampão de síntese do primeiro filamento (Invitrogen™), DTT 5 mM, 40 unidades de inibidor de RNAse, 0,5 mM de cada dNTP, 1 μΜ de iniciador de VPR R5507 ou grupos de Rev R8300 (como indicado abaixo) e 400 unidades de Superscript™ III. A reação foi incubada a 55°C durante 1 hora e depois a 70°C durante 15 minutos para inativar a enzima. Transferiram-se 2,5 uL da reação RT para cada reação de PCR utilizando as mesmas condições descritas acima com a exceção de os iniciadores terem sido utilizados a 0,6 μΜ de concentração final para VPR e 0,2 μΜ para REV e o tempo de alongamento durante os ciclos de PCR ter sido 2 min. A composição dos grupos de iniciadores para cada reação de PCR foi a seguinte:

Transferiu-se 1 yL do PCR primário para um PCR secundário que continha IX tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 2,5 unidades de Polimerase Pfu Hot Start (Stratagene™) e iniciadores que continham sítios de ligação de RNA polimerase de 64T e T7 do modo seguinte: 0,4 yM de iniciadores de VPR VPR F 5090 e VPR R 5419 e 0,6 yM de iniciadores de Rev REV F 7912 e REV R 8300. Os resultados mostrados na Figura 9 demonstram que cada um dos seguintes grupos de iniciadores diretos e reversos VPR F 4995: VPR R 5507, VPR F 5058: VPR R 5507, VPR F 4995: VPR R 5419 e VPR F 5058: VPR R 5419 consegue amplificar vpr a partir de RNA do HIV obtido de um paciente cronicamente infetado. De modo semelhante, cada um dos seguintes grupos de iniciadores diretos e reversos REV F 7750: REV R 8300, REV F 7830: REV R 8300 e REV F 7911: REV R 8300 consegue amplificar rev a partir de RNA do HIV obtido de um paciente cronicamente infetado.

Exemplo 9

Amplificação da região codificadora de NEF de RNA do HIV do plasma de um paciente cronicamente infetado com o HIV RNA do HIV é isolado de material de plasma como descrito acima. 0 RNA é transferido para a reação de síntese do primeiro filamento de cDNA de 20 pL que contém IX tampão de síntese do primeiro filamento (Invitrogen™), DTT 5 mM, 40 unidades de inibidor de RNAse, 0,5 mM de cada dNTP, 1 μΜ de iniciador NEF R 9069 e 400 unidades de Superscript™ III. A reação é incubada a 55°C durante 1 hora e depois a 70°C durante 15 minutos para inativar a enzima. Transferem-se 2,5 uL da reação RT para cada reação de PCR utilizando as mesmas condições descritas acima com a exceção de os iniciadores serem utilizados a 0,4 μΜ de concentração final e o tempo de alongamento durante os ciclos de PCR ter sido 2 min. A composição dos grupos de iniciadores de nef para cada reação de PCR foi a seguinte:

Transfere-se 1 pL de PCR primário para PCR secundário que continha IX tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 2,5 unidades de Polimerase Pfu Hot Start (Stratagene™) e 0,2 pM de cada iniciador contendo sítios de ligação de RNA polimerase de 64T e T7: iniciadores NEF F 8343 e NEF R 9069.

Exemplo 10

Múltiplas Quasiespécies do HIV podem ser detetadas por análise de sequências codificadoras de gag, rev e vpr amplificadas de um paciente cronicamente infetado com o HIV

Regiões codificadoras de Gag foram amplificadas de material de um paciente como descrito acima. Os fragmentos PCR obtidos num PCR encaixado secundário utilizando múltiplas combinações de iniciadores (vias GAG F 124: GAG R 1881, GAG F 304: GAG R 1881, GAG F 334: GAG R 1881, GAG F 304: GAG R 1913 Figura 8) foram subclonados e sequenciados como descrito acima. O alinhamento de sequências parciais está mostrado na Figura 10C. A análise indica que pelo menos 7 clones de GAG distintos foram recuperados do plasma deste paciente.

Alinhamento de sequências codificadoras para Rev e VPR, respetivamente. Produtos de PCR de reações de PCR encaixado secundário para Rev e VPR foram subclonados e analisados como descrito para GAG. A análise de sequências de clones de rev (Figura 10B) e clones de vpr (Figura 10C) demonstra a amplificação de múltiplas quasiespécies do HIV.

Exemplo 11

Quasiespécies isoladas de VPR contêm alterações de aminoácidos em regiões de sequências de proteínas de epítopos de HLA O mapa previsto de epítopos de HLA para a sequência codificadora de VPR (Base de Dados de Sequências do HIV do Los Alamos National Laboratory) foi comparado com a sequência de proteína deduzida de clones de VPR isolados obtidos por amplificação de RNA do HIV do mesmo paciente cronicamente infetado com o HIV. Duas das substituições de aminoácidos identificadas afetam a composição proteica em epítopos de CTL (Figura 11).

Exemplo 12 RNA codificou expressão de GAG em Células Dendríticas Isolamento de Células Dendrlticas Humanas

Uma amostra de leucaférese de um voluntário saudável foi recolhida num COBE Spectra (Gambro BCT) utilizando o procedimento AutoPBSC descrito pela Lifeblood (Memphis, TN) . Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas para a amostra de leucaférese utilizando um gradiente de densidade Ficoll™ (Histopaque®-1007 Hybri-Max®, Sigma) e foram cultivadas durante 1 até 2 horas num balão de plástico para proporcionar monócitos de aderência (CD14 + ) . As células não aderentes foram desperdiçadas e os monócitos restantes foram cultivados em meio X-VIVO-15™ (Cambrex) durante seis dias na presença de fator estimulador de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) e interleuquina-4 (IL-4). As células derivadas de monócitos perderam progressivamente expressão de CD 14 e adquiriram expressão de CD80 consistente com o fenótipo de células dendríticas num estado imaturo.

No dia 7, as DCs imaturas foram transfetadas por eletroporação com 5 yg de RNA/106 células de RNA de gag modificado com análogo de Cobertura m7G convencional e cauda (A) 64 ou ARCA e cauda (A) 64. Especificamente, células dendríticas imaturas são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para mudar as condições do tampão e são novamente suspensas em tampão. Células dendríticas são transfetadas com RNA de patogénio amplificado por eletroporação. A eletroporação é realizada em cuvetes de hiato de 4 mm contendo 500 pL da suspensão de células que contém 4 x 107 células/mL a um pulso de 300 V, 100 Ω e 150 pF. As células são depois cultivadas em meio que contém as citoquinas de maturação, IL-Ιβ, IL-6, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e dinoprostona (prostaglandina E2) , bem como GM-CSF e Interleuquina-4 (IL-4) durante 4 horas ou 26 horas. Após a incubação para permitir a expressão de proteínas, as células foram recolhidas, fixadas, permeabilizadas e coradas com anticorpos monoclonais de murganho anti-GAG (NIH #4121) à diluição de 1: 20. A ligação do anticorpo foi detetada com um anticorpo secundário IgG-PE de burro anti-murganho (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ). As células foram analisadas num citómetro de fluxo Becton Dickinson FACSCalibur™ utilizando o programa de análise Cellquest™. Os resultados mostrados na Figura 12 indicam que mRNA de gag preparado de acordo com os métodos da invenção pode ser e é expresso em DCs transfetadas às 4 e 26 horas pós-transfeção.

Exemplo 13

Progressão temporal da expressão de proteína GAG em Células HeLa 5xl05 células HeLa foram transfetadas utilizando reagente Transmessenger™ (QIAGEN®) com 2 pg de RNA modificado com ARCA e cauda (A) 64 para GAG amplificado do plasmídeo pBKBHlOS. Células de controlo negativo foram tratadas do

mesmo modo mas não se adicionou RNA durante a transfeção. Após a transfeção, as células foram colocadas de novo em meio durante períodos de tempo indicados e foram recolhidas para análise de transferência western. As células foram submetidas a lise num tampão de extração de proteínas isotónico (triton X-100 0,01%, NaCl 150 mM, Tris 100 mM pH 7,6, EDTA 5 mM). 25 yg de lisato de proteína de cada condição foram resolvidos utilizando gel de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF seguido de incubação com anticorpos monoclonais de murganho anti-GAG (NIH AIDS Research & Reference Reagent program Cat #4121) a uma diluição 1: 40. A ligação dos anticorpos foi visualizada por incubação com anticorpos secundários de cabra anti-murganho (Santa Cruz Cat #sc-2055) e reagente ECL™ plus (Amersham) seguindo as recomendações do fabricante. 200 ng de p24 de GAG recombinante purificado (Immunodiagnostic) foram utilizados como controlo positivo. Os resultados mostrados na Figura 13 indicam que a expressão máxima de proteína em células HeLa é observada entre as 6 e 15 hrs pós-transfeção.

Exemplo 14

Expressão de REV em Células Dendríticas Células dendríticas foram recolhidas no dia 6 e transfetadas com 5 yg de RNA/ 106 células de RNA de REV com MART ou ARCA cauda (A) 64 e colocadas de novo em cultura com citoquinas frescas e "cocktail" de maturação. Às 4 horas, as células transfetadas foram fixadas, permeabilizadas e coradas com um anticorpo policlonal de ovelha anti-REV a (Novus Biologicals, cat.# ab9513) a uma diluição 1/1000. A ligação de anticorpo foi detetada com um anticorpo secundário IgG-PE de burro anti-ovelha (United States Biologicals,

Swampscott, ΜΑ). As células foram analisadas num citómetro de fluxo Becton Dickinson FACSCalibur™ utilizando o programa de análise Cellquest™. A Figura 14 mostra a expressão de mRNA de rev em DC às 4 horas pós-transfeção.

Exemplo 15

Progressão temporal da expressão de proteína de REV em Células HeLa Células HeLa foram transfetadas com RNA modificado com ARCA e cauda (A)64 como descrito acima para análise de transferência western. 40 yg de lisatos de proteína foram resolvidos em eletroforese em gel de SDS e transferidos para uma membrana de PVDF. A proteína foi detetada por incubação com anticorpos policlonais de ovelha anti-REV (Novus Biologicals Cat # ab9513) a uma diluição 1: 1500. A ligação de anticorpos foi visualizada por incubação com anticorpos secundários anti-ovelha (Santa Cruz Cat #sc-2701) seguido de desenvolvimento com o estojo ECL plus (Amersham). Os resultados obtidos mostrados na Figura 15 e de outra experiência independente indicam que o nível máximo de expressão de proteína de REV se situa entre as 6 e 20 horas pós-transfeção.

Exemplo 16

Expressão de Nef em Células Dendríticas Células dendríticas foram recolhidas no dia 6 e submetidas a eletroporação com 4 yg de RNA/ 106 células de RNA de NEF com GFP ou ARCA cauda (A) 64 e colocadas de novo em cultura com citoquinas frescas e "cocktail" de maturação. Às 4 ou 24 horas, células transfetadas foram fixadas, permeabilizadas e coradas com um anticorpo policlonal de Coelho anti-Nef em (cortesia de Dr. R. Sekaly) a uma diluição 1/1000 (4 hrs.) ou 1/4000 (24 hrs.). A ligação de anticorpo foi detetada com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). As células foram analisadas num citómetro de fluxo Becton Dickinson FACSCalibur™ utilizando o programa de análise Cellquest™. Os resultados mostrados na Figura 16 indicam que nef é expresso às 4 e 24 horas pós-transfeção.

Exemplo 17

Amplificação Bem-sucedida de Múltiplas Quasiespécies de Antigénio de RNA do HIV de Pacientes com Infeção pelo HIV e Expressão em Células Dendríticas

Para validar o nosso novo procedimento de RT-PCR multiplex amplificámos os quatro antigénios de plasma de pacientes com infeção pelo HIV. RNA extraído do plasma congelado arquivado de três pacientes com títulos de HIV de 250 000, 146 148, e 3 221 835 cópias/mL, respetivamente, foi utilizado em RT-PCR para cada antigénio. Os seguintes grupos de iniciadores de promotores de T7 e 64 dT foram utilizados para PCR encaixado.

A Figura 17A demonstra a amplificação bem-sucedida dos quatro antigénios nos três pacientes com infeção pelo HIV.

Produtos da ronda encaixada de PCR foram transcritos in vitro para gerar RNA e os quatro antigénios foram transcritos com êxito (Figura 17b). Tal indicou que todos os fragmentos de PCR foram modificados com êxito com o promotor de T7 durante a ronda encaixada de PCR. A confirmação independente de modificação bem-sucedida com o sitio de ligação de RNA polimerase de T7, em conjunto com a extensão poliT 64, bem como a confirmação da identidade de sequências foram proporcionadas por análise de dados de sequências obtidos de fragmentos de PCR secundário subclonados. A nossa estratégia de utilização de grupos de iniciadores diretos e reversos foi concebida para amplificar múltiplas quasiespécies do HIV únicas a cada paciente com infeção pelo HIV. Devido à variação de quasiespécies de antigénios do HIV entre pacientes individuais, é de esperar que diferentes grupos de iniciadores hibridizem com diferentes sequências de quasiespécies, de modo que ocorrerá amplificação num padrão que é único para cada paciente. Tal está demonstrado na Figura 17a para amplificação de Gag em três pacientes com infeção pelo HIV: o grupo de iniciadores na via 3 não produziu nenhum produto de PCR para o Paciente 1 mas originou um produto limpo para o Paciente 2, ao passo que o grupo de iniciadores na via 6 não conseguiu amplificar material do Paciente 2 mas amplificou com êxito o RNA do Paciente 1 e Paciente 3.

Para confirmar que grupos de iniciadores distintos capturam quasiespécies distintas do HIV, sequenciámos e analisámos clones de Gag de PCR completos obtidos do Paciente 3, que estava altamente virémico (titulo de HIV de 3 221 835 cópias/mL). Nesta experiência obtiveram-se bandas distintas do tamanho esperado para Gag nas vias 1, 2, 4, 5 e 6 (Figura 17a). Os fragmentos de PCR secundário foram clonados, rastreados quanto à presença de um inserto e sequenciados. Produtos de PCR amplificados por uma combinação distinta de grupos de iniciadores foram clonados separadamente, com um total de 10 clones positivos por grupo de iniciadores. Foi efetuada análise de sequências de nucleótidos utilizando "software" Lasergene (DNAStar), a Base de Dados de Sequências do HIV de Los Alamos e análise BLAST. Estimaram-se relações filogenéticas de sequências de nucleótidos amplificadas de novo por comparação com sequências correspondentes às previamente relatadas. Obtiveram-se sequências de consenso de ciados do HIV comuns da Base de Dados de Sequências do HIV de Los Alamos e foram utilizadas como referência. As sequências de nucleótidos foram alinhadas utilizando "software" Clustal V. Construiram-se árvores filogenéticas utilizando o módulo MegAlign do "software" Lasergene. A análise das relações filogenéticas de distintos clones de Gag do paciente 3 revelou uma diversidade ampla de quasiespécies capturadas (Fig. 18A). Mais importante ainda, e como previsto, algumas quasiespécies foram capturadas por amplificação utilizando certos grupos de iniciadores e algumas não o foram.

Uma vantagem potencialmente central dos nossos antigénios de tecnologia de vacina é a amplificação e apresentação de antigénios de antigénios de quasiespécies que representam mutações de escape do HIV que se desenvolvem sob CTLs do hospedeiro para induzir resistência à resposta imunológica inicial. No Paciente 1 identificámos mutações de sequências nas quasiespécies de Gag que podem originar substituições de aminoácidos na proteína pl7 de Gag, depois comparámos estas sequências de aminoácidos mutadas com epítopos de HLA previstos utilizando a base de dados de Imunologia Molecular de Los Alamos. Estes dados, resumidos na Figura 18b, indicaram que algumas mutações capturadas originaram transições de aminoácidos localizadas na posição relevante de um epítopo de HLA associado a apresentação de antigénios. Tal pode refletir a evolução de quasiespécies do HIV que são resistentes à pressão de CTLs. Em contraste, epítopos imunogénicos novos e relevantes que surgem devido a mutações do HIV também serão capturados utilizando o nosso protocolo de amplificação desenvolvido de novo. As relações filogenéticas de clones completos de gag, rev e vpr amplificados para o plasma do Paciente 1 infetado pelo HIV estão mostradas nas Figuras 18C, 18D e 18E.

Confirmámos a tradução de RNA e expressão de proteínas de antigénios Gag, Vpr, Rev e Nef do HIV em células eucarióticas transfetadas utilizando RNA isolado e amplificado de pelo menos três pacientes com infeção pelo HIV. RNA recoberto e poliadenilado amplificado de pacientes com infeção pelo HIV quanto a Gag foi traduzido in vitro na presença de 35S metionina. As proteínas foram resolvidas por eletroforese utilizando um gel desnaturante, foram transferidas para PVDF e expostas. RNA amplificado quanto a Vpr foi transfetado em células HeLa e RNA amplificado quanto a Rev e Nef foi transfetado em células dendríticas. Doze até quinze horas após a transfeção, as células foram recolhidas e submetidas a lise. Lisatos de células completas foram resolvidos em géis de SDS-PAGE, transferidos para PVDF e sondados utilizando anticorpos específicos para cada antigénio. A proteína Rev foi detetada utilizando anticorpo policlonal de ovelha anti-Rev (Novus Biologicals), a proteína Vpr foi detetada utilizando antissoro anti anti-HIV-ÍNL4-3 Vpr (1-46) (NIH AIDS Research & Reference Reagent program) e a proteína Nef foi detetada utilizando anticorpo policlonal anti-Nef de Coelho (cortesia de Dr. R. Sekaly) . Estes resultados estão resumidos na Figura 19, que mostra que proteínas com o peso molecular apropriado (56 kDa) foram detetadas numa reação de tradução in vitro utilizando RNA de Gag como modelo. A via de controlo contém lisatos obtidos de células transfetadas com o RNA do antigénio correspondente amplificado de clones do HIV não infeciosos. A via NTC continha lisatos obtidos de células transfetadas ou da mistura de tradução in vitro, na ausência de qualquer RNA. Os pesos moleculares dos marcadores moleculares estão indicados à esquerda. A identidade da proteína Gag expressa foi confirmada por Transferência Western utilizando RNA de Gag amplificado do plasmídeo de controlo pBKBHlOS. RNA de Gag do Paciente 1 e Paciente 3 foi traduzido em extratos de células HeLa. Foram detetados outros antigénios em lisatos celulares de células dendríticas ou HeLa transfetadas com RNA que codifica Vpr (10,5 kDa), Rev (11,4 kDa) e Nef (23,6 kDa). No Paciente 1, a banda específica reconhecida com anticorpo anti-Nef foi difusa, com algum material a migrar a peso molecular mais elevado. Uma explicação possível é estar presente mais do que uma quasiespécie de Nef, ou uma mutação de Nef com uma modificação pós-tradução, o que deu origem a diferentes proteínas a migrar de acordo com variações do peso molecular.

Foi feita uma observação semelhante em lisatos obtidos de DCs transfetadas com RNA de Rev do Paciente 3. A identidade da proteína Gag expressa foi confirmada por análise FACS de DCs transfetadas com RNA de Gag do Paciente 1 utilizando anticorpo monoclonal anti-Gag (Beckman Coulter). A coloração por FACS intracelular de DCs recolhidas 4 horas pós-eletroporação corou células positivamente. A ligação de anticorpos em células transfetadas com RNA modificado com o análogo ARCA foi mais elevada do que a das transfetadas com RNA modificado com análogo convencional m7G de cobertura. Utilizou-se uma massa igual de RNA recoberto com m7G ou RNA modificado com ARCA, o que indica que mRNA recoberto com ARCA origina expressão mais elevada de proteína em comparação com a de mRNA de gag recoberto com m7G. Vpr amplificada de estirpes do HIV isoladas de um paciente foi expressa em Células dendríticas (dados não mostrados) bem como em células HeLa.

Os resultados dos exemplos anteriores demonstram que: (1) reuniões de iniciadores de complexidade limitada podem ser estrategicamente concebidas para amplificar de modo fiável os produtos pretendidos a partir de um grupo diversificado de modelos abrangendo diferentes Ciados, (2) PCR encaixado pode ser conduzido para adicionar o promotor de T7 à extremidade 5' e uma cauda oligo-dT à extremidade 3', (3) múltiplas quasiespécies do HIV presentes em soro de pacientes podem ser amplificadas por este método, (4) os produtos de PCR encaixado podem ser transcritos em RNA recoberto, poliadenilado, (5) células dendríticas podem ser transfetadas com RNA específico para antigénios e expressar a proteína esperada como mostrado por análise de FACs e (6) a proteína produzida tem o peso molecular correto, como mostrado por análise de transferência Western de células transfetadas. Em conjunto, estas observações proporcionam evidências substanciais de que a nossa estratégia de conceção de vacinas proporciona a amplificação de múltiplas quasiespécies do HIV para apresentação de antigénios por células dendriticas. Além disso, ao combinar grupos de iniciadores é possível proporcionar a apresentação da gama completa de quasiespécies do HIV e repertório de CTLs únicos de um paciente individual com infeção pelo HIV, o que representa um desenvolvimento significativo na tecnologia de vacinas contra a SIDA.

Exemplo 18 Células Dendriticas Transfetadas com mRNA do HIV Amplificado de Plasma de Pacientes Estimulam Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) Autólogas RN A do HIV autólogo foi preparado por amplificação de estirpes do HIV em plasma de pacientes utilizando os iniciadores da invenção para produzir um DNA do HIV, que depois foi transcrito in vitro para produzir mRNA do HIV que codifica polipéptidos de vpr, rev, nef e gag. DCs imaturas foram cotransfetadas com quatro genes do HIV autólogo (Vpr, Rev, Nef e Gag) juntamente com RNA que codifica CD40L e subsequentemente foram cultivadas na presença de IFN-g para atingir maturação completa das DCs. As DCs maduras carregadas com antigénios foram utilizadas para estimular PBMCs de pacientes com HIV autólogo. Após 6 dias em cultura, PBMCs foram recuperadas e novamente estimuladas com quatro bibliotecas de péptidos sobrepostos individuais correspondentes a sequências de consenso para Vpr, Rev, Nef e gag (duas reuniões) . A frequência de células T CD8 + positivas para IFN-gama foi determinada por ICS em resposta ao reconhecimento de cada gene do HIV individual. Preparações de DCs foram carregadas com 1 yg de RNA/milhão de DCs com cada um dos quatro genes do HIV (Figura 20, coluna da esquerda) e, numa experiência paralela, a carga útil de RNA de Nef foi reduzida para 0,25 yg/milhão de DCs, ao passo que cada um dos outros três genes foi transfetado a 1 yg de RNA/milhão de DCs (Figura 20, coluna da direita). Os resultados mostram que a redução da carga de mRNA de Nef relativamente aos mRNAs de Vpr, Rev e Gag intensifica a imunidade global sem comprometer a resposta imunológica ao antigénio Nef.

Exemplo 19 Células Dendriticas Maduras Transfetadas com RNA do HIC autólogo Induzem Respostas de Memória mais Fortes do que DCs Maduras Pulsadas com Péptidos de Consenso DCs imaturas foram transfetadas apenas com 5 yg de RNA de eGFP/milhão de DCs (controlo negativo) ou DCs transfetadas com eGFP subsequentemente pulsadas com péptidos de consenso de gag na forma de duas reuniões. Alternativamente, DCs foram transfetadas com RNA de Gag autólogo (5 yg de RNA/milhão de DCs). Em todos os casos, DCs foram cotransfetadas com RNA de CD40L e subsequentemente cultivadas em IFN-gama para atingir a maturação completa. DCs carregadas com antigénio foram cocultivadas com PBMCs previamente etiquetadas com CFSE. Passados 6 dias, PBMCs foram recuperadas e determinou-se a frequência de células reativas com antigénio (CFSE baixo). Além disso, células com baixo CFSE foram coradas por ICS quanto a Granzima B como marcador da função efetora de CTLs. Os resultados mostrados na Figura 21 demonstram a resposta imunológica superior induzida por DCs carregadas com RNA de gag do HIV autólogo em comparação com DCs pulsadas com péptido de consenso de gag.

Exemplo 19

Ensaio Clínico de Vacina de Células Dendríticas Autólogas Carregadas com RNA que Codifica Polipéptidos de Múltiplas Estirpes do HIV num Paciente A finalidade deste ensaio é examinar a segurança e resposta imunológica da administração de uma vacina de células dendríticas a pacientes infetados pelo HIV submetidos a terapia HAART. Os objetivos principais deste estudo são: • Examinar a segurança de múltiplas administrações de DCs carregadas com RNA em pacientes infetados pelo HIV submetidos a terapia HAART. • Avaliar a resposta de células T a vacinação com DCs carregadas com RNA utilizando os ensaios de Coloração de Citoquinas Intracelulares (ICS) e de proliferação de células T CSFE em amostras de sangue recolhidas 8 vezes durante o estudo na Visita 1 (rastreio) , Visita 2 (referência antes da vacinação), antes de cada uma das 5 vacinações nas semanas 4, 8, 20, 32 e na semana 36 e/ou no final do estudo/visita de terminação.

CONCEÇÃO DO ENSAIO A Fase de Pré-Tratamento será conduzida numa base de pacientes externos antes do inicio da Fase de Tratamento. A elegibilidade de pacientes será avaliada via avaliações de rastreio e confirmada na Avaliação de Referência. Esta fase consiste em: • Visita de Rastreio. • Recolha de sangue • Visita de Leucaférese [ocorre depois de o médico gestor determinar que o paciente é adequado para leucaférese]. • Monitorização imunológica (serão recolhidas amostras na Visita 2 (rastreio) e Visita 3 (referência antes da vacinação). • Avaliação de Referência (será realizada no primeiro dia de dosagem mas antes da administração inicial da vacina).

Durante a Fase de Tratamento, os pacientes receberão vacinações intradérmicas nas Semanas do Estudo 0, 4, 8, 20 e 32. Os pacientes distribuídos aleatoriamente no braço 1 do estudo receberão 1,2 x 107 DCs transfetadas num volume de 0,6 mL e os pacientes distribuídos aleatoriamente no braço 2 do estudo receberão l,2xl06 DCs transfetadas num volume de 0,6 mL. Em cada visita serão efetuadas avaliações de segurança. A monitorização imunológica será efetuada na Visita 2 (rastreio), Visita 3 (referência antes da vacinação), após cada administração subsequente nas semanas do estudo - 4, 0, 4, 8, 20, 32 e/ou no final do estudo/visita de terminação (um mínimo de duas semanas após a administração da última vacina).

SEGURANÇA • Alterações emergentes do tratamento em sinais vitais (pressão sanguínea, batimento cardíaco, taxa respiratória e temperatura do corpo) relativamente a valores de referência obtidos antes de cada vacinação. • Incidência de AEs emergentes do tratamento • Alterações emergentes do tratamento em reações localizadas nos sítios de injeção das vacinas após cada vacinação. • Adenopatia, fragilidade ou inflamação (inguinal e axilar) emergentes do tratamento avaliadas antes e após cada vacinação. • Alterações emergentes do tratamento relativamente aos valores de referência (incluindo avaliação do grau por CTC) em testes clínicos laboratoriais obtidos antes de cada vacinação. • Alterações emergentes do tratamento em exames físicos e eletrocardiogramas (ECGs) em intervalos periódicos durante a Fase de Tratamento. • Alterações emergentes do tratamento em avaliações de autoimunidade medidas por sinais e sintomas clínicos (por exemplo, urticária, citopenias, artralgias) e avaliações laboratoriais (ANA, RF, anticorpo anti-dsDNA, CH50, anticorpo anti-tiroide, teste Indireto de Coombs) em intervalos periódicos durante a Fase de Tratamento.

SELEÇÃO E RECRUTAMENTO DE SUJEITOS 0 rastreio e avaliações para determinar a elegibilidade devem estar completados num período de 2 semanas antes da entrada no estudo.

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

Infeção pelo HIV-1 documentada por qualquer estojo de teste de ELISA licenciado e confirmada por transferência Western em qualquer altura antes da entrada no estudo. Um resultado positivo de cultura do HIV-1, antigénio do HIV-1, RNA do HIV-1 no plasma ou um segundo teste de anticorpo por um método diferente de ELISA é aceitável como teste alternativo de confirmação.

Sujeitos presentemente a receber o seu primeiro regime de ART potente, definido como uma combinação de três ou mais fármacos antirretrovirais, durante um período > 6 meses antes da entrada no estudo. Se o sujeito estiver presentemente a receber um regime de ART potente que não é o seu primeiro regime de ART potente, então o sujeito deverá ter estado a receber o corrente regime de ART potente durante pelo menos 4 semanas antes da data em que foi obtido o nível de RNA do HIV-1 de rastreio e deve ter mudado para o corrente regime de ART potente por motivos diferentes de falha virológica. NOTA: Ritonavir em combinação com outro inibidor de proteases será considerado um agente antirretroviral.

Documentação de níveis correntes, persistentes de RNA do HIV-1 < 400 cópias/mL durante um período de pelo menos 6 meses antes da entrada no estudo, em que 1 mês é igual a 30 dias, documentados por pelo menos três medições separadas umas das outras por pelo menos 1 mês, com a primeira medição realizada pelo menos 6 meses antes da entrada no estudo e as outras medições realizadas num período de 6 meses da entrada no estudo.

Documentação de contagens correntes, persistentes de células T CD4+ > 350 células/mm3 durante um período de pelo menos 3 meses antes da entrada no estudo, em que 1 mês é igual a 30 dias, documentadas por pelo menos duas medições, com a primeira medição realizada pelo menos 3 meses antes da entrada no estudo e a segunda medição realizada num período de 1 mês da entrada no estudo.

Contagem de células CD4+ > 350 células/mm3 obtida em rastreio em qualquer laboratório de fluxo certificado pela AACTG.

No rastreio do estudo, nível de RNA do HIV-1 < 200 cópias/mL pelo ensaio Roche Amplicor HIV-1 Monitor™ Ultrasensitive. Homens e mulheres com idades > 18 anos.

Valores laboratoriais obtidos num período de 30 dias antes da entrada no estudo: • Creatinina < 3 x ULN. • AST (SGOT), ALT (SGPT) e fosfatase alcalina < 5 x ULN.

Valores laboratoriais obtidos num período de 30 dias antes da entrada no estudo e novamente num período de 72 horas da entrada no estudo. Estes valores devem ser obtidos em dois instantes separados: • Contagem absoluta de neutrófilos (ANC) > 750/mm3. • Hemoglobina > 8 g/dL. • Contagem de plaquetas > 75 000/mm3. • Teste negativo de gravidez para todos os sujeitos do sexo feminino com potencial reprodutor.

CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO

Qualquer infeção aguda ou doença clínica grave num período de 14 dias antes da entrada no estudo. O sujeito será excluído deste estudo devido a uma doença grave (que requeira tratamento sistémico e/ou hospitalização) até o sujeito completar a terapia ou estar clinicamente estável durante a terapia, na opinião do investigador, durante pelo menos 14 dias antes da entrada no estudo.

Qualquer valor de RNA do HIV-1 obtido num período de 6 meses de entrada no estudo >400 cópias/mL.

Qualquer contagem de células T CD4 obtida num período de 3 meses da entrada no estudo < 350 células/mm3.

Historial de irradiação de nodos linfáticos

Uso prévio de qualquer vacina para o HIV.

Uso de hidroxiureia num período de 45 dias antes da entrada no estudo.

Gravidez e aleitamento.

Tomada de quaisquer moduladores ou supressores imunológicos num período de 30 dias antes da entrada no estudo, incluindo mas não se limitando a fármacos tais como corticosteroides sistémicos; interferões; interleuquinas; talidomida; sargramostim (fator estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos [GM-CSF]); dinitroclorobenzeno (DNCB); timosina alfa, timopentina, inosiplex; polirribonucleósido; ditocarbe sódio.

Alergia/sensibilidade a fármaco(s) do estudo ou suas formulações.

Uso ativo de drogas ou álcool ou dependência que, na opinião do investigador, irá interferir na adesão a requisitos do estudo.

Seroconversão conhecida do HIV-1 num período de um ano antes da entrada no estudo.

Quaisquer agentes antirretrovirais ainda em investigação que não sejam obtidos através de acesso expandido.

TRATAMENTO DE PACIENTES

MEDICAÇÃO E DOSE DO ESTUDO A vacina consiste em células dendriticas processadas de modo asséptico, maduras, autólogas submetidas a eletroporação com RNAs do HIV autólogos, selecionados. Cada dose será proporcionada num frasco criogénico que contém 0,6 cc de células crioconservadas suspensas a uma concentração de 1,2 x 107 células/mL (braço 1) ou l,2xl06 (braço 2) para proporcionar DCs maduras autólogas carregadas com RNA do HIV amplificado suspensas em DMSO 10% e glucose 5% em plasma autólogo inativado pelo calor.

FUNDAMENTAÇÃO DAS DOSES A seleção do nivel superior de doses foi conduzida pelo número máximo antecipado de células dendriticas transduzidas com RNA que poderiam ser produzidas a partir de uma única leucaférese e que pudessem proporcionar pelo menos seis vacinas (cinco para administração e uma para o controlo de qualidade). O intervalo de imunização foi selecionado para se obterem múltiplas imunizações, que são muitas vezes requeridas para demonstrar respostas imunológicas, dentro de uma janela temporal razoável.

DOSAGEM E ADMINISTRAÇÃO DE DOSES

Preparação da Vacina para Administração A vacina será removida do armazenamento criogénico imediatamente antes da administração ao paciente e descongelada fazendo rolar o frasco entre palmas abertas ou mantendo o frasco num punho fechado. 0 produto ficará completamente descongelado num período de três até cinco minutos. Deve ter-se cuidado neste procedimento, pois o frasco está extremamente frio quando é primeiramente removido do expedidor criogénico seco. A vacina deve ser administrada imediatamente após a descongelação para minimizar a exposição de células descongeladas ao DMSO.

Antes da utilização, as células descongeladas devem ser suavemente misturadas dando pancadinhas no frasco. Deve evitar-se inversão do frasco. Após a mistura, a vacina será extraída para três seringas de alergia de 1 mL (serão extraídos 0,2 mL para cada seringa) com uma agulha integral de calibre 26 (fornecida pelo fabricante).

Administração da Vacina A vacina deve ser administrada imediatamente depois do enchimento da seringa para evitar a administração de doses desiguais devido a células que sedimentaram na seringa. A vacina será administrada intradermicamente. A administração ocorrerá nas Semanas do Estudo 0, 4, 8, 20 e 32 .

Em cada dia de injeção da vacina, a totalidade da dose será administrada numa única cadeia de nodos linfáticos começando na axila direita e depois rodando no sentido dos ponteiros do relógio entre os quatro sítios anatómicos (axila direita, axila esquerda, inguinal esquerdo e inguinal direito) . As injeções devem ser aplicadas no aspeto anteromedial do membro tão próximo da articulação quanto possível. Para o braço pode ser utilizada a superfície anterior do braço distai ao cotovelo. A administração da vacina deve ser efetuada por três injeções intradérmicas que administram 0,2 mL de vacina, perfazendo uma dose total de 0,6 mL. Os sítios de injeção devem estar afastados aproximadamente 5 cm uns dos outros. Deve ter-se o cuidado de retirar a agulha lentamente para minimizar fugas da administração. Deve ser tomada a média da percentagem de fugas da administração e arredondada para o quarto mais próximo ao longo das três injeções e registada no CRF do paciente. Não são permitidas modificações de doses da medicação do estudo durante o estudo.

Atribuição do Tratamento do estudo

Depois de um paciente assinar o formulário de Consentimento Informado, o pessoal das instalações irá fazer o registo do paciente com o Responsável. O pessoal das instalações atribuirá um número de rastreio específico das instalações que é único para cada paciente na visita de rastreio.

Após confirmação de que todas as avaliações pré-tratamento são aceitáveis, aos pacientes será atribuído num Número ID e serão recrutados. Será recrutado um número máximo de vinte pacientes avaliáveis. Pacientes com células insuficientes, após a leucaférese, para produzir pelo menos seis doses de vacina (cinco para administração e uma para controlo da qualidade) serão retirados do estudo. Estes pacientes constituirão falhas de preparação e não serão substituídos no estudo. Os pacientes que sejam retirados ou que se retirem a si próprios do estudo por motivos não relacionados com progressão de doença ou tratamento com vacina antes de completarem pelo menos cinco vacinações (por exemplo, morte acidental, sem pós-observação) não são avaliáveis e serão substituídos. Se, na opinião do Investigador, a progressão de doença requerer outra terapia antes de a primeira injeção de vacina estar disponível, o paciente será retirado do estudo devido a progressão de doença e não será substituído.

Medicação(ões)/Tratamento(s) Concomitante(s) Permitido(s)

Os pacientes podem tomar quaisquer medicações concomitantes com a exceção de ART concomitante, outros agentes imunossupressores ou qualquer outra forma de imunoterapia. Todas as prescrições concomitantes e medicações não sujeitas a receita médica (OTC) concomitantes proibidas (por exemplo, esteroide tópico, etc.) tomadas durante o estudo serão registadas no CRF. Medicações OTC concomitantes não proibidas não serão registadas no CRF.

MANIPULAÇÃO DA MEDICAÇÃO DO ESTUDO

Recolha e Expedição de Componentes da Vacina Recolha de Espécimes Sanguíneos/plasmáticos Leucaférese • Pacientes serão submetidos a leucaférese no centro de administração de leucaférese da instalação clínica utilizando um Sistema de Leucaférese COBE Spectra. Se o acesso por veias periféricas for inadequado, um cateter de lúmen duplo rígido pode ser colocado na veia jugular ou subclávia. É recomendado que a enfermeira da aférese avalie visualmente o acesso venoso durante a visita de rastreio. • Aproximadamente 180 mL de produto de leucaférese serão recolhidos durante a visita de leucaférese. • Será efetuada uma recolha separada de aproximadamente 150 mL de plasma autólogo durante a recolha da leucaférese. • A pressão sanguínea do paciente será registada e sangue será recolhido para contagem de células sanguíneas completas (CBC) com diferencial antes e imediatamente após a leucaférese. CBC com diferencial também será efetuada no produto de leucaférese. • PBMCs serão recolhidas num saco de citaférese esterilizado, descartável, de utilização única de acordo com práticas clínicas padrão e diretrizes apresentadas no Manual de Referência do Estudo. • O espécime de leucaférese e espécime de plasma autólogo serão transportados para a instalação do laboratório de preparação sem processamento adicional num recipiente de expedição especial fornecido pelo fabricante. Estes produtos serão mantidos num recipiente controlado, monitorizado, isolado e transportados por um transportador comercial durante a noite. • O produto de leucaférese deve ser expedido para o fabricante no dia do procedimento de acordo com as instruções do Manual de Referência do Estudo.

Na instalação de preparação, o produto de leucaférese será inspecionado para determinar se é aceitável para a preparação de uma vacina. Se o produto não for adequado para produzir pelo menos seis vacinas, o paciente será retirado do estudo.

CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO PARA A VACINA

Cada dose de vacina terá aproximadamente 1,2 x 107 células num volume total de 0,6 mL (braço 1) ou l,2xl06 células num volume total de 0,6 mL (braço 2). Cada dose de vacina será proporcionada num frasco criogénico que contém células crioconservadas suspensas a uma concentração de 1,2 x 107 células/mL para proporcionar DCs autólogas, carregadas com RNA total tumoral amplificado, maduras suspensas em DMSO 10% e glucose 5% em plasma autólogo inativado pelo calor. A vacina de cada dia de tratamento será expedida individualmente. Um lote da medicação do estudo NÃO será mantido no local clinico. O frasco criogénico será transportado num expedidor criogénico seco com azoto liquido sob condições controladas a temperaturas iguais ou menores do que -150 °C. O frasco criogénico será armazenado neste expedidor criogénico seco no local até à utilização. O expedidor deve regressar imediatamente ao fabricante para expedir doses subsequentes.

CALENDÁRIO TEMPORAL E DE EVENTOS A Fase de Pré-Tratamento será conduzida numa base de pacientes externos antes do inicio da Fase de Tratamento. Uma linha temporal é mostrada na Figura 22. A duração total da Fase de Pré-tratamento será 6 semanas. A Fase de Pré-tratamento consiste nas seguintes visitas:

Visita de Rastreio (Visita 1)

Visita de Leucaférese (Visita 2)

Visita da Avaliação de Referência (Visita 3)

FASE DE TRATAMENTO

As seguintes avaliações do estudo devem ser efetuadas durante a Fase de Tratamento:

MONITORIZAÇÃO IMUNOLÓGICA

Para além dos pontos finais de segurança clinica, serão avaliadas respostas imunológicas. A monitorização imunológica será efetuada na Visita 1 (visita de rastreio), na Visita 3 (referência antes da vacinação), antes da administração de cada vacina subsequente nas semanas do estudo 4, 8, 20, 32 e na semana 36 (Visita 8) ou_ no final do estudo/visita de terminação (um mínimo de duas semanas após a administração da última vacina).

Amostras de sangue serão recolhidas em sete instantes e avaliadas quanto à presença de células T que respondem à vacinação por ICS (medição de IFN-γ e IL-2) e por proliferação de células T com CFSE de acordo com os seguintes métodos:

Preparação de PBMC para análises de Imunomonitorização:

EQUIPAMENTO/ARTIGOS

1. Tubos de polipropileno esterilizados de 50 mL

2. Banho de água a 37°C 3. Pipetas de 10 e 25 mL, individualmente embrulhadas

4. Frascos criogénicos de 2 mL

5. Congelador a -80°C 6. Recipientes de congelação (Nalgene) 7. Congelador a Azoto Líquido 8. Hemacitómetro

REAGENTES 1. Soro AB Humano (Gemini BioProducts) 2. DMSO (Cat# D2650, testado quanto a endotoxinas, Sigma), o DMSO expira 6 meses após a abertura. 3. RPMI 1640 (Life Technologies) 4. Albumina de Soro Humano (5 gramas, cat# A5843, pobre em endotoxinas, Sigma; ou Serologicals Corp.)

Para preparar uma solução de HSA 12,5%, adicionar 40 mLs de RPMI 1640 à garrafa de 5 gramas. Misturar suavemente por inversão. Não aplicar vórtice, pois o HSA irá formar espuma. Filtrar de modo esterilizado e armazenar a 4°C durante um período até 6 meses. 5. Meio do Ensaio: MATIS + soro AB Humano 10%

Pipetar para uma garrafa esterilizada de 500 mL: 250 mLs de RPMI 1640

250 mLs de EHAA 10 mL de solução de Pen/Estrep

25 mLs de L-Glutamina 200 mM 50 uL de solução 0,5 M de 2-Mercaptoetanol 50 mLs de soro AB humano inativado pelo calor

Etiquetar a garrafa com a data e iniciais. Armazenar a 4°C.

6. Azul de Tripano (0,4% em PBS, cat# T8154 Sigma) PROCEDIMENTO

Congelação de PBMCs 1. Colocar recipientes de congelação Nalgene a 4°C. 2. Etiquetar frascos criogénicos com:

ID do Paciente 10 x 106 PBMC

Data da recolha de sangue e iniciais Tech 3. Colocar frascos criogénicos etiquetados no congelador a -20 °C. 4. Para cada frasco criogénico adiciona-se 1 mL de volume total por 10 x 106 PMBCs. 5. Preparar 2X meio de congelação: para 20 frascos criogénicos 10 mis de solução de HSA 12,5%

2,5 mLs de DMSO

Misturar e colocar em gelo durante um período mínimo de 30 minutos. 6. Suspender novamente PBMCs com ficoll a 2 x 107 linfócitos viáveis/mL em solução arrefecida de HSA 12,5% 7. Adicionar ο 2X meio de congelação arrefecido à suspensão de células gota-a-gota rodopiando suavemente o tubo. 8. Remover o frasco criogénico arrefecido dos -20°C e transferir alíquotas de 1 mL por frasco criogénico. 9. Colocar o frasco criogénico em gelo após a transferência de alíquotas de PBMCs. 10. Transferir os frascos criogénicos para um recipiente de congelação Nalgene e colocar num congelador a -80°C. 11. Para armazenamento de longa duração, transferir os frascos criogénicos para um congelador de azoto líquido após 24 horas de congelação a -80°C. Nunca armazenar células a -20°C, mesmo que apenas temporariamente. 12. Registar a localização do frasco (número da caixa e número do compartimento) na base de dados de espécimes e arquivo do congelador.

Descongelação de PBMCs 1. Colocar o meio de cultura de células num banho de água a 37°C durante cerca de 30 minutos. 2. Etiquetar um tubo de centrifugação de 50 mL por amostra e adicionar 8 mLs de meio de ensaio morno (22°C até 37°C). 3. Remover frascos criogénicos do congelador de azoto liquido e colocar diretamente sobre gelo seco. 4. Não descongelar mais do que 2 frascos criogénicos ao mesmo tempo. Colocar os frascos criogénicos num banho de água a 37 °C até a suspensão celular estar quase completamente fundida ou permanecer uma pequena porção de gelo. 5. Secar o exterior dos frascos criogénicos e limpar com etanol 70%. 6. Adicionar lentamente 1 mL de meio de cultura de células morno (22°C até 37°C) às células descongeladas. 7. Transferir a suspensão de células para os tubos de polipropileno de 50 mL contendo 8 mLs de meio. 8. Equilibrar os tubos e centrifugar a 1200 rpm durante 10 minutos. 9. Aspirar o sobrenadante e suspender novamente células em 2 mL de meio de ensaio. 10. Efetuar contagem manual de células utilizando Azul de Tripano para determinar a viabilidade de PBMCs.

Protocolo de ICS

EQUIPAMENTO/ARTIGOS

Tubos de polipropileno esterilizados de 50 mL Tubos de polipropileno esterilizados de 15 mL Placa de fundo redondo de 96 cavidades, 1 mL

REAGENTES

Soro AB Humano (Gemini BioProducts) RPMI 1640 (Life Technologies)

PBS PBS FCS 2%

Péptido de HIV de 15 meros e de Controlo Brefeldina A

Anticorpos: CD4 APC-Cy7, CD27-PE, IL-2 FITC, IFN-γ APC, CCR7-PE Cy7, CD28

CyChrome (BD) e CD45 RA ECD (Coulter)

PBMCs de indivíduos infetados com o HIV

PROCEDIMENTO 1. Descongelar PBMCs (ver Protocolo relacionado)

2 . ICS - Distribuir 2.106 células/1 mL/cavidade (placa de fundo redondo profunda de 96 cavidades). Preparamos 5 cavidades para cada péptido para a coloração com 6 cores.

Adicionou-se anticorpo anti-CD28 e CD49d (Becton Dickinson, San Jose, CA) a cada amostra (1 yg/mL) como coestimuladores. - Ativar as células com SEA (200 ng/mL)

Ou NS (Controlo Negativo)

Ou péptido(s) (5 yg/mL) - Incubar todas as amostras a 37°C. A incubação total durará aproximadamente 12 horas. - Após 1-1,5 horas de incubação a 37°C, adicionar brefeldina A para uma concentração final de 10 yg/mL. - Transferir as células na placa de fundo redondo de 96 cavidades depois de decorrido um total de 12 horas de incubação. - Lavar duas vezes com PBS FCS 2%.

- Corar quanto a marcadores de superfície celular. (CD4 APC-Cy7 (5 yL), CD27 PE (10 yL), CD28 CyChrome (20 yL), CCR7-PE Cy7 (10 yL) , CD45 RA CyChrome (10 yL) em 100 yL de PBS FCS 2%. - Incubar a 4°C durante 30 minutos. - Lavar duas vezes com PBS FCS 2%. - Adicionar 100 yL de PBS e 100 yL de paraformaldeído 4%. - Incubar à TA durante 30 minutos. - Lavar duas vezes com tampão de permeabilização (saponina 0,5% em PBS. Preparado de fresco de cada vez) . - Adicionar 50 yL de tampão de permeabilização. - Incubar à TA durante 30 minutos. - Corar quanto a citoquinas intracelulares IL-2 FITC (1 yL) , IFN-γ APC (10 yL) em 50 yL de tampão de permeabilização - Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. - Lavar duas vezes em PBS FCS 2%. - Adicionar 100 yL de PBS e 100 yL de paraformaldeído 4%. - Análise das células em FACS nos dias seguintes.

Controlos: - Células não coradas como controlo negativo. - Controlo de isotipo para coloração de superfície. - Controlo de isotipo para coloração intracelular. - Controlo positivo. - Controlo de permeabilização (Perm-a-sure= reconhece uma proteína celular humana expressa de modo constitutivo): uma amostra será permeabilizada, uma não o será.

Controlo de ativação: uma amostra permanecerá não estimulada como controlos de fundo sem ativação.

Ensaio de proliferação de células T com CSFE

Reagentes:

Lote de SEB ou SEA 1 mg/mL Éster de succinimidilo de diacetato de 5-6-carboxifluoresceína (CFSE) (Molecular Probes, cat# C-1157) Marcadores da superfície celular: Anticorpos conjugados a FL2 (PE) , FL3 (PerCP ou Cychrome) e FL4 (APC)

PBS

Tampão de lavagem coloração: PBS FCS 2%

Soro AB Humano RPMI-10 (Sigma).

Procedimento:

Titulação CFSE é dissolvido em DMSO anidro com qualidade de reagente e armazenado a -80 °C. Nova preparação de CFSE deve ser titulada para se obterem resultados de coloração ótimos. Para a titulação, um volume igual de concentrações entre 0,5 - 5 μΜ de CFSE é adicionado a PBMCs (lxl07/mL) e incubado no escuro com mistura suave à temperatura ambiente durante 8 minutos. A reação é interrompida por adição de um volume igual de HS durante 1 minuto. As células são lavadas com PBS e cultivadas, a 37°C a 5% de CO2, a lxl06/mL em RPMI que contém HS 10%, durante a noite, e a intensidade da fluorescência de células tratadas com várias concentrações é determinada por análise FACS. A concentração ótima de CFSE é definida como sendo aquela à qual todas as células são coradas a uma intensidade da fluorescência entre 103 e 104 unidades log em citometria de fluxo (canal FLl) . Observámos que a intensidade da fluorescência diminui significativamente entre o momento da coloração e o dia seguinte, de modo que todos os resultados de titulação e dados experimentais são recolhidos apenas depois de passadas 24 horas de incubação nas condições acima mencionadas. Devem adicionar-se marcadores de superfície conjugados a FL2 (PE) e FL3 (PerCP ou Cychrome) para fixar a voltagem e compensação a todas as concentrações de CFSE testadas (se a fluorescência de CFSE for demasiado elevada, é quase impossível compensar FL2 e FL3). Nas nossas experiências, a concentração final de CFSE utilizada varia habitualmente entre 0,5 e 1,25 μΜ.

Coloração 1) Suspender novamente PBMCs a 10 milhões/mL em PBS. 2) Preparar 2X solução de CFSE. (Se a solução de trabalho final for 1,5 uM, depois preparar uma solução 3 uM) 3) Adicionar 1 volume de 2X CFSE a PBMCs. 4) Incubar durante 8-10 min com mistura suave sob a hote sem luz . 5) Interromper completando o volume do tubo com RPMI HS 10 O. o · 6) Recolher as células (7 min, 1400 PRM) e suspender novamente a 1 milhão por mL com meio completo. 7) Distribuir as células em placas de 96 Cavidades profundas (1 até 2 milhões/ cavidade) e estimular com SEB (1 pg/mL ou SEA 50-100 ng/mL) como controlo positivo para a proliferação, 10 ug/mL de péptido isolado, 2 ug/mL/péptido quando se utilizar uma reunião de péptidos, 2 ug/mL de proteína recombinante. 8) Incubar a 37°C durante 4 até 7 dias. 9) Retirar 800 uL do sobrenadante e deixar as células no fundo. Transferir células para placas de fundo em V 96 utilizando um PIPETMAN multicanais. 10) Lavar com PBS FCS 2% (100 uL). 11) Corar quanto a marcadores de superfície em 50 pL de PBS FCS 2%. 12) Incubar durante 20 min à TA no escuro. 13) Lavar com PBS FCS 2% (150 pL). 14) Suspender novamente em 400 pL de formaldeído 2% em PBS FCS 2%. 15) Adquirir dados no citómetro de fluxo.

AVALIAÇÕES DE SEGURANÇA A segurança dos pacientes será avaliada por exames físicos, incluindo historial médico, testes clínicos laboratoriais, ECGs, medições de sinais vitais e avaliações de AE. As variáveis de segurança incluirão a classificação da incidência e gravidade de efeitos secundários associados à administração de células dendríticas, incluindo parâmetros hematológicos e de química do sangue. Estas variáveis também incluirão avaliações de autoimunidade, avaliações de adenopatia e avaliações quanto a reações localizadas nos locais de injeção da vacina. Os resultados de todos os procedimentos e avaliações de segurança serão monitorizados ao longo do estudo.

EXAME FÍSICO E HISTORIAL MÉDICO

Durante a Visita de Rastreio obter-se-á um historial médico com atenção particular a 1) uma revisão dos sistemas do corpo e 2) utilização de medicações de prescrição, incluindo ART. Recomenda-se que, na visita de rastreio, a enfermeira da aférese avalie visualmente o acesso venoso do paciente.

Um exame fisico será conduzido na Visita de Rastreio, Visita de Avaliação de Referência e em cada uma das visitas subsequentes durante a Fase de Tratamento. Também será conduzido um exame fisico quando o estudo for terminado. Serão avaliados resultados físicos dentro das seguintes categorias: neurológica, cardiovascular, respiratória, linfática, pele, abdómen, cabeça, ouvidos, olhos, nariz, garganta e alergias.

AVALIAÇÕES CLÍNICAS LABORATORIAIS

Espécimes de sangue e urina para a medição e avaliação de parâmetros de química clínica, hematologia e urinálise serão recolhidos em vários momentos durante o estudo. Serão obtidos valores para os seguintes parâmetros:

Avaliação de Química Clínica Sódio

Potássio

Cloreto

Creatinina Cálcio SGOT (AST) (transaminase glutâmico-oxalacética do soro) SGPT (ALT) (transaminase glutâmico-pirúvica do soro)

Fosfatase Alcalina Bilirrubina (total) LDH (apenas rastreio) (lático desidrogenase)

Albumina do Soro

Avaliação de Hematologia

Contagem de Células Sanguíneas Completas com diferencial Contagem de Plaquetas Hemoglobina (Hgb)

Hematócrito

Tempo de Protrombina (PT) (apenas rastreio)

Tempo de Tromboplastina Parcial (PTT) (apenas rastreio)

Urinálise

Apenas tira reagente (incluindo proteína, glucose, hemoglobina, pH e cetona), e microscópica, se clinicamente indicado.

Os resultados dos testes clínicos laboratoriais conduzidos durante o estudo devem ser avaliados pelo Investigador para determinar a elegibilidade continuada de cada paciente para participação no estudo. Se valores estiverem fora do intervalo de referência normal, o Investigador deve atribuir uma classificação de toxicidade por CTC e avaliar se o valor é ou não clinicamente significativo no contexto do estudo. Todos os valores laboratoriais anormais considerados clinicamente significativos pelo Investigador devem ser representados na página de AE do CRF. Se a anormalidade laboratorial estiver claramente relacionada com um diagnóstico ou síndrome medicamente definido, o diagnóstico ou síndrome será registado na página de AE, não os valores laboratoriais individuais. Se o valor anormal não estiver relacionado com um diagnóstico ou síndrome, o valor laboratorial será registado na página de AE.

Sinais Vitais e Peso

Os sinais vitais incluem pressão sanguínea sistólica e diastólica, batimento cardíaco, taxa respiratória e temperatura do corpo. Estas medições, juntamente com o peso do paciente, serão efetuadas na Visita de Rastreio, Visita de Leucaférese (apenas pressões sanguíneas pré- e pós-leucaférese), Visita de Avaliação de Referência, em todas as visitas de dosagem (antes da vacinação e a cada quinze minutos durante a primeira hora pós-vacinação, e a cada trinta minutos durante a segunda hora pós-vacinação quanto a sinais vitais) e na terminação do estudo. Serão conduzidas medições de sinais vitais após cinco minutos na posição sentada. Não serão realizadas outras medições ou procedimentos durante este período de cinco minutos.

AVALIAÇÕES DE AUTOIMUNIDADE

As avaliações de autoimunidade serão medidas por sinais e sintomas clínicos (por exemplo, urticária, citopenias, artralgias) e por avaliações laboratoriais de ANA, RF, anticorpo anti-dsDNA, CH50, anticorpo anti-tiroide e teste Indireto de Coombs. As avaliações serão efetuadas na Visita de Rastreio e em cada visita subsequente. Estas medições também serão repetidas na terminação do estudo.

AVALIAÇÕES DE ADENOPATIA

Os nodos linfáticos de drenagem (axilares e inguinais) serão avaliados quanto a alterações de tamanho, fragilidade ou inflamação. As avaliações serão conduzidas na Visita de Avaliação de Referência e em cada visita subsequente. Além disso, os pacientes irão registar o desconforto nodal em casa entre visitas.

AVALIAÇÕES DE REAÇÕES NOS SÍTIOS DE INJEÇÃO DE VACINA

Avaliações de reações nos sitios de injeção de vacina serão efetuadas a cada quinze minutos durante a primeira hora pós-vacinação, a cada trinta minutos durante a segunda hora pós-vacinação e em casa pelos pacientes quarenta e oito horas pós-vacinação. Os pacientes receberão um cartão onde registarão as suas observações às quarenta e oito horas. 0 pessoal das instalações telefonará ao paciente para recolher esta informação num período de dois até seis dias após cada vacinação. Para pacientes que relatem uma AE de reações em sítios de injeção de Grau > 2, o investigador principal ou designado irá requerer que o paciente regresse à clínica para avaliação das reações nos sítios da injeção por pessoal treinado. As reações serão classificadas de acordo com o CTC e serão registadas com as AEs no CRF.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

[0273] <110> Argos Therapeutics, Inc.

Nicolette, Charles Tcherepanova, Irina Harris, Jason Healey, Don

<12 0> AMPLIFICAÇÃO INDEPENDENTE DE ESTIRPES DE PATOGÉNIOS E VACINAS PARA OS MESMOS

<130> MER029WO <150> US 60/522,310 <151> 2004-09-14 <150> US 60/665,130 <151> 2005-03-25 <160> 408 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 1 actctggtaa ctagagatcc 20

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<210> 57 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 57 taatacgact cactataggg agaccaccat ggaacaagcc ccag 44

<210> 58 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 58 taatacgact cactataggg agaccaccat ggaacaagcc ccgg 44

<210> 59 <211> 9 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de Kozak <400> 59 ccaccatgg 9

<210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 60 ggataaacag cagttgttgc 20

<210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 61 gaataaacag cagttgttgt 20

<210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 62 ggataaacgg cagttgttgc 20

<210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 63 gaataaacaa cagttgttgc

<210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 64 gaataaacag cagctgttgc 20

<210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 65 attctgctat gtcgacaccc 20

<210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 66 attctgctat gtcggcgccc 20

<210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 67 attctgctat gtcggcaccc 20

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<210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 69 ctccatttct tgctctcctc 20

<210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 70 ctccatttct tgctcttctc 20

<210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 71 ctccattcct tgctctcctc 20

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<210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Seguência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 79 atagtaggag gcttggtagg 20

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<210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 100 gcattaagca agctaacagc 20

<210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 101 gcgttgagca agctaacagc 20

<210> 102 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 102 tttttttttt ítttituu tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttitgtgacg aggggtcgtt g 81

<210> 103 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 103 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttgtgacg aggggtcgct g 81

<210> 104 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 104 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttgtaaeg agggggcgtt g 81 <210> 105 <211> 81

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 105 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttgtgtcg agggggcgtt g 81

<210> 106 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 106 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt: 60 ttttgctcct gtatctaata gage 84

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<210> 108 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 108 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttgctcct gtatctaaca gage 84

<210> 109 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 109 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttggt ttccatcttc ctgg 84

<210> 110 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 110 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttttiggt ttccatcttc ctgc 84

<210> 111 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 111 tttttttttt uttmttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt mattttt 60 tttttttggc ttccatctcc ctgg 84

<210> 112 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 112 tttttttttt tttttttttt itUtttttt tttttttttt tttttttttt ttttfitttt 60 tttttttggt ttccatttcc ctgg 84

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<210> 120 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tittttttU 60 tttttttatt ctgctatgtt gacaccc 87

<210> 121 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 121 tttttttttt tttttttttt tttttttttt ILtttltttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttctc caittettgc tctcctc 87

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<210> 125 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 125 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttti tttttttttt 60 tttttltcct gaetceaata ttgtagg 87

<210> 126 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 126 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttgcattg agcaagetaa cage 84

<210> 127 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 127 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttgcattg agcaagetaa ctgc 84

<210> 128 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 128 ttlttttttt llfttttttt ttttttltit ttííítlttt ittttttttt tttftttttt 60 ttttgcattg agcaagttaa cage 84

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<210> 134 <211> 41 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 134 taatacgact cactataggg agaccaccat gggagtgatg g 41

<210> 135 <211> 41 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 135 taatacgact cactataggg agaccaccat gggagtgaag g 41

<210> 136 <211> 41 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 136 taatacgact cactataggg agaccaccat gggagtgagg g 41

<210> 137 <211> 82 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 137 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttttatag caaageectt tc 82

<210> 138 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 138 tagctgaggg gacagatag 19

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<210> 141 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 141 atgggtggca agtggtcaaa acg 23

<210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 142 atgggtggca aatggtcaaa aag 23

<210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 143 atgggtggca agtggtcaaa agg 23

<210> 144 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 144 ccagtacagg caaaaagc 18

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<210> 146 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 146 cagtacaggc aagaagc 17

<210> 147 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 147 taatacgact cactataggg agaccaccat gggtggcaag tggtcaaaaa g 51

<210> 148 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 148 taatacgact cactataggg agaccaccat gggtggcaag tggtcaaaac g 51

<210> 149 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 149 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttíteeag tacaggcaaa aagc 84

<210> 150 <211> 83 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 150 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttttcagt aeaggcgaaa ago S3

<210> 151 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 151 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttttccag tacaggcaag aagc 84

<210> 152 <211> 80 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 152 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttgtc agcagtcttt 80

<210> 153 <211> 80 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 153 tttttttttt tttttttttt tttttttttt mttttm tttttttttt tttttttttt 60 tttttttgtc agcagtctca 80

<210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 154 tttttgacca cttgccaccc 20

<210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 155 tttttgacca cttgccactc 20

<210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 156 tttttgacca cttgcccccc 20

<210> 157 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 157 ttttttttft tttttttttt tttttttttt ttitttttit mtmttt tttttttttt 60 tttttttttg aec-acttgcc accc 84

<210> 158 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 158 tttttttttt titttttttt ttttttittt tttttttttt tittttttit tttttttttt 60 tttttitttg accacttgcc actc 84

<210> 159 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 159 tttttitttg accacttgcc cccc 84

<210> 160 <211> 48 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 160 taatacgact cactataggg agaccaccat ggtgggagca gtgtctca 48

<210> 161 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 161 taatacgact cactataggg agaccaccat ggaggcacaa gaggaagagg 50

<210> 162 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 162 tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtg 28

<210> 163 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 163 ctcgatgtca gcagttcttg aagtactc 28

<210> 164 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 164 cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatc 28

<210> 165 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 165 gtctacttgt gtgctatatc tctttttc 28

<210> 166 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 166 gcattcccta caatccccaa ag 22

<210> 167 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 167 ggtctaacca gagagaccca gtacag 26

<210> 168 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 168 agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt g 31

<210> 169 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 169 tgccttgagt gcaagtagtg tgtgccc 27

<210> 170 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 170 aaaagggctg ttggaaatgt gg 22

<210> 171 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 171 ggaaggacac caaatgaaag attgtactga gag 33

<210> 172 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 172 gcctgtcttt cagtgcaatc tttcatttgg tgtcc 35

<210> 173 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 173 tctgttctga ggaaaattcc ctggcctccc 30

<210> 174 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 174 attccctaca atccccaaag tcaag 25

<210> 175 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 175 attccctaca atccccaaag tc 22

<210> 176 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 176 tggaaaggtg aaggggcagt agtaatacaa g 31

<210> 177 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 177 tggaaaggtg aaggggcagt agtaataca 29

<210> 178 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 178 ctcatcctgt ctacttgcca cacaatcatc ac 32

<210> 179 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 179 ccctagtggg atgtgtactt ctgaac 26

<210> 180 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 180 taggagtagc acccaccaag gcaaagag 28

<210> 181 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 181 tggtgtgtag ttctgccaat cagggaag 28

<210> 182 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 182 cttgaagcac tcaaggcaag ctttattg 28

<210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 183 gggatttggg gttgctctgg 20

<210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 184 gggatttggg gctgctctgg 20

<210> 185 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 185 tgatagtagg aggcttggta gg 22

<210> 186 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 Ο 0> 186 tgatagtagg aggcttaata gg 22

<210> 187 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 187 tgatagtagg aggcttgata gg 22

<210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 188 gttaggcagg gatattcacc 20

<210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 189 gttaggcagg gatactcacc 20

<210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 190 ccctgtctta ttcttctagg 20

<210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 191 ccctgtctta ttcttacagg 20

<210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 192 ccctgtctta ttcttgtagg 20

<210> 193 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 193 tttttttttt tttttttttt tttfctttttt tttttttttt ttííttttíí tttttttttt 60 tttttccctg tcttattctt ctagg 85

<210> 194 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 194 tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttftfttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttlttccdg tcttattctt acagg 85

<210> 195 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 195 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttecctg tcitattctt gtagg 85

<210> 196 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 196 ttcttcctgc cataggagat gc 22

<210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 197 ttcttcctgc cataggaaat gc 22

<210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 198 gcagttgtag gctgacttcc 20

<210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4 0 0> 199 gcagttgtag gctgactccc 20

<210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 200 gcagttgtag gctggcttcc 20

<210> 201 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 201 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttgcagt tgtaggctga cttcc 85

<210> 202 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 202 tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttifttttft ittttttttt tttttttttt 60 tttttgcagt tgtaggctga ctcce 8 5

<210> 203 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 203 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttgcagt tgtaggetgg cttcc 85

<210> 204 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 204 tagctggctg gacagatag 19

<210> 205 <211> 87 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 205 aagatagggg ggcaactaaa ggaagctcta ttagatacag gagcagatga iacagtatta 60 gaagaaaiaa attígccagg aagatgg S7

<210> 206 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 206 gtgcgagagc gt 12

<210> 207 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 207 gtgcgagacc gt 12

<210> 208 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 208 aacaagcccc ag 12

<210> 209 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 209 aacaagcccc gg 12

<210> 210 <211> 11 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 210 acccacctcc c 11

<210> 211 <211> 11 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 211 acccgcctcc c 11

<210> 212 <211> 9 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 212 gagtgatgg 9

<210> 213 <211> 9 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 213 gagtgaagg 9

<210> 214 <211> 9 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 214 gagtgaggg 9

<210> 215 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 215 gtggcaagtg gtcaaaaag 19

<210> 216 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 216 gtggcaagtg gtcaaaacg 19

<210> 217 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 217 tgggagcagt gtctca 16

<210> 218 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 218 aggcacaaga ggaagagg 18

<210> 219 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 219 taatacgact cactataggg agaccaccat gg 32

<210> 220 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 220 gtgacgaggg gtcgttg 17

<210> 221 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 221 gtgacgaggg gtcgctg 17

<210> 222 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 222 gtaacgaggg gtcgttg 17

<210> 223 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 223 gtgtcgaggg ggcgttg 17

<210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 224 gctcctgtat ctaatagagc 20

<210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 225 gctcctgtat ctaataaagc 20

<210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 226 gctcctgtat ctaacagagc 20

<210> 227 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 227 ggtttccatc ttcctgg 17

<210> 228 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 228 ggtttccatc ttcctgc 17

<210> 229 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 229 ggcttccatc tccctgg 17

<210> 230 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 230 ggtttccatt tccctgg 17

<210> 231 <211> 87 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 231 aagafagggg ggcaactaaa ggaagcccia ttagaiaccg gagcagatga tacagtalta 60 gaagaaataa atttaccagg aagatgg 87

<210> 232 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 232 ggtttccatt ttcctgg 17

<210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 233 ggataaacag cagttgttgc 20

<210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 234 gaataaacag cagttgttgt 20

<210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 235 gaataaacag cagctgttgc 20

<210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 236 attctgctat gtcgacaccc 20

<210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 237 attctgctat gtcggcgccc 20

<210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 238 attctgctat gtcggcaccc 20

<210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 239 attctgctat gttgacaccc 20

<210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 240 ctccatttct tgctctcctc 20

<210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 241 ctccatttct tgctcttctc 20

<210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 242 cctgactcca atactgtagg 20

<210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 243 cctgactcca atactgcagg 20

<210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 244 cctgactcca atattgtagg 20

<210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 245 gcattgagca agctaacagc 20

<210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 246 gcattgagca agctaactgc 20

<210> 247 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 247 gcattgagca agttaacagc 20

<210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 248 gcattaagca aactaacagc 20

<210> 249 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 249 atagcaaagc cctttc 16

<210> 250 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 250 ccagtacagg caaaaagc 18

<210> 251 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 251 cagtacaggc gaaaagc 17

<210> 252 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 252 ccagtacagg caagaagc 18

<210> 253 <211> 13 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 253 gtcagcagtc ttt 13

<210> 254 <211> 13 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 254 gtcagcagtc tea 13

<210> 255 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 255 gaccacttgc caccc 15

<210> 256 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 256 gaccacttgc cactc 15

<210> 257 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 257 gaccacttgc ccccc 15

<210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 258 ccctgtctta ttcttctagg 20

<210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 259 ccctgtctta ttcttacagg 20

<210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 260 ccctgtctta ttcttgtagg 20

<210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 261 gcagttgtag gctgacttcc 20

<210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 262 gcagttgtag gctgactccc 20

<210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 263 gcagttgtag gctggcttcc 20

<210> 264 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 264 agcgaacaaa cagtagttgt tgcag 25

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<210> 268 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 268 agcgatcaaa cagtagttgt tgcag 25

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<210> 270 <211> 90 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 270 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttagcga acaaacagta gítgttgcaa 90

<210> 271 <211> 90 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 271 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 títttagcga tcaaacagca gttgttgcag 90

<210> 272 <211> 90 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 272 tttttttttt tttttttttt íttttttttt íttttttttt íttttttttt tttttttttt 60 títttagcga acaaacagta gttgttgaag 90

<210> 273 <211> 90 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 273 íttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttagcga tcaaacagta gttgttgcag 90

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<210> 279 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 279 agacagtggc aatgagagtg aggg 24

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<210> 282 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 282 ttaccctgtc ttattcgtgt ggg 23

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<210> 291 <211> 53 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 291 taatacgact cactataggg agaagacagt ggcaccacca tggagagtga agg 53

<210> 292 <211> 53 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 292 taatacgact cactataggg agaagacagt ggcaccacca tggagagtga egg 53

<210> 293 <211> 53 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 293 taatacgact cactataggg agaagacagt ggcaccacca tggagagtga ggg 53

<210> 294 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 294 tlttccttcc agtcccccct tttct 85

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<210> 296 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 296 tttttttgac cacttgccac coat 84

<210> 297 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 297 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt fttttttttt fttttttttt 60 tttttttgac cacttgcccc ccat 84

<210> 298 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 298 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttgac· cacttgttac ccat 84 <210> 299 <211> 84

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 299 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttittttgac eaetlgcctc ccat 84

<210> 300 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 300 aagacagcag tacaaatggc ag 22

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<210> 311 <211> 49 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 311 taatacgact cactataggg agaccaccat ggaaaacaga tggcagggg 49

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<210> 318 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 318 gcatttccta tggcaggaag aa 22

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<210> 328 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 328 gcacaataat gtatgggaat ggg 23

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<210> 330 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 330 taatacgact cactataggg agatcctcta tcaaagcagt gag 43

<210> 331 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 331 taatacgact cactataggg agatcctcta tcagagcagt aag 43

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<210> 334 <211> 86 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 334 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttm tttttttttt 60 ttttctgtgg gtaeacaggc atgcgt 86

<210> 335 <211> 86 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 335 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttctgtgg gtacacaagc atgtgt 86

<210> 336 <211> 86 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 336 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttltt tttttttttt 60 ttttctgtgg gtaeacaggc ttgtgt §6

<210> 337 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 337 aatgatgaca gcatgtc 17

<210> 338 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 338 aatgatgaca gcatgcc 17

<210> 339 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 339 aatgatggta gcctgtc 17

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<210> 343 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 343 aagggctgtt ggaagtgtgg 20

<210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 344 aaaggttgct ggaaatgtgg 20

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<210> 347 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 347 cctagtggga tgtgtatttc tga 23

<210> 348 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 348 cctagtggga tgtgcacttc tga 23

<210> 349 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 349 cctagtggga tatgtacttc tga 23

<210> 350 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 350 cctagtggga tgtatacacc tga 23

<210> 351 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 351 ccaagtattg tagagatcct acc 23

<210> 352 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 352 ccaagtattg tagagatctt acc 23

<210> 353 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 353 ccaagtattg tagagaccct acc 23

<210> 354 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 354 ccaagtattg tagggatcct acc 23

<210> 355 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 355 ccaagtattg tagtgtccct acc 23

<210> 356 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 356 taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc agggaatttc c 51

<210> 357 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 357 taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc agggaatttt c 51

<210> 358 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 358 taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc aggaaatttc c 51

<210> 359 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 359 taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc aggaaatttt c 51

<210> 360 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 360 taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc agggaatttc c 51

<210> 361 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 361 ttítfttttt íttttttttl ttt.ttttttí ttittifiií ttttttttít íttitttttt 60 ttfcícctagt gggatgtgta cttctga 87

<210> 362 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 362 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttectagt gggatgtgta cttccga 87

<210> 363 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 363 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatgtgta tttctga 87

<210> 364 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 364 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttcctagt gggatgtgca cttctga 87

<210> 365 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 365 tttttttttt tttttttttt ttttttttfct ttttittttt tttttttttt tttttttttt 60 tttteciagt gggatatgta cttctga B7

<210> 366 <211> 87 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 366 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 ttttectagt gggatgtata cacctga 87

<210> 367 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 367 aagaaggtgg agagcaagac 20

<210> 368 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 368 aagaaggtgg agagcaaggc 20

<210> 369 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 369 aagaaggtgg agagagagac 20

<210> 370 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 370 aagaaggtgg cgagcaagac 20

<210> 371 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 371 aagaaggtgg cgagcaaggc 20

<210> 372 <211> 10 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 372 agagtgatgg 10

<210> 373 <211> 10 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 373 agagtgaagg 10

<210> 374 <211> 9 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 374 agagtgacg 9

<210> 375 <211> 10 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 375 agagtgaggg 10

<210> 376 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 376 aaacagatgg caggtg 16

<210> 377 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 377 aaacagatgg caggta 16

<210> 378 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 378 aaacagatgg caggcg 16

<210> 379 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 379 aaacagatgg cagggg 16

<210> 380 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 380 tctatcaaag cagtaag 17

<210> 381 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 381 tctatcaaag cagtgag 17

<210> 382 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 382 tctatcagag cagtaag 17

<210> 383 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <4Ο0> 383 tctaccaaag cagtaag 17

<210> 384 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 384 ggaaggccag ggaatttcc 19

<210> 385 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 385 ggaaggccag ggaattttc 19

<210> 386 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 386 ggaaggccag ggaatttcc 19

<210> 387 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 387 ggaaggccag gaaattttc 19

<210> 388 <211> 9184 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 388 ggtctctctg gttagaccag atetgagccí gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc itgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 gtggcgcccg aacagggacc tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct cícgacgcag 240 gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtaegee 300 aaaaattttg actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa 360 gcgggggaga attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat 420 ataaatíaaa acataiagía tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg 480 gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc 540 agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc 600 aícaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa 660 acaaaagtaa gaaaaaagca cagcaageag cagctgaeae aggacacagc aatcaggíca 720 gccaaaatta ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatateac 780 ctagaaoítt 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aagtatactg catttaccat acetagtata aacaatgaga caccagggat 2520 tagaiatcag tacaatgtge ttccacaggg atggaaagga tcaccagcaa tattccaaag 2580 iagcatgaca aaaatcttag agccttttag aaaacaaaat eeagacatag ttatctatca 2640 atacatggat galttgtatg laggatdga cltagaaata gggcagcata gaacaaaaat 2700 agiaggagctg agacâlcâíc'^Ig^tgaggig’gggactScc acaccagaca aaaaacatca 2760 gaaagaaect ccattccttt ggatgggtta tgaactccat cctgataaat ggacagtaca 2S20 gcctatagtg ctgccagaaa aagacagctg gactgtcaat gacatacaga agttagtggg 2880 gaaattgaai tgggcaagtc agatttaccc agggattaaa gtaaggcaat tatgiaaact 2940 ccttagagga accaaagcac taacagaagt aataccacta acagaagaag cagagctaga 3000 actggcagaa aacagagaga ttctaaaaga accagtacat ggagtgtatt atgacccatc 3060 aaaagactta aiagcagaaa tacagaagca ggggcaaggc caatggacat atcaaattta 3120 tcaagagcea ttlaaaaato tgaaaacagg aaaatatgca agaatgaggg gtgcccacac 3180 taaigaigta aaacaattaa cagaggcagt goaaaaaata acca.ca.gaaa gcatagtaai 3240 atggggaaag actectaaat ttaaactgcc catacaaaag gaaacatggg aaacalggtg 3300 gacagagtat tggcaagcca cctggattcc tgagtgggag tttgttaata ccectcccit 3360 agtgaaatta tggtaccagt tagagaaaga acccatagta ggagcagaaa ccttctatgt 3420 agatggggca gctaacaggg agactaaatt aggaaaagca ggatatgfta ctaatagagg 3480 aagacaaaaa gttgicaece iaactgacac aacaaatcag aagactgagt tacaagcaat 3540 ttatctagct ttgcaggatt cgggattaga agtaaaca.ta gtaacagact cacaatatgc 3600 attaggaatc attcaagcac aaccagatca aagtgaatca gagttagtca atcaaataat 3660 agagcagtta ataaaaaagg aaaaggteta tctggcatgg gtaceagcac acaaaggaat 3720 tggaggaaat gaacaagtag ataaatiagt cagtgctgga atcaggaaag tactattttt 3780 agatggaata gataaggccc aagatgaaca igagaaatai cacagtaatt ggagagcaat 3840 ggctagtgat tttaacctgc cacctgtagt agcaaaagaa atagtagcca gcigtgataa 3900 atgtcageta aaaggagaag ccatgcatgg acaagtagac tgtagtccag gaatatggca 3960 actagaiigt acacatttag aaggaaaagt tatcctggto. gcagtteatg iagccagtgg 4020 aiatatagaa geagaagtta ttccagcaga aacagggcag gaaacagcat attttetttt 4080 aaaattagca ggaagatggc cagtaaaaac aatacatact gacaatggca gcaatttcac 4140 cggtgctacg 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tcaagcagga cataacaagg taggatctct acaatacitg gcactagcag 5040 cattaataac accaaaaaag ataaagccae ctttgcetag tgttacgaaa ctgacagagg 5100 atagatggaa caagceecag aagaccaagg gccacagagg gagccacaca atgaatggac 5160 actagagctt ttagaggagc ttaagaatga agctgttaga cattítecta ggatttggct 5220 ccatggctta gggcaacata tctatgaaac ttatggggat acttgggcag gagtggaagc 5280 cataataaga attctgcaac aactgctgtt tatccafttt cagaattggg tgtcgacata 5340 gcagaatagg cgttactcga cagaggagag caagaaatgg agccagtaga tcctagacta 5400 gagccctgga agcatccagg aagtcagcct aaaactgctt gtaccaattg ctattgtaaa 5460 aagtgttgct ticattgcca agfttgtttc ataacaaaag ccttaggcat ctcctatggc 5520 aggaagaagc ggagacagcg acgaagagct catcagaaca gtcagaetca tcaagcttct 5580 ctatcaaagc agtaagtagt acatgtaatg caacctatac caatagtagc aatagtagea 5640 ttagtagtag caataataat agcaatagtt gtgtggtcca tagteateat agaatatagg 5700 aaaatattaa gacaaagaaa aatagacagg ttaattgata gaciaataga aagagcagaa 5760 gacagtggca atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 5820 gggcaccatg ctccitggga tgttgaigal ctgtagtgct acagaaaaai tgtgggtcac 5880 agtctattat ggggtaccig tgtggaagga agcaaccacc actctatttt gtgcateaga 5940 tgutaaagca tatgatacag aggtacataa tgtttgggec acacatgcct gtgtacccac 6000 agaccccàac ccâcãagaag íagtattggt aaatgtgaca gaaaatttta acatgíggaa 6060 aaatgacaíg gtagaacaga tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa 6120 gecatgtgta aaattaaccc cactctgtgt tegtttaaag tgcactgatt tgaagaatga 61S0 tactaatacc aatagtagía gcgggagaat gataatggag aaaggagaga taaaaaacíg 6240 ctctttcaat atcagcacaa gcataagagg taaggtgcag aaagaalatg cattttttta 6300 iaaacttgat ataataccaa íagataatga tactaccagc tataagttga caagttgtaa 6360 cacctcagíc attacacagg ccígtccaaa ggtatccttt gagccaattc ccatacatta 6420 ítgtgccccg gctggttííg cgattctaaa atgtaataat aagacgtíca atggaacagg 6480 accafgtoea aatgtcagca cagtacaatg tacacatgga attaggccag tagtatcaac 6540 tcaacígetg ttaaatggca gtctagcaga agaagaggía gíaattagat cigtcaattt 6600 cacggacaat gctaaaaeca taatagtaca gctgaacaca tctgtagaaa ttaattgíac 6660 aagacccaac 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ctggctgtgg aaagataceí aaaggatcaa cagctcetgg ggatttgggg 7560 ítgctctgga aaactcattt gcaccaetgc tgtgccttgg aatgctagtí ggagíaataa 7620 atctctggaa cagatltgga atcacacgac ctggaíggag tgggacagag aaatíaacaa 76S0 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 7740 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acafaacaaa 7800 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 7800 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 7920 icagacccac ctoccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaaiag aagaagaagg 7980 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatccttgg cacttatctg 8040 ggacgatctg cggagcctgt gcctcttcag ctaccaccge ttgagagact tactcttgat 8100 tgtaacgagg attgtggaa.c ttctgggacg cagggggtgg gaagccctca aatattggtg 8160 gaaictccta cagtattgga gicaggaact aaagaatagt gctgttagct tgctcaatgc 8220 cacagccata gcagtagctg aggggacaga tagggttata gaagtagtac aaggagcttg 8280 iagagctatt cgccacaiac ctagaagaat aagacagggc tiggaaagga tttigctata 8340 agatgggtgg caagtggtca aaaagtagtg tgatiggatg gcctactgta agggaaagaa 8400 tgagacgagc tgagccagca gcagataggg tgggagcagc afctcgagac ctggaaaaao 8460 atggagcaat cacaagtagc aatacagcag ctaccaatgc tgcttgtgcc Iggctagaag 8520 cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag tcacacctca ggtaccttta agaccaatga 8580 cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc 8640 taattcacte ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct 8700 acttccetga ttagcagaae tacacaccag ggccaggggt cagatatcca ctgacctttg 8760 gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagaiaagat agaagaggcc aataaaggag 8820 agaacaccag citgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag 8880 tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcafca cgtggcccga gagctgcatc 8940 cggagtactt caagaactgc tgacatcgag cttgciacaa gggactitce gctggggact 9000 ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg gggagiggcg agccctcaga tcetgcatat 9060 aagcagctgc tttttgcctg tactgggtet ctctggttag aecagatctg agectgggag 9120 ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagigctt 9180 caaa 9184

<210> 389 <211> 9184 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <4Ο0> 389 gaagcactca aggcaagctt taitgaggct faagcagtgg gttecctagt tagccagaga 60 gctcccaggc teagatctgg tetaaccaga gagacccagt aeaggcaaaa agcagctgct 120

tatatgcagg atctgagggG tcgccactcc ccagteccge ccaggccacg cctecctgga 1 SO aagtccccag cggaaagtec cttgtagcaa gctcgaiglc agcagttc.it gaagtactcc 240 ggatgcagct ctcgggccac gtgatgaaat gctaggcggc tgtcaaacct ccactctaac 300 acttctotct ccgggtcatc catcccatge aggctcacag ggtgtaacaa gctggtgttc 360 fctcetttat tggcctcttc tatcttatct ggctcaactg gtactagctt gtagcaccat 420 ccaaaggtca gtggatatct gacccctggc cctggtgtgt agttctgcta atcagggaag 480 tagccttgtg tgtggtagat ccacagatca aggatatctt gtcttctttg ggagtgaatt 540 agcccttcca gtcccccctt ttcttttaaa aagtggctaa gatciacagc tgccitgtaa 600 gtcattggtc ttaaaggtac ctgaggtgtg actggaaaac ccacctcctc ctcctcttgt 660 gcttctagcc aggcacaagc agcattggta gctgctgtat tgctacttgt gattgctcca 720 tgtttttcca ggtetcgaga tgctgctccc accctatctg ctgctggctc agctcgtctc 780 attctttccc ttacagtagg ccatccaatc acactacttt ttgaccactt gccacccatc 840 ttatagcaaa atcctttcca agccctgtct tattettcta ggtatgtggc gaatagctct 900 acaagctcct tgtactactt ctataaccct atctgtcccc teagctacig ciatggctgt 960 ggcattgagc 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actggcctaa ttcaatgtgt acattgtací gtgctgacat ttgtacatgg 2700 tcctgttcca ttgaacgtct tattattaca ttttagaatc gcaaaaccag ccggggcaca 2760 ataatgíatg ggaattggcl: caaaggaíac cíttggacag gcctgtgtaa tgactgaggi 2820 gttacaactt gtcaacttat agctggtagt atcatíatct attggtatta tatcaagttt 28S0 ataaaaaaat gcatattctt tctgcaccít acctclíatg cttgtgctga tattgaaaga 2940 gcagtttirt atctctcctí tctocattat cattctcccg ctactactat tggtattagt 3000 atcattcttc aaatcagtgc actttaaact aacacagagí ggggtteatt ttacacatgg 3060 ctttaggctt tgatcccaía aactgattat atcctcatgc atctgttcta ccatgtcatt 3120 tttccacatg ttaaaatttt otgtcacatt taccaatact actícttgtg ggttggggtc 3180 tgtgggtaca caggcatgtg tggcccaaac atfatgtacc tctgtatcat atgctttagc 3240 atctgatgca caaaatagag tggtggttgc ttccttccae acaggtaccc cataatagac 3300 tgtgacccac aatttttctg tagcaciaca gatcaicaac atcccaaggagcatggtgcc 3360 ccatctccac ccccatctcc acaagtgctg aiatttctec tfcactctca (igccactgr 3420 cttctgctct ttctattagt ctatcaatta acctgtetat ttttetttgt cttaaiattt 3480 tcctatattc tatgattact atggaceaca caactattgc tattattatt gctactacta 3540 atgctactat tgctactatt ggtataggtt geattacatg tactacttac tgctttgata 3600 gagaagettg atgagtctga ctgttctgat gagctcttcg tegetgtetc cgcttcttcc 3660 tgccatagga gatgcctaag gcttitgtta tgaaacaaac ttggcaaiga aagcaacaci 3720 ttttaeaata gcaattggta eaageagttt taggctgact tcctggatgc ttccagggct 3780 ctagfctagg atctactggc tccatttett gctctcctct gtcgagtaac gcctattctg 3S40 ctatgtcgac acccaattct gaaaatggat aaacagcagt tgttgcagaa ttctiattai 3000 ggcttccact cetgcccaag tatccccata agtttcatag atatgttgcc ctaagccatg 3960 gagccaaatc ctaggaaaat gtctaacagc ttcattctta agcteetcta. aaagctctag 4020 tgfccaltca ttgtgtggct ccctctgigg cccttggict Ictggggctt gttccatefa 40S0 tcetetgtca gtttcgtaac actaggcaaa ggtggcttta tcttttttgg igitaitaat 4140 gctgetagtg ccaagtattg tagagatcci accitgttat gtcctgcttg atattcaeac 4200 ctagggctaa ctatgtgtcc taataaggcc tttcitatag cagagtctga aaaacagtca 4260 aagtaaíaca gatgaattag ttggtctgci agttcagggt ctacttgtgt gctatatetc 4320 tttttcctoc attctatgga gacteceiga cccaaatgcc agtctettic [cctgtatgc 4380 agaccccaat atgttgttat taccaatcta gcatccccta gígggatgíg tacíícígaa 4440 cttattcttg gatgagggct ttcatagtga tgtetataaa accatcccct agctttccct 4500 gaaacaiaca tatggtgttt tactaaactt ttccatgttc taatectcai cctgtctact 4560 tgccacacaa tcateacctg ccatctgfti tccataafcc ctaatgatct ttgcttttct 4620 tcttggcact actttiatgt caetattatc ttgiattact actgcccctt cacctttcca 4680 gaggagcftt gctggtactt tccaaagtgg atttctgctg tcccfgtaat aaacccgaaa 4740 attttgaatt tttgtaattt gtttttgtaa ttetttagtt tgtatgtctg ttgctattat 4800 gícíacíatí cíítcccetg cactgtaccc cccaatcccc ccttttcttt iaaaattgfg 4860 gaígaaiací gccatttgta ctgctgíctt aagaígttca gcctgatetc tiacctglcc 4920 tataattttc ttíaattctt tattcataga ttctacíact ccttgacttt ggggattgta 4980 gggaattcca aattectgct tgattccegc ccaccaacag gcggccctaa ccgiagcacc 5040 ggtgaaattg ctgccattgt cagtatgtat tgtttttact ggccatcttc ctgctaattt 5100 taaaagaaaa tatgctgttt cctgccctgt ttctgctgga ataacttctg cttcíatata 5160 tccaclggct acatgaactg ctaccaggat aactttícct tctaaatgtg tacaatctag 5220 ttgccatatt cctggactac agtc.tacttg tccatgcatg gcttctcctt ttagctgaca 5280 tttatcaeag ctggctacta tttcttttgc tactacaggt ggcaggttaa aateactagc 5340 cattgctcic caattactgí gatatttctc atgttcatct tgggcctíai ctattccate 5400 taaaaatagt actttcctga ttccagcact gactaatíta tctacttgtt catttcctcc 5460 aattcetttg tgtgctggta cccatgccag atagacctit tccttfttia ttaactgctc 5520 tatíatttga tígactaact cigattcact ttgatctggt tgtgcítgaa tgattcctaa 5580 tgcataítgt gagtctgtta etatgtttac ttctaaíccc gaatcctgca aagctagata 5640 aaltgcttgt aactcagtcí tctgaíttgt tgígtcagit agggtgacaa ctttttgtct 5700 tectctatta gtaacatatc ctgcttttcc taatttagtc tccctgttag ctgccccatc 5760 tacatagaag gtttctgctc ctactatggg tíctttctct aactggtacc alaatttcac 5820 taagggaggg gtattaacaa actcccactc aggaatccag gtggcítgcc aatactctgt 5880 ccaceatgtt tcccatgttt cctlttgtat gggcagttta aatttaggag tctttcccca 5940 tatíactaig ctttctgtgg ttaíttttfg cactgcctct gttaattgct ttacatcatí 6000 agtgtgggea cccctcattc ttgcatattt tcctgttttc agaítítíaa atggcíctíg 6060 ataaatttga tatgíccatt ggccítgccc ctgcttctgt aíttctgcta ttaagtettt 6120 tgatgggtca taaíacactc catgíactgg tfcttttaga atctctctgt íttctgccag 61S0 ttcfagctcl gcticttctg ttagtggtat tacttctgtt agtgctttgg ttcetetaag 6240 gagtttacat aaítgcctta ctttaatcec tgggtaaatc tgacttgccc aatícaattt 6300 ccccactaac ílctgtatgt cattgacagt ccagcígtcí ttttctggca gcactatagg 6360 ctgtacígtc catttatcag gatggagttc araacccatc caaaggaaíg gaggttcttt 6420 ctgatgtttt ttgtctggtg tggtaagtcc ccacctcaac agafgttgfc tcagctcctc 6480 tatttttgtt ctatgctgcc ctatttctaa gtcagatcct acatacaaat catccaigia 6540 ttgatagata actatgtctg gattttgttt tetaaaaggc tctaagattt ttgtcatget 6600 actttggaat attgctggtg atcctttcca tecctgtgga agcacattgt actgataict 6660 aatccctggt gtctcattgt ttatactagg tatggtaaat gcagtatact tcctgaagtc 6720 ttcatctaag ggaactgaaa aatatgcatc acccacatcc agtaetgtta ctgatitttt 6780 cttttttaac cctgcgggat gtggtattcc taattgaact tcccagaagt cttgagttct 6840 cttattaagt totctgaaat ctactaattt tctccattta gtactgtctt ttttctttat 6900 ggcaaatact ggagtattgt atggattttc aggoccaatt ttigaaattt tcccttcctt 6960 ttccatetct gtacaaattt ctactaatgc ttttattttt tcttctgtca atggccattg 7020 tttaaclttt gggccateca ttcctggctt teattttact ggtacagtet eaatagggct 7080 aatgggaaaa ttiaaagtgc aaccaatctg agtcaacaga tttcttccaa ttatgttgac 7140 aggtgtaggt cctactaaia ctgtacetat agctttatgt ccacagattt ctatgagtat 7200 ctgatcatac tgtcttactt tgataaaacc tccaattccc cctatcattt ttggtttcca 7260 tcttcctggc aaactcattt cttctaatac tgtatcatct gcicctgiat ctaatagagc 7320 Ucctttagt tgcccccota tctttattgt gacgaggggt cgttgecaaa gagtgacctg 7380 agggaaglia aaggatacag ttccttgtct atcggctcct gcttctgagg gggagttgtt 7440 gtctciaccc cagacctgaa gctetcttet ggtggggetg ttggctctgg tctgctotga 7500 agaaaattcc ctggeettcc cttgtaggaa ggccagatct tccciaaaaa attagcetgi 7560 ctcteagtac aatctttcat ttggtgtcct tcctttccac atttccaaca gccctttttc 7620 ctaggggccc tgcaattfct ggctgtgtgc ccttetttgc cacaattgaa acacttaaca 7680 atctttettt ggticciaaa attgectctc tgcatcatta tggtagctga atttgttact 7740 tggctcattg cttaagceaa aactcttgcc ttatggccgg gtcctCGtac tccctgacat 7800 gcSglcatca tttcttctag tgtagccgct ggtcccaatg cttttaaaat agtcttacaa 7860 tctgggtteg cattttggac caacaaggti tctgtcatac aatttittac ctcctgtgaa 7920 gcltgdcgg ctcttagagt tttatagaac cggtctacat agtctetaaa gggttccttt 7980 ggtccttgtc ttatgtecag aatgctggta gggctataca ttcttactat tttatttaat 8040 cc caggatta tccatctttt ataaatttct cctaciggga taggtggatt atttgtcatc 8100 eatcctaitt gttcctgaag ggtactagta gttcctgcta tgtcacttee ccttggttct 8160 ctcaíctggc ctggtgcaat aggcccígca tgcactggat gcacícfatc ccattcígca 8220 gcttcctcaí ígatggtctc ttttaacatt ígGatggctg cítgaígtcc ccccactgtg 8280 tttagcaígg ígtltaaatc ttgíggggtg gctccttctg ataatgctga aaacatgggt 8340 atcacttctg ggctgaaagc cttcícttct actactttía cccaígcatt taaagttcia 8400 ggígaiatgg cctgatgtac catttgcccc íggatgttet gcactatagg gtaatttígg 8460 ctgacctgat tgcígtgtcc tgígtcagct gcígctígct gtgctttttt cttacttttg 8520 ttttgcíctt cctetatctt gtctaaagct tccttggtgt ctítíatctc tatectttga 8580 tgcacacaat agagggttgc tactgtatta tataatgatc taagttcttc tgatcctgic 8640 tgaagggatg gttgíagctg tcccagtatt tgtctacagc cttctgatgt ttctaacagg 8700 ccaggattaa cígcgaatcg ttctagctcc ctgcttgccc atactatatg ttttaattta 8760 tattttttct tíccccctgg ccttaaccga aítttttecc atcgatctaa ttctcccccg 8820 cttaatactg acgctcícgc acccatctct ctccttctag cctocgctag teaaaatttt 8880 tggcgtactc accagícgcc gcccctcgcc tcttgccgtg cgcgcltcag caagccgagt 8940 cctgcgtcga gagagctcct ctggtttccc tttcgcttte aggtecctgt tcgggcgcca 9000 ctgctagaga ttttccacac tgactaaaag ggtctgaggg atctctagtt aceagagtca 9060 cacaacagac gggcacacac tacttgaagc actcaaggca agctttattg aggcttaagc 9120 agtgggttcc ctagttagcc agagagctcc caggctcaga tctggtctaa ccagagagac 9 í80 ccct 9184

<210> 390 <211> 87 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 390 aaaataggag gacaactgaa agaagctcta ttagatacag gagcagaíga. tacagtatta 60 gaagatataa atttgccagg gaaatgg 87

<210> 391 <211> 87 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 391 aaagtaggag gacagctaaa agaagctcta ttagacacag gagcagatga tacagtatta 60 gaagacataa atttgccagg aaaatgg 87

<210> 392 <211> 87 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 392 aagatagggg ggcaactaaa ggaagctcta ttagalacag gagcagatga tacagtatta 60 gaagaaatga gittgccagg aagatgg 87

<210> 393 <211> 185 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de Consenso <400> 393 tycttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatftct tcagagcaga ccagagccaa 60 cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactecc cctcagaagc 120 aggagccgat agacaaggax mtgtatcctt trrcttccct cagatcaeto tttggcaacg 180 acccc 185

<210> 394 <211> 185 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 394 ttcttcagag eagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa 60 cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactecc ccicagaagc 120 aggagccgat agacaaggag atgtatcctt tggcttecct cagateactc tttggcaacg 180 acccc 185

<210> 395 <211> 185 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 395 ttcttcagag eagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa 60 cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc 120 aggagccgat agacaaggaa ctgtatcett taacttccct cagatcactc tttggcaacg 180 acccc 185

<210> 396 <211> 149 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 396 tcctteagag cagaccagag ccaacagccc caccagcaga gagcttcagg tttggggaag 60 aggtaacaac tccctctcag aaacaggage cgatagacaa ggagatgtat cctitggcit 120 ccetcagatc actctitggc aacgacccc 149

<210> 397 <211> 149 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 397 tcctteagag cagaccagag ccaacagccc caccagaaga gagcttcagg tciggggtag 60 agacaacaac kcccctcag aâgcaggagc cgatagacaa ggaactgtat cdttaactt 120 ccetcagatc actctitggc aacgacccc 149

<210> 398 <211> 100 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 398 ttagataaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa agacacagca ageageaget 60 gacacaggaa acagcagcaa gcaggtcagc caaaattacc 100

<210> 399 <211> 100 <212> DNA <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 399 atggacccac cfcccaaccc cgagggaacc cgacaggccc gaaggaateg aagaagaagg 60 tggagagaga gacagagaca catecggaag atfagtggat 100

<210> 400 <211> 180 <212> DNA <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 400 gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ticccaggcc atggcttcat 60 ggattggggc agcatatcta tgaaacttat ggggatactt ggacaggagt ggaagccata 120 ataagaattc tgeaacaact gctgtttetc catttcagaa ttgggtgtcg acatagcaga 180

<210> 401 <211> 96 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 401

Met Gin Gin Ala Pro Glu Asp Gin Giy Pro Gin Arg Glu Pro His Asn 15 10 15

Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu Gin Leu Lys Asn Glu Ala Val Arg 20 25 30

His Pile Pro Arg lie Trp Leu His Gly Leu Gly Gin His He Tyr Gin 35 40 45

Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala Gly Val Gin Ala He He Arg He Leu 50 55 60

Gin Gin Leu Leu Phe He His Phe Arg lie Gly Cys Arg His Ser Arg 65 70 75 80 lie Gly Val Thr Arg Gin Arg Arg Ala Arg Asn Gly Ala Ser Arg Ser 85 90 95

<210> 402 <211> 40 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 402 GIu Leu Leu G!u Glu Leu Lys Asn Glu Ala Val Aig His Phe Pro Arg IS 10 15

Pro Trp Leu His Gly Leu Gly Gin His He Tyr Glu Thr Tyr Gly Asp 20 25 30

Thr Tip Thr Gly Val Glu Ala lie 35 40

<210> 403 <211> 21 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 403

Lys He Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His 1 5 10 15

Be Val Tip Ala Ser '“20

<210> 404 <211> 21 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana <400> 404

Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly Gly Arg Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His 15 10 15 lie Val Tip Ala Ser 20

<210> 405 <211> 18 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana <4Ο0> 405

Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Tltr Vai Ala Thr Leu 15 10 15

TyrCys

<210> 406 <211> 18 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 406

Thr Gly Ser Glu Glu Phe Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Vai Ala Thr Leu 15 10 15

Tyr Cys

<210> 407 <211> 1816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 407 cttctctgcc agaagatacc atttcaactt taacacagca tgaícgaaac atacaaccaa 60 acttctcccc gatetgcgge caetggactg eecateagca ígaaaatttt tatgtattta 120 cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcaí 180 agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aaícttcatg aagattttgt attcatgaaa 240 acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatcct tactgaactg tgaggagaít 300 aaaagccagt ttgaaggctí tgtgaaggat ataatgttaà acaaagagga gac gaagaaa 360 gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat cagaatcctc aaattgeggc acatgteata 420 agtgaggcea gcagtaaaac aacatctgtg tiacagigag ctgaaaaagg atactacacc 4S0 atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga 540 ctctattata tctatgccca agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagcl 600 ccatttaiag ccagcctctg cctaaagtec cccggtagat tcgagagaat cttacteaga 660 gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct tgcgggcaac aatccattca cttgggagga 720 gtatttgaat tgcaaccagg tgctteggtg ttlgtcaalg tgactgatcc aagccaagtg 780 agccatggea ctggcttcae gtcctttggc ttacteaaac tctgaacagt gtcaccttgc 840 aBgctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcacagcggt taagcccacc 900 ccctgttaac tgcctaitta taaccctagg atcctcctta tggagaacta tttattatac 960 acteeaaggc atgtagaact gtaataagtg aartacaggt cacatgaaac caaaaegggc 1020 cctgctccat aagagcttat atatctgaag cagcaacccc actgatgcag acatceagag 1080 agicctatga aaagacaagg ccattatgca caggttgaat tctgagtaaa cagcagataa 1140 cttgccaagt tcagttttgt ttcttigcgt gcagtgtctt tccatggata atgcatttga 1200 tttatcagtg aagatgcaga agggaaatgg ggagcctcag ctcacatíca gttaíggttg 1260 actetgggtt cciatggcct tgttggaggg ggccaggctc tagaacgtct aacacagtgg 1320 agaacogaaa cccccccccc cccccccgcc accctctcgg acagttattc attctcttte 13S0 aatctctctc tctccatctc tctetttcag tctctctctc tcaacctctt tettccaatc 1440 tctctttctc aatctctctg tttccctttg tcagtctett ccctccccca gtctctcttc 1500 toaatccccc tttctaacac acacacacac acacacacac aeacacacac acacacacac 1560 acacacacac acacacacac agagtcagge cgttgctagt cagtictcit ciitccaccc 1620 tgtccctatc tctaccacta tagatgaggg tgaggagtag ggagtgcagc cctgagcctg 1680 cccactcctc attacgaaat gactgiattt aaaggaaatc tattgtatct acctgcagtc 1740 tccattgttt ccagagtgaa cttgtaaita tcttgttatt tatiitttga ataataaaga 1800 cctcttaaca ttaaaa 1816 <210> 408 <211> 261

<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 408

Met Be Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 15 10 15

Leu Pro lie Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30

Be Thr Gin Met He Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60

Phe Met Lys Thr He Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu He Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95

Asp He Met Leu Asn Lyre Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asu Ser Phe Glu 100 105 110

Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin He Ala Ala His Val lie Ser 115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trp Ak Glu Lys Gly 130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ala Gin Val Thr 165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe He Ala Ser 180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Tie Leu Leu Arg Ala 195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lvs Pro Cys Gly Gin Gin Ser He His 210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Ghi Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Glu Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu 260

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula dendrítica isolada que compreende uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes num sujeito individual, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV, e que compreende adicionalmente mRNA transcrito in vitro de CD40L.
2. Célula dendrítica de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos mRNAs são derivados de amplificação de ácido nucleico de polinucleótidos do HIV para produzir DNA do HIV amplificado e transcrição do DNA amplificado para produzir mRNA transcrito in vitro.
3. Célula dendrítica de acordo com a reivindicação 2, em que os referidos polinucleótidos do HIV são amplificados utilizando iniciadores concebidos para compensar a variabilidade de sequências entre múltiplas estirpes do HIV, em que os referidos iniciadores são selecionados das SEQ ID NO:s 1-371.
4. Célula dendrítica de acordo com a reivindicação 2, em que os referidos polinucleótidos do HIV são amplificados utilizando um iniciador direto que compreende uma porção 5' e uma porção 3', em que a porção 5' compreende um promotor e uma sequência de Kozak otimizada e a porção 3' compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO:s 206-218 e 372- 387.
5. Célula dendrítica de acordo com a reivindicação de qualquer reivindicação precedente, em que os referidos polipéptidos do HIV compreendem dois ou mais do grupo que consiste em: polipéptidos de gag, polipéptidos de rev, polipéptidos de vpr, polipéptidos de env, polipéptidos de nef, polipéptidos de vpu, polipéptidos de vif, polipéptidos de pol.
6. Célula dendrítica de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a referida APC provém ou é derivada do referido sujeito.
7. Vacina que compreende a célula dendrítica de acordo com qualquer reivindicação precedente e um transportador farmaceuticamente aceitável.
8. Vacina de acordo com a reivindicação 7 para utilização no tratamento de um paciente infetado com o HIV.
9. Método de preparação de uma vacina autóloga, que compreende: transfetar células dendríticas obtidas ou derivadas de um indivíduo infetado com o HIV com mRNA de CD40L e uma pluralidade de mRNAs transcritos in vitro, em que cada um codifica uma variante alélica de um polipéptido de múltiplas estirpes do HIV presentes no referido indivíduo, em que a referida pluralidade de mRNAs codifica múltiplas variantes alélicas do referido polipéptido e não codifica o genoma completo do HIV.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que os referidos mRNAs são derivados por amplificação de ácido nucleico de polinucleótidos do HIV utilizando uma pluralidade de pares de iniciadores concebidos para compensar a variabilidade entre múltiplas estirpes do HIV, em que os referidos iniciadores são selecionados das ID NO:s 1-371.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que os referidos polinucleótidos do HIV são amplificados utilizando um iniciador direto que compreende uma porção 5' e uma porção 3 ' , em que a porção 5' compreende um promotor e uma sequência de Kozak otimizada e a porção 3' compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas ID NO:s 206-218 e 372-387 .
12. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida célula dendritica é uma célula dendritica imatura.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, que compreende adicionalmente amadurecer a referida célula dendritica imatura subsequentemente a transfeção.
14. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida célula dendritica é uma célula dendritica madura.
15. Célula dendritica isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 6 para utilização no tratamento de um paciente infetado com o HIV.
16. Célula dendritica isolada para utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a referida célula se destina a utilização como vacina.