KR20020000280A

KR20020000280A - 환경수에서 바이러스 오염 검출방법

Info

Publication number: KR20020000280A
Application number: KR1020000034564A
Authority: KR
Inventors: 김상종; 조장천; 조홍백; 이승훈
Original assignee: 김상종
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2000-06-22
Publication date: 2002-01-05

Abstract

본 발명은 환경수에서 바이러스 오염 검출방법에 관한 것으로 다수 네스티드 PCR분석으로 환경수에 존재하는 아데노바이러스와 엔테로바이러스를 검출하는 방법이다. 본 발명은 아데노바이러스에 대한 2쌍의 프라이머와 엔테로바이러스에 대한 3개의 프라이머를 제조하고 1차 PCR와 2차 PCR을 수행하여 다른 종류의 바이러스 특정서열이 동시에 증폭되어 환경수내에 존재하는 아데노바이러스와 엔테로바이러스의 존재유무와 오염정도를 쉽고 정확하게 확인 할 수 있다. 또한 본 발명의 아데노바이러스와 엔테로바이러스는 환경수에서 우세적으로 존재하는 바이러스이므로, 본 발명의 바이러스 오염검출방법을 일반화된 바이러스 오염 분석방법으로 적용할 수 있다.

Description

환경수에서 바이러스 오염 검출방법{Detection method of viral pollution in environmental water}

본 발명은 환경수에서 바이러스 오염의 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 환경수에 오염되어 있는 바이러스의 지표로 아데노바이러스와 엔테로바이러스를 PCR을 통하여 검출하는 방법에 관한 것이다.

엔테로(enteric) 바이러스는 배설물로 배출되어 수상, 지상, 심지어 식수에도 존재하는 바이러스로서(Gerba, C.P., and Rose, J.B. 1990. In Drinking water microbiology. Edited by G. A. McFeters. Spriger-Verlag, New York ; Keswick, B.H., Gerba, C., DuPont, H.L., and Rose, J. 1984. Appl. Environ. Microbiol. 47: 1290-1294), 소량으로도 사람에게 해를 주어(Ward, R.L., and Akin, E.W. 1984. CRC Crit. Rev. Environ. Contam. 14: 297-310) 국민보건을 위하여 엄격히규제되고 있는 바이러스이다. 하지만 현재 환경수의 미생물 오염지수는 박테리아를 지표로 하여 설정되어 있어 살균처리 과정에 박테리아보다 더욱 저항적이고(Sobsey, M.D. 1989. Water Sci. Technol. 21: 179-195), 자연환경에서 박테리아 보다 더 오래 살며(Berg, G., and Metcalf, T.G. 1978. Edited by G. Berg. Ann Arbor Science. Ann Arbor, Mich.), 계절에 따른 증식시기가 박테리아의 증식시기와 다른(American Public Health Association. 1995. Washington, D. C.) 바이러스의 오염정도를 적절히 나타내지 못하고 있다. 그러므로 환경수의 바이러스 오염정도를 확인하기 위한 정확한 방법이 필요하다.

엔테로바이러스를 검출하는 전통적인 방법은 세포배양법으로 많은 시간, 노동력, 및 비용이 요구된다. 더욱이 세포배양법은 대표적으로 위험한 바이러스인 칼리시바이러스(caliciviruses)나 헵타티스(hepatitis)A형간염바이러스 등을 검출할 수 없거나 또는 오염된 양이 클 경우에만 검출할 수 있어, 바이러스 핵산을 직접 분리하거나 PCR을 이용하여 바이러스 핵산을 직접 검출하고 있다. 상기의 핵산에 근거한 바이러스의 검출방법은 감염상태의 바이러스를 확인 할 순 없지만 민감도, 싼 가격, 짧은 시간 때문에 오늘날까지 널리 이용되고 있다.

또한 엔테로바이러스가 하수와 오염된 물에서 우세적으로 존재함이 이미 확인되어(Castignolles, N., Petit, F., Mendel, I., Simon, L., Cattolico, L., and Buffet-Janvresse, C. 1998. Mol. Cell. Probes, 12: 175-180 ; Gantzer, C., Maul, A., Audic, J.M., and Schwartzbrod, L. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4307-312 ; Kopecka 1993; Pina 1998; Puig, M., Jofre, J., Lucena, F.,Allard, A., Wadell, G., and Girones, R. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60: 2963-970 ) 환경수에 오염된 바이러스 분석법으로 엔테로바이러스를 PCR분석의 타겟으로 이용하고 있다. 하지만 환경수에서 바이러스 오염의 지표로 이용하는 엔테로바이러스의 오염이 헵파티티스 A형간염 바이러스와 같은 위험한 병원균의 오염과 항상 일치하는 것은 아니다라는 보고가 있어(Dubrou, S., Kopecka, H., Lopez-Pila, J.M., Marechal, J., an Prevot, J. 1991. Water Sci. Technol. 24: 267-272 ; Pina 1998) 엔테로바이러스만으로 환경수의 바이러스 오염을 확인하는데 한계가 있다.

최근에는 엔테로바이러스 검출과 함께 아데노바이러스를 PCR분석으로 환경수의 오염정도를 평가하는 방법을 사용하고 있다. 아데노바이러스는 핵산을 근거로 한 검출방법이 특성화되어있고 엔테로바이러스보다 오수, 바다, 수돗물 등의 다양한 환경수에서 안정하게 존재하며, PCR분석에 의하여 엔테로바이러스보다 하수나 오염된 물에서 더 많이 검출되고 있다.(Casti gnolles, N., Petit, F., Mendel, I., Simon, L., Cattolico, L., and Buffet-Janvresse, C. 1998. Mol. Cell. Probes, 12: 175-180 ; Enriquez, C.E., Hurst, C.J., and Gerba, C.P. 1995. Water Res. 29: 2548-553 ; Puig, M., Jofre, J., Lucena, F., Allard, A., Wadell, G., and Girones, R. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60: 2963-970 ; Vantarakis, A.C., and Papapetropoulou, M. 1998. Water Res. 32: 2365 2372) 또한 엔테로바이러스와 아데노바이러스의 계절적인 분포는 하수와 오수에서 서로 다른 것으로 나타났다.(Irving, L.G., and Smith, F.A. 1981. Appl. Environ.Microbiol. 41: 51-9 ; Krikelis, V., Spyrou, N., Markoulatos, P., and Serie, C. 1984. Can. J. Microbiol. 31: 24-5 ; Tani, N., Dohi, Y., Kurumatani, N., and Yonemasu, K. 1995. Microbiol. Immunol. 39: 577-80.) 따라서 아데노바이러스와 엔테로바이러스를 동시에 검출함으로써 병원균 바이러스오염 여부를 광범위로 확인 할 수 있지만, 현재까지 두 가지 바이러스를 동시에 검출 할 수 있는 기술이 개발되어 있지 않으며 정확하고 고민감도로 바이러스 오염 여부를 알 수 있는 방법은 없는 실정이다.

바이러스 오염을 PCR분석으로 검출하는 방법은 통상적으로 한 쌍의 프라이머를 사용하여 샘플내의 특정 바이러스 서열만을 증폭하는 것과 여러 개의 프라이머 쌍을 사용하여 다양한 바이러스군을 동시에 증폭할 수 있는 다수(multiplex) PCR도 있다. 상기 PCR분석을 통한 목적 서열검출은 주로 임상샘플에 사용되며(Casas, I., Tenorio, A., Echevarria, J.M., Klapper, P.E., and Cleator, G.M. 1997. Virol. Methods, 66: 39-50 ; Ellis, J.S., Fleming, D.M., and Zambon, M.C. 1997. Clin. Microbiol. 35: 2076-082 ; Pozo, F., and Tenorio, A. 1999. Virol. Methods, 79: 9?9 ; Stockton, J., Ellis, J.S., Saville, M., Clewley, J.P., and Zambon, M.C. 1998. J. Clin. Microbiol. 36: 2990-2995.), 구체적인 예로 특허공고 제 92-006826호의 B형과 c형 간염 바이러스분석방법, 특허공고 제 97-0005651호의 인유두종 바이러스 타입 16, 18의 동시검출을 위한 PCR 프라이머를 이용한 바이러스의 동시검출방법, 특허공고 제 94-000407호의 비형간염 바이러스 디엔에이 검출키트 등이 있다.

PCR 방법은 상기에 설명한 바와 같이 목적하는 서열의 존재여부를 쉽고 빠르게 확인할 수 있는 기술이지만 PCR 결과의 정확성과 민감도를 위하여 각 샘플의 조건이나 목적서열의 특이성, 프라이머, PCR 방법에 맞는 PCR조건이 최적화 되어야 한다. 사용하는 샘플의 조성과 구성성분에 의해 PCR조건이 달라져 최적의 PCR조건을 확립하기 어렵고 그 결과 또한 절대적이지 않지만 PCR의 최적 조건이 확립이 되면 다른 기술에 비해 빠르고 쉽게 결과를 볼 수 있다. 따라서 환경수의 바이러스 오염정도를 정확하게 확인할 수 있는 PCR방법과 조건 확립이 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명은 환경수에 포함된 바이러스의 존재유무를 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 환경수를 채취한 장소를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 다수 네스티드 PCR로 증폭된 엔테로바이러스와 아데노바이러스의 유전자조각을 아가로즈젤상에서 전기영동한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 환경수에서 채취한 시료에 엔테로바이러스 프라이머들과 아데노바이러스 프라이머들을 가하여 동시에 PCR을 수행하고 증폭되어진 바이러스 DNA를 아가로즈 젤상에서 확인하는 것을 포함하는 바이러스 오염검출방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 환경수에 존재하는 바이러스의 오염정도를 측정하기 위하여 창궐시기가 다르고 다른 바이러스의 오염지표로 대표할 수 있는 아데노바이러스와 엔테로바이러스를 동시에 검출 할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기의 두 바이러스는 배설물 오염으로 인한 환경수에서 우세적으로 존재하기 때문에 다른 바이러스의 오염지표로 사용할 수 있다.(Castig nolled 1998 ; Gantzer, C., Maul, A., Audic, J.M., and Schwartzbrod, L. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4307-312 ; Kopecka, H., Dubrou, S., Prevot, J., Marechal, J., and Lopezpila, J.M. 1993. ; Pina, S., Puig, M., Lucena, F., Jofre, J., and Girones, R. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3376-382 ; Puig 1994)

본 발명의 아데노바이러스와 엔테로바이러스의 검출 방법은 하이브리드(Hybrid), 항원항체반응, 염기서열분석, 세포배양, PCR이 바람직하며, 특히 PCR방법 중 다수 네스티드(multiplex nested) PCR방법이 가장 바람직하다.

상기 다수 네스티드 PCR은 여러 개의 프라이머를 동시에 사용하여 여러 개의 각기 다른 염기서열을 증폭하는 네스티드 PCR이고 상기 네스티드 PCR은 목적 DNA 조각의 외부에 위치한 DNA 서열에 상보적인 프라이머를 제조하여 목적 DNA 조각보다 큰 사이즈의 DNA 조각을 증폭한 후 다시 목적 DNA의 내부에 위치한 DNA서열에 상보적인 프라이머로 다시 증폭하는 PCR방법이다. 상기 네스티드 PCR은 목적 DNA 조각만을 정확하게 증폭할 수 있을 뿐만 아니라 소량의 시료에서도 목적 DNA를 증폭할 수 있는 PCR의 개량된 방법이다. 이러한 장점을 지닌 다수 네스티드 PCR을 병원균 바이러스가 낮은 농도로 존재하는 환경수에 적용함으로서 쉽고 간편하게 병원균 바이러스를 검출할 수 있으며 다수의 프라이머로 다수의 바이러스를 동시에 확인 할 수 있다.

본 발명은 아데노바이러스와 엔테로바이러스에 대한 다수 네스티드 PCR을 동시에 수행하기 위하여 아데노바이러스의 프라이머 2쌍과 엔테로바이러스 프라이머3개를 제조하여 다수 네스티드 PCR을 수행하였다.

본 발명의 실험방법은 먼저 RNA 형태인 엔테로바이러스의 유전자를 DNA로 전환시키는 역전사 반응을 수행하고 그 후 아데노바이러스의 외부 프라이머 AV1/AV2와 엔테로바이러스 외부 프라이머 EV1/EV2로 1차 PCR을 수행한 후 1차 PCR 반응물에 다시 아데노바이러스 내부 프라이머 AV3/AV4와 엔테로바이러스 내부 프라이머 EV3을 첨가하여 2차 PCR을 수행함으로써 아데노바이러스와 엔테로바이러스를 동시에 검출하였다.

본 발명의 다수 네스티드 PCR에 사용하는 프라이머는 아데노바이러스 프라이머가 75 nM 내지 130 nM로 PCR반응물에 포함되는 것이 바람직하고 엔테로바이러스 프라이머가 200 nM 내지 300 nM로 포함되는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 최적 프라이머 농도는 아데노바이러스 프라이머 100 nM, 엔테로바이러스 프라이머 250 nM이 적절하다.

또한 환경수 샘플에 존재하는 바이러스 종간에 농도차가 현저히 다를수 있어 고농도로 존재하는 바이러스가 저농도의 바이러스의 PCR 반응을 방해하여 정확한 PCR이 수행되지 않을 가능성이 있어 실험하였으나, 본 발명의 다수 네스티드 PCR은 바이러스 혼합물의 농도차에 상관없이 일정한 결과를 나타내었다.

본 발명에선 한강의 세 곳에서 일년간에 4번에 거쳐 채집한 12종의 강물과 실험실에서 일년간 4번에 거쳐 채집한 4종의 수돗물을 대상으로 다수 네스티드 PCR을 수행하고 본 발명의 다수 네스티드 PCR의 정확성과 민감도를 세포배양과 단일 PCR결과로 비교하였다. 그 결과 세포배양과 다수 네스티드 PCR 결과가 상이한 샘플이 소수 발견되었으나, 이는 세포배양에서 바이러스에 의해 용해된 세포가 본 발명의 다수 네스티드 PCR로 검출되는 엔테로바이러스와 아데노바이러스이외의 바이러스에 의한 것도 포함하므로 세포배양결과와 다수 네스티드 결과가 동일하지 않은 것은 당연한 것이며 상기 세포배양은 분석시간이 길고 배양가능한 바이러스만 세포배양으로 결정할 수 있으며 배양가능한 바이러스의 범위는 분석에 사용한 세포주에 따라 달라질 수 있어 사용에 제한이 따른다.(Tani, N., Shimamoto, K., Ichimura, K., Nishii, Y., Tomita, S., and Oda, Y. 1992. Enteric virus level in river water. Water Res. 26: 45?8.) 또한 본 발명의 다수 네스티드 PCR분석은 파지티브(positive) 결과가 감염성 바이러스의 존재뿐만 아니라 바이러스 오염과 잠재적인 바이러스의 위험성을 나타내어 환경수에서 바이러스 오염의 일반적인 측정 기술로 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 환경수 채취와 바이러스분리

강물과 수돗물샘플 채취

강물샘플은 한강의 다른 세 곳에서 1998년 4월에서 1999년 2월간 4번 채집하였다. 채취 장소 PD와 JS는 한강 주류이고 다른 한곳 WS는 PD와 JS 사이에 한강으로 유입되는 지류이다. 각 위치는 도 1에 나타나 있으며 세 곳의 강물은 서울의 수돗물로 제공되고 있다.

상기 PD/JS/WS의 1997년 연평균 생화학적 산소 요구량, 부유고형물, 대장균양은 하기 표 1과 같다.(Ministry of Environment, Republic of Korea. 1998. Environmental Statistics Yearbook Vol. 11. Ministry of Environment, Republic of Korea.)

	생화학적 산소 요구량(BOD)	부유고형물(SS)	대장균양
PD	1.5	8.2 mg/L	6.0 x 10³MPN/100㎖
JS	2.6	8.8 mg/L	1.4 x 10³MPN/100㎖
Ws	3.2	10.9 mg/L	2.6 x 10⁵MPN/100㎖

채취한 강물은 전처리 필터인 5 ㎛ X 1 ㎛ 카트리지 필터로 바이러스의 필터 흡착을 방해하는 강물 샘플에 있는 미립자를 제거하였다. 그 후 전여과한 300 ℓ의 물을 1MDS필터(CUNO Inc., Meriden, Conn.)로 여과하였다. 수돗물 샘플은 1997년 12월에서 1998년 7월간 네 번 실험실에서 채집하여 전여과 과정 없이 1MDS필터로 여과하였다. 필터에 흡착된 바이러스들은 1.5 % 비프 추출액을 포함한 0.05 M 글리신 완충용액 pH 9.5로 용출시켰다. 상기 용출물은 1 M 염화수소로 pH 7.2로 적정하고 용출물 1 L에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000를 최종농도 13 %로, 염화나트륨을 최종농도 0.2 M 이 되도록 가하여 4 ℃에서 12시간 부드럽게 흔들면서 반응을 시켰다. 반응 후 용출물은 7,000 xg로 30분간 원심분리하고 펠렛은 10 mM PBS(Phosphate buffered saline) 30 ㎖을 넣어 녹여 0.2 ㎛의 구멍 필터로 여과한 다음 -70 ℃에 보관하였다.

RNA와 DNA 동시추출

상기 환경수에서 추출한 바이러스 부유물 25 ㎕에 실리카 기질 용액 20 ㎕(Bioneer Co., Chungbuk, Korea)와 용해완충용액(lysis buffer: 0.1 M 트리스-염산 100 ㎖에 120 g GuSCN이 포함된 pH 6.4 용액, NaOH로 pH 8로 적정된 0.2 M EDTA 22 ㎖, 2.6 g의 트리톤 X-100) 450 ㎕를 첨가하여 10분간 상온에서 둔 후 세척완충용액(0.1 M 트리스-염산 100 ㎖, 12 g GuSCN, pH 6.4) 500 ㎕로 두 번 세척하고 70 % 에탄올로 두 번, 아세톤으로 한번 세척하였다. 아세톤을 증발시킨 후 펠렛은 10 mM 디티오트레이톨(dithio threitol)과 1 U/㎕ RNasin(promega)이 포함된 25 ㎕의 DEPC(diethyl pyrocarbonate treated deionized water)에 녹이고 원심분리로 상층액만 분리하였다.

[실시예 2] 프라이머 제조

하기 표 2의 아데노바이러스와 엔테로바이러스의 검출에 이용할 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하였다.(Allard, A., Albinsson, B., and Wadell, G. 1992. J. Med. Virol. 37: 149-57 ; Leparc, I., Aymard, M., and Fuchs, F. 1994. Mol. Cell. Probe, 8: 487-95.) 아데노바이러스의 프라이머서열은 핵손(hexon)유전자 위치의 것으로 사용하였고 프라이머의 특이성은 47가지의 사람 아데노바이러스 혈청타입에 대하여 수행하여 확인되었다.(Puig 1994) 아데노바이러스에서 외부 프라이머 AV1과 AV2는 300 bp 아데노바이러스 PCR 생산물을 제조하고, 내부 프라이머 AV3과 AV4는 142 bp의 아데노바이러스 PCR 생산물을 제조한다. 엔테로바이러스의 프라이머 서열은 엔테로바이러스 혈청타입 중 가장 보존적인 5-말단 비전사부분을 선택하였다. 엔테로바이러스에서 프라이머 EV1과 EV2는 435 bp 엔테로바이러스유전자 단편을 증폭하고 반면에 프라이머 EV1과 프라이머 EV3는 362 bp의 엔테로바이러스 유전자 단편을 증폭한다.

	위치	프라이머	서열 5' -> 3'
아데노바이러스	Hexon	AV 1	GCC GCA GTG GTC TTA CAT GCA CAT C
		AV 2	CAG CAC GCC GCG GAT GTC AAA GT
		AV 3	GCC ACC GAG ACG TAC TTC AGC CTG
		AV 4	TTG TAC GAG TAC GCG GTA TCC TCG CGG TC
엔테로바이러스	5'NTR	EV 1	CAA GCA CTT CTG TTT CCC CGG
		EV 2	ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA
		EV 3	CTT GCG CGT TAC GAC

[실시예 3] 다수 네스티드 PCR

역전사

아데노바이러스는 두 가닥의 DNA로 이루어진 바이러스이고 엔테로바이러스는 한 가닥의 RNA로 이루어진 RNA바이러스이므로, RNA를 DNA로 전환시키는 역전사 반응을 수행하였다. 엔테로바이러스 핵산 추출물 5 ㎕에 역전사 혼합물(50 mM 트리스-염산(pH 8.3), 75 mM 염화칼륨, 10 mM DTT, 3 mM 염화마그네슘, 0.5 mM dNTP, 1.23 ㎛ EV2 프라이머, 50 U M-MLV 역전사효소 5 ㎕과 10 U의 RNasin을 첨가하였다. 역전사는 42 ℃에서 45분간 수행하였고 반응 후 역전사효소를 비활성화시키기 위하여 95 ℃에서 5분간 열처리하였다.

1차 다수 네스티드 PCR

반응이 끝난 역전사 반응물 10 ㎕를 40 ㎕의 PCR 혼합물(최종 농도 :10 mM 트리스-염산(pH8.8), 50 mM 염화칼륨, 0.1 % 트리톤 X-100, 200 uM dNTP, 1.25 U taq 중합효소, 0.25 uM 엔테로바이러스 프라이머 EV1, 0.1 uM 아데노프라이머쌍AV1, AV2, 1.5 mM 염화마그네슘)과 혼합하였다. PCR는 하기 표 3의 조건으로 증폭단계를 실행하였다.

단계	순서	온도	시간	사이클 수
변성단계	1	94 ℃	4분	1번
첫 증폭단계	2	95 ℃	30초	2->3->4순서로 35번
	3	55 ℃	30초
	4	72 ℃	1분
최종 증폭단계	5	72 ℃	7분	1번

PCR 수행결과 435 bp의 엔테로바이러스 유전자단편과 300 bp의 아데노바이러스 유전자단편이 증폭되었다.

2차 다수 네스티드 PCR

상기 1차 다수네스티드 PCR로 증폭된 유전자 단편을 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편내의 특정서열을 다시 증폭하였다. 먼저 상기의 첫 번째 PCR 산물 1 ㎕를 취하여 0.25 ㎛ 의 엔테로바이러스 프라이머 쌍 EV1 와 EV2, 0.1 ㎛의 아데노바이러스 네스티드 프라이머쌍 AV3과 AV4가 포함된 새로운 PCR 반응 혼합물 30 ㎕에 첨가하여 표 3의 PCR 조건과 동일하게 증폭하였다. 그 결과 362 bp의 엔테로바이러스와 142 bp의 아데노바이러스 유전자 단편이 증폭되었다.

도 2는 본 발명의 다수 네스티드 PCR로 증폭된 엔테로바이러스와 아데노바이러스의 유전자조각을 아가로즈젤상에서 전기영동한 것으로, 엔테로바이러스의 프라이머농도를 250 nM로 고정하고 아데노바이러스 프라이머의 농도를 달리하여 각 조건에 따른 PCR 결과를 보았다. 레인 1은 분자량을 나타낸 것이고 레인 2는 아데노바이러스 프라이머AV1과 AV2를 50 nM로 1차 PCR을 수행한 것이고, 레인 3은 아데노바이러스 프라이머AV1과 AV2를 150 nM로 1차 PCR을 수행한 것이고, 레인 4는 아데노바이러스 프라이머AV1과 AV2를 100 nM로 1차 PCR을 수행한 것이고, 레인 5는 아데노바이러스 프라이머AV3과 AV4를 50 nM로 레인 2의 1차 PCR 생산물에 첨가하여 2차 PCR을 수행한 것이고, 레인 6은 아데노바이러스 프라이머AV3과 AV4를 150 nM로 레인 3의 1차 PCR 생산물에 첨가하여 2차 PCR을 수행한 것이고, 레인 7은 아데노바이러스 프라이머AV3과 AV4를 100 nM로 레인 4의 1차 PCR 생산물에 첨가하여 2차 PCR을 수행한 것이고, 레인 8은 실시예 2의 시료를 10배 희석한 후 아데노바이러스 프라이머를 50 nM로 1, 2차 PCR을 수행한 것이고, 레인 9는 실시예 2의 시료를 10배 희석한 후 아데노바이러스 프라이머를 150 nM로 1, 2차 PCR을 수행한 것이고, 레인 10은 실시예 2의 시료를 10배 희석한 후 아데노바이러스 프라이머를 100 nM로 1, 2차 PCR을 수행한 것이다. 도 2의 PCR 생산물은 아데노바이러스 프라이머가 100 nM로 엔테로바이러스 프라이머가 250 nM로 첨가되어 다수 네스티드 PCR을 수행하였을 때 가장 정확한 결과를 나타내었다.

[실험예]

네스티드 PCR 생산물의 서열확인

실시예 3의 증폭된 PCR 생산물을 젤에 전기영동하여 밴드를 분리하고 정제하여 농축시켰다. 정제한 네스티드 PCR 생산물은 pGEM-T 벡터에 접합시키고E. coli의 DH5α에 형질전환시켰다. lacZ를 이용한 스크니링으로 형질전환체E. coil를 선별하여 위저드 미니 프랩(wizard mini-preps; Promega Co., Madison, WI)으로DNA를 분리하였다. 총 아데노바이러스 4 클론과 엔테로바이러스 4클론을 ALKexpress DNA 자동분석기(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에서 T7프라이머와 Cy5 오토레드 서열분석키트로 서열분석하였다. 서열은 EMBL/GenBank 데이터에서 등록된 서열을 비교하였다.

단일 PCR

실시예 3의 다수 네스티드 PCR을 단일 PCR과 비교하였다. 단일 PCR은 실시예 3의 동일한 샘플을 아데노바이러스 프라이머만을 가하여 PCR하고 또한 엔테로바이러스 프라이머만을 가하여 PCR하였다. 하기 표 4에서 다수 네스티드 PCR과 단일 PCR을 비교한 결과 다수 네스티드 PCR이 단일 PCR에 비해 고민감도를 나타내었다.

세포배양

실시예 1에서 채취한 각 샘플 0.8 ㎖씩을 4일 지난 BGM세포의 조직배양판에 접종하였다. 조직배양판은 2주간 37 ℃에서 배양하였다. 세포배양 샘플은 얼리고 녹이는 과정을 3번 반복하고 두 번째의 신선한 단층의 BGM 세포에 접종하였다. 배양 후 현미경으로 관찰하여 세포의 사멸현상이 일어난 경우를 바이러스양성으로 판정하였고 바이러스 수치결정은 각 샘플마다 0.8㎖씩을 5개의 조직배양판에 접종하여 최적확수법(Most probable number)으로 도출하였다.

샘플	PCR 결과	세포배양(평균 MPN/mL)
	실험한시료의 부피(mL)		엔테로바이러스	아데노바이러스
	실험한시료의 부피(mL)		단일PCR	다수PCR	단일PCR	다수PCR
PD	1998,4	60	+ - -	+ - -	+ - -	- - -	2.3 x 10^-5(3.6x10^-6- 7.7x10^-5)
	1998,7	50	+ - -	+ - -	- - -	+ - -	1.1 x 10^-4(1.5x10^-5- 2.7x10^-4)
	1998,10	36	- - -	- - -	- - -	+ - -	< 8 x 10^-5(< 1.2x10^-6- < 2.7x10^-4)
	1999,2	50	+ - -	+ - -	+ + -	+ + -	< 2.8x 10^-5(< 4.2x10^-6- < 9.4x10^-5)
JS	1998,4	40	+ - -	+ + -	- - -	- - -	8.0 x 10^-5(5.3x10^-6- 2.1x10^-4)
	1998,7	50	+ - -	- - -	- - -	- - -	6.4 x 10^-5(7.1x10^-5- 7.7x10^-4)
	1998,10	40	- - -	- - -	- - -	+ - -	< 3.5 x 10^-5(< 5.3x10^-6- < 1.2x10^-4)
	1999,2	50	+ + -	+ + -	+ - -	+ - -	< 3.5 x 10^-5(< 5.3x10^-6- < 1.2x10^-4)
WS	1998,4	36	+ - -	+ - -	+ - -	+ - -	8.4 x 10^-4(2.0x10^-4- 2.1x10^-3)
	1998,7	33	+ - -	+ - -	+ - -	+ - -	3.0 x 10^-4(7.1x10^-5- 7.7x10^-3)
	1998,10	28	+ - -	+ - -	+ - -	+ - -	3.6 x 10^-4(8.5x10^-5- 9.2x10^-4)
	1999,2	50	+ + -	+ + -	+ + +	+ + +	6.4 x 10^-5(4.3x10^-6- 1.7x10^-4)
수돗물	1997,12	500	+ + +	+ + -	+ - -	+ + -	6.4 x 10^-6(4.3x10^-7- 1.7x10^-5)
	1998,1	500	+ + -	+ - -	+ + -	+ - -	6.4 x 10^-6(4.3x10^-7- 1.7x10^-5)
	1998,4	1700	+ - -	+ + -	+ - -	+ - -	3.4 x 10^-6(4.5x10^-7- 8.1x10^-6)
	1998,7	200	+ + -	+ + +	+ - -	+ - -	7.0 x 10^-6(1.1x10^-6- 2.4x10^-5)

상기 표 4는 12개의 강물샘플과 4개의 수돗물샘플을 PCR과 세포배양으로 분석하여 나타내었다. 상기 표 4의 +, -, - 는 샘플의 원액 , 10배 희석, 100배 희석 한 후 PCR을 수행하였을 때 +는 PCR 생산물이 있음을 -는 PCR 생산물인 없음을 나타낸 것이다. 따라서 100배 희석했을 때(즉 기호의 세 번째 순서에) +로 표시된 것은 100배로 희석하여도 PCR 생산물이 생길 만큼 많은 양의 바이러스가 샘플에 포함되어 있음을 뜻한다. PCR분석의 결과는 아데노바이러스와 엔테로바이러스 모두에 대한 16개의 샘플 중 10 샘플에서 단일 PCR 결과와 동일하였고, 바이러스는 연중 2월의 강물 샘플에서 가장 높은 수치로 나타났다. PCR로 추정한 바이러스의 양은 주류에서보다 지류에서 더 높았으며 아데노바이러스와 엔테로바이러스 모두 분석한 수돗물 샘플에서 발견되었다.

또한 동일한 샘플들을 세포배양으로 분석하였다. 지류(6.4 x 10^-5MPN/㎖- 8.4 x 10^-4MPL/㎖)에서 채집한 샘플들은 주류의(2.3 x 10^-5MPN/㎖ - 1.1 x 10^-4MPN/㎖, p<0.06)샘플보다 더 많은 바이러스를 보유하고 있었으나 세포배양분석에 의해 추정된 바이러스의 양은 2월 샘플에서 가장 낮게 나와 PCR을 통한 바이러스 양과는 모순이 있었다. 세포배양과 PCR간의 불일치는 다음 사실들을 고려한다면 설명되어질 수 있다. 첫째, PCR은 세포배양보다 더 민감하지만 PCR 결과는 PCR에 사용한 분석부피가 세포배양에서 사용한 분석부피보다 소량이어서(약 몇 백배) 세포배양에서는 파지티브(positive)으로 나타나나 PCR에서는 네그티브(negative)일 수 있다. 두 번째로 세포배양은 감염가능한 세포주에서만 배양되는 바이러스를 감지하므로 세포배양에 의해 다른 감염성의 바이러스를 감지할 수 없다. 하지만 PCR 분석은 비감염성의 바이러스 파티클이나 세포배양으로 감지 할 수 없는 바이러스 핵산을 감지하여 PCR에선 파지티브 결과를 보이지만 세포배양에선 네그티브 결과가 나올 수 있다.

상기의 언급한 바와 같이 본 발명의 환경수에서 바이러스 오염 검출방법은 다수 네스티드 PCR로 아데노바이러스와 엔테로바이러스를 동시에 검출할 수 있을 뿐만 아니라 환경수에 오염된 바이러스의 오염정도를 쉽게 알 수 있다.

Claims

환경수에서 채취한 시료에 엔테로바이러스 프라이머들과 아데노바이러스 프라이머들을 가하여 동시에 PCR을 수행하고 증폭되어진 바이러스 DNA를 아가로즈 젤상에서 확인하는 것을 포함하는 바이러스 오염검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 프라이머들은 75 nM 내지 130 nM로, 상기 엔테로바이러스 프라이머들은 200 nM 내지 300 nM로 PCR반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스 오염검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 프라이머들은 서열번호 1인 EV1 프라이머, 서열번호 2인 EV2 프라이머, 및 서열번호 3인 EV3 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 오염 검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 프라이머들은 서열번호 4인 AV1 프라이머, 서열번호 5인 AV2 프라이머, 서열번호 6인 AV3 프라이머, 및 서열번호 7인 AV4 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 오염 검출방법.
제 1항에 있어서, 상기 PCR은 다수 네스티드 PCR이며,

(a) 시료에 엔테로바이러스 프라이머 EV2와 역전사효소로 역전사 PCR을 수행하여 엔테로바이러스의 RNA를 DNA로 치환하고;

(b) 상기 역전사 PCR 반응물에 아데노바이러스 프라이머AV1/AV2와 엔테로바이러스 프라이머 EV1을 첨가하여 1차 PCR을 수행하고; 및

(c) 상기 1차 PCR 반응물에 아데노바이러스 프라이머 AV3/AV4 및 엔테로바이러스 프라이머 EV3을 동시에 첨가하여 2차 PCR하는 것을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이러스 오염 검출방법.
제 5항에 있어서, 상기 1차 PCR은

(a) 94 ℃에서 4분간 변성단계;

(b) 95 ℃, 30초; 55 ℃, 30초; 및 72 ℃, 1분의 사이클을 35회 실시하는 증폭단계; 및

(c) 72 ℃, 7분 동안 실시하는 최종증폭단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 오염 검출방법.
제 5항에 있어서, 상기 2차 PCR을 1차 PCR과 동일한 조건으로 실시하는 것을 특징으로 하는 바이러스 오염 검출방법.