KR101382850B1

KR101382850B1 - 박과 식물에 대한 병원성 바이러스 검출 마커 및 이를 이용한 검출방법

Info

Publication number: KR101382850B1
Application number: KR1020110095935A
Authority: KR
Inventors: 김국형; 이종승; 조원경; 이수헌; 최홍수
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2014-04-09
Also published as: KR20130032922A

Abstract

본 발명은 박과 또는 가지과 식물에 대한 병원성 바이러스 검출 마커 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로서, 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 박과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 또한 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 세트, 및 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 가지과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

Description

박과 식물에 대한 병원성 바이러스 검출 마커 및 이를 이용한 검출방법{Genetic Markers for Detecting Quarantine Plant Viruses and Methods for Detecting by Using Thereof}

본 발명은 박과 또는 가지과 식물에 감염된 병원성 바이러스 검출을 위한 마커 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.

전 세계적인 무역의 증가로 다양한 종류의 식물이 한국으로 수입되고 있다. 따라서 잠재적이거나 불명확한 병원균, 특히 식물 바이러스가 곡물, 사료, 견목(hard woods), 묘목, 채소, 과일 및 한약재 등의 숙주식물과 함께 들어올 가능성이 있다. 최근 다양한 바이러스들에 대한 높은 민감성을 가진 몇몇 숙주 식물의 수입이 국립식물검역소(National Plant Quarantine Service; NPQS)에 의해 엄격하게 금지되고 있다. 그러나 많은 식물 바이러스들에 대한 숙주 범위가 잘 알려지지 않았기 때문에 한국에는 보고되지 않은 외래 식물 바이러스가 알려지지 않은 숙주 식물을 통해 들어올 수 있다.

보고되지 않은 식물 바이러스들이 외국으로부터 들어오는 것을 방지하기 위해서, 검역을 위한 특이적이고 민감하며 빠른 검출방법을 준비할 필요가 있다. 알려진 방법 중의 하나는 역전사 중합연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)에 기초한 방법으로서, 다른 방법들보다 우수하다(Park and Kim, 2004). 따라서 본 발명자들은 RT-PCR에 기초한 진단용 검출시스템을 위하여, 수입되는 식물들을 통해 국내로 도입될 수 있지만 한국에서 보고되지 않은 식물 바이러스들의 RT-PCR 검출용 특이적 프라이머 세트를 개발하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 다양한 식물 바이러스들 중에서 5개의 식물 단일가닥 RNA 바이러스를 선택하였는데, 이는 오이 엽맥 황화 바이러스(Cucumber vein yellowing virus; CVYV)(Janssen et al., 2007), 조롱박 황화 발육장애 바이러스(Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV)(Yakoubi et al., 2007), 감자 황반 모자이크 바이러스 Potato aucuba mosaic virus ;PAMV)(Manoussopoulos, 2001), 감자 노란색 난쟁이 바이러스(Potato yellow dwarf virus; PYDV)(Ghosh et al., 2008), 토마토 황화 바이러스(Tomato chlorosis virus; ToCV)(Wintermantel et al., 2005)이다. 이러한 바이러스들은 박과 또는 가지과에 속하는 식물에 심각한 경제적 손실을 가져온다. 이들은 다양한 속(genus) 및 과(family)에 속하며 표 1에 나타낸 바와 같이 뚜렷한 생물학적 특성을 보인다. 예를 들면, CYSDV 및 ToCV는 클로스테로바이러스(Closteroviridae) 과에 속하는 크리니바이러스(Crinivirus) 속에 해당하지만, CVYV, PAMV 및 PYDV는 포티바이러스(Potyviridae), 알파플렉시바이러스(Alphaflexiviridae) 및 라브도바이러스(Rhabdoviridae) 과에 속하는 이포모바이러스(Ipomovirus), 포텍스바이러스(Potexvirus) 및 뉴클레오라브도바이러스(Nucleorhabdovirus) 속에 해당한다(ICTV, 2010). CVYV, CYSDV, 및 ToCV의 3종의 바이러스는 보통 베미시아 타바시(Bemisia tabaci)에 의해 전달되지만(Berdiales et al., 1999; Martinez-Garcia et al., 2004; Morris et al., 2006), PAMV 및 PYDV는 진딧물(aphid) 및 곤충인 아갈리아 콘스트릭타(Agallia constricta)(Ghosh et al., 2008; Manoussopoulos, 2001)를 보통 벡터로 사용한다. CVYV 및 CYSDV는 많은 수의 숙주 식물들, 특히 오이, 멜론 및 호박을 포함하는 박과 식물들을 감염시킨다(Janssen et al., 2007; Yakoubi et al., 2007). 이와 대조적으로 PAMV, PYDV 및 ToCV는 감자와 토마토를 포함하는 가지과 식물을 감염시킨다(Bandyopadhyay et al., 2010; de Bokx, 1975; Louro et al., 2000).

<표 1> 본 발명에 사용된 식물 바이러스 목록

스페인 및 포르투갈을 포함하는 남유럽에서는 거대한 경제 손실을 일으키는 상기 5종의 모든 바이러스의 발생이 보고되었다(Cuadrado et al., 2001; Font et al., 2004; Louro et al., 2000; Lozano et al., 2004). 예를 들면, 말라가, 알메리아 및 스페인에서 ToCV가 처음으로 발생한 이래로, 잎의 황화(foliar chlorosis)와 함께 토마토에 감염된 ToCV는 특히 스페인의 남부 및 동부 지방에서 점차적으로 강력한 전염성 바이러스가 되었다(Font et al., 2004). 지난 몇 년 동안, ToCV는 새로운 지역 및 파프리카와 같은 식물로 퍼져 나갔다(Lozano et al., 2004). 이와 더불어, 알메리아(스페인)의 온실에서 자란 오이는 2000년도에 CVYV에 의해 크게 피해를 입었다(Cuadrado et al., 2001).

이들 바이러스는 2종 이상 복합 감염되어 있는 경우가 많으며, 바이러스에 감염된 식물체의 외관상 병징은 재배품종이나 작형, 환경요인에 따라 매우 다양하고 복합적으로 나타나므로 육안으로 바이러스를 정확하게 진단하기는 매우 어렵다. 한편, 일반적으로 사용되고 있는 바이러스 진단용 항체시약은 한 종의 바이러스만 진단이 가능하므로 복합 감염된 시료를 진단해야 할 경우 수종의 시약을 사용하거나, 여러 번 진단해야 하는 문제점이 있다.

한편, 한국특허등록 제10-496015호 “큐리녹반모자이크 바이러스 진단용 특이 프라이머”, 한국특허등록 제10-0703599호 “베고모바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 검출방법 및 키트”, 한국특허등록 제10-496017호 “박과작물 발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합” 등 식물 바이러스 검출용 프라이머를 개시하고 있다. 상기 한국등록특허 제10-496017호는 박과작물에 흔하게 발생하고, 이미 국내에 보고된 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합이다. 그러나 국내에서는 보고된 적이 없는 바이러스에 특이적인 검출용 프라이머 세트는 없었다. 이에 본 발명자들은 국내에서는 보고된 적이 없는 바이러스에 특이적인 검출용 프라이머 세트가 필요하다는 점을 인식하고 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 박과 또는 가지과 식물에 대한 병원성 바이러스를 동시에 검출하기 위한 마커로서 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 박과류 또는 가지과류에 감염된 바이러스의 동시 검출 방법 및 검출 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 제1의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 박과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

보다 상세하게는, 상기 바이러스는 오이 엽맥 황화 바이러스(Cucumber vein yellowing virus; CVYV) 또는 조롱박 황화 발육장애 바이러스(Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV)인 것을 특징으로 하는 박과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 제2의 양태는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 세트, 및 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 가지과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

보다 상세하게는, 상기 바이러스는 감자 황반 모자이크 바이러스 Potato aucuba mosaic virus; PAMV), 감자 노란색 난쟁이 바이러스(Potato yellow dwarf virus; PYDV), 토마토 황화 바이러스(Tomato chlorosis virus; ToCV)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 가지과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명의 프라이머는 DNA 마커의 증폭산물을 분석할 수 있는 시그날을 제공하도록 적합하게 표지될 수 있다. 상기 적합한 표지로는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정 등의 방법에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

또한 상기 프라이머의 염기서열은 염기서열의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열을 포함한다.

상기에서 변형서열의 경우 실질적으로 상기 바이러스의 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다. 또한 개별 변형서열은 다른 바이러스 게놈과 혼성화가 가능하지 않은 정도의 변형이어야 한다. 프라이머로 사용되는 경우 변형된 염기의 수는 혼성화능을 실질적으로 유지하는 한 특별한 한정을 요하지는 아니하나, 통상 변이의 결과 얻어진 염기서열의 총 염기 개수가 10∼50개 정도가 바람직하다.

변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되어야 할 것이다.

본 발명의 제3의 양태는 (a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 청구항 제5항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박과류 또는 가지과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 제4의 양태는 박과류 또는 가지류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출 키트를 제공한다.

상기 검출 키트는 PCR 완충액, dNTP, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함한다. 추적키트는 포함되는 프라이머는 검출하고자 하는 목적 바이러스에 따라 달라질 수 있으며, 프라이머에 따라 PCR 반응조건이 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 프라이머의 GC%, 및 Tm에 따라 PCR 반응조건을 조절하는 것이 바람직하며, 가장 최적의 반응조건에서 PCR될 수 있는 프라이머를 포함하는 것이 좋다.

바이러스들을 검출하기 위해서 바이러스 특이적 RT-PCR 및 혈청학적 접근방법은 널리 이용된다. 많은 실험 단계가 필요하고 항체를 만드는데 시간이 걸리는 혈청학적 접근방법에 비해 본 발명에 사용된 RT-PCR은 단순하고 빠르며 재현가능하고 정확하다. 한편 웨스턴 블랏(western blot)이나 엘라이저(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)는 많은 양의 샘플이 요구되지만, RT-PCR는 바이러스 감염된 잎의 작은 조각과 같은 소량의 샘플만으로도 충분하다. 생물학적 시료는 공항이나 항구에서 오랜 시간 존재할 수 없고, 많은 샘플들을 동시에 시험해야 하므로 검역을 위해서는 빠를 뿐만 아니라 정확하고 특이적인 결과를 얻는 것이 필요하다. 따라서 본 발명의 RT-PCR 기반의 검출 시스템은 다른 방법들보다 식물 바이러스 검역에 있어서 우수한 효과가 있다.

도 1은 총 RNAs의 분리 및 새롭게 개발된 프라이머 세트을 이용한 바이러스 특이적 dsDNA 단편의 RT-PCR 증폭결과를 나타낸다. (A) 바이러스 감염된 식물 잎으로부터 분리된 총 RNAs의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸다. M: λ DNA/HindIII 사이즈마커(600 ng/5 μl), lane 1: CVYV, lane 2: CYSDV, lane 3: PAMV, lane 4: PYDV, lane 5: ToCV (B) 바이러스 특이적 dsDNA 단편의 RT-PCR 증폭결과를 나타낸다. M: λ DNA/HindIII 사이즈마커(600 ng/5 μl), lane 1: CVYV-1 프라이머 세트, lane 2: CYSDV-1 프라이머 세트, lane 3: PAMV-1 프라이머 세트, lane 4: ToCV-1 프라이머 세트, lane 5: PYDV-1 프라이머 세트, lane 6: PYDV-2 프라이머 세트, lane 7: PYDV-3 프라이머 세트
도 2는 프라이머 세트들의 특이성 및 민감도를 개선하기 위한 구배(Gradient) RT-PCR 결과를 나타낸다. M1: λ DNA/HindIII 마커(600 ng/5 μl), M2: 100 bp DNA ladder 마커(NEB, UK), lane 1, 4, 7, 10, 13, 16 및 19: 어닐링 온도 50 ℃; lane 2, 5, 8, 11, 14, 17 및 20: 어닐링 온도 53.2 ℃; lane 3, 6, 9, 12, 15, 18 및 21: 어닐링 온도 56.7 ℃
도 3은 새롭게 개발된 프라이머들의 바이러스 검출 특이성에 대한 RT-PCR 결과이다. 증폭된 dsDNA 단편들을 1% 아가로스 겔에서 분리하였고, EtBr에서 염색하였다. 건강한 N. benthamiana (lane 1, 4, 7, 10 및 13)와 토마토 (lane 2, 5, 8, 11 및 14) 및 바이러스 감염된 잎들(lane 3, 6, 9, 12 및 15)에서 준비된 cDNAs와 각각의 프라이머 세트를 PCR반응에 사용하였다. M: 100 bp DNA ladder 마커(NEB, UK)
도 4는 RT-PCR을 위한 어닐링 온도의 최적화 결과를 나타낸다. (A) 어닐링 온도 53 ℃, (B) 어닐링 온도 56 ℃에서 각각의 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭된 dsDNA 단편을 보여준다. lane 1: CVYV-2 프라이머 세트, lane 2: CYSDV-2 프라이머 세트, lane 3: PAMV-2 프라이머 세트, lane 4: ToCV-2 프라이머 세트, M1: λ DNA/HindIII 마커(600 ng/5 μl), M2: 100 bp DNA ladder 마커(NEB, UK)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: RNA 추출

본 발명에 사용된 5종의 식물 바이러스는 바이러스 감염된 건조 식물 조직 또는 -20 ℃에 보관된 총 식물 핵산 추출물 형태로 식물 바이러스 수집처인 DSMZ GmbH(Braunschweig, Germany)로부터 입수하였다. 모든 바이러스들은 NPQS로부터 승인 하에 수입되었고, 모든 실험들은 NPQS 직원과의 긴밀한 협조 하에 수행되었다.

니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 및 토마토의 건강한 잎과 바이러스에 감염된 식물 조직로부터의 총 RNA의 추출은 이전의 논문에서 사용된 방법인 Trizol Reagent? (Molecular Research Center, Inc., USA), 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol) (25 : 24 : 1) 추출, 에탄올(ethanol) 침전법을 이용하였다(Park and Kim, 2004). 총 RNA의 정량은 NanoPhotometer^TM (Implen GmbH, Germany)를 이용하였으며, 1% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 전기영동을 하였다.

실시예 2: 프라이머 제작

RT-PCR을 위하여, 각각의 바이러스의 염기서열(nucleotide sequence)를 바탕으로 최종 PCR 산물의 분자크기가 달라서 각종 바이러스의 분리 및 동정이 가능하도록 프라이머를 제작하였다. CVYV[5'-GAATGGCACAAGTGATGAGAGG-3'(서열번호 1)/5'-ATTAGCGGCAAGTGTCTGGTG-3'(서열번호 2) 또는 5'-GGCACAAGTGATGAGAGGAAAAC-3'(서열번호 3)/5'-CATTAGCGGCAAGTGTCTGGTG-3'(서열번호 4)], CYSDV[5'-GGACGGCTGACTTTATCAATTATG-3'(서열번호 5)/5'-TGTGACACGTTATAATATTTCTTTTC-3'(서열번호 6) 또는 5'-CATGCACGGTGACCAAAAGAAG-3'(서열번호 7)/5'-CAAAGCCTGGCATTTCATCAAC-3'(서열번호 8)] 그리고 ToCV[5'-GAGGTTAGACCCAAAATGTCCG-3'(서열번호 19)/5'-CTGAGATATTCATCAACGAACCAT-3'(서열번호 20)]의 경우 코트 단백질(coat protein) 지역의 잘 보존된 염기서열 부분을 이용하여 RT-PCR 프라이머를 제작하였다. 6개의 ORF로 이루어진 PAMV[5'-GCTGTGGGCTGTGTGTAAAG-3'(서열번호 9)/5'-TCCAATTGTCTTTAATGAACGC-3'(서열번호 10)]를 검출하기 위해서, 추정 중합효소의 서열을 RT-PCR 증폭을 위해 사용하였다. PYDV[5'-CGCTCAGTTCGTGCAGTTGT-3'(서열번호 13)/5'-TCTGATTCTAGTCCACGCTGC-3'(서열번호 14) 또는 5'-GATGCAGTCAGCGGAAGTCAC-3'(서열번호 15)/5'-GGTAATGGCTGGCAGTCCA-3'(서열번호 16)]의 경우, 음성 가닥(negative strand)으로부터 전사되는 RNA 서열을 바탕으로 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein) 부분을 이용하여 RT-PCR용 특이적 프라이머를 제작하였다. RT-PCR에 의해 예측되는 PCR 산물의 크기는 192bp내지 354bp이다. PYDV의 경우에는 3종류의 다른 프라이머쌍이 제작되었다(표 2). 모든 프라이머는 바이오니아(한국)에서 제작되었다.

<표 2> RT-PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 염기서열

실시예 3: cDNA 합성

분리된 총 RNA는 에티디움 브로마이드(ethidium bromide; EtBr)로 염색된 1% 아가로스 젤에서 정량하였다. 추출된 모든 총 RNA는 매우 좋은 품질을 나타냈다(도 1A). 분리된 총 RNA를 주형으로 하여 본 발명자들은 cDNA를 합성하였다. 각각의 바이러스에 대해서 2μg의 total RNA(5 μl), 10pmol 농도의 reverse primer(1μl), 3 μl의 2.5mM dNTPs 그리고 DEPC가 처리된 dH2O를 6 μl 넣어주고 65℃에서 5분간 변성(denature) 과정을 수행한다. 그리고 100 units의 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase; RT), M-MLV 5X buffer (5 μl), DEPC가 처리된 dH2O 4.5 μl를 RNA/nucleotide/primer가 섞여있는 혼합물(Promega, USA)에 넣어준다. RT반응은 42℃에서 1시간 동안 진행되며, RT반응을 종결시키기 위해서 1시간 후 80℃에서 3분 동안 반응시킨다.

실시예 4: 중합효소 연쇄반응 ( PCR )과 염기서열 분석

각각의 cDNA로부터 PCR 단편을 증폭하기 위해서, 2 μl의 cDNA 혼합물, 5 μl의 10X buffer, 3 μl의 2.5mM dNTPs, 2 μl의 프라이머 쌍 (표 2), 37.5 μl의 dH2O 그리고 2.5 unit의 Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 포함하는 50μl의 PCR mixture를 준비한다. PCR 산물은 94℃/3분 (1회); 92℃/20초, 53℃/1분, 72℃/1분 (30회); 72℃/10분 (1회)의 조건에 따라 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, USA)를 이용하여 반응하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 분리되어, QIAquick^?gelextractionkit(Qiagen)를 이용하여 추출하였다. DNA의 염기서열은 서울대학교 National Instrumentation Center for Environmental Management의 ABI Prism 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems)로 확인되었고, 염기서열은 BLAST 와 Clustal W에 의해 분석되었다.

합성된 cDNA를 주형으로 하여, 어닐링 온도 53℃에서 30초 동안 PCR을 수행하였다. 그 결과 두 개의 PCR 산물로 증폭된 PYDV-3을 제외한 모든 프라이머 쌍은 특이적 단편으로 증폭되었다(도 1B).

실시예 5: Gradient RT - PCR

프라이머 결합의 특이성을 높이기 위해서 어닐링 온도에 변화를 주는 gradient PCR을 수행하였다. PCR 산물은 94℃/3분 (1회); 92℃/20초, 50℃/1분, 72℃/1분 (30회); 72℃/10분 (1회), 94℃/3분 (1회); 92℃/20초, 53.2℃/1분, 72℃/1분 (30회); 72℃/10분 (1회), 94℃/3분 (1회); 92℃/20초, 56.7℃/1분, 72℃/1분 (30회); 72℃/10분 (1회) 의 조건에 따라 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, USA)를 이용하여 반응하였다. PCR 산물은 1% agarose gel 상에서 분리되었다(도 2). 그 결과, 어닐링 온도를 높이면 PCR 산물이 많이 증폭되는 것을 알 수 있었으나, PYDV-3 프라이머 쌍은 단일한 특이적 증폭 단편을 얻는 것은 실패하였다(도 2).

새롭게 제작된 프라이머 쌍의 바이러스 특이성을 시험하기 위해서, 건강한 N. benthamiana 와 토마토의 잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. 바이러스 특이적 프라이머 쌍은 오직 바이러스에 감염된 식물 잎의 각각의 바이러스에서만 검출되었고, 건강한 N. benthamiana 와 토마토로부터는 검출되지 않았다(도 3). 또한, 본 발명자들은 PYDV을 제외한 4개의 바이러스에서 프라이머 쌍을 추가적으로 제작하였다. CVYV, CYSDV 및 ToCV는 다른 CP 부분이, PAMV는 중합효소 부분이 프라이머 제작을 위해 이용되었다. 새롭게 제작된 프라이머들의 Tm에 대한 어닐링 온도는 53.5℃ 내지 59.4℃의 범위이다(표 2). 53℃의 어닐링 온도에서는 CYSDV-2 프라이머 세트만 예측했던 밴드로 증폭되었고, 다른 프라이머 세트들은 비특이적인 여러 개의 밴드로 증폭되었다. 이는 어닐링 온도가 각 바이러스에 대한 특이적인 밴드를 증폭시키는데 결정적이라는 것을 나타낸다(도 4A). 각 프라이머 쌍의 적합한 어닐링 온도를 찾기 위해서 56℃에서 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, CVYV-2와 CYSDV-2는 각각 예측대로 특이적 밴드로 증폭되었다(도 4B). 그러나 PAMV와 ToCV 프라이머 쌍은 비특이적 밴드가 강하게 나타나 단일 밴드를 얻는데 실패하였다. 본 발명을 통해 발명자들은 CVYV, CYSDV 및 PYDV 검출을 위한 효과적인 두 개의 프라이머 쌍과 PAMV 및 ToCV 검출을 위한 하나의 프라이머 쌍을 개발하였다. 또한 모든 프라이머 세트의 최적화된 어닐링 온도는 56℃로 결정되었다.

예측예 1 : RT - PCR 을 통한 식물바이러스의 동시 검출

박과류 식물에 감염된 바이러스를 동시에 검출하기 위하여, 상기 제작된 CVYV-1_F (서열번호 1) 및 CVYV-1_R (서열번호 2) 프라이머 세트와 CYSDV-2_F (서열번호 7) 및 CYSDV-2_R (서열번호 8) 프라이머 세트를 이용하여 동시에 RT-PCR 반응을 수행하면 334bp와 289bp 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이를 통해 박과류 식물에 감염된 오이 엽맥 황화 바이러스(Cucumber vein yellowing virus; CVYV) 또는 조롱박 황화 발육장애 바이러스(Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV)를 각각 또는 동시에 검출할 수 있을 것으로 예측된다.

한편, 가지과류 식물에 감염된 바이러스를 동시에 검출하기 위하여, PAMV-1_F (서열번호 9) 및 PAMV-1_R (서열번호 10) 프라이머 세트, PYDV-2_F (서열번호 15) 및 PYDV-2_R (서열번호 16) 프라이머 세트와 ToCV-1_F (서열번호 19) 및 ToCV-1_R (서열번호 20) 프라이머 세트를 이용하여 동시에 RT-PCR반응을 수행하면 338bp, 253bp 및 193bp 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이를 통해 가지과류 식물에 감염된 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV), 감자 노란색 난쟁이 바이러스(Potato yellow dwarf virus; PYDV) 또는 토마토 황화 바이러스(Tomato chlorosis virus; ToCV)를 각각 또는 동시에 검출할 수 있을 것으로 예측된다.

<참고문헌>

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Claims

(a) 박과류 식물로부터 총RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 총RNA으로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(c)) 상기 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트, 완충용액, dNTPs, DNA 중합효소를 한 튜브(tube)에 넣어주는 단계;
(d) 상기 튜브를 이용하고, 어닐링 온도를 56℃로 하여, PCR을 수행하는 단계; 및
(e) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출 방법.
청구항 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스는 오이 엽맥 황화 바이러스(Cucumber vein yellowing virus; CVYV) 또는 조롱박 황화 발육장애 바이러스(Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV)인 것을 특징으로 하는 박과류 식물에 감염된 바이러스의 동시 검출 방법.
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