BRPI9913893B1 - Identificação dos microrganismos responsáveis por infecções agudas do trato respiratório (ari) - Google Patents

Description

"IDENTIFICAÇÃO DOS MICROORGANISMOS RESPONSÁVEIS POR INFECÇÕES AGUDAS DO TRATO RESPIRATÓRIO (ARI)" A presente invenção está relacionada com o campo de detecção de microorganismos, mais particularmente a detecção de infecções agudas do trato respiratório.

Infecções agudas do trato respiratório (ARIs) são a causa mais comum de morbidade e mortalidade infantil no mundo, responsáveis por cerca de 30% das mortes infantis nos países em desenvolvimento (Hinman e col., 1998). Enquanto raramente é a causa de morte em países industrializados, ARIs são responsáveis por custos enormes diretos e indiretos com saúde (Garenne e col., 1992; UNICEF, 1993; Dixon, 1985). Os agentes causadores de ARIs abrangem cercam uma grande variedade de microrganismos. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza e Moraxella caterrhalis (Barlett e Mundy, 1995) são as bactérias encontradas mais comuns. Como comensais do trato respiratório superior, geralmente contaminam amostras de escarro, aspirados naso-faríngeos ou swabs e deste modo o papel etiológico delas nas ARIs é difícil de ser comprovado por amostragem no trato respiratório superior, a menos que técnicas invasivas sejam utilizadas (punção pulmonar) (Trolfors e Claesson, 1997; Nohynek e col.; 1995).

Ao contrário destas bactérias, a detecção de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae e também a detecção de vírus em uma criança com sintomas respiratórios é usualmente considerada como evidência de infecção aguda. Métodos atuais para identificar estes agentes incluem cultura de células, ensaios de detecção rápida de antígenos, sorologia (indiretamente) e recentemente PCR (Trolfors e Claesson, 1997; Saikku, 1997). Técnicas de cultura de células requerem laboratórios especializados, são caras, consomem muito tempo e são muito trabalhosas. Ensaios rápidos de antígenos estão disponíveis somente para alguns microrganismos (influenza A e RSV na maior parte dos países). A sorologia geralmente requer documentação de um aumento da concentração de anticorpos de uma amostra de sangue aguda para uma amostra de sangue convalescente e dessa forma os resultados dos testes são obtidos muito tarde para serem de relevância para o tratamento de doença aguda. Enquanto comumente nenhum método rápido para o diagnóstico microbiológico de ARI está disponível para o uso de rotina, a disponibilidade de tal teste podería resultar em terapias de antibiótico adaptada, resultando em custos reduzidos, menos efeitos, colaterais assim como em uma redução no deenvolvimento de resistência (Woo e col., 1997). Técnicas de ampliação de ácido nucléico comumente disponíveis tais como PCR (Saiki e col., 1998) e RT-PCR são técnicas altamente sensíveis para a detecção de seqüências de ácido nucléico de vírus e bactérias em amostras clínicas (Saiki, 1990; Kawasaki, 1990). Estas técnicas de ampliação são particularmente vantajosas para detectar organismos fastidiosos ou "difícil de ser obtida uma cultura" tais como o vírus sincicial respiratório (Paton e col., 1992) ou M. pneumoniae (Van Kuppeveld e col., 1992).

Estudos prévios utilizando PCR e RT-PCR para o diagnóstico de ARIs se concentraram na detecção de um vírus bacteriano simples; contudo a utilidade diagnostica das técnicas de ampliação do ácido nucléico para um agente infeccioso simples é limitada pela incapacidade de se estabelecer uma etiologia específica sempre que o resultado for negativo e pela incapacidade de documentar infecções simultâneas envolvendo mais de um organismo infeccioso.

Ensaios PCR-multiplex publicados para a detecção simultânea de patógenos (Hassan-King e col., 1996, 1998; Messmer e col., 1997) e painel RT-PCR-multiplex para amostras respiratórias conforme descrito por Gilbert e col. (1996) possui a desvantagem de condições de ensaios diferentes e diferentes consumo de tempo para cada organismo detectado e o uso de vários tubos para uma amostra, desta forma aumentando o risco de contaminação cruzada. A nossa estratégia para superar estas limitações foi a de utilizar um protocolo RT-PCR-multiplex que permita a detecção simultânea de patógenos respiratórios em um dia de trabalho incluindo RNA-vírus (enterovírus, vírus influenza A e B, parainf luenzavírus tipo 1 e 3, vírus sincicial respiratório), um DNA-vírus (adenovírus) e bactéria (C. pneumoniae, M. pneumoniae) que normalmente não colonizam o trato respiratório superior de crianças. 0 propósito da presente invenção é o de fornecer métodos e kits para detectar infecções agudas do trato respiratório.

Mais particularmente é um propósito da presente invenção fornecer um método PCR multiplex e kit para detecção de infecções agudas do trato respiratório . É também um propósito da invenção fornecer primers e sondas úteis para detectar infecções agudas do trato respiratório.

Mais particularmente a presente invenção está relacionada com um método para detecção de infecção aguda do trato respiratório compreendendo a ampliação de várias seqüências de nucleotídeos alvo presentes em uma seqüência biológica através de uma mistura de primer compreendendo no mínimo um conjunto de primer obtido a partir de cada uma das seguintes regiões de genes: a sub-unidade F1 do gene de glicoproteína de fusão para RSV, o gene de hemaglutinineuraminidase para PIV-1, a região 5 não codificadora do gene da proteína de fusão PIV-3, a seqüência 16S rRNA para M. pneumoniae, a seqüência 16S rRNA para C. pneumoniae, a região 5 não codificada para enterovírus, o gene da proteína não estrutural do influenza A, - o gene da proteína não estrutural do influenza B, e, o gene de hexon para adenovírus.

Este método RT-PCR multiplex é particularmente preferido porque permite determinar a presença dos seguintes microrganismos que infectam o trato respiratório de crianças em uma etapa de ampliação: RSV, vírus parainfluenza, M. pneumoniae, C. pneumoniae, enterovírus, influenza A e B e adenovírus.

De acordo com uma modalidade alternativa, a presente invenção também está relacionada com um método conforme definido acima, onde o vírus parainfluenza humano, influenza A e B, RSV e no mínimo um dos seguintes microrganismos são detectados através de um RT-PCR multiplex utilizando pares de primer das regiões especificadas acima: M. pneumoniae, C. pneumoniae, enterovírus ou adenovírus.

De acordo com uma modalidade alternativa, a presente invenção também está relacionada com um método conforme definido acima no qual o vírus parainfluenza humano, influenza A e B, RSV e no mínimo um dos seguintes microrganismos são detectados através de RT-PCR utilizando pares de primer das regiões especificadas acima: M. pneumoniae, C. pneumoniae, enterovórus ou adenovírus.

De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção está relacionada com um método conforme definido acima onde os citados primers 16 S rRNA são substituídos por primers da região espaçadora entre as seqüências 16S e 23S rRNA.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um método, conforme definido acima, onde além disso, no mínimo, um par de primers para a detecção específica de B. pertussis e B. parapertussis são utilizados, com os citados primers sendo preferencialmente da região espaçadora entre as seqüências 16S e 23S rRNA.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um método, conforme definido acima, onde os citados primers são selecionados da Tabela 2 ou Tabela 4.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um método, conforme definido acima, onde os citados produtos ampliados são subsequentemente detectados utilizando uma sonda, com a citada sonda sendo preferencialmente selecionada da Tabela 3, Tabela 4 ou Tabela 5.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um primer escolhido da Tabela 2 ou Tabela 4. A presente invenção também está relacionada com o uso de tal primer em um método como definido acima. A invenção também está relacionada com um método para preparar um primer de acordo com a invenção.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com uma sonda escolhida da Tabela 3, Tabela 4 ou Tabela 5. A presente invenção está relacionada com o uso de tal sonda em um método conforme definido acima. A invenção está também relacionada com um método para preparar uma sonda de acordo com a invenção. Os primers e sondas da invenção podem ser variados conforme especificado abaixo.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um kit para a detecção de infecção aguda do trato respiratório compreendendo um conjunto de primers, conforme definido acima, para realizar um método conforme definido acima. Além dos citados primers, tal kit pode conter também sondas assim como os tampões necessários para alcançar a ampliação e possíveis reações de hibridização assim como um kit de inserção. A presente invenção está relacionada também com um kit, conforme definido acima, contendo no mínimo uma das sondas conforme definida acima.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um kit para a detecção de infecção aguda do trato respiratório compreendendo um conjunto de sondas para realizar um método, conforme definido acima. Além das ditas sondas, tal kit pode conter também primers assim como os tampões necessários para alcançar a hibridização e as possíveis reações de ampliação assim como um kit de inserção. A presente invenção também está relacionada com um kit, conforme definido acima, contendo no mínimo um dos primers como definido acima.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção está relacionada com um kit, conforme definido acima, onde as citadas sondas são aplicadas como linhas paralelas em um suporte sólido, preferencialmente em uma membrana de nylon, preferencialmente um kit LiPA (ver a seção de exemplos e abaixo). Técnicas diferentes podem ser aplicadas para realizar os métodos da presente invenção. Estas técnicas podem compreender a imobilização dos ácidos nucléicos alvo, após ampliação, em um suporte sólido e realizar a hibridização com sondas de oligonucleotídeos marcados. Alternativamente, as sondas podem ser imobilizadas em um suporte sólido e a hibridização pode ser realizada com ácidos polinucléicos alvo marcados, possivelmente após ampliação. Esta técnica é denominada hibridização reversa. Uma técnica conveniente de hibridização reversa é o ensaio de sondas de linha (LiPA, Innogenetics, Bélgica). Este ensaio utiliza sondas com oligonucleotídeos imobilizados como linhas paralelas em uma tira de suporte sólido. Alternativamente, as sondas podem estar presentes em um formato de arranjo ou micro-arranjo. As sondas podem ser marcadas neste arranjo ou sintetizadas "in situ" no arranjo (Lockhart e col., 1996) em localizações distintas. Conclui-se que qualquer outra técnica para detecção das sequências alvo co-ampliadas supra-mencionadas também são cobertas pela presente invenção. Tal técnica pode envolver sequenciamento ou outros métodos de arranjo conhecidos na área.

As seguintes definições e explicações vão permitir uma compreensão melhor da presente invenção. O material alvo nas amostras a serem analisadas pode ser tanto DNA como RNA, por exemplo DNA genômico, RNA mensageiro ou versões ampliadas. Estas moléculas são nessa aplicação também denominadas "ácidos polinucléicos".

Procedimentos bem conhecidos de extração e purificação estão disponíveis para o isolamento de RNA ou DNA de uma amostra (por exemplo, em Sambrook e col., 1989). O termo "sonda" de acordo com a presente invenção se refere a um oligonucleotídeo de fita única que está designado para hibridizar especificamente para os ácidos polinucléicos alvo. Preferencialmente, as sondas da invenção apresentam cerca de 5 a 50 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente de cerca de 10 a 25 nucleotídeos. Particularmente os comprimentos de sondas de preferência incluem 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos. Os nucleotídeos conforme utilizados na presente invenção podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e nucleotídeos modificados tais como inosina ou nucleotídeos contendo grupos modificados que não alteram essencialmente as suas características de hibridização. 0 termo "primer" se refere à uma seqüência de oligonucleotídeos de fita única capaz de atuar como um ponto de iniciação para a síntese de um produto de extensão do primer que é complementar para a fita de ácido nucléico a ser copiada. O comprimento e a seqüência do primer deve ser tal que permita iniciar a síntese dos produtos de extensão. Preferencialmente o primer é de cerca de 5-50 nucleotídeos de comprimento. A seqüência e comprimento específico irão depender da complexidade do DNA e RNA alvos necessários, assim como das condições nas quais o primer é utilizado, tais como temperatura e força iônica. Conclui-se que os primers da presente invenção podem ser utilizados como sondas e vice-versa, desde que as condições experimentais sejam adaptadas. A expressão "par de primer adequadq" nesta invenção se refere ao par de primers que permite a ampliação específica de um fragmento de ácido polinucléico alvo específico. O termo "região alvo" de uma sonda ou de um primer de acordo com a presente invenção é uma seqüência dentro dos ácidos polinucléicos a serem detectados para os quais a sonda ou o primer é completamente complementar ou parcialmente complementar (isto é, com algum grau de não pareamento). Conclui-se que o complemento da citada seqüência alvo é também uma seqüência alvo adequada em alguns casos. "Hibridização específica" de uma sonda para uma região alvo de um ácido polinucléico significa que a citada sonda forma uma dupla com parte desta região ou com a região inteira sob as condições experimentais utilizadas, e que sob essas condições a citada sonda não forma uma dupla com outras regiões dos ácidos polinucléicos presentes na amostra a ser analisada. "Hibridização específica" de um primer para uma região alvo de um ácido polinucléico significa que durante a etapa de ampliação, o citado primer forma uma dupla com parte desta região ou com a região completa sob as condições experimentais utilizadas, e que sob estas condições o citado primer não forma uma dupla com outras regiões dos ácidos polinucléicos presentes na amostra a ser analisada. Conclui-se que "dupla" conforme utilizado, significa uma dupla que conduzirá à ampliação específica. 0 fato dos primers de ampliação não terem de combinar exatamente com a seqüência alvo correspondente no modelo para garantir a ampliação apropriada é amplamente documentado na literatura (Kwok e col., 1990). Contudo, quando os primers não estão completamente complementados à sua seqüência alvo, deve-se considerar que os fragmentos ampliados irão possuir a sequência dos primers e não a sequência alvo. Primers podem ser rotulados com um rótulo de escolha (por exemplo, biotina). O método de ampliação utilizado pode ser tanto reação em cadeia de polimerase (PCR, Saiki e col., 1988), reação em cadeia de ligase (LCR;

Landgren e col., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), ampliação com base na seqüência de ácido nucléico (NASBA; Guatelli e col., 1990; Compton, 1991), sistema de ampliação com base na transcrição (TAS; Kwoh e col., 1989), ampliação de substituição de fita (SDA; Duck, 1990) ou ampliação através de Q replicase (Lomeli e col., 1989) ou qualquer outro método adequado para ampliar moléculas de ácido nucléico conhecidas na área.

Seqüências de sonda e primer são representadas por toda a especificação como oligonucleotídeos DNA de fita única da extremidade 5' à extremidade 3' . É óbvio para o especialista da área que, qualquer das sondas especificadas abaixo podem ser utilizadas como tal, ou na sua forma complementar, ou na sua forma de RNA (onde T é substituído por U).

As sondas, de acordo com a invenção, podem ser preparadas pela clonagem de plasmídeos recombinantes contendo inserções que incluem as seqüências de nucleotídeos correspondentes, se necessário, pela excisão do ultimo dos plasmídeos clonados pelo uso de nucleases adequadas e recuperando-as, por exemplo, pelo fracionamento de acordo cora o peso molecular. As sondas, de acordo com a presente invenção, podem ser sintetizadas quimicamente, por exemplo, pelo método fosfo-triester convencional.

Os oligonucleotídeos utilizados como primers ou sondas podem incluir também análogos de nucleotideo tais como fosforotiatos (Matsukura e col., 1987), alquilfosforotiatos (Miller e col., 1979) ou ácidos nucléicos peptídeo (Nielsen e col., 1991, 1993) ou podem conter agentes interpostos (Asseline e col. ,1984). Como a maioria das variações ou modificações introduzidas nas seqüências de DNA originais da invenção, estas variações irão precisar de adaptações com relação às condições sob as quais os oligonucleotídeos devem ser utilizados para obter a especificidade e sensibilidade necessária. Contudo os resultados de hibridização eventuais serão essencialmente os mesmos que os obtidos com os oligonucleotídeos não modificados. A introdução destas modificações pode ser vantajosa a fim de influenciar positivamente características tais como cinética de hibridização, reversibilidade da formação do híbrido, estabilidade biológica das moléculas de oligonucleotídeo, etc. O termo "suporte sólido" pode estar associado a qualquer substrato ao qual uma sonda de oligonucleotídeos possa ser acoplada, desde que mantenha as suas características de hibridização e desde que o nível de formação de hibridização permaneça baixo. Geralmente o substrato sólido será uma placa de microtítulo, uma membrana (por exemplo, nylon ou nitrocelulose) ou uma microesfera (glóbulo) ou um fragmento. Antes da aplicação à membrana ou fixação, pode ser conveniente modificar a sonda de ácido nucléico para facilitar a fixação ou melhorar a eficiência de hibridização. Tais modificações podem circundar a extremidade do homopolímero, ligado com grupos reativos diferentes tais como grupos alifãticos, grupos NH2/ grupos SH, grupos carboxílicos, ou ligados com biotina, haptenos ou proteínas. 0 termo "marcado" se refere ao uso de ácidos nucléicos marcados. A marcação pode ser realizada pelo uso de nucleotídeos marcados incorporados durante a etapa de polimerase da ampliação tal como ilustrado por Saiki e col., (1988) ou Bej e col., (1990) ou primers marcados, ou por qualquer outro método conhecido por especialista da área. A natureza da marcação pode ser isotópica (32P, 35S, etc.) ou não isotópica (biotina, digoxigenina, etc). 0 "termo amostra biológica ou amostra" se refere, por exemplo, a aspirados naso-faríngeos, swabs naso-faríngeos ou de garganta, lavagem de garganta ou aspirados de traquéia ou outra amostra do trato respiratório contendo DNA ou RNA.

Para sondas projetadas com características desejadas, as seguintes orientações úteis conhecidas para o especialista da área podem ser aplicadas.

Por causa da extensão e especificidade das reações de hibridização tais como aquelas descritas aqui, são afetadas por um número de fatores, a manipulação de um ou mais destes fatores irá determinar e sensibilidade exata de uma sonda particular, se perfeitamente complementar ao seu alvo ou não. A importância e efeito de várias condições de ensaio são explicadas mais adiante. A estabilidade [sonda:alvo] do híbrido do ácido nucléico pode ser escolhida a fim de ser compatível com as condições de ensaio. Isto pode ser executado evitando seqüências longas AT enriquecidas, pela terminação dos híbridos com pares de base G:C, e pela projeção da sonda com uma Tm apropriada. Os pontos iniciais e terminais da sonda devem ser escolhidos a fim de que o comprimento e a % de GC resulte em uma Tm de cerca de 2 - 10°C maior que a temperatura na qual o ensaio final possa ser realizado. A composição da base da sonda é significativa em virtude dos pares de base G-C exibirem estabilidade técnica maior quando comparada com os pares de base A-T devido às ligações de hidrogênio adicionais. Desta forma, a hibridização envolvendo ácidos nucléicos complementares de teor maior de G-C serão mais estáveis à temperaturas mais altas.

Condições tais como força iônica e temperatura de incubação sob as quais uma sonda será utilizada também devem ser consideradas quando se projeta uma sonda. Sabe-se que o grau de hibridização irá aumentar quando a força iônica da mistura de reação aumenta, e que a estabilidade térmica dos híbridos irá aumentar com o aumento da força iônica. Por outro lado, os reagentes químicos, tais como formamida, uréia, DMSO e álcoois, que quebram as ligações de hidrogênio, irão aumentar a força de hibridização. A desestabilização das ligações de hidrogênio por tais reagentes pode reduzir muito a Tm. Em geral, a hibridização ótima para sondas de oligonucleotídeo sintético, com cerca de 10 - 50 bases de comprimento, ocorre aproximadamente 5°C abaixo da temperatura de fusão para uma dupla fornecida. A incubação à temperaturas abaixo do ponto ótimo pode permitir seqüências de base não pareadas para hibridizar e pode portanto resultar em especificidade reduzida. É desejável ter sondas que hibridizam somente sob condições de alto rigor. Sob condições de alto rigor, somente híbridos de ácido nucláico altamente complementares irão se formar; híbridos sem um grau suficiente de complementariedade não irão se formar. Desta forma, o rigor das condições do ensaio determina a quantidade de complementariedade necessária entre as duas fitas de ácido nucléico formando um híbrido. O grau de rigor é selecionado de tal forma a maximizar a diferença na estabilidade entre o híbrido formado com o alvo e o ácido nucléico não alvo.

Regiões no RNA ou DNA alvo que são conhecidas por formar estruturas internas fortes inibitórias para hibridização são menos preferidas. Da mesma forma, sondas com auto-complementariedade extensa devem ser evitadas. Conforme explicado acima, a hibridização é a associação de duas fitas simples de ácidos nucléicos complementares para formar uma fita dupla com ligações de hidrogênio. É implícito que se uma das duas fitas estiver totalmente ou parcialmente envolvida em um híbrido, terá menos condições de participar na formação de um novo híbrido. Poderá existir híbridos intra-moleculares e inter-moleculares formados nas moléculas de um tipo de sonda se houver auto-complementariedade suficiente. Tais estruturas podem ser evitadas através de um projeto meticuloso de sonda. Projetando-se uma sonda da tal forma que uma porção substancial da seqüência de interesse seja uma fita simples, a proporção e extensão de hibridização pode ser muito aumentada. Programas de computação estão disponíveis para procurar este tipo de interação. Contudo, em certos exemplos, pode não ser possível evitar este tipo de interação.

Hibridização padrão e condições de lavagem são apresentadas na seção Materiais & Métodos dos exemplos. Outras condições são, por exemplo, 3x SSC (citrato salino de sódio), FA deionizada 20% (Formamida) à temperatura de 50°C. Outras soluções (SSPE (EDTA fosfato salino de sódio), TMAC (cloreto de amônia tetrametil), etc.) e temperaturas podem também ser utilizadas desde que a especificidade e sensibilidade das sondas sejam mantidas. Quando necessário, pequenas modificações das sondas no comprimento ou na seqüência têm que ser realizadas para manter a especificidade e sensibilidade necessária sob as circunstancias fornecidas. O termo "tampão de hibridização" significa um tampão que permite uma reação de hibridização entre as sondas e os ácidos polinucléicos presentes na amostra, ou os produtos ampliados, sob as condições de rigor apropriadas. O termo "solução de lavagem" significa uma solução capacitada para lavar os híbridos formados sob as condições de rigor apropriadas. A invenção, agora sendo em geral descrita, será mais rapidamente compreendida pela referência dos seguintes exemplos e figuras, que são incluídos somente pelo propósito de ilustração de certos aspectos e incorporações da presente invenção e não são de nenhuma forma limitantes da presente invenção. Todas as referências mencionadas na invenção são incorporadas como referência.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E TABELAS

Figura 1 - Separação dos produtos m-RT-PCR em gel de agarose. 10 μΐ dos produtos m-RT-PCR foram separados em gel de agarose 2%. O m-RT-PCR foi realizado utilizando 1 μΐ do ácido nucléico viral ou bacteriano como modelo, conforme descrito em material e métodos. Os comprimentos esperados do produto são fornecidos no texto. O tamanho do fragmento de DNA do marcador (0.7 μg de PUC19 digerido MSpl) em pares de base (bp) é 1:501 bp; 2:404 bp; 3:331 bp; 4:242 bp; 5:190 bp; 6:147 bp; 7:110 bp.

Fiaura 2 Proporção de resultados m-RT-PCR positivos. 0 número de resultados m-RT-PCR positivos e amostras totais é fornecido no eixo y. A escala de tempo no eixo x é de Novembro de 1995 a Abril de 1998.

Fiaura 3 - Frequência de resultados m-RT-PCR-ELISA positivos em amostras clínicas. O número de resultados m-RT-PCR positivos para cada um dos nove organismos é fornecido no eixo y. A escala de tempo no eixo x e de Novembro de 1995 a Abril de 1998.

Figura 4 - Porcentagem de organismos causadores de infecções. O total de organismos que causam uma doença respiratória é fornecido em porcentagem do total de organismos que causam a doença de acordo. Organismos não incluídos no teste não são mostrados na figura.

Figura 5 - Apresenta a separação das "amplicons" em um gel de agarose 2% obtidos após RT-PCR-multiplex no material de referência. Apresenta bandas discretas de tamanho esperado para todos os organismos testados.

Figura 6 - Apresenta resultados de hibridização destes "amplicons" com tiras Li PA assim como um controle negativo. Estes resultados demonstram claramente que todas as sondas na tira reagem especificamente com seu "amplicon" correspondente e que nenhuma hibridização cruzada é observada entre os diferentes organismos testados.

Tabela 1 - Apresenta os resultados de um estudo comparativo entre m-RT-PCR-ELISA e os EIA'S comerciais.

Tabela 2 - Apresenta as seqüências do primer utilizadas no exemplo 1.

Tabela 3 - Resume as sondas diferentes para os organismos identificados conforme descrito originalmente e suas versões adaptadas para uso LiPA.

Tabela 4 - Resume as seqüências de primers e sondas, derivados da região espaçadora 16S - 23S rRNA para os patógenos bacterianos.

Tabela 5 - Apresenta as seqüências de sondas para RSV utilizadas no exemplo 3.

Tabela 6 - Apresenta uma comparação de resultados de cultura e LiPA para uma série de 3 6 amostras cegas, realizadas no exemplo 3.

Tabela 7 - Apresenta uma comparação de resultados de cultura e Li PA para uma série de 3 0 amostras cegas para cultura de Mycoplasma pneumoniae utilizando RT-PCR-multiplex e LiPA, realizadas no exemplo 3. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Abreviações Infecção aguda do trato respiratório (ARI); transcrição reversa combinada com PCR (RT-PCR); PCR-RT-multiplex (m-RT-PCR); m-RT-PCR combinada com ensaio de hibridização de micropoço (m-RT-PCR-ELISA),- vírus influenza tipo A (influenza A ou InfA); vírus Influenza tipo B (influenza B ou InfB); vírus parainfluenza tipo 1 (PIV-1); vírus parainfluenza tipo 3 (PIV-3); vírus sincicial respiratório (RSV).

MATERIAIS E MÉTODOS 1. Amostras de paciente Aspirados naso-faríngeos foram obtidos de crianças hospitalizadas com ARI em nossa instituição no período entre Novembro de 1995 ate Abril de 1998. O diagnóstico inclui pneumonia, bronquite asmática, bronquite, laringo-traqueíte (o ultimo incluindo laringite, laringo-traqueo-bronquite e (pseudo -) crupe), faringite, tonsilite, rinite, conjuntivite, otite média e foram obtidos da liberação de banco de dados de diagnóstico baseado em computador do hospital. Enquanto a coleta de amostras não estava completa durante o primeiro inverno (novembro de 1995 a abril de 1996) , estava > 95% completa para o tempo remanescente como Io de outubro, 1996. As amostras foram coletadas no primeiro dia de trabalho após a hospitalização, enviadas diretamente para o laboratório, inicialmente armazenadas â temperatura de 4 o C, preparadas para o teste e após isso e para armazenagem mais prolongada utilizar a temperatura de -70°C. As amostras foram divididas com precauções apropriadas para evitar contaminação e uma parte foi utilizada diretamente para a detecção do antigeno RSV e influenza tipo A pelo uso de ensaios imunoenzimáticos (EIA) (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) . Uma segunda parte foi utilizada para m-RT-PCR seguida por eletroforese em gel de agarose e especificação em um ensaio de hibridização com micropoço. 2. Extração de ácido nucléico As amostras recebidas de Novembro de 1995 até de Julho de 1997 foram preparadas conforme abaixo. Ácidos nucléicos totais foram obtidos de 100 μΐ de amostras respiratórias diluídas com 100 μΐ de solução de NaCl 0,9%. Sulfato de sódiododecil foi adicionado até uma concentração final de 0.1%. A extração de ácido nucléico foi executada uma vez com 1 volume de mistura de fenol-clorofórmio 1:1 e uma vez com 1 volume de clorofórmio e precipitada com acetato de amônia 0.3 M e etanol. Pelotas de ácido nucléico foram secas e re-suspensas em 15 μΐ de água bi-destilada tratada com dietilpirocarbonato. Amostras recebidas de Agosto de 1997 a Abril de 1998 foram preparadas utilizando "kit de ácido nucléico viral de alta pureza" (Boelhringer), seguindo as instruções do computador (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha).

Controles do procedimento de preparação foram os seguintes: uma amostra negativa (escarro de pessoas sadias) foi incluída em cada série de 5-10 amostras para monitorar a contaminação cruzada em potencial. No caso de um resultado falso positivo no controle negativo, o m-RT-PCR foi repetido em todas as amostras clínicas positivas nestas séries com outra porção da amostra clínica. Controles positivos da cultura (influenza A, influenza B, PIV-1, PIV-3 ou RSV, respectivamente) foram utilizados em cada teste para documentar a eficiência do procedimento de preparação. Amostras preparadas foram utilizadas imediatamente para m-RT-PCR e alíquotas remanescentes foram armazenadas â temperatura de -70°C. 3. RT-PCR-Multiolex Sequências alvo eram regiões codificadas/não retificadas, respectivamente, de: sub-unidade F1 do gene de glicoproteína de fusão para RSV, gene de hemaglutiníneuraminidase para PIV-1, região 5' não-codificadora do gene da proteína de fusão para PIV-3, seqüência de nucleotídeo do RNA ribossomal 16S para C. pneumoniae, seqüência de nucleotídeo do RNA ribossomal 15S para C. pneumoniae, um enterovírus intercalado com região 5' não codificadora altamente conservante para enterovírus, gene de proteína não- estrutural de influenza A e influenza B e seqüência do gene hexon para adenovírus. As seqüências foram selecionadas de procedimentos descritos previamente (Paton e col., 1992; Karron e col., 1992; Fan e Henrickson, 1996; Rotbart, 1990; Gaydos e col., 1992; Van Kuppeveld e col.,1992; Claas e col., 1992; Hierholzer e col., 1993). Para adenovirus, a sequência do sonda A foi utilizado como segundo primer de ampliação ao invés do primer 2 (Hierholzer, 1993).

Uma quantidade de 5 a 6 μΐ das preparações de ácido nucléico de amostras clínicas foram incluídas na reação de transcrição reversa (RT) em um volume final de 20 1. A RT foi realizada por 60 minutos à temperatura de 37°C com a seguinte composição de tampão: Tris-HCl 50 mM (pH 8.3), MgCL2 75 mM, trifosfatos de deoxinucleosídeo 10 mM (cada) (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia), mistura de hexanucleotídeo 0.2 pg/μΐ (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha), RNAsin 20U (Promega, Madison, Wisconsin USA) e 10 U de transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney (Eurogentec, Seraing, Bélgica).

Após inativação térmica da transcriptase reversa à temperatura de 90 °C por 5 minutos, 20 μΐ completos da mistura de reação RT foram utilizados para PCR multiplex em um volume total de 80 μΐ. A composição do tampão (sem considerar o RT-Tampão) foi de Tris-HCl 10 mM (pH 8.3), KC1 50 mM, MgCl2 1.5 mM, gelatina 0.001%, dATP 0.2 mM, dCTP, dGTP, dTTP 0.2 mM, digoxigenina-ll-dUTP 0.01 mM (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha), primer (cada) 1 μΜ (Eurogentec, Seraing, Bélgica) e 5 U de AmpliTaq-Gold polimerase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ, USA). PCR foi realizado com um Thermocycler PE 9600 (Perkin, Elmer, Branchburg, NJ, USA) conforme abaixo 40 ciclos de desnaturação à temperatura de 94 °C por 3 0 segundos (10 minutos durante ciclo 1) , temperando à temperatura de 50°C por 3 0 segundos e extensão à temperatura de 72 °C por 30 segundos (7 minutos durante ciclo 40).

Como controle negativo, o reagente branco que continha H20, foi utilizado ao invés de ácido nucléico. Como controle m-RT-PCR positivo, o ácido nucléico celular total extraído de material estoque viral e/ou bacteriano foi utilizado. 4. Prevenção de contaminação cruzada Para prevenir contaminação cruzada no laboratório, as seguintes precauções foram tomadas: todas os reagentes comprados foram divididos em pequenas alíquotas. A preparação de reagentes PCR, a extração de ácidos nucléicos de amostras clínicas e a etapa de ampliação foram conduzidas em três salas diferentes. Pontas equipadas com filtros de selagem (ponta com selo de segurança de BlOzym, Hess. Oldendorf, Alemanha) foram utilizadas para pipetar os reagentes introduzidos no PCR e todas as áreas e o equipamento foram descontaminados com hipoclorito de sódio e Bacillol (um germicida alcoólico de: Bode Chemie, Hamburgo, Alemanha) antes e após a pipetagem. 5. Eletroforese em gel de aaarose A separação por eletroforese de produtos PCR (10 μΐ) foi realizada por 30 minutos a 130 tot 160 mA em gel de agarose 2% em 0.5 x tampão TBE (Tris-borato 0.045 M, EDTA 0.001 M) , corado com bromato de etídio e produtos PCR foram visualizados por iluminação UV conforme descrito por Sambrook e col. (Sambrook e col., 1989). Para controle do comprimento dos fragmentos, 0.6-0.8 /ig de pUC19 Mspl preparado foi aplicado como marcador. 6. Análise da hibridizacão de micropoco Este ensaio foi realizado utilizando o sistema PCR-ELISA da Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemanha). Nove poços de uma placa de microtítulo revestida com estreptavidina foram preenchidos cada um com 5 μΐ de produto PCR e desnaturados adicionando-se 25 μΐ de NaOH 0.2 N em cada poço. Após 5 minutos 2 00 μΐ de tampão de hibridização contendo 2 pmol da respectiva sonda de captura biotinilatado foram adicionados. As sondas de captura utilizadas eram específicas para as seqüências alvo ampliadas (ver acima) e as seqüências das sondas para enterovírus, influenza A, influenza B, PIV-1, adenovírus (sonda B) e M. pneumoníae (Gpol) eram idênticas para seqüências reportadas previamente (Rotbart, 1990; Claas e col., Van Kuppenveld e col., 1992; Hierholzer e col., 1993; Fan e Hendrickson, 1996) . As seqüências de sondas utilizadas para os outros são 5'- CCT GCA TTA ACA CTA AAT TC-3' (SEQ ID NO 1) para RSV; 5'-TCT TGC TAC CTT CTG TAC TAA-3' (SEQ ID NO 2) para C. pneumonie e 5'-AAA ATT CCA AAA GAG ACC GGC-3' (SEQ ID NO 4) para PIV-3 . Todos os sondas de captura eram 3'- biotinilatados e comercializados por Eurogentec (Seraing, Bélgica). Foi permitido proceder a captura por 1 hora à temperatura de 37°C, e depois os poços foram lavados 4 vezes com 200 μΐ de solução de lavagem (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) à temperatura ambiente. Foi adicionado em cada poço, 200 μΐ de anti-DIG-peroxidase (10 mU/ml, (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) diluída 1/1,000 em um tampão contendo Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM (pH 7.5). As placas foram incubadas por 3 0 minutos à temperatura de 3 7°C e os poços foram lavados 4 vezes com solução de lavagem. A solução substrato ABTS® 200 μ (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) foi adicionada, e os poços foram incubados por 30 minutos à temperatura de 37°C. A densidade ótica (OD) foi lida em uma leitora DIAS (Dynatech, Laboratories, Guernsey, Ilhas Channel) a 405 nm (filtro de referencia 492 nra) . O processo era considerado válido, se todos os valores do controle negativo fossem menores que 0.2 unidades OD e o controle positivo fosse maior que 1.0 unidade OD. Amostras foram classificadas como PCR positiva ou negativa de acordo com um valor OD cut-off de 0.5 e pela comparação com os resultados da eletroforese com gel. Amostras com leituras iniciais entre 0.2 e 0.5 foram consideradas limites e foram classificadas como positiva ou negativa somente após re-testagem com o conjunto de primer único especifico. Controles de hibridização positivos foram incluídos em cada ensaio de hibridização de micropoço. Eles consistiam de produtos PCR derivados de controles positivos que estavam incluídos no m-RT-PCR. 7. Administração de dados Todos os dados obtidos foram manuseados em um banco de dados Access Microsoft. Este banco de dados incluiu todas as informações disponíveis sobre pacientes assim como todos os dados e resultados diagnósticos de m-RT-PCR-ELISA e no caso de influenza A e RSV, os dados de EIA. 8. Estocrue viral e bacteriano Estoques virais e bacterianos utilizados como controle positivo foram gentilmente fornecidos pelas seguintes pessoas: B. Schweiger e E. Schreier, (Robert-Koch-Institute, Berlim) enterovírus, Influenza A e Influenza B; K. M. Edwards (Vanderbilt University, Tennessee, USA) RSV, PIV-1, PIV-3, A. Stracker (Institute for Virology, Bochum) RSV-longo, PIV-3; R. Krausse e P. Rautenberg (Institute for Medicai Microbiology, Kiel), M. peumoniae, C. peumoniae e adenovlrus. 0 número exato de vírus ou bactérias nestas amostras não foi conhecido e admitiu-se como sendo no máximo 108/ml como estabelecido por B. Schweiger e P. Rautenberg (comunicação pessoal). Para o teste de sensibilidade preliminar de m-RT-PCR, foram utilizadas diluições consecutivas (dez vezes mais etapas) de ácidos nucléicos preparados destas culturas como modelo para m-RT-PCR e para ampliação com conjuntos de primer simples.

Devido à informação não disponível sobre o número exato de vírus e bactérias, a quantidade provável de ácidos nucléicos que foi suficiente para resultar em um produto de ampliação foi calculada com base no número adotado de partículas (108/ml de amostra não diluída). Para detectar uma possível reatividade cruzada entre os organismos, 1 μΐ de ácido nucléico não diluído de cada organismo foi utilizado em um m-RT-PCR.

RESULTADOS 1. rt-PCR Multiplex em ácidos nucléicos virais e bacterianos O procedimento m-RT-PCR-ELISA foi testado com ácidos nucléicos preparados de soluções estoque conforme descrito em material e métodos. Como pode ser visto na figura 1, somente um produto de ampliação específica poderia ser observado em cada faixa. Os tamanhos previstos dos produtos de ampliação (C. pneumoniae, 4 63 bp; M. pneumoniae, 277 bp; influenza B, 249 bp; RSV, 239 bp; PIV-3, 205 bp; influenza A, 190 bp; PIV-1, 179 bp; enterovírus 154 bp; adenovírus, 134 bp) estavam de acordo com os tamanhos dos fragmentos calculados do gel de agarose (Fig.l). Isto sugere que o m-RT-PCR produziu produtos específicos. Contudo, a diferenciação de influenza A e PIV-3 pelo tamanho de fragmento somente em eletroforese em gel é difícil, mas os valores de absorbância obtidos pelo teste de PCR-ELISA confirmaram essa especificidade. Primers não consumidos são visíveis na base do gel. A fim de avaliar a sensibilidade do m-RT-PCR, as soluções concentradas de estoque de vírus foram diluídas consecutivamente em mais de dez etapas e testadas com pares de primer específicos para produzir produtos de ampliação visíveis em gel de agarose que eram específicos no PCR-ELISA. Supondo-se que um máximo de 108 dos microrganismos/ml que estavam presentes na solução estoque original, calculou-se que com o método era possível detectar 1 sequência alvo de M. Pneumoniae e 1 sequência alvo de C. pneumoniae, 10 cópias de DNA de adenovírus e RNA de enterovírus 100 cópias de PIV-1, PIV-3, influenza A, influenza B e RSV-RNA na reação m-RT-PCR análoga.

2. Comparação de Ensaio Imunoenzimático (EIA) com m-RT-PCR-ELISA

Para receber informação sobre a qualidade do m-RT-PCR-ELISA, comparamos os resultados obtidos com os dos EIA'S comerciais. Com este EIA, 940 amostras clínicas foram testadas para a presença de influenza A e 1.031 amostras clínicas para a presença de RSV. Os resultados estão resumidos na tabela 1. A conformidade total foi de 95% de resultados PCR para RSV para aqueles obtidos por EIA (com 140 amostras positivas + 891 amostras negativas em EIA como referencia = 100%). Vinte e cinco amostras foram identificadas como RSV positivas por PCR-ELISA somente, 24 como RSV positiva somente através de EIA. No caso de influenza A, a conformidade total de PCR para EIA foi de 98% (com 53 positivas + 887 negativas em EIA como referencia = 100%) com 1 amostra positiva através de EIA somente e 14 amostras positivas somente através de PCR ELISA. 3. Resultados de m-RT-PCR-ELISA com amostras clínicas Um total de 1.118 amostras foram testadas por m-RT-PCR-ELISA. O número de amostras testadas durante o tempo e a proporção de resultados PCR positivos podem ser obtidas através da figura 2. A quantidade de amostras aumentou periodicamente todas as épocas de frio (de novembro a abril) e isto estava correlacionado com um número aumentado de resultados PCR positivos. Durante o período de inverno de 1996/1997, o número máximo de amostras de pacientes (n=106) foi recebido em fevereiro e a detecção de no mínimo 1 microorganismo por m-RT-PCR foi atingida em 48%. O número menor de amostras no inverno de 1995/1996 foi devido à coleta incompleta de amostras prematuramente durante as nossas séries de teste. Os resultados para os diferentes microrganismos são apresentados com detalhes na figura 3. Um total de 723 (65%) amostras foram consideradas negativas e 395 (35%) foram consideradas positivas por no mínimo 1 dos organismos incluídos no teste. Dos isolados, 37.5% eram RSV, 20.0% influenza A, 12.9% adenovírus, 10.6% enterovírus, 8.1% M. pneumoniae, 4.3% PIV-3, 3.5% PIV-1, 2.8% influenza B e 0.2% C. pneumoniae (baseado no m-RT-PCR-ELISA positiva total). RSV e influenza A foram detectados principalmente de dezembro a maio. Para influenza B (fevereiro a abril de 1997) e para PIV-1 (setembro a dezembro de 1997) somente um pico principal foi observado. A infecção com adenovírus, enterovírus, PIV-3 e M. pneumoniae foi detectada mais ou menos constantemente durante o tempo C. pneumoniae foi detectado somente uma vez em janeiro de 1997. 4. Deteccão simultânea de dois organismos A evidência mostrada por m-RT-PCR de infecção simultânea com dois organismos em 20 casos (1.8% do total ou 5% das amostras positivas). A co-ampliação da seqüência de ácido nucléico do adenovírus ocorre com C. pneumoniae (lx) , enterovírus (lx) , influenza A (lx) e RSV (5x) . Infecções duais envolvendo enterovírus foram detectadas com adenovírus (Ιχ) , influenza A (3x) , influenza B (lx) , PIV-3 (3x) , K pneumoniae (lx) e com RSV (3x) .

Além disso, o ácido nucléico de influenza B foi co-ampliado com RSV e M. pneumoniae com PIV-1 cada em uma amostra. 5. Dados clínicos Os dados clínicos estavam disponíveis como de fevereiro de 1995 de 861/1.061 pares de amostras-paciente com segunda ou amostras seguintes da mesma admissão de hospital, com um paciente sendo excluído. Destes 861 pacientes, 550 estavam entre 0 e 2 anos de idade, 153 estavam entre 2 a 5 anos de idade e 158 possuíam mais de 5 anos. Em 62% destas amostras nenhum ácido nucléico viral ou bacteriano pode ser detectado por m-RT-PCR. 0 diagnóstico mais freqüente neste estudo com base hospitalar foi de pneumonia (309 casos ou 36%) . Foi mais comumente causada por RSV (n=59) , influenza A (n=17) , M. pneumoniae (n=l6) e adenovírus (n=15). Enterovírus, PIV-3, PIV-1 e influenza B estavam associados com menos de 10 casos de pneumonia cada. Entre 167 pacientes com bronquite asmática (19% de 861 amostras) RSV foi detectado em 45 casos, adenovírus em 16 e enterovírus, influenza A, influenza B, PIV-1, PIV-3 e M. pneumoniae em menos de 10 casos cada. Bronquite foi observada em um total de 95 pacientes (11% das 861 amostras) e os organismos detectados eram RSV (13 casos), enterovírus e influenza A (4 casos cada), adenovírus (3 casos). A rinite foi diagnosticada em 7.1%, laringotraqueíte em 6.2% e faringite, otite média, tonsilite e conjuntivite em menos de 5% cada das 861 amostras testadas com a detecção de um microrganismo por τη-RT-PCR em menos de 10 casos. Outras doenças foram diagnosticadas em 9.1% dos pacientes. A freqüência de detecção de um dos nove organismos no PCR para uma doença respiratória fornecida é mostrada na figura 4. RSV foi mais comumente associada com pneumonia, bronquite asmática, bronquite, otite média ou faringite. Influenza A foi associado com mais de 5% dos casos de otite média, tonsilite, faringite, laringotraqueíte, pneumonia; enterovírus foi associado com mais de 5% dos casos de tonsilite, faringite; adenovírus foi associado com faringite, bronquite asmática, conjuntivite e tonsilite, M. pneumoniae mais comumente associado com pneumonia, enquanto PIV-1 foi principalmente asociado com laringotraqueíte e PIV-3 com laringotraqueíte e conjuntivite. C. pneumoniae foi detectado somente uma vez em um paciente com bronquite. EXEMPLO 2: Aplicacão LIPA para infeccões agudas do trato respiratório 1. Proieto dos sondas de olicronucleotídeos para aplicacão LiPA

Algumas das sondas de oligonucleotídeos utilizadas no Exemplo 1 foram adaptadas a fim de obter boas especificidades e sensibilidades para organismos diferentes quando utilizadas em um ensaio LiPA (Line Probe Assay, Wo 94/12670). A Tabela 3 resume as diferentes sondas para os organismos identificados conforme descrito originalmente e suas versões adaptadas para uso LiPA.

Sondas otimizadas foram fornecidas enzímaticamente com um poly-T-tail utilizando transferase deoxinucleotidil terminal (Pharmacia) em um tampão de reação padrão. Após uma incubação de 1 hora, a reação foi bloqueada e as sondas adaptadas foram precipitadas e lavadas com etanol resfriado. As sondas foram dissolvidas em 6X SSC nas suas concentrações específicas respectivamente e aplicadas como linhas horizontais em strips de membranas. O DNA biotinilatado foi aplicado lado a lado como controle positivo. Os oligonucleotídeos foram fixados â membrana aquecendo à temperatura de 80°C por 12 horas. A membrana foi então cortada em tiras de 4 mm.

2. Preparação de ácido nucléico e ampliação de PCR

Estoques de cultura viral e bacteriana foram utilizados como material de referência. 0 ácido nucléico foi extraído de acordo com procedimentos padrão conforme descrito acima.

Um a cinco μΐ da preparação de ácido nucléico foi utilizado no multiplex-RT-PCR conforme descrito previamente, com a exceção de que o número de ciclos foi reduzido para 35 e que a rotulagem dos amplicons foi realizada utilizando-se primers biotinilatados ao invés da modalidade de digoxigenona-11-dUTP.

3. Desempenho do teste LiPA

Volumes equivalente (5 a 10 μΐ) dos fragmentos de PCR biotinilatados e da solução de desnaturação (NaOH 400 mM/EDTA 10 mM) foram homogeneizados em recipiente de teste e incubados à temperatura ambiente por 5 minutos. Então, 2 ml da solução de hibridização pré-aquecida à temperatura de 50°C (2XSSC/SDS 0.1%) foram adicionados seguido da adição de uma tira por recipiente de teste. A hibridização ocorreu por 1 hora à temperatura de 50°C em um banho-maria fechado e com agitação. As tiras foram lavadas duas vezes com 2 ml de solução de lavagem estrita (2xSSC/SDS 0.1%) à temperatura ambiente por 2 0 segundos, e uma vez à temperatura de 50°C por 15 minutos. Após esta lavagem estrita, as tiras foram enxaguadas duas vezes com 2 ml da solução de Enxagüe padrão Innogenetics (RS) . As tiras foram incubadas em uma plataforma rotatória com um conjugado de fosfatase alcalina-estreptavidina rotulada diluída em solução conjugada padrão por 3 minutos à temperatura ambiente. As tiras foram então lavadas duas vezes com 2 ml de RS e uma vez com tampão substrato padrão (SB), e a reação cromática foi iniciada pela adição de BCIP e NBT para o SB. Após 30 minutos à temperatura ambiente, a reação cromática foi bloqueada substituindo-se os corantes por água destilada. Imediatamente após a secagem, as tiras foram interpretadas. 0 procedimento completo descrito acima pode também ser substituído pelo equipamento de automação Inno-LiPA padrão (Auto-LiPA, Innogenetics, Zwijnaarde, Bélgica).

Como pode ser observado na Figura 5, a separação em um gel de agarose a 2% dos "amplícons" obtidos após multiplex-RT-PCR em material de referência, apresenta faixas distintas do tamanho esperado para todos os organismos testados. A figura 6 apresenta os resultados de hibridização destes "amplícons" com as tiras LiPA assim como um controle negativo. Estes resultados demonstram claramente que todas as sondas na tira reagem especificamente com os seus "amplicons" correspondentes e nenhuma hibridização cruzada é observada entre os diferentes organismos testados. 4. Desenvolvimento de nova sonda para C. pneumoniae, M. pneumoniae, B. pertussis e B. parapertussis Para substituir primers e sondas (16S rRNA) utilizados no multiplex-RT-PCR para a detecção de M. pneumoniae e C. pneumoniae, um novo conjunto de primers e sondas foi desenvolvido para estes organismos derivados da região espaçadora 16S-23S rRNA. Primers e sondas foram também desenvolvidos para a detecção específica de B. pertussis e B. parapertussis ou B. bronchi séptica para adicionar ao multiplex-RT-PCR.

Na tabela 4, estão resumidas seqüências dos primers e sondas derivadas da região espaçadora 16S-23S rRNA para estes patógenos bacterianos.

Os experimentos com PCR demonstraram que todos os conjuntos de primers selecionados ampliaram especificamente os organismos correspondentes e "amplicons" não foram obtidos utilizando ácidos nucléicos derivados de organismos filogeneticamente relacionados ou de qualquer dos outros agentes infecciosos detectados no multiplex-RT-PCR.

Primers universais biotinilatados derivados da terminação 3' do 16S rRNA e da parte 5' do 23S rRNA foram utilizados para ampliar a região espaçadora 16S-23S rRNA da bactéria de interesse e seus parentes próximos.

Hibridização reversa nas tiras LiPA em 2x SSC/SDS 0.1% à temperatura de 50 °C mostrou que todas as sondas selecionadas reagiram especificamente com os organismos de interesse e nenhuma reação cruzada foi observada com "amplicons" derivados do multiplex-RT-PCR descrito previamente.

Experimentos iniciais demostraram que primers e sondas (derivados da região espaçadora ribossomal) podem ser implementados no multiplex-RT-PCR para substituir os primers e sondas geralmente utilizados para M. pneumoniae e C. pneumoniae e o ensaio pode ser estendido pela adição de primers e sondas para Bordetella spp. envolvida nas infecções do trato respiratório.

Baseado nestes resultados é previsto que este conjunto pode ser estendido adicionalmente com sondas (mais particularmente da região espaçadora 16S-23S rRNA) para outros patógenos relevantes, tais como Legionella. pneumophila. EXEMPLO 3. Hibridização LiPA e m-RT-PCR em sobrenadantes de cultura Para verificar a exatidão e especificidade da hibridização multilex-RT-PCR e LiPA, um número de culturas cegas foram analisadas com o ensaio LiPA.

1. Preparação de amostra e PCR A preparação de ácido nucléico foi feita em sobrenadantes de cultura utilizando "Kit de Ácido Nucléico Viral de Alta Pureza" da Boehringer-Mannheim conforme descrito pelo fabricante. O m-RT-PCR envolveu a transcrição reversa do RNA dos organismos RNA (RSV, PIVI, PIV3, infA, InfB, enterovírus) seguido por uma ampliação de PCR do cDNA correspondente e o DNA do adenovírus M. pneumoniae, C. pneumoniae, B. pertussis e B. parapertussis conforme é descrito nos exemplos anteriores.

Primers foram selecionados de seqüências alvo altamente conservadas previamente publicadas, exceto para ampliação das espécies bacterianas. Os primers utilizados são os seguintes: para M. pneumoniae SEQ ID NO 17 e SEQ ID NO 19; para C. pneumoniae SEQ ID NO 20 e SEQ ID NO 21 e para ambas as espécies de Bordetella SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 23.

2. Hibridizacão LiPA

Cinco a 10 μΐ de produto PCR foi hibridizado para tiras LiPA contendo sondas especificas para os diferentes organismos, conforme descritos na Tabela 3 para enterovírus, influenza A e B, adenovírus e parainfluenza vírus, e na Tabela 4 para as espécies bacterianas. Para RSV, as sondas utilizadas são as descritas na Tabela 5. A hibridização foi realizada conforme descrito no exemplo 2. 3. Resultados Uma comparação dos resultados de cultura e LiPA para uma primeira série de 36 amostras cegas é resumida na Tabela 6.

Os resultados LiPA são concordantes com os resultados de cultura na maioria dos casos. Em dois casos, o teste multilex revelou a presença de infecções duplas, onde os resultados de cultura somente detectaram um dos dois organismos presentes.

Os resultados LiPA negativos obtidos foram observados com sobrenadantes de cultura antiga, possivelmente devido à degradação de material de ácido nucléico.

Em um segundo experimento, amostras cegas para cultura de Mycoplasma pneumoniae foram avaliadas utilizando o multiplex-RT-PCR e subseqüente hibridização LiPA.

Os resultados de 30 amostras cegas estão resumidos na Tabela7.

Os resultados no teste LiPA foram 100% concordantes com os resultados obtidos na cultura.

TABELA 1: Comparação de EIA e m-PCR-ELISA TABELA 2: Seaüências de Primer Utilizadas no Exemplo 1 ENTERO- PP1: att gtc acc ata age age ca-3' ENTERO- RP1: tcc tcc ggc ccc tga atg cg-3' MPN-FP1: aag gac ctg caa ggg tte gt-3' MPN-RP1: ctc tag cca tta cet gct aa-3' INFLUA-FP1: aag ggc ttt cac cga aga gg-3' INFLUA-RP1: ccc att ctc att act gct tc-3' INFLUB-EPlt atg gcc ate gga tcc tea ac-3' INFLUB-RP1: tgt cag cta tta tgg age tg-3' ADEN0-FP1: gcc gag aag ggc gtg cgc agg ta-3' ADENO-RPX: atg act ttt gag gtg gat ccc atg ga-3' CPN-EP1: tga caa ctg tag aaa tac agc-3' CPN-RP1: cgc etc tet cct ata aat-3' PIV1-FP1: cac ate ctt gag tga tta agt ttg atg a 3 ' PIV1-RP1: att tet gga gat gtc ccg tag gag aac-3' PIV3-FP1: tag cag tat tga agt tgg ca-3' PIV3-RP1: aga ggt caa tac caa caa cta-3 RSV-FP1: tgt tat agg cat ate att ga-3' RSV-RP1: tta acc age aaa gtg tta ga-3' TABELA 3. *Y = c ort ** Sondas em negrito são utilizados no ensaio LiPA de primeira geração. TABELA 4. Seqüência dos Primers e Sondas, derivados da Região espacadora 16S-23S rRNA. *: FP = primer avançado; RP = primer reverso. TABELA 5. Seaüência de sondas para RSV. utilizadas no Exemplo 3. *r = a ou g, em=a ou c TABELA 6. Resultados de cultura e LiPA para uma série de 36 amostras cegas Tabela 7. Resultados de 30 amostras "cegas" para cultura de Microplasma pneumoniae._____________________________ REFERÊNCIAS

Adcock, P.M., G.G. Stout, Μ. A. Hauck, and G.S. Hauck, and G.S. Marshall (1997). Effect of rapid viral diagnosis on the management of children hospitalized with lower respiratory tract infection. J. Pediatric. Infect. Dis. 16:842-846.

Asseline U., Delarue M., lancelot G., Toulme F. and Thuong N. (1984) Nucleic acidbinding molecules with high affinity and base sequence specificity : intercalating agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81(11):3297-301.

Barlett, J.G., and L.M. Mundy (1995). Community-acquired pneumonia, NEJM, 333:1618 - 1624.

Bej A., Mahbubani M. , Miller R., Di Cesare J.,Haff L., Atlas R. (1990) Multiplex PCR amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in water. Mol Cell Probes 4:353-365 .

Claas, E.C.J., M.J.W. Sprenger, G.E.M. Kleter, R. van Beek, W.G.V. Quint, and N.Masurel (1992). Type-specific Identification of influenza viruses A, B and C by the polymerase chain reaction. J. Virol. Meth. 39: 1-13.

Compton J. (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 350: 91-92.

Dixon, R.E. (1985). Economic costs of respiratory infections in tha United States. Am. J. Med. 78 (Suppl. 6B): 45 - 51.

Drews, A. L., R. L. Atmar, W.P. Glezen, B.D. Baxter, P.A. Piedra, S.B Greenberg (1997) . Dual respiratory vírus infections. Clin. Infect. Dis. 25: 1421 - 1429.

Duck P. (1990) Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides. Biotechniques 9: 142-147.

Echeviarra, J.E., D.D, Erdman, E.M. Swierkosz, B.P. Holloway, L.J. Anderson (1998) . Simultaneous detection and Identification of human parainfluenza viruses 1, 2, and 3 fromclinical samples by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 36: 1388 - 1391.

Ellis, J.S., D.M. Fleming and M.C. Zambon (1997). Multiplex reverse transcription-PCR for surveillance of influenza A and B viruses in England and Wales in 1995 and 1996. J. Clin. Microbiol. 35:2076 - 2082.

Falck G. , J. Gnarpe (1997) . Prevalence of Chlamydia pneumoniae in healthy children and in children with respiratory tract infections. Pediatr. Infect. Dis. J. 16: 549 - 554.

Fan, J. And K. Henrickson (1996) . Rapid diagnosis of human parainfluenza virus type 1 infection by quantitative revers transcription-CPR-enzyme hybridization assay. J. Clin. Microbiol. 34: 1914 - 1917.

Garenne, M., C. Ronsmans, H. Campbell (1992). The magnitude of mortality from acute respiratory infections in children under 5 years in developing countries. World Health Stat. Q. 45: 180 - 191.

Gaydos, C.A., T.C. Quinn, and J.J. Eiden (1992). Identification of Chlemydia pneumoniae by DNA amplification of the 16S rRNA gene. J. Clin. Microbiol. 3Q: 796 - 800 Gendrel, D., Raymond, F. Moulin, J.L. Iniguez, S. Ravilly, F. Habib, P. Leblon, and G. Kalifa (1997). Etiology and response to antibiotic therapy of community-acquired pneumonia in French children. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16: 388- 391.

Gilbert, L.L., A. Dakhama, B.M. Bone, E.E. Thomas, and R.G. Hegele (1996). Diagnosis of viral respiratory tract infections in children by using a reverse transcription-PCR panei, J. Clin. Microbiol. 34: 140 - 143.

Goo, Y.A.M.K. Hori, J.H. Jr. Voorhies, C.C. Kuo, S.P. Wang, L.A. Campbell (1995). Failure to detect Chlamydia in ear fluid from children with otitis madia. Pedriatr. Infect. Dis. J. 14: 1000 - 1001.

Guatelli J. , Whitfield K. , Kwoh D., Barringer K. , Richman D. and Gengeras T. (1990) Isothermal, in vitro amplification of nucleic by a multionzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 1874-1878.

Hassan-King, Μ., I. Baldeh, R. Adogbola, C. Omosigho, S.O. Usen, A. Oparaugo, B.M. Greenwood (1996). Detection of Haemophilus and Streptococcus pneumoniae DNA in blood culture by a single PCR assay. J. Clin. Microbiol. 34: 2030 - 2032.

Hassan-King, M., R. Adegbola, I. Baldeh, K. Mulholland, C. Omosigho, S. Usen, A. Palmer, G. Schneider, O. Secka,M. Weber, B. Greenwood (1998). A polymerase chain reaction for the diagnosis of Heamoplihus influenzae type b disease in children and its evaluation during gt i/âCCidie trail. Pediatr. Dis. J. 17: 309 - 312.

Hemming, V. G. (1994). Viralrespiratory diseases in children : classification etiology, epidemiology and risk factors. J. Pediatr. 124: S 13 - 16.

Hierholzer, J.C., P.E. Halonen, P.O Dahlen, P. G Bingham, M.M. McDonough (1993). Detection of adenovirus in clinicai specimens by polymerase chain reaction and liquid-phase hybridization quantitated by time-resolved fluoremetry, J. Clin. Microbiol. 31: 1886 - 1891.

Hinman, A .R. (1998). Global progress in infectious diseases control. Vaccine 16: 1116 - 1121.

Karron, R.A., K.L. 0'Brien, J.L. Froehlich, and V.A. Brown (1992). Molecular epidemiology of a parainfluena type 3 virus outbreak on a pediatric ward. J. Inf. Dis. 167: 1441 - 1445.

Kawasaki, E.S. (1990). Amplification of RNA. P 21-27 In M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (ed.), PCR protocols : A guide to methods and applications. Academic Press.

Kwoh D., G., Whitfield K., Chappelle H., Dimíchele L. and Gingeras T. (1989). Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format. Proc Natl Acad Sei USA 86: 1173-1177.

Kwok S., Kellogg D., McKinney N., Spasic D., Goda L., Levenson C. and Sinisky J. (1990) Effects of primer-template mismatches on the polymarase chain reaction: Human immunodeficiency vírus type 1 model studes. Nucl, Acids Res. 18: 999.

Landgren U. , Kaiser R., Sanders and Hood L. (1988) A lígase-mediated gene detectíon technique. Science 241: 1077 - 1080.

Lockhart, D.J., Dong, H. , Byrne, M.C., Follettie, M., Gallo, M.V. , Chee, M.S., Mitteman, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H. and Bown, E.L. (1996). Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays. Nature Biotechnology 14: 16745-1680.

Lomeli H. , Tyagi S., Pritchard C., Lisardi P. and Kramer F. (1989) Quantitative assays based on the use of replícatable hyoridization probes. Clin Chem 35: 1826-1831.

Marx, A., T.J. Torok, R.C. Holman, M.J. Clarke, and L.J. Anderson (1997). Pediatric Hospitalizatíons for croup (laryngotracheobronchitis) : biennial increases associated with human parainfluenzavirus 1 epidemics. J. Infect. Dis. 176: 1423 - 1427.

Matsukra M. , Shinozuka K. , Zon G. , Mitsuya H. , Reitz M., Cohen J. And Broder S (1987) . Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides : inhibitors of replication and cytopathic effects of human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (21):7706-10.

Messmer, T.O., K. Skelton, J. F. Moroney, H. Daugharty, and B.S. Fields (1997). Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks. J. Clin. Microbial. 35:2043 - 2046.

Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979) Ninionic nucleic acid analogues. Sintesis dnd characterization of dideoxyyribonucleoside mathylphosphonates. Biochemistry 18 (23): 5134-43.

Mullis K., Faloona F., Scharf S. et al. specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction (1986). Gold spring Harb. Symp. Symp. Quant.Biol.1:163-273.

Mullis K.B. and Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction (1987).Methods Enzymol.155: 335-350.

Nielsen P. , Egholm M., Berg R. and Buchart 0. (1991) Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254 (5037) : 1497-500.

Nielsen P., Egholm M.,R.and Buchardt 0. (1993) Sequence specific inhibition of DNA restrictionenzyme cleavage by PNA. Nucl. Acids Res. 21(2): 197-200.

Nohynek, H., J. Eskola, M. Kleemola, E. Jalonen, P. Saikku, M. Leinonen (1995). Bacterial antibody assaya in the diagnosis of acute lower respiratory tract infection in children. Pediatr. Infect. Dis. J. 14: 478 - 484.

Paton, A.W., J.C. Paton, A.J. Lawrence, P.N. Goldwater, and R.J. Harris (1992). Rapid detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates by reverse transcription and polymerase chain reaction amplification. J. Clin. Microbiol. 30: 901 - 904.

Reznikov, Μ. , T.K. Blackmore, J.J. Finaly-Jones and D.L. Gordon (1995). Comparsion of nasopharyngel and throat swab specimens in a polymerase chain reaction-based test for Mycoplasma pneumoniae. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14: 58 - 61.

Rotbart, H.A. (1990). Enzymatic RNA amplification of the enterovirus, J. Clin. Microbiol. 28 : 438 - 442.

Rotbart, H.A., M.H. Sawyer, S. Fast, C. Lewinski, N. Murphy, E.F. Keyser, J. Spadoro, S.Y. Kao, M. Loeffelholz (1994). Diagnosis of enteroviral by using PCR with a colorimetric microwell detection assay. J. Clin. Microbiol. 32:2590 - 2592.

Saiki R.K., Bugawan T.L., Hom G.T. et al. Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes (1986) . Nature 324 :163-166.

Saiki, R.K., D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.3. Mullis,K.A. Erlich (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491.

Saiki R.K., Walsh P.S., C.H. and Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilizes sequence-specific oligonucleotíde probes (1989). Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6230-6234.

Saiki, R.K. (1990) . Amplification of genomic DNA, p 13-20. In M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (ed.) PCR protocols : A guide to methods and applications. Academic Press.

Saikku, P. (1997). Atypical respiratory pathogens. Clin. Microbiol. Inf. 3:599-604.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, And T. Maniatis (1989). Molecular cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Clod Spring Harbor, NY.

Stauffer, F., H. Haber, A. Rieger, R. Mutschlechner, P. Hasenberger, V.J. Tevere, K.K. Young (1998) . Genus levei Identification of mycobacteria from clinicai specimens by using an easy-to-handle Mycobacterium-specific PCR Assay. J. Clin. Microbiol. 36:614-617.

Stuyver L. , Rossau R. , Wyseur A. et al (1993) Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen. Virol. 74:1093-1102.

Trolfors, B. And B.A. Claesson (1997). Childhood pneumonia : possibilities for aetíological diagnosis. Baillière's Clinicai Paediatrics. 5:71-84. UNICEF. (1993). Pneumonia, 3.5 millions deaths, The State of the World's Children.

Valassina, Μ. A.M. Cuppone, M.G. Cusi, P.E. Valensin (1997). Rapid detection of different RNA respiratory vírus by multiplex RT-PCR: application to clinicai specimens. Clin. Diagn. Virol. 8:227-232.

Van Kuppeveld, F.J.M. van der Logt, A.F. Angulo, M.J. Van Zoest, W.G.V. Quint, H.G.M. Níesters, J.M.D. Galama, and W.J.G. Melchers (1992). Genus-and species-specific Identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification. Appl. Env. Microbiol, 58:2606-2615.

Woo, P.C., S.S. Chlu, W. H. Seto, M. Pelris (1997). Cost-effectiveness of rapid diagnosis of viral respiratory tract ínfections ín pediatric patients J. Clin. Microbiol, 35:1579-1581.

Wu D. and Wallace B. ¢1989) The ligation amplification reaction (LAR) ~ amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics 4:560-569.

Yang S.Y. A standardized method for detection of HLA-A and HLA-B alleles by one-dimensional isoelecrtic fousing (IEF) gel electrophoresis of HLA. Histocompatibility testing 1987 (ed. B. Dupont) . Springer-Verlag, New York, pp.332-335.

Claims (7)

1. Método para a detecção de infecção aguda do trato respiratório, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a amplificação simultânea de no mínimo as nove seqüências de nucleotídeos alvo presentes em uma amostra biológica através de uma mistura de iniciadores compreendendo no mínimo os nove pares de iniciadores abaixo listados, para as regiões de genes abaixo especificadas: - a sub-unidade Fl do gene de glicoproteína de fusão para RSV,com SEQ ID Nos 51 e 52; - o gene da hemaglutinineuraminidase para PIV-1, com SEQ ID Nos 47 e 48; - a região 5' não codifiçadora do gene de proteína de fusão para PIV-3, com SEQ ID Nos 49 e 50; - sequência 16S rRNA para M. pneumoniae, com SEQ ID Nos 37 e 38; - seqüência 16S rRNA para C. pneumoniae, com SEQ ID Nos 45 e 46; - a região 5' não codificadora para enterovírus, com SEQ ID Nos 35 e 36; - o gene de proteína não-estrutural do influenza A, com SEQ ID Nos 39 e 40; - o gene de proteína não-estrutural do influenza B, com SEQ ID Nos 41 e 42 e, - o gene hexon para adenovírus, com SEQ ID Nos 43 e 44.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o par de iniciadores 16S rRNA de M. pneumoniae ser substituído por um par de iniciadores com SEQ ID Nos 17 e 19 ou por um par de iniciadores com SEQ ID Nos 18 e 19 da região espaçadora entre as seqüências 16S e 23S rRNA de M. pneumoniae, e pelo fato de o dito par de iniciadores da região 16S de C. pneumoniae ser substituído por um par de iniciadores de SEQ ID Nos 20 e 21 da região espaçadora entre as sequências 16S e 23S de C.pneumoniae.

3. Método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de adicionalmente ser utilizado no mínimo um par de iniciadores com SEQ ID Nos 22 e 23 para a detecção específica de B. pertussis e B. parapertussis.

4. Método, de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de os citados produtos amplificados serem subsequentemente detectados utilizando uma sonda, com a dita sonda sendo selecionada de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33 E SEQ ID NO 34.

5. Kit para a detecção de infecção aguda do trato respiratório, CARACTERIZADO pelo fato de compreender no mínimo os nove pares de iniciadores definidos na reivindicação 1.

6. Kit para a detecção de infecção aguda do trato respiratório, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de compreender no mínimo os nove pares de iniciadores definidos na reivindicação 1, e compreender no mínimo uma das sondas definidas na reivindicação 4.

7. Kit, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de as citadas sondas serem aplicadas como linhas paralelas em um suporte sólido, preferencialmente em uma membrana de nylon.