ES2256871T3 - Composiciones y procedimientos para la deteccion de mycobacterium kansasil. - Google Patents
Composiciones y procedimientos para la deteccion de mycobacterium kansasil.Info
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Abstract
ESTA INVENCION REVELA Y REIVINDICA SONDAS PARA ENSAYOS DE HIBRIDACION DE OLIGONUCLEOTIDOS Y OLIGONUCLEOTIDOS COOPERADORES DISEÑADOS PARA SER COMPLEMENTARIOS DE REGIONES ESPECIFICAS DEL RARN DE M. KANSASII O DEL ADN QUE LO CODIFICA, O DE UN OLIGONUCLEOTIDO O ACIDO NUCLEICO QUE CONTIENE, CONSISTE ESENCIALMENTE EN, O CONSISTE EN UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO DE RARN O RADN DE M. KANSASII. LAS SONDAS DE HIBRIDACION DE LA PRESENTE INVENCION ESTAN DISEÑADAS PARA HIBRIDAR UN ACIDO NUCLEICO DIANA EN UNA REGION DE LA MOLECULA QUE TIENE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO DIANA ESPECIFICO EN CONDICIONES QUE PERMITEN LA DETECCION SELECTIVA DEL ACIDO NUCLEICO DIANA. LAS SONDAS ADEMAS ESTAN DISEÑADAS PARA DETECTAR M. KANSASII TIPICO ASI COMO CEPAS ATIPICAS. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN REVELA Y REIVINDICA MOLECULAS HIBRIDAS DE ACIDO NUCLEICO DE DOBLE CADENA FORMADAS ENTRE LAS SONDAS DE HIBRIDACION Y SUS ACIDOS NUCLEICOS DIANA ESPECIFICOS.
Description
Composiciones y procedimientos para la detección
de Mycobacterium kansasii.
La invención descrita y reivindicada en este
documento se refiere al diseño y uso de sondas de ácido nucleico y
oligonucleótidos auxiliares para detectar ácidos nucleicos de la
especie bacteriana Mycobacterium kansasii en muestras
experimentales, por ejemplo, de frotis de garganta, muestras de
tejidos, fluidos corporales y de cultivos.
Mycobacterium kansasii es una bacteria
fotocromogénica de crecimiento lento que causa una enfermedad
pulmonar crónica semejante a la tuberculosis (Wayne, L.G. y G.P.
Kubica, 1986, "The Mycobacteria", pp.
1435-1457, en Sneath y col., ed. Bergey's Manual of
Systemic Bacteriology, vol. 2, Williams y Wilkins, Baltimore). Entre
las mycobacterias diferentes de las cepas del complejo de M.
tuberculosis y M. avium, M. kansasii es una de
las especies más frecuentemente aisladas.
Las infecciones diseminadas causadas por
micobacterias no tuberculosas como M. kansasii se han
convertido en una creciente preocupación para la salud pública a
medida que aumenta el número de individuos infectados por SIDA.
M. kansasii es actualmente la segunda micobacteria no
tuberculosa más común causante de enfermedad diseminada en
pacientes infectados por el VIH (después del complejo de M.
avium).
Los procedimientos clásicos para la
identificación de micobacterias implican diversas técnicas
bioquímicas, tinción ácida rápida, morfología celular y análisis
por HPLC. Las células de M. kansasii son bastones de tamaño
moderadamente largo a largo. Las colonias varían de planas a
elevadas y los tipos de colonias de lisas a rugosas. Las colonias
de M. kansasii son típicamente apigmentadas cuando crecen en
la oscuridad, y se vuelven amarillas después de la exposición a la
luz (fotocromogénicas). Las pruebas bioquímicas incluyen reducción
de nitrato positiva, hidrólisis de tween y urea, actividad catalasa
y producción de niacina. La especiación de un aislamiento de
micobacterias usando estos procedimientos de identificación puede
llevar varios meses.
Ciertas subespecies de M. kansasii son
atípicas. Véase, por ejemplo Ross y col., J. Clin. Microbiol.
30:2930-2933 (1992). Estas subespecies atípicas
tienen variaciones en su secuencia del ARNr de 23S y, por lo tanto,
no son necesariamente detectables con sondas dirigidas al ARNr de
23S derivado de las especies típicas de M. kansasii. Sin
embargo, estas cepas atípicas han sido implicadas como agentes
causantes de infecciones y es importante, por tanto, poder
identificar las cepas atípicas de M. kansasii. Por tanto, el
término M. kansasii como se usa en este documento se refiere
a cepas del organismo, tanto típicas como atípicas.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar sondas para hibridación de ácidos nucleicos para la
detección rápida y específica de M. kansasii en muestras
experimentales y particularmente en muestras clínicas humanas. Es
además un objeto de la presente invención proporcionar sondas
capaces de detectar subespecies de M. kansasii previamente
no detectables.
Como se usa en este documento, el término
"muestra experimental" pretende indicar cualquier muestra de
la que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana en cuestión,
e incluye, pero no se limita a: muestras biológicas, fluidos
corporales o exudados como orina, sangre, leche, fluido
cerebroespinal, esputo, saliva, heces, aspirados pulmonares, frotis
de garganta o genitales, muestras clínicas que contienen uno o
varios de los anteriores, muestras medioambientales, muestras de
alimentos y muestras de laboratorio.
La hibridación de ácidos nucleicos es el proceso
por el que dos cadenas de ácido nucleico que tienen secuencias de
nucleótidos completa o parcialmente complementarias se unen en
condiciones de reacción predeterminadas para formar un híbrido
bicatenario estable con puentes de hidrógeno específicos. Cada
cadena de ácido nucleico puede ser un ácido desoxirribonucleico
(ADN) o un ácido ribonucleico (ARN); por tanto, la hibridación puede
implicar híbridos ARN:ARN, híbridos ADN:ADN o híbridos ARN:ADN.
Por tanto, como se usa en esta solicitud, el
término "hibridación" se refiere a la capacidad de dos cadenas
monocatenarias de ácido nucleico, completa o parcialmente
complementarias, de unirse en una orientación antiparalela para
formar una estructura estable con una región bicatenaria. Las dos
cadenas constituyentes de esta estructura bicatenaria, a veces
denominada híbrido, se mantienen unidas entre sí por puentes de
hidrógeno. Aunque estos puentes de hidrógeno se forman más
comúnmente entre nucleótidos que contienen las bases adenina y
timina o uracilo (A y T o U) o citosina y guanina (C y G), el
apareamiento de bases puede tener lugar entre bases que no son
miembros es estos pares "canónicos". El apareamiento de bases
"no canónico" es bien conocido en la técnica. Véase, por
ejemplo, The Biochemistry of the Nucleic Acids (Adams y col., eds.,
1992).
La hibridación de ácidos nucleicos es un
procedimiento común para detectar y cuantificar ácidos nucleicos
diana con secuencias nucleotídicas específicas. Tales procedimientos
son útiles para la identificación y clasificación de organismos, el
diagnóstico de enfermedades infecciosas y de anormalidades
genéticas, pruebas de alimentos y fármacos y la identificación de
sospechosos criminales, entre otros numerosos objetivos.
Típicamente, los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos usan
una sonda oligonucleotídica marcada para ensayos de hibridación con
una secuencia de ácido nucleico complementaria de la secuencia
diana. Estos marcadores son bien conocidos en la técnica y pueden
incluir isótopos radiactivos, enzimas o grupos fluorescentes,
luminiscentes o quimioluminiscentes; los solicitantes prefieren el
uso de ésteres de acridinio quimioluminiscentes como marcadores.
Véase Arnold y col., Patente de EE.UU. nº 5185439, que disfruta de
propiedad común con la presente solicitud. La sonda se mezcla con
una muestra de la que se sospecha que contiene un ácido nucleico con
la secuencia diana, en condiciones de hibridación apropiadas para
permitir la alineación de las dos cadenas mediante puentes de
hidrógeno en la región de complementariedad. La sonda hibrida
entonces con el ácido nucleico presente en la muestra. El dúplex
híbrido resultante puede detectarse mediante diversas técnicas bien
conocidas en la técnica, como adsorción sobre hidroxiapatito.
También se incluyen en estas técnicas aquellas que implican la
degradación selectiva del marcador presente en la sonda no
hibridada y la medida posterior de la cantidad de marcador asociado
con la sonda hibridada restante, como se describe en Arnold y col.,
Patente de EE.UU. nº 5283174, que disfruta de propiedad común con
la presente solicitud. Esta última técnica, denominada ensayo de
protección de hibridación (HPA), se prefiere actualmente por
los
solicitantes.
solicitantes.
Frecuentemente una muestra experimental no
contendrá un número suficientemente grande de moléculas de ácido
nucleico para permitir la detección o cuantificación directas por
hibridación de ácidos nucleicos, debido a los límites de
sensibilidad del marcador particular utilizado. En tal caso, la
cantidad de secuencia nucleotídica diana detectable se aumenta
antes de usar la hibridación de ácidos nucleicos para identificar su
presencia o cantidad en la muestra experimental. Este procedimiento
se denomina amplificación de ácidos nucleicos y al procedimiento
para aumentar la cantidad de ácido nucleico diana se hace referencia
como amplificación del ácido nucleico diana o de la secuencia
nucleotídica diana.
Los procedimientos de amplificación implican el
uso de al menos una cadena de ácido nucleico que contiene una
secuencia nucleotídica diana como un molde en una reacción de
polimerización de ácido nucleico para producir una segunda cadena
complementaria que contiene la secuencia nucleotídica diana. La
amplificación puede llevarse a cabo en las dos cadenas, codificante
y no codificante, de una molécula dúplex de ácido nucleico que
contiene la secuencia nucleotídica diana. Mediante la repetición de
este proceso, usando los ácidos nucleicos producto como moldes en
ciclos posteriores, el número de moléculas de ácido nucleico que
contienen la secuencia nucleotídica diana aumenta rápidamente.
Se han descrito numerosos procedimientos de
amplificación; entre ellos hay varias realizaciones de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), (véase por ejemplo, Mullis y col,
Patente de EE.UU. nº 4683195) y procedimientos que usan
transcripción (síntesis de ARN) in vitro en una o varias
etapas del procedimiento, (véase, por ejemplo, Murakawa y col., DNA
7:287-295, Burg y col., Solicitud PCT nº WO89/1050,
Gingeras y col., Solicitud PCT nº WO88/10315, Kacian y Fultz,
Solicitud Europea nº 89313154, McDonough y col., Publicación PCT nº
WO 94/03472, Kacian y col., Publicación PCT nº WO 93/22461 y
Dattagupta y col., (presentada en los Estados Unidos, a 16 de marzo
de 1994, Solicitud DE EE.UU. con número de serie 08/215081). Las dos
últimas referencias disfrutan de propiedad común con la presente
solicitud.
Una sonda para ensayos de hibridación se usa para
detectar, indicar y/o cuantificar la presencia del ácido nucleico
diana en cuestión; dicha sonda se marca normalmente con un átomo
radiactivo o luminiscente o un grupo químico detectable, como una
fracción quimioluminiscente. Los solicitantes prefieren el uso de
derivados de éster de acridinio como reactivo marcador. Sin embargo,
la presencia del ácido nucleico diana en cuestión también se puede
detectar sin el uso de una sonda marcada. Por ejemplo, los híbridos
formados entre la sonda y el ácido nucleico diana pueden aislarse
usando hidroxiapatito o exclusión molecular o pueden visualizarse
usando electroforesis en gel no desnaturalizante. Ocasionalmente, el
ácido nucleico diana en cuestión incluirá cualquier molécula de una
población de moléculas de ácido nucleico diferentes con secuencias
nucleotídicas derivadas normalmente de una fuente biológica. A modo
de ejemplo solamente y no como limitación, la secuencia
nucleotídica diana puede ser compartida por los ácidos nucleicos de
un género de organismos (pero no por organismos que no pertenecen
al género), en que se desea la detección de alguno de dichos
organismos. De forma alternativa, la secuencia nucleotídica diana
puede ser exclusiva de una especie de organismo o de una cepa de
dicha especie.
No se pretende necesariamente que todas las
sondas sean detectables. Algunas sondas de hibridación, denominadas
"oligonucleótidos auxiliares" o "sondas auxiliares" están
diseñadas para facilitar la capacidad de otra sonda de ensayo de
unirse a su secuencia nucleotídica diana. Aunque sin desear quedar
limitados por la teoría, los solicitantes creen que las sondas
auxiliares facilitan la unión de la sonda de ensayo, disminuyendo
localmente la cantidad de puentes de hidrógeno intramoleculares en
el ácido nucleico diana, haciendo con ello la secuencia
nucleotidica diana más disponible para una hibridación específica
con la sonda marcada. Dependiendo de la localización del sitio de
unión de la sonda marcada y de la estructura secundaria del ácido
nucleico diana, las sondas auxiliares pueden dirigirse a regiones
de la secuencia nucleotídica próximas al sitio de unión de la sonda
marcada o dirigirse a regiones distantes del sitio de unión que, sin
embargo, afectan a la unión de la sonda. Las sondas auxiliares se
describen en Hogan y col., Patente de EE.UU. nº 5030557, que
disfruta de propiedad común con la presente solicitud.
Descripciones del uso de la hibridación de ácidos
nucleicos para detectar la presencia de secuencias nucleotídicas
particulares se proporcionan en Kohne, Patente de EE.UU. nº 4851330
y en Hogan y col., Solicitud de Patente Internacional nº WO
8803957, ambas referencias disfrutan de propiedad común con la
presente solicitud. Hogan describe procedimientos para determinar
la presencia de un organismo no vírico o de un grupo de organismos
no víricos en una muestra (por ejemplo, esputo, orina, sangre y
secciones de tejidos, alimentos, tierra y agua) usando técnicas de
hibridación de ácidos nucleicos.
Hogan, en la referencia anterior, también
describe una serie de sondas de hibridación que detectan
específicamente sólo secuencias nucleotídicas diana de ARN
ribosómico (ARNr) que pertenecen a un organismo o grupo de
organismos específico.
Yang y col., J. Clin. Microbiol.
31:2769-2772 (1993) describen el aislamiento de una
secuencia a partir de un aislamiento clínico que, al ser usada como
una sonda de hibridación, muestra especificidad de especie frente a
M. kansasii. El clon p6123 derivado de M. kansasii
descrito en ese documento no contiene una región que sea
completamente homóloga a la secuencia de una sonda descrita en la
presente invención.
La Patente europea nº 0669402 describe secuencias
de ácido nucleico útiles como cebadores de amplificación para la
detección específica de especie y la identificación de M.
kansasii. Los cebadores de amplificación se derivan del clon
p6123 descrito previamente en Yang y col., referencia anterior, y
como tales no muestran una completa homología de secuencia con
ninguna de las sondas descritas en la presente invención.
La Patente de EE.UU. nº 5500341 describe sondas y
cebadores de oligonucleótidos que muestran especificidad por M.
kansasii en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos y en
reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. El clon genómico
MK7 derivado de M. kansasii no contiene una región que sea
completamente homóloga a la secuencia de una sonda descrita en la
presente invención.
Endozo y col., Abstracts of the General Meeting
of the American Society for Microbiology, vol. 95, página 133,
describen la identificación de un subgrupo de M. kansasii por
análisis de secuencia de ARNr. Se identificó un grupo de 11
aislamientos que presentaba características típicas de M.
kansasii, pero mostraba diferencias en las regiones variables
de los genes de ADNr de 23S.
Una secuencia completa del ADN ribosómico de 23S
de M. kansasii está disponible en la base de datos GENBANK,
con el número de acceso Z17212.
La invención presentada describe y reivindica
sondas oligonucleotídicas para ensayos de hibridación y
oligonucleótidos auxiliares diseñados para ser complementarios de
regiones específicas de ARNr de M. kansasii o del ADN que
codifica aquél o de un oligonucleótido o ácido nucleico que
comprende, consta esencialmente o consta de, una secuencia
nucleotídica de ARNr o ADNr de M. kansasii.
Las sondas de hibridación de la presente
invención están diseñadas para hibridar con un ácido nucleico diana
en una región de la molécula que tiene una secuencia nucleotídica
diana específica, en condiciones que permiten la detección
selectiva del ácido nucleico diana.
Por tanto, una característica básica y novedosa
de las sondas de hibridación y de los oligonucleótidos auxiliares
de la presente invención es su capacidad, en unas condiciones de la
reacción de hibridación definidas y apropiadas, de hibridar con una
región predeterminada de un ácido nucleico diana de M.
kansasii, con preferencia sobre ácidos nucleicos o regiones de
ácidos nucleicos que no son diana. Esta especificidad es una función
del grado de complementariedad entre las secuencias nucleotídicas
de las regiones del ácido nucleico diana y la sonda de hibridación
implicada en el complejo de hibridación unido por puentes de
hidrógeno, así como de las condiciones de la reacción de
hibridación.
La presente invención también describe y
reivindica moléculas híbridas bicatenarias de ácidos nucleicos
formadas entre las sondas de hibridación y sus específicos ácidos
nucleicos diana. Los híbridos formados entre entre las sondas de
ensayo y las moléculas del ácido nucleico diana son útiles para la
detección y/o cuantificación de M. kansasii, ya que estas
estructuras se pueden distinguir física o químicamente de la sonda
de ensayo no hibridada después de la reacción de hibridación. Por
ejemplo, los híbridos formados entre las sondas de ensayo y
moléculas de ácido nucleico diana pueden segregarse de las sondas de
ensayo no hibridadas mediante el uso de hidroxiapatito, exclusión
molecular, electroforesis en gel y otras metodologías relacionadas.
Si se usan sondas de ensayo marcadas, el marcador presente en las
sondas de ensayo puede detectarse como parte de los híbridos, de
modo que el marcador en los híbridos indica la presencia del ácido
nucleico diana en la muestra original. Si se usan sondas de ensayo
no marcadas, la presencia de los híbridos puede detectarse por
espectrofotometría, unión de colorantes y otros procedimientos bien
conocidos.
Alternativamente, cuando se usan sondas de ensayo
marcadas, la presencia de híbridos puede detectarse sin necesidad
de segregar físicamente los híbridos de la sonda marcada no
hibridada. Como se describe en Arnold y col., Patente de EE.UU. nº
5283174, es la degradación selectiva del marcador presente en la
sonda no hibridada. Esta última técnica, denominada ensayo de
protección de hibridación (HPA), se prefiere actualmente por los
solicitantes.
Por tanto, es un objetivo de la presente
invención proporcionar sondas oligonuceotídicas para ensayos de
hibridación capaces de distinguir M. kansasii de otros
organismos en una muestra experimental. Estas sondas poseen un alto
grado de especificidad para los ácidos nucleicos de M.
kansasii e hibridarán con los mismos en condiciones de
hibridación que no favorecen la hibridación de la misma sonda con
ácidos nucleicos de organismos estrechamente relacionados como
M. gastri, M. avium y M. intracellulare. Por
tanto, el uso de sondas para ensayos de hidridación permite la
detección o cuantificación específicas de M. kansasii en un
muestra experimental que contiene estos organismos. Estas sondas
pueden usarse solas en un ensayo de hibridación, o pueden usarse
conjuntamente con otras sondas de ensayo y/o oligonucleótidos
auxiliares. Las sondas para ensayos de hibridación pueden usarse
directamente para detectar ácidos nucleicos diana no amplificados o
pueden usarse para detectar ácidos nucleicos con secuencias
nucleotídicas de M. kansasii obtenidas a través de la
amplificación de ácidos nucleicos.
Las sondas de la invención pueden ser específicas
o no específicas para cepas de M. kansasii. Como se ha
indicado anteriormente, existen variantes atípicas de M.
kansasii que poseen diferentes secuencias de ácido nucleico en
su ARNr de 23S. Dos de estas subespecies atípicas, identificadas en
este documento como las subespecies "BOV" y "COU", se
identifican a continuación. Las sondas se pueden diseñar para
incluir las subespecies tanto típicas como atípicas de M.
kansasii, o para ser exclusivas para una subespecie. Por tanto,
un objeto de la presente invención es proporcionar sondas y/o
mezclas de sondas oligonucleotídicas para ensayos de hibridación
capaces de distinguir todos los organismos de M. kansasii
(típicos y atípicos) de los organismos no incluidos en M.
kansasii. Además, un objeto de la presente invención es
proporcionar sondas oligonucleotídicas para ensayos de hibridación
capaces de detectar e identificar una subespecie de organismos de
M. kansasii. En estas sondas se incluyen sondas específicas
para los organismos de M. kansasii típicos, para la
subespecie BOV de M. kansasii y para la subespecie COU
de
M. kansasii.
M. kansasii.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar procedimientos para la detección de todos los
organismos de M. kansasii y para distinguir M.
kansasii de los organismos no incluidos en M. kansasii.
Además, un objetivo de la presente invención es proporcionar
procedimientos para distinguir entre sí subespecies de M.
kansasii, como las típicas, BOV y COU.
Otro objeto de la presente invención es permitir
la identificación rápida, específica y reproducible de M.
kansasii en una muestra experimental derivada de un frotis de
garganta u otra muestra, mediante el uso de sondas para ensayos de
hibridación y oligonucleótidos auxiliares dirigidos a los ácidos
nucleicos de M. kansasii.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar una composición para aumentar la tasa de hibridación
de una sonda para ensayos de hibridación específica de M.
kansasii con su ácido nucleico diana, así como para aumentar la
estabilidad del híbrido así formado usando oligonucleótidos
auxiliares capaces de hibridar con los ácidos nucleicos de M.
kansasii, facilitando de este modo la unión de la sonda marcada
a su diana.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una sonda para ensayos de hibridación para detectar la
presencia de Mycobacterium kansasii en una muestra, en que la
sonda tiene una longitud de 10 a 100 bases y tiene al menos una
región de 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria de
una región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia
diana seleccionada del grupo compuesto por ID SEC Nº (número de
identificación de secuencia o ID SEC Nº):5, ID SEC Nº:6, ID SEC
Nº:8, ID SEC Nº:9, el complemento de ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID
SEC Nº:17, ID SEC Nº:18, ID SEC Nº:20, ID SEC Nº:21, el complemento
de ID SEC Nº:21 y ID SEC Nº:22. La sonda forma un dúplex detectable
con ácido nucleico de Mycobacterium kansasii en condiciones
de hibridación restrictivas, y no forma un dúplex detectable con
ácido nucleico de Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae,
Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium
gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare,
Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae o
Mycobacterium tuberculosis en las condiciones de hibridación
restrictivas.
En una realización preferida, la secuencia diana
se selecciona del grupo compuesto por ID SEC Nº:5, ID SEC Nº:8, ID
SEC Nº:17 y ID SEC Nº:20. En otra realización preferida, la
secuencia diana se selecciona del grupo compuesto por ID SEC Nº:6,
ID SEC Nº:9, el complemento de ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID SEC
Nº:18, ID SEC Nº:21, el complemento de ID SEC Nº:21 y ID SEC
Nº:22.
Preferentemente, la secuencia de bases de la
sonda, pero sin incluir la región de 10 bases contiguas
perfectamente complementaria de una región de al menos 10 bases
contiguas presente en una secuencia diana, es complementaria al
menos al 80% de la secuencia de bases presente en la secuencia
diana. Con mayor preferencia, la secuencia de bases de la sonda,
pero sin incluir la región de 10 bases contiguas perfectamente
complementaria de una región de al menos 10 bases contiguas
presente en una secuencia diana, es complementaria al menos al 90%
de la secuencia de bases presente en la secuencia diana.
Preferentemente, la secuencia de bases de la
sonda es perfectamente complementaria de la secuencia de bases
presente en la secuencia diana. Preferentemente, la secuencia de
bases de la sonda tiene una longitud de 10 a 50
bases.
bases.
Preferentemente, el Mycobacterium kansasii
es la subespecie BOV de Mycobacterium kansasii.
Alternativamente, el Mycobacterium kansasii es la subespecie
COU de Mycobacterium kansasii. Preferentemente la sonda
incluye un marcador.
La invención proporciona un dúplex detectable
formado entre una sonda de la invención y ácido nucleico de
Mycobacterium kansasii. La invención también proporciona una
mezcla de sondas para detectar la presencia de Mycobacterium
kansasii en un muestra. La mezcla de sondas comprende una sonda
de la invención y uno o varios oligonucleótidos auxiliares.
Preferentemente, cada uno de los uno o varios oligonucleótidos
auxiliares tiene una longitud de 10 a 100 bases y tiene una región
de al menos 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una
región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia de
referencia seleccionada del grupo compuesto por ID SEC Nº:11, ID
SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:14, ID SEC Nº:15, ID SEC Nº:23,
ID SEC Nº:24, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:26, ID SEC Nº:27 y
complementos de las mismas.
En una realización preferida, la secuencia de
referencia de la mezcla de sondas se selecciona del grupo compuesto
por ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:14, ID SEC Nº:26, ID SEC
Nº:15, ID SEC Nº:27 y complementos de las mismas.
La invención proporciona una mezcla de sondas
para detectar la presencia de Mycobacterium kansasii en un
muestra. La mezcla de sondas comprende una primera sonda para
ensayos de hibridación de la invención, en la que la secuencia
diana se selecciona del grupo compuesto por ID SEC Nº:5, ID SEC
Nº:8, ID SEC Nº:17 y ID SEC Nº:20; y una segunda sonda para ensayos
de hibridación de la invención, en la que la secuencia diana se
selecciona del grupo compuesto por ID SEC Nº:6, ID SEC Nº:9, el
complemento de ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID SEC Nº:18, ID SEC
Nº:21, el complemento de ID SEC Nº:21 y ID SEC Nº:22.
Preferentemente la mezcla de sondas comprende
además uno o varios oligonucleótidos auxiliares. Preferentemente
cada oligonucleótido auxiliar tiene una longitud de 10 a 100 bases y
tiene una región de al menos 10 bases contiguas perfectamente
complementaria de una región de al menos 10 bases contiguas presente
en una secuencia de referencia seleccionada del grupo compuesto por
ID SEC Nº:11, ID SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:14, ID SEC
Nº:15, ID SEC Nº:23, ID SEC Nº:24, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:26, ID
SEC Nº:27 y complementos de las
mismas.
mismas.
Preferentemente la mezcla de sondas comprende
además una tercera sonda para ensayos de hibridación para detectar
la presencia de Mycobacterium kansasii en un muestra. La
sonda tiene una longitud de 10 a 100 bases y tiene una región de al
menos 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una región
de al menos 10 bases contiguas presente en una tercera secuencia
diana seleccionada del grupo compuesto por ID SEC Nº:4, ID SEC
Nº:7, ID SEC Nº:16 y ID SEC Nº:19. La tercera sonda forma un dúplex
detectable con ácido nucleico de Mycobacterium kansasii en
condiciones de hibridación restrictivas y dicha tercera sonda no
forma un dúplex detectable con ácido nucleico de Mycobacterium
avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum,
Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium
haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
scrofulacelum, Mycobacterium simiae o Mycobacterium
tuberculosis en las condiciones de hibridación
restrictivas.
restrictivas.
Preferentemente la secuencia de bases de la
tercera sonda tiene una longitud de 10 a 50 bases. Preferentemente
la secuencia de bases de la tercera sonda, pero sin incluir la
región de 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una
región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia
diana, es complementaria al menos al 80% de la secuencia de bases
presente en la tercera secuencia diana. Con mayor preferencia, la
secuencia de bases de la tercera sonda, pero sin incluir la región
de 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una región de
al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia diana, es
complementaria al menos al 90% de la secuencia de bases presente en
la tercera secuencia diana. Con la máxima preferencia, la secuencia
de bases de la tercera sonda es perfectamente complementaria de la
secuencia de bases presente en la tercera secuencia diana.
Preferentemente la tercera sonda incluye un marcador.
La invención también proporciona un procedimiento
para detectar la presencia de Mycobacterium kansasii en una
muestra. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar a la
muestra al menos una sonda o una mezcla de sondas de la invención e
incubar la muestra en condiciones de hibridación restrictivas, de
modo que la sonda o sondas hibriden con ácido nucleico de
Mycobacterium kansasii, formando así un dúplex detectable.
La sonda no forma un dúplex detectable con ácido nucleico de
Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium
fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae,
Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare,
Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae o
Mycobacterium tuberculosis en condiciones de hibridación
restrictivas. El procedimiento también comprende la detección del
dúplex, en caso de que se forme, como una indicación de la
presencia de Mycobacterium kansasii en la muestra.
La presente invención también proporciona un kit
para detectar la presencia de Mycobacterium kansasii. El kit
comprende una sonda para ensayos de hibridación de la invención.
La presente invención se dirige a sondas para
ensayos de hibridación y oligonucleótidos auxiliares para ser
usados en la detección específica de ácidos nucleicos de M.
kansasii, incluyendo aquellos ácidos nucleicos de cepas
atípicas de M. kansasii. Todos los oligonucleótidos descritos
y reivindicados en este documento tienen en común el hecho de que
contienen al menos una región de secuencia nucleotídica
complementaria de la de un ácido nucleico de M.
kansasii.
En la memoria descriptiva los términos siguientes
tienen los significados indicados, a menos que se indique
expresamente de otra manera.
Con "ácido nucleico diana" se indica un
ácido nucleico mono- o bicatenario que tiene una secuencia
nucleotídica diana.
Con "oligonucleótido" se indica un polímero
nucleotídico monocatenario con una longitud de más de 2 nucleótidos,
preferentemente entre 10 y 100 nucleótidos, con mayor preferencia
con una longitud entre 12 y 50 nucleótidos. Tales oligonucleótidos
pueden estar unidos por enlaces fosfodiéster, enlaces fosforotioato
o por otros enlaces raros o que no existen de forma natural. Por
ejemplo, un oligonucleótido puede incluir ácidos nucleicos
peptídicos (ANP).
Además, un oligonucleótido puede tener
nucleótidos no comunes o fracciones no nucleotídicas, como
fracciones 2'-metoxirribopiranósicas o
2'-halurorribopiranósicas. Un oligonucleótido, como
se define en este documento, es un ácido nucleico, preferentemente
ADN, pero puede ser ARN o tener una combinación de ribonucleótidos y
desoxirribonucleótidos unidos por enlaces covalentes. Sustituciones
de enlaces raros o que no existen de forma natural y/o nucleótidos
no comunes o fracciones no nucleotídicas no deben interferir con la
capacidad del oligonucleótido para hibridar con las secuencias
diana. Sondas oligonuceotídicas de una secuencia definida pueden
producirse por técnicas conocidas por los expertos en la materia,
como síntesis química o bioquímica y por expresión in vitro
o in vivo de moléculas de ácido nucleico recombinantes, por
ejemplo, vectores bacterianos o retrovíricos. Según se pretende en
esta descripción, un oligonucleótido no se compone de ADN
cromosómico o de los productos de transcripción in vivo del
mismo.
Con "secuencia de ácido nucleico diana",
"secuencia nucleotídica diana", o "secuencia diana" se
indica una secuencia desoxirribonucleotídica o ribonucleotídica
deseada específica que comprende toda o una parte de la secuencia
nucleotídica de una molécula de ácido nucleico diana monocatenaria y
la secuencia desoxirribonucleotídica o ribonucleotídica
perfectamente complementaria de la misma.
Una secuencia nucleotídica "sustancialmente
similar" es una secuencia nucleotídica idéntica, o con no más
del 20% de apareamientos erróneos, o deleciones internas y/o
adiciones (excluyendo nucleótidos equivalentes de ADN o ARN),
comparada con una particular secuencia de ácido nucleico
identificada. Un oligonucleótido con una secuencia nucleotídica
sustancialmente similar a una secuencia identificada en un ácido
nucleico de referencia comparte la capacidad de hibridación
selectiva de dicho ácido nucleico de referencia. Además, un
oligonucleótido con una secuencia nucleotídica sustancialmente
similar puede formar un híbrido detectable y estable con un ácido
nucleico que tenga una secuencia nucleotídica perfectamente
complementaria de la secuencia identificada en condiciones de
hibridación restrictivas, pero no formará un híbrido detectable y
estable con una secuencia de ácido nucleico no diana. Estas
secuencias sustancialmente similares pueden tener nucleótidos
adicionales en los extremos 3' y/o 5' de la secuencia
identificada.
Condiciones "restrictivas" en el ensayo de
hibridación se refieren a las condiciones en las que una sonda
específica para ensayos de hibridación es capaz de hibridar con
ácidos nucleicos diana (preferentemente ARNr o ADNr de M.
kansasii) y no significantemente con otros ácidos nucleicos
presentes en la muestra experimental derivados, bien de otros
microorganismos (por ejemplo, M. gastri, M. avium y M.
intracellulare) o de humanos. Se tendrá en cuenta que estas
condiciones pueden variar dependiendo de factores que incluyen el
contenido de GC y la longitud de la sonda, la temperatura de
hibridación, la composición del reactivo o disolución de
hibridación y del grado de especificidad de hibridación que se
pretende. Ejemplos de condiciones de hibridación restrictivas
específicas se proporcionan en la descripción a continuación.
Con "sonda" se indica un oligonucleótido
monocatenario con una secuencia parcial o completamente
complementaria de una secuencia de ácido nucleico que se pretende
detectar, de modo que hibrida de forma estable con la misma en
condiciones de hibridación restrictivas. En caso de una sonda
específica de grupo o de especie, dicha sonda tiene la capacidad de
hibridar de forma estable con un ácido nucleico diana y no con
ácidos nucleicos no diana, como aquellos de los organismos que no
pertenecen al grupo filogenético o especie, en condiciones de
hibridación restrictivas. Las sondas pueden, pero no necesitan,
tener regiones que no son complementarias de una secuencia diana,
siempre que dichas secuencias no alteren sustancialmente la deseada
especificidad de la sonda en condiciones de hibridación
restrictivas. Si tales regiones no complementarias existen, éstas
pueden contener una secuencia promotora 5' y/o un sitio de unión
para la transcripción de ARN, un sitio de reconocimiento por una
endonucleasa de restricción, una secuencia no selectiva que permita
la inmovilización de la sonda o la hibridación con un segundo ácido
nucleico diana específico, o pueden contener secuencias que
confieran una estructura secundaria o terciaria deseada, como un
sitio catalítico activo o una estructura de horquilla en la sonda,
en el ácido nucleico diana o en ambos. Una sonda puede marcarse con
una fracción con un grupo indicador como un radioisótopo, una
fracción fluorescente o quimioluminiscente, con una enzima u otro
ligando, que pueden usarse para la detección o confirmación de que
la sonda ha hibridado con la secuencia diana. Un uso de una sonda es
como sonda en ensayos de hibridación; las sondas pueden usarse
también como oligonucleótidos terapéuticos in vivo o in
vitro, o como agentes no codificantes para bloquear o inhibir
la transcripción génica, el corte y empalme de ARNm o la traducción
en células enfermas, infectadas o
patógenas.
patógenas.
Como se usa en esta descripción, la frase "una
sonda (u oligonucleótido) con una secuencia de ácido nucleico
compuesta esencialmente por una secuencia seleccionada de" un
grupo de secuencias específicas significa que la sonda, como
característica básica y novedosa, formará un híbrido detectable y
estable con un ácido nucleico en una región de la secuencia
nucleotídica con una secuencia nucleotídica exactamente
complementaria de una de las secuencias de ácido nucleico listadas
en el grupo en condiciones de hibridación restrictivas. Un
complemento exacto bajo esta definición incluye la correspondiente
secuencia de ADN o ARN.
Con "híbrido de ácido nucleico" o
"híbrido" se indica una estructura de ácido nucleico que
contiene una región bicatenaria unida por puentes de hidrógeno,
preferentemente con una longitud entre 10 y 100 nucleótidos, con
mayor preferencia con una longitud entre aproximadamente 12 y 50
nucleótidos, en la que cada cadena es complementaria de la otra y
en la que la región es suficientemente estable en condiciones de
hibridación restrictivas para ser detectada por medios que
incluyen, pero no se limitan a, detección de luz de
quimioluminiscencia o fluorescencia, autorradiografía o
electroforesis en gel. Dichos híbridos pueden comprender moléculas
dúplex de ARN:ARN, ARN:ADN o ADN:ADN.
Con "complementario" se indica que las
secuencias nucleotídicas de regiones similares de dos ácidos
nucleicos monocatenarios, o de diferentes regiones del mismo ácido
nucleico monocatenario, tienen una composición de bases
nucleotídicas que permite a las cadenas monocatenarias hibridar
conjuntamente en una región bicatenaria estable, unida por puentes
de hidrógeno, en condiciones de hibridación restrictivas. Cuando una
secuencia nucleotídica contigua de una región monocatenaria es
capaz de formar una serie de pares de bases "canónicos" unidos
por puentes de hidrógeno con una secuencia nucleotídica análoga de
la otra región monocatenaria, de modo que A se aparea con U o T y C
se aparea con G, las secuencias nucleotídicas son
"perfectamente" complementarias.
Con "variantes modificadas moderadamente" se
indican ácidos nucleicos u oligonucleótidos con una secuencia
nucleotídica complementaria de una primera región de secuencia
nucleotídica de un primer ácido nucleico, en que la primera región
de secuencia nucleotídica es perfectamente complementaria de una
segunda región de secuencia nucleotídica contenida en un segundo
ácido nucleico "de referencia". Variantes modificadas
moderadamente no tienen más de 8 nucleótidos adicionales y no más
de 8 nucleótidos menos que el ácido nucleico de referencia. Se
entenderá que tales variantes modificadas moderadamente pueden tener
nucleótidos no complementarios en los extremos 5' y 3', lo que hará
la sonda más larga que la secuencia nucleotídica de referencia. Las
variantes modificadas moderadamente formarán un híbrido detectable
estable con una región de ácido nucleico diana que tenga una
secuencia nucleotídica de M. kansasii en condiciones de
hibridación restrictivas, pero no formará un híbrido detectable
estable con un ácido nucleico no diana.
Con "amplificación de ácidos nucleicos" o
"amplificación de dianas" se indica el aumento del número de
moléculas de ácido nucleico con al menos una secuencia de ácido
nucleico diana.
Con "oligonucleótido auxiliar" se indica una
sonda de ácido nucleico normalmente no marcada, diseñada para
hibridar con el ácido nucleico diana en un locus diferente al de la
sonda para ensayos de hibridación marcada, aumentando de este modo
la tasa de hibridación de la sonda marcada, la temperatura de fusión
(T_{m}) del híbrido diana: sonda marcada o ambas.
Las condiciones de la reacción de hibridación,
sobre todo la temperatura de hibridación y la concentración de sal
en la disolución de hibridación, pueden seleccionarse para permitir
que las sondas de hibridación de la presente invención hibriden
preferentemente con ácidos nucleicos que tienen una secuencia
nucleotídica diana de M. kansasii sobre otros ácidos
nucleicos no diana que se sospecha que están presentes en la muestra
experimental. Con concentraciones de sal reducidas y/o temperaturas
aumentadas (denominado restrictividad aumentada) disminuye la
extensión de la hibridación de ácidos nucleicos, ya que los puentes
de hidrógeno entre las bases nucleotídicas apareadas en la molécula
híbrida bicatenaria se deterioran; este proceso se denomina
"fusión".
En general, los híbridos más estables son
aquellos que tienen el mayor número de pares de bases nucleotídicas
contiguas perfectamente apareadas (es decir, unidas por puentes de
hidrógeno). Por tanto, normalmente se esperará que tales híbridos
sean los últimos en fundirse a medida que disminuye la
restrictividad de las condiciones de hibridación. Sin embargo, una
región de ácido nucleico bicatenario que contiene uno o varios pares
de bases erróneamente apareados, "no canónicos" o imperfectos
(dando como resultado un apareamiento más débil o inexistente en
esa posición de la secuencia nucleotídica del ácido nucleico), puede
ser aún sufucientemente estable en condiciones de restrictividad
relativamente alta como para permitir la detección del híbrido de
ácido nucleico en un ensayo de hibridación, sin que haya reacción
cruzada con otros ácidos nucleicos no diana presentes en la muestra
experimental.
Por consiguiente, dependiendo tanto del grado de
variación de secuencia entre ácidos nucleicos del organismo diana y
aquellos de organismos no diana, pero estrechamente relacionados,
por una parte, como del grado de complementariedad entre la
secuencia nucleotídica de una particular sonda de hibridación y la
del ácido nucleico diana, por otra parte, uno o varios
apareamientos erróneos entre la sonda y la diana no perjudicarán
necesariamente la capacidad del oligonucleótido de hibridar con los
ácidos nucleicos diana con preferencia sobre los no diana.
Las sondas para ensayos de hibridación de la
presente invención se eligieron, seleccionaron y/o diseñaron para
maximizar la diferencia entre las temperaturas de fusión de los
híbridos sonda:diana (T_{m}, definida como la temperatura a la
que la mitad de las moléculas potencialmente bicatenarias en una
mezcla de reacción dada se encuentran en un estado desnaturalizado,
monocatenario) y la T_{m} de un híbrido erróneamente apareado
formado entre la sonda y el ARNr o ADNr de los organismos más
estrechamente relacionados filogenéticamente que se espera que
estén presentes en la muestra experimental, pero que no se pretende
detectar. Mientras que los oligonucleótidos de amplificación no
marcados y los oligonucleótidos auxiliares no necesitan tener un
grado de especificidad tan extremadamente alto como la sonda marcada
para ensayos de hibridación para ser útiles en esta invención,
generalmente se diseñan de forma similar, para que hibriden con los
ácidos nucleicos diana de uno o varios organismos con preferencia
sobre otros ácidos nucleicos.
Las secuencias nucleotídicas del ARNr de M.
kansasii y de organismos estrechamente relacionados como M.
gastri, M. avium y M. intracellulare se obtuvieron de
fuentes publicadas o fueron determinadas independientemente por los
solicitantes usando técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos
bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Lane y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6955 (1985).
Mediante alineamiento de las secuencias de ARNr
de estos diversos organismos, los solicitantes han descubierto
regiones discretas específicas de relativa variabilidad
interespecífica. Aquellas regiones que mostraron la mayor cantidad
de variabilidad de secuencia nucleotídica entre el organismo diana
M. kansasii y los organismos "no diana", por ejemplo
M. gastri, M. avium y M. intracellulare, se eligieron
como potenciales regiones diana para el diseño de las sondas
específicas de especie para ensayos de hibridación.
La Figura 1 muestra las secuencias consenso entre
los nucleótidos 622 y 680 (como se numeran en el ARNr de 23S de
E. coli; la "región 650") del ARNr de 23S de cepas
típicas de M. kansasii, así como de dos cepas variantes
atípicas marcadas aquí "COU" y "BOV". ID SEC Nº:1 es de la
cepa típica, mientras que ID SEC Nº:2 es de la cepa BOV y ID SEC
Nº:3 es de la cepa COU.
La mera identificación de secuencias
nucleotídicas potencialmente diana supuestamente únicas no garantiza
que se pueda hacer una sonda para ensayos de hibridación, que sea
funcionalmente específica de especie para hibridar con el ARNr o el
ADNr de M. kansasii que comprende dicha secuencia. Otros
factores diversos determinarán la idoneidad de un locus de ácido
nucleico como sitio diana para sondas específicas de especie. A modo
de ejemplo, al aumentar el contenido GC de la potencial secuencia
nucleotídica diana (y así el del híbrido bicatenario sonda:diana)
generalmente aumenta la estabilidad, y con ello la T_{m}, del
híbrido. El número de nucleótidos contiguos en esta región de
secuencia que son idénticos en uno o varios de los organismos "no
diana" también afectará a la estabilidad, y con ello a la
T_{m}, de un híbrido parcialmente mal apareado entre una sonda
perfectamente complementaria del ARNr de M. kansasii y un
ácido nucleico con secuencias nucleotídicas de ARNr del organismo u
organismos no diana. Por tanto, si la diferencia entre las
temperaturas de fusión de los dos híbridos no es suficientemente
grande, normalmente al menos 2-5ºC, una sonda puede
no ser específica de especie, a pesar de tener como diana una
región
única.
única.
La temperatura de hibridación deseada y la
composición de la disolución de hibridación (en cuanto a
concentración de sal) son dos condiciones con un efecto de mayor
importancia en la estabilidad de los híbridos bicatenarios; estas
condiciones han de tenerse en cuenta en la construcción de una sonda
específica de grupo o de especie. La estabilidad térmica de los
ácidos nucleicos híbridos aumenta con la fuerza iónica de la mezcla
de reacción. Por otro lado, agentes químicos que deterioran los
puentes de hidrógeno, como formamida, urea, dimetilsulfóxido y
alcoholes, pueden reducir de forma importante la estabilidad térmica
de los híbridos.
Para maximizar la especificidad de una sonda por
su diana, las sondas sujeto de la presente invención se diseñaron
para hibridar con sus dianas en condiciones muy restrictivas. En
tales condiciones, sólo cadenas de ácido nucleico monocatenarias
con un alto grado de complementariedad hibridarán entre sí; cadenas
de ácido nucleico monocatenarias que no posean tan alto grado de
complementariedad tenderán a no formar híbridos. Por consiguiente,
la restrictividad de las condiciones de ensayo (es decir, la
temperatura y la fuerza iónica) puede determinar el grado de
complementariedad que debe existir entre dos cadenas de ácido
nucleico para formar un híbrido. De acuerdo con la presente
invención, la restrictividad se elige para maximizar la diferencia
en estabilidad entre el híbrido formado entre la sonda y el ácido
nucleico diana e híbridos potenciales formados entre la sonda y
cualquier ácido nucleico monocatenario no diana que esté
presente.
Una apropiada especificidad de sonda puede
diseñarse minimizando la longitud de la sonda que tenga una
secuencia perfectamente complementaria de secuencias de organismos
no diana, evitando regiones con alto contenido en G y C homólogas
de secuencias no diana y construyendo la sonda de modo que contenga
tantos apareamientos erróneos desestabilizantes frente a las
secuencias no diana como sea posible.
La longitud de la secuencia de ácido nucleico
diana, y por consiguiente la longitud total de la secuencia de la
sonda, puede ser también importante para la especificidad. En
algunos casos puede haber varias secuencias nucleotídicas en una
región "variable" particular, diferentes en posición y
longitud, que pueden usarse como dianas para sondas específicas de
especie. En algunos casos no puede diseñarse una sonda específica de
especie para una región variable de ARNr particular, bien porque la
región de la secuencia no es accesible a la sonda o por otras
razones. Mientras que es posible que ácidos nucleicos no
perfectamente complementarios hibriden, la estabilidad del híbrido
vendrá determinada generalmente por el tramo más largo de secuencia
de bases perfectamente homóloga. Pueden usarse sondas de
oligonucleótidos de longitudes y composición de bases
diferentes.
Las regiones diana que forman fuertes estructuras
intramoleculares inhibitorias de la hibridación son regiones diana
menos preferidas. Asimismo, se deberá evitar diseños de sondas que
den lugar a una extensiva autocomplementariedad. Como se ha
explicado anteriormente, hibridación es la asociación de dos cadenas
monocatenarias de ácidos nucleicos complementarios para formar un
híbrido bicatenario unido por puentes de hidrógeno. Por tanto, si
una o las dos cadenas está implicada total o parcialmente en uniones
intramoleculares o intermoleculares, será menos capaz de participar
en la formación de un nuevo híbrido intermolecular sonda:diana. Por
ejemplo, se sabe que las moléculas de ARN ribosómico forman hélices
intramoleculares y estructuras secundarias muy estables mediante
puentes de hidrógeno. Mediante el diseño de un ensayo de hibridación
de modo que una porción sustancial de la secuencia diana permanezca
en estado monocatenario hasta la hibridación con la sonda, se puede
aumentar en gran medida la tasa y extensión de la hibridación entre
la sonda y la diana. Una forma en la que se puede conseguir esto es
elegir como secuencia nucleotídica diana una secuencia que esté
relativamente no implicada en la formación de puentes de hidrógeno
intramoleculares. Alternativamente o adicionalmente, la sonda para
ensayos de hibridación puede usarse en una mezcla de sondas con
oligonucleótidos auxiliares que pueden hacer el sitio diana más
accesible para hibridación con la sonda para ensayos de hibridación.
Tales sondas auxiliares se describen generalmente.
Se dispone de una serie de fórmulas que
proporcionan una estimación de la temperatura de fusión para
oligonucleótidos perfectamente apareados con sus ácidos nucleicos
diana. Una de estas fórmulas,
T_{m}=81,5+16,6 \
(log_{10}[Na^{+}])+0,41 \ (fracción \
G+C)-(600/N)
(en la que N = la longitud del
oligonucleótido en número de nucleótidos) proporciona una buena
estimación para la T_{m} de oligonucleótidos con una longitud de
aproximadamente 14 a 70 nucleótidos. A partir de estos cálculos
pueden efectuarse verificaciones empíricas posteriores o
"afinar" la T_{m} mediante técnicas de cribado. (Para más
información sobre hibridación y sondas de oligonucleótidos véase,
por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) (en el capítulo
11)). Esta referencia proporciona también estimaciones del efecto de
los apareamientos erróneos sobre la T_{m} de un
híbrido.
Un oligonucleótido está compuesto de subunidades
nucleotídicas unidas covalentemente entre sí. Los grupos azúcar de
las subunidades nucleotídicas pueden ser ribosa, desoxirribosa o
derivados modificados de las mismas, como
O-metilrribosa o 2'-halurorribosa.
Las subunidades nucleotídicas pueden estar unidas por enlaces
fosfodiéster, enlaces modificados o por fracciones no nucleotídicas
que no impiden la hibridación del oligonucleótido. Los enlaces
modificados incluyen aquellos enlaces en los que un enlace
fosfodiéster estándar se reemplaza por un enlace diferente, como un
enlace fosforotioato o un enlace metilfosfonato. Como se ha
mencionado anteriormente, cuando se usa como sonda para ensayos de
hibridación, el oligonucleótido contiene preferentemente un grupo
indicador, como éster de acridinio o un radioisótopo, para ayudar a
identificar la hibridación de la sonda con su secuencia
diana.
diana.
Todos los oligonucleótidos de la presente
invención, tanto sondas para ensayos de hibridación como
oligonucleótidos auxiliares, pueden modificarse con grupos químicos
para mejorar su rendimiento o para facilitar la caracterización de
los productos de amplificación. Por ejemplo, oligonucleótidos de
esqueleto modificado, como los que tienen grupos fosforotioato o
metilfosfonato que hacen los oligonucleótidos resistentes a la
actividad nucleolítica de determinadas polimerasas, permiten el uso
de tales enzimas en una amplificación u otra reacción. Otro ejemplo
de modificación implica el uso de ligadores no nucleotídicos (por
ejemplo, Arnold y col., Solicitud de Patente Europea
88308766-0), incorporados entre nucleótidos o en un
extremo de la cadena del oligonucleótido, que no impiden la
hibridación o la elongación del cebador.
Como se ha descrito anteriormente, el extremo 5'
de los oligonucleótidos puede modificarse para ser resistente a la
actividad exonucleasa 5' presente en algunas polimerasas de ácidos
nucleicos. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo añadiendo un
grupo no nucleotídico al nucleótido terminal del extremo 5' del
cebador usando técnicas como las descritas por Arnold y col., véase
arriba, con el título "Non-nucleotide Linking
Reagents for Nucleotide Probes".
Las sondas oligonucleotídicas para ensayos de
hibridación descritas y reivindicadas en este documento son capaces
de hibridar con ácidos nucleicos diana que contienen secuencias
nucleotídicas de ARNr o ADNr de M. kansasii con preferencia
sobre los ácidos nucleicos de especies bacterianas estrechamente
relacionadas filogenéticamente, preferentemente M. gastri, M.
avium y M. intracellulare. Estas sondas para ensayos de
hibridación se diseñaron, seleccionaron y/o eligieron basadas en una
comparación de las secuencias nucleotídicas de las regiones
correspondientes del ARN ribosómico de M. kansasii,
incluyendo el ARNr de las variantes de M. kansasii, y dichas
especies estrechamente relacionadas filogenéticamente.
Las sondas para ensayos de hibridación de la
presente invención son complementarias de las siguientes secuencias
nucleotídicas de ARNr diana:
- ID SEC Nº 4
- GCGUAUCGCGCGCGAGCG,
- ID SEC Nº 5
- GGCGUAUCACGCGUGAGCG,
- ID SEC Nº 6
- GGCGUAUCACGUGCAAGCG,
y versiones de ADN de las mismas,
en que timina sustituye a
uracilo:
- ID SEC Nº 16
- GCGTATCGCGCGCGAGCG,
- ID SEC Nº 17
- GGCGTATCACGCGTGAGCG,
- ID SEC Nº 18
- GGCGTATCACGTGCAAGCG,
o las secuencias nucleotídicas
perfectamente complementarias de estas
secuencias.
Las sondas de hibridación pueden variar en
longitud de 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a 100 nucleótidos y tienen
preferentemente una longitud entre 10 y 50 nucleótidos. Las sondas
deben ser capaces de hibridar con las regiones diana identificadas
en condiciones de hibridación restrictivas, como se han definido
anteriormente. Como tales, deben tener una región de al menos 10
bases contiguas perfectamente complementaria de una región de al
menos 10 bases contiguas presente en una secuencia diana, híbrido
detectable con ácido nucleico de M. kansasii y no debe ser
capaz de formar un híbrido detectable con ácido nucleico no diana
como los de M. avium, M. gastri o M.
intracellulare.
Realizaciones preferidas de estas sondas
oligonucleotídicas para ensayos de hibridación tienen la secuencia
nucleotídica:
- ID SEC Nº 8
- CGCTCACGCGTGATACGCC,
- ID SEC Nº 9
- CGCTTGCACGTGATACGC,
- ID SEC Nº 10
- CGCTTGCACGTGATACGCC,
y versiones de ARN de las mismas,
en que uracilo sustituye a
timina:
- ID SEC Nº 20
- CGCUCACGCGUGAUACGCC,
- ID SEC Nº 21
- CGCUUGCACGUGAUACGC,
- y
- ID SEC Nº 22
- CGCUUGCACGUGAUACGCC,
o las secuencias nucleotídicas
perfectamente complementarias de las
mismas.
Las secuencias núcleo de estas sondas
oligonucleotídicas para ensayos de hibridación preferidas tienen la
secuencia nucleotídica:
- ID SEC Nº 28
- GCGCGCG
- ID SEC Nº 29
- ACGCGUG
- ID SEC Nº 30
- ACGUGCG
- ID SEC Nº 31
- CGCGCGC
- ID SEC Nº 32
- CACGCGU
- ID SEC Nº 33
- CGCACGU
Las sondas oligonucleotídicas de hibridación
pueden usarse tanto solas como en combinación. Las sondas
correspondientes a ID SEC Nº:7 CGCTCGCGCGCGATACGC y las sondas
relacionadas con éstas pueden usarse para la detección de M.
kansasii típico; las sondas correspondientes a ID SEC Nº:8 y las
sondas relacionadas con éstas pueden usarse para la detección de
las cepas atípicas BOV de M. kansasii; las sondas
correspondientes a ID SEC Nº:9 y ID SEC Nº:10 y las sondas
relacionadas con éstas pueden usarse para la detección de las cepas
atípicas COU de
M. kansasii. Combinaciones de estas sondas pueden usarse para la detección de las correspondientes combinaciones de cepas de M. kansasii.
M. kansasii. Combinaciones de estas sondas pueden usarse para la detección de las correspondientes combinaciones de cepas de M. kansasii.
Las sondas oligonucleotídicas para ensayos de
hibridación de la presente invención se marcan preferentemente con
un marcador detectable como un radioisótopo, una fracción
fluorescente o quimioluminiscente, con una enzima u otro ligando,
los cuales pueden usarse para la detección o confirmación de que la
sonda ha hibridado con la secuencia diana. Los solicitantes
prefieren el uso de ésteres quimioluminiscentes de acridinio como
marcadores. Véase Arnold y col., Patente de EE.UU. nº 5185439, que
disfruta de propiedad común con la presente solicitud. La sonda de
ensayo se mezcla con una muestra de la que se sospecha que contiene
un ácido nucleico con la secuencia diana, en las condiciones de
hibridación apropiadas para permitir el alineamiento de las dos
cadenas por puentes de hidrógeno en la región de
complementariedad.
La sonda o sondas pueden también combinarse con
uno o varios oligonucleótidos auxiliares no marcados para facilitar
la unión al ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica diana
de M. kansasii. Las sondas hibridan entonces con el ácido
nucleico diana presente en la muestra; los dúplex híbridos
resultantes pueden separarse y detectarse mediante diversas
técnicas bien conocidas en la técnica, como adsorción sobre
hidroxiapatito y monitorización radiactiva. También se encuentran
incluidas entre dichas técnicas aquellas que implican la
degradación selectiva del marcador presente en la sonda no hibridada
y la medida posterior de la cantidad de marcador asociado con la
sonda hibridada restante, como se describe en Arnold y col., Patente
de EE.UU. nº 5283174, que disfruta de propiedad común con la
presente solicitud. Esta última técnica es la preferida actualmente
por los solicitantes.
Oligonucleótidos auxiliares específicos se usaron
para facilitar la hibridación de las sondas para ensayos de
hibridación con el ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos
auxiliares se describen en Hogan y Milliman, Patente de EE.UU. nº
5030557, que disfruta de propiedad común con la presente solicitud.
Los oligonucleótidos auxiliares específicos para facilitar la
detección específica de M. kansasii tienen secuencias
nucleotídicas complementarias de la secuencia nucleotídica de ARN
de M. kansasii de:
- ID SEC Nº 11
- GCCGCAGCGAAAGCGAGTCTGAATAGG,
- ID SEC Nº 12
- TGTGTAGTGGCGTGTTCTGGACCCGAAGCGG,
y versiones de ADN de las mismas,
en que timina sustituye a
uracilo:
- ID SEC Nº 23
- GCCGCAGCGAAAGCGAGUCUGAAUAGG,
- ID SEC Nº 24
- UGUGUAGUGGCGUGUUCUGGACCCGAAGCGG,
o las secuencias nucleotídicas
perfectamente complementarias de las
mismas.
Realizaciones preferidas de estos
oligonucleótidos auxiliares son oligonucleótidos que tienen la
secuencia nucleotídica de:
- ID SEC Nº 13
- CGTATTCAGACTCGCTTTCGCTGCGGC,
- ID SEC Nº 14
- CCGCTTCGGGTCCAGAACACGCCACTACACA,
- ID SEC Nº 15
- CTATTCAGACTCGCTTTCGCTGCGGC,
y versiones de ARN de las mismas,
en que uracilo sustituye a
timina,
- ID SEC Nº 25
- CGUAUUCAGACUCGCUUUCGCUGCGGC,
- ID SEC Nº 26
- CCGCUUCGGGUCCAGAACACGCCACUACACA,
- ID SEC Nº 27
- CUAUUCAGACUCGCUUUCGCUGCGGC,
o las secuencias nucleotídicas
perfectamente complementarias de las
mismas.
En general, los oligonucleótidos auxiliares
pueden usarse en condiciones de hibridación restrictivas, pero no
son necesariamente específicos de especie en su selectividad; es
decir, las secuencias nucleotídicas diana para los oligonucleótidos
auxiliares no son necesariamente exclusivas de la especie M.
kansasii. Preferentemente, las sondas para ensayos de
hibridación se usan en combinación con oligonucleótidos auxiliares
para la detección de M. kansasii.
Los siguientes ejemplos de diversas realizaciones
de la presente invención se presentan sólo como ilustración y no
pretenden limitar el alcance de la invención.
Las secuencias de ADN que codifican el ARNr de
23S de diversas cepas de M. kansasii se obtuvieron mediante
amplificación por PCR y secuenciación cíclica.
Las diversas secuencias del ARNr de 23S de M.
kansasii se compararon con las de algunos de sus parientes
filogenéticos más cercanos, incluyendo M. gastri, M. avium y
M. intracellulare. Se encontró que la región correspondiente
a una región de E. coli cerca del nucleótido 650 tenía
variaciones específicas de especie que podían usarse para el diseño
de sondas. Las sondas ID SEC Nº:7, ID SEC Nº:8 y ID SEC Nº:9 se
eligieron por proporcionar la mejor distinción entre las secuencias
de ARNr de M. kansasii, incluyendo las variantes atípicas, y
de los otros organismos estrechamente relacionados.
En este experimento se ensayó la especificidad de
la sonda de hibridación de la secuencia nucleotídica de ID SEC
Nº:8, mediante hibridación con los organismos estrechamente
relacionados M. gastri y M. tuberculosis. Un
oligonucleótido auxiliar con la secuencia de ID SEC Nº:13 se usó
para facilitar la hibridación de las sondas para ensayos de
hibridación con el ácido nucleico diana. Se usaron cepas tipo ATCC
de M. kansasii, M. gastri y M. tuberculosis. Los
organismos se inocularon en medios sólidos apropiados y se crecieron
hasta la fase logarítmica. Un asa llena de 1 \mul de crecimiento
de cada cultivo se añadió a un tubo de lisis bacteriana que
contenía bolitas de cristal y 200 \mul de una disolución de lisis
compuesta de sorbitol al 5%, azida sódica 2,85 mM, Hepes 3,7 mM,
Triton X-100 al 0,035%, succinato 50 Mm, AEDT 10
mM, AEGT 10 mM, laurilsulfato de litio (LSL) al 1% y LiCl 600 mM.
Los tubos se sonificaron durante 15 minutos a temperatura ambiente
para lisar los organismos y después se inactivaron a 95ºC \pm 5ºC
durante 10 minutos.
Las sondas se marcaron con éster de acridinio.
Por cada sonda se usaron aproximadamente 2,5 x 10^{6} URL
(unidades relativas de luz - una medida del número de fotones
detectados por un luminómetro). Las hibridaciones se realizaron en
una disolución que contenía succinato de litio 0,05 M a pH 5, LiCl
0,6 M, laurilsulfaro de litio (LSL) al 1% (p/v), ácido
etilendiaminotetraacético (AEDT) 10 mM, ácido etilenglicol
bis(beta-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético
(AEGT) 10 mM, a 60ºC durante 15 minutos. A cada tubo se añadieron
300 \mul de una disolución que contenía tetraborato sódico 0,15 M
a pH 8.5 y TRITON® X-100 al 1% y cada reacción se
incubó a 60ºC durante 8 minutos y se enfrió a temperatura ambiente.
La detección de la hibridación se analizó en un luminómetro
Gen-Probe LEADER® I (Gen-Probe
Incorporated, San Diego, CA). El luminómetro inyecta automáticamente
dos reactivos, de los cuales el primero comprende ácido nítrico 1
mM y peróxido de hidrógeno al 0,1% y el segundo comprende hidróxido
sódico 1N. Los resultados de los ensayos se dieron en URL. Valores
de URL superiores a 30000 URL se consideraron como una reacción
positiva. En estos experimentos, cada reacción se realizó por
duplicado y los resultados se muestran a continuación.
| Valor URL | Valor URL | Valor URL | Valor URL | Valor URL | Valor URL | |
| para | para | para | para | para | para | |
| M. kansasii | M. gastri | M. gastri | M. gastri | M. gastri | M. tuberculosis | |
| 533 | 529 | Cl 979 | Cl 980 | Cl 981 | 546A | |
| repetición 1 | 821.729 | 6.157 | 4.427 | 5.770 | 6.826 | 3.810 |
| repetición 2 | 875.094 | 6.283 | 4.613 | 5.998 | 6.823 | 3.754 |
| media | 848.412 | 6.220 | 4.520 | 5.884 | 6.825 | 3.782 |
En este experimento se ensayó la especificidad de
las sondas de hibridación de las secuencias nucleotídicas de ID SEC
Nº:8 y ID SEC Nº:9 mediante la hibridación de estas sondas con cepas
atípicas de M. kansasii. Las cepas 1-9 se
clasificaron como la cepa BOV, mientras que las cepas
10-11 se clasificaron como la cepa COU.
Crecimiento, lisis, hibridación y detección fueron como se ha
descrito en el ejemplo 2. La hibridación se mejoró mediante el uso
de sondas auxiliares en cada reacción de hibridación. Para las
sondas de las secuencias nucleotídicas de ID SEC Nº:8, se usaron
sondas auxiliares con la secuencia nucleotídica de ID SEC Nº:14 y
ID SEC Nº:15; para las sondas de las secuencias nucleotídicas de ID
SEC Nº:9 se usaron sondas auxiliares con la secuencia nucleotídica
de ID SEC Nº:14 y ID SEC Nº:13. Los resultados demuestran la
especificidad de las sondas para los dos tipos de cepas variantes
de M. kansasii.
| Organismo | Número de cepa | URL de la hibridación con | URL de la hibridación con |
| ID SEC Nº:8 | ID SEC Nº:9 | ||
| M. kansasii | 1 | 294.999 | 2.267 |
| M. kansasii | 2 | 462.898 | 1.751 |
| M. kansasii | 3 | 450.743 | 1.591 |
| M. kansasii | 4 | 467.158 | 1.082 |
| M. kansasii | 5 | 424.864 | 2.556 |
| M. kansasii | 6 | 456.904 | 1.693 |
| M. kansasii | 7 | 444.551 | 1.567 |
| M. kansasii | 8 | 382.435 | 2.593 |
| M. kansasii | 9 | 458.054 | 2.718 |
| M. kansasii | 10 | 1.686 | 765.969 |
| M. kansasii | 11 | 1.263 | 1.076.440 |
En este experimento la especificidad de la sonda
de hibridación con la secuencia nucleotídica ID SEC Nº:7 se
demuestra por hibridación con una serie de organismos diferentes
estrechamente relacionados. El crecimiento y la lisis de las
células fue como se ha descrito en el ejemplo 2, usando el ARN
liberado por una colonia o >10^{8} organismos. La hibridación
fue como se ha descrito en el ejemplo 2, usando sondas auxiliares
con la secuencia nucleotídica de ID SEC Nº:13 y ID SEC Nº:14. La
detección fue como se ha descrito en el ejemplo 2.
| Organismo | nº ATCC | Valor URL |
| Mycobacterium avium | 25291 | 3.208 |
| M. bovis | 19210 | 2.739 |
| M. bovis BCG | 35734 | 3.522 |
| M. chelonae | 14472 | 2.576 |
| M. fortuitum | 6841 | 4.019 |
| M. gastri | 15754 | 3.015 |
| M. gordonae | 14470 | 1.885 |
| M. haemophilum | 29548 | 3.165 |
| M. intracellulare | 13950 | 1.373 |
| M. kansasii | 12478 | 123.797 |
| Organismo | nº ATCC | Valor URL |
| M. kansasii | 25414 | 201.751 |
| M. kansasii | 25101 | 206.062 |
| M. scrofulacelum | 19981 | 2.030 |
| M. simiae | 25275 | 1.764 |
| M. smegmatis | 14468 | 2.378 |
| M. tuberculosis (avir) | 25177 | 3.061 |
| M. tuberculosis (vir) | 27294 | 2.680 |
| M. ulcerans | 19423 | 1.905 |
| M. vaccae | 15483 | 1.905 |
| Nocardia asteroides | 19247 | 3.468 |
En este experimento se demuestra adicionalmente
la especificidad de la sonda de hibridación con la secuencia
nucleotídica ID SEC Nº:7 para M. kansasii, mediante
hibridación con una amplia muestra representativa filogenética de
organismos. El crecimiento y la lisis de las células fue como se ha
descrito en el ejemplo 4. La hibridación y la detección fueron como
se ha descrito en el ejemplo 4, usando las mismas sondas auxiliares.
Los resultados de este experimento se presentan a continuación en
la tabla 4.
| Organismo | nº ATCC | Valor URL |
| Acinetobacter calcoaceticus | 33604 | 5.327 |
| Bacillus subtilis | 6051 | 6.792 |
| Bacteroides fragilis | 23745 | 1.908 |
| Branhamella catarrhalis | 25238 | 2.730 |
| Campylobacter jejune | 33560 | 4.618 |
| Candida albicans | 18804 | 3.188 |
| Chromobacterium ciolaceum | 29094 | 9.401 |
| Clostridium perfrigens | 13124 | 3.684 |
| Deinococcus radiodurans | 35073 | 3.556 |
| Derxia gummosa | 15994 | 2.033 |
| Pseudomonas aeruginosa | 25330 | 4.602 |
| Rahnella aquatilis | 33071 | 2.534 |
| Rhodospirillum rubrum | 11170 | 3.320 |
| Organismo | nº ATCC | Valor URL |
| Staphylococcus aureus | 12598 | 3.120 |
| Staphylococcus epidermidis | 12228 | 3.106 |
| Streptococcus mitis | 9811 | 2.410 |
| Streptococcus pneumoniae | 6306 | 2.074 |
| Vidrio parahemolyticus | 17802 | 8.516 |
| Yersinia enterocolitica | 9610 | 4.105 |
En este experimento se ensayó la especificidad de
una sonda que contiene las tres sondas diseñadas (ID SEC Nº:7, ID
SEC Nº:8 y ID SEC Nº:9) y las dos sondas auxiliares (ID SEC Nº:13 y
ID SEC Nº:14) frente a cepas bacterianas estándar. Se evaluaron un
total de 55 cepas de referencia de micobacterias de la colección
ATCC (American Type Culture Collection). Estas cepas representaban
los organismos más estrechamente relacionados con M.
kansasii. Ensayos estándar de especificidad se realizaron usando
el crecimiento obtenido de cultivos en crecimiento activo de las
cepas ATCC, excepto para Mycobacterium haemophilum, del que
no había células disponibles. En su lugar se usó ARNr de
Mycobacterium haemophilum a una concentración equivalente a
la disponible a partir de los cultivos de células en crecimiento.
El crecimiento y la lisis de las células fueron como se ha descrito
en el ejemplo 2. La hibridación y la detección fue también como se
ha descrito en el ejemplo 2. Todas las micobacterias estrechamente
relacionadas produjeron resultados negativos, muy por debajo del
umbral de 30000 URL.
| Organismo | nº ATCC | URL |
| Mycobacterium acapulcensis | 14473 | 1.821 |
| Mycobacterium agri | 27406 | 1.629 |
| Mycobacterium aichiense | 27280 | 1.653 |
| Mycobacterium asiaticum | 25276 | 2.023 |
| Mycobacterium aurum | 23366 | 2.042 |
| Mycobacterium avium | 25291 | 1.654 |
| Mycobacterium austroafricanum | 33464 | 2.298 |
| Mycobacterium bovis | 19210 | 1.986 |
| Mycobacterium bovis BCG | 35734 | 1.655 |
| Mycobacterium celatum | 51130 | 1.238 |
| Mycobacterium chelonae | 14472 | 2.141 |
| Mycobacterium chitae | 19627 | 1.557 |
| Mycobacterium chubuense | 27278 | 2.116 |
| Mycobacterium dierhoferi | 19340 | 1.996 |
| Mycobacterium duvalii | 43910 | 1.287 |
| Organismo | nº ATCC | URL |
| Mycobacterium engbaekii | 27353 | 1.447 |
| Mycobacterium farcinogenes | 35753 | 1.728 |
| Mycobacterium fallax | 35219 | 2.536 |
| Mycobacterium flavescens | 14474 | 1.721 |
| Mycobacterium fortuitum | 6841 | 1.648 |
| Mycobacterium fortuitum ssp. acetamidlyticum | 35931 | 1.676 |
| Mycobacterium gadium | 27726 | 1.967 |
| Mycobacterium gallinarum | 19710 | 1.946 |
| Mycobacterium gastri | 15754 | 2.178 |
| Mycobacterium gilvum | 43909 | 1.244 |
| Mycobacterium gordonae | 14470 | 1.753 |
| Mycobacterium haemophilum .1 \mug/rxn | 29854 | 1.227 |
| Mycobacterium intracellulare | 13950 | 1.776 |
| Mycobacterium kansasii | 12478 | 848.396 |
| Mycobacterium komossense | 33013 | 1.666 |
| Mycobacterium lactis | 27356 | 1.490 |
| Mycobacterium malmoense | 29571 | 1.940 |
| Mycobacterium marinum | 927 | 1.448 |
| Mycobacterium microti | 1.277 | |
| Mycobacterium neoaurum | 25795 | 1.135 |
| Mycobacterium nonchromogenicum | 19530 | 1.810 |
| Mycobacterium obuense | 27023 | 2.668 |
| Mycobacterium parafortuitum | 19686 | 2.244 |
| Mycobacterium phlei | 11758 | 1.563 |
| Mycobacterium porcinum | 33776 | 1.796 |
| Mycobacterium poriferae | 35087 | 1.856 |
| Mycobacterium pulveris | 35154 | 2.031 |
| Mycobacterium rhodesiae | 27024 | 1.996 |
| Mycobacterium scrofulceum | 19981 | 2.551 |
| Mycobacterium shimoidei | 27962 | 2.018 |
| Mycobacterium simiae | 25275 | 2.276 |
| Organismo | nº ATCC | URL |
| Mycobacterium smegmatis | 14468 | 1.928 |
| Mycobacterium sphagni | 33027 | 2.233 |
| Mycobacterium szulgai | 35799 | 1.780 |
| Mycobacterium terrae | 15755 | 2.221 |
| Mycobacterium thermoresistibile | 19527 | 1.582 |
| Mycobacterium tokaiense | 27282 | 1.529 |
| Mycobacterium triviale | 23292 | 2.011 |
| Mycobacterium tuberculosis A | 25177 | 2.363 |
| Mycobacterium tuberculosis V | 27294 | 2.124 |
| Mycobacterium vaccae | 15483 | 1.959 |
| Mycobacterium valentiae | 29356 | 1.602 |
| Mycobacterium xenopi | 19250 | 1.775 |
En este experimento se ensayó la especificidad de
la mezcla de sondas y sondas auxiliares usadas en el ejemplo 6
frente a cepas bacterianas estándar. Se evaluaron un total de 68
cepas de referencia de la colección ATCC (American Type Culture
Collection). Estas cepas representaban una muestra representativa
filogenética de organismos. Ensayos estándar de especificidad se
realizaron usando el crecimiento obtenido de cultivos en
crecimiento activo de las cepas ATCC. El crecimiento y la lisis de
las células fue como se ha descrito en el ejemplo 2. La hibridación
y la detección fue también como se ha descrito en el ejemplo 2.
Todos los organismos de la muestra representativa filogenética
produjeron resultados negativos, bien por debajo del umbral de
30000 URL.
| Organismo | nº ATCC | URL |
| Acinetabacter calcoaceticus | 33604 | 1.708 |
| Actinomadura madurae | 19425 | 1.602 |
| Actinomyces pyogenes | 19411 | 1.413 |
| Actinoplanes italicus | 27366 | 1.705 |
| Aeromonas hydrophila | 7966 | 2.707 |
| Artrobacter oxydans | 14358 | 1.187 |
| Bacillus subtilis | 6051 | 6.682 |
| Bordetella bronchiseptica | 10580 | 1.796 |
| Branhamella catarrhalis | 25238 | 1.609 |
| Brevibacterium linens | 9172 | 3.057 |
| Organismo | nº ATCC | URL |
| Candida albicans | 18804 | 1.363 |
| Chromobacterium violaceum | 29094 | 2.153 |
| Citrobacter freundii | 8090 | 2.981 |
| Corynebacterium aquaticum | 14665 | 1.665 |
| Corynebacterium diphtheriae | 11913 | 2.027 |
| Corynebacterium haemolyticum | 9345 | 1.806 |
| Corynebacterium matruchotii | 33806 | 1.783 |
| Corynebacterium minutissimum | 23347 | 1.027 |
| Corynebacterium pseudodiphtheriticum | 10700 | 1.896 |
| Corynebacterium pseudogenitalium | 33035 | 1.767 |
| Corynebacterium pseudotuberculosis | 19410 | 2.408 |
| Corynebacterium renale | 19412 | 1.725 |
| Corynebacterium striatum | 6940 | 1.839 |
| Cryptococcus neoformans | 32045 | 1.921 |
| Deinococcus radiodurans | 35073 | 11.100 |
| Dermatophilus congolensis | 14637 | 1.420 |
| Enterobacter aerogenes | 13048 | 1.831 |
| Enterobacter cloacae | 13047 | 2.045 |
| Enterococcus faecalis | 19433 | 1.223 |
| Enterococcus faecium | 19434 | 1.406 |
| Escherichia coli | 10798 | 1.732 |
| Haemophilus influenzae | 19418 | 3.099 |
| Haemophilus parainfluenzae | 3392 | 1.856 |
| Klebsiella ozaenae | 11296 | 1.413 |
| Klebsiella pneumoniae | 23357 | 2.490 |
| Legionella micdadei | 33218 | 1.544 |
| Legionella pneumophilia | 33152 | 1.893 |
| Microbacterium lacticum | 8180 | 1.276 |
| Neisseria gonorrhoeae | 19424 | 2.502 |
| Neisseria meningitidis | 13077 | 3.593 |
| Nocardia brasiliensis | 19296 | 1.988 |
| Organismo | nº ATCC | URL |
| Nocardia farcinica | 3318 | 1.244 |
| Nocardia otitidis-caviarum | 14629 | 3.466 |
| Nocardiopsis dassonvillei | 23218 | 3.120 |
| Oerskovia turbata | 33225 | 1.136 |
| Oerskovia xanthineolytica | 27402 | 1.764 |
| Pseudomonas aeruginosa | 25330 | 2.080 |
| Rahnella aquatilis | 33071 | 1.767 |
| Rhodococcus aichiensis | 33611 | 1.689 |
| Rhodococcus bronchialis | 25592 | 3.095 |
| Rhodococcus chubuensis | 33609 | 1.146 |
| Rhodococcus equi | 6939 | 1.568 |
| Rhodococcus sputi | 29627 | 1.045 |
| Salmonella enteritidis | 13076 | 1.594 |
| Salmonella typhi | 6539 | 1.436 |
| Serratia marcescens | 13890 | 1.868 |
| Staphylococcus aureus | 12598 | 1.622 |
| Staphylococcus epidermis | 12228 | 1.600 |
| Streptococcus bovis | 33317 | 1.429 |
| Streptococcus equinus | 9812 | 1.964 |
| Streptococcus mitis | 9811 | 1.192 |
| Streptococcus pneumoniae | 6306 | 1.616 |
| Streptococcus pyogenes | 19615 | 1.618 |
| Streptococcus sp. Group C | 12388 | 1.821 |
| Streptomyces griseus | 23345 | 1.647 |
| Xanthomonas maltophilia | 13637 | 1.822 |
| Yersinia enterocolitica | 9610 | 1.456 |
La mezcla de sondas de hibridación (mostrada en
el ejemplo 6) se ensayó en cuanto a su especificidad para M.
kansasii frente a 58 aislamientos clínicos, representantes de 7
especies de micobacterias. El cultivo y crecimiento de las células
y la hibridación fueron como se ha descrito en el ejemplo 2. No se
observaron reacciones cruzadas con aislamientos clínicos
estrechamente relacionados.
| Organismo | Sitio | URL |
| M. tuberculosis | CWVA | 1.171 |
| M. asiaticum | VAWH | 1.195 |
| M. asiaticum | VAWH | 1.278 |
| M. marinum | CWVA | 1.493 |
| M. avium | CWVA | 1.568 |
| M. marinum | CWVA | 1.583 |
| M. asiaticum | VAWH | 1.634 |
| M. tuberculosis | CWVA | 1.647 |
| M. avium | 628 | 1.698 |
| M. scrofulacelum | VAWH | 1.755 |
| M. avium | CWVA | 1.817 |
| M. gastri | NYC | 1.826 |
| M. marinum | Mayo | 1.897 |
| M. avium | 631 | 1.960 |
| M. scrofulacelum | VAWH | 1.967 |
| M. gastri | NYC | 2.018 |
| M. scrofulacelum | VAWH | 2.034 |
| M. avium | 627 | 2.067 |
| M. gastri | NYC | 2.388 |
| M. gastri | NYC | 4.351 |
| M. marinum | CWVA | 2.046 |
| M. kansasii atípico | Europa | 52.542 |
| M. kansasii | SKBL | 61.699 |
| M. kansasii | Mayo | 66.671 |
| M. kansasii | CWVA | 122.806 |
| M. kansasii | Mayo | 172.522 |
| M. kansasii atípico | Europa | 232.362 |
| M. kansasii | CWVA | 306.988 |
| M. kansasii | Mayo | 336.892 |
| M. kansasii atípico | Europa | 342.741 |
| Organismo | Sitio | URL |
| M. kansasii | Mayo | 366.586 |
| M. kansasii atípico | Europa | 406.881 |
| M. kansasii atípico | Europa | 577.724 |
| M. kansasii atípico | Europa | 588.268 |
| M. kansasii | CWVA | 611.845 |
| M. kansasii | CWVA | 653.662 |
| M. kansasii | CWVA | 691.591 |
| M. kansasii | CWVA | 713.305 |
| M. kansasii atípico | Europa | 722.536 |
| M. kansasii | CWVA | 734.935 |
| M. kansasii | CWVA | 776.246 |
| M. kansasii | VAWH | 789.324 |
| M. kansasii atípico | Europa | 802.059 |
| M. kansasii | Mayo | 821.953 |
| M. kansasii atípico | Europa | 827.164 |
| M. kansasii atípico | Europa | 846.198 |
| M. kansasii | CWVA | 858.037 |
| M. kansasii atípico | Europa | 905.348 |
| M. kansasii | CWVA | 911.333 |
| M. kansasii | CWVA | 931.887 |
| M. kansasii | CWVA | 948.911 |
| M. kansasii | CWVA | 954.200 |
| M. kansasii | ATCC | 964.110 |
| M. kansasii | CWVA | 1.013.473 |
| M. kansasii | CWVA | 1.020.477 |
En este experimento se ensayó la sensibilidad de
la mezcla de sondas y sondas auxiliares (mostrada en el ejemplo 6)
con ARNr de M. kansasii típicos y atípicos. El ARNr se usó en
concentraciones de 0, 0,1, 0,25, 0,5 y 1 ng/\mul. Los ensayos se
realizaron por duplicado para cada concentración y tipo de ARNr. Una
cantidad de 100 \mul de ARNr de la cepa típica de M.
kansasii, de la cepa atípica BOV o la cepa atípica COU, se
añadió a tubos que contenían la sonda y los reactivos de
hibridación liofilizados, como se ha descrito en el ejemplo 2. Las
reacciones se mezclaron mediante vórtex y se hibridaron a 60ºC
durante 15 minutos. La detección fue como se ha descrito en el
ejemplo 2. Los resultados muestran que las sondas son sensibles y
capaces de detectar bajos niveles de ARNr típico y atípico de M.
kansasii.
| URL rep 1 | URL rep 2 | media URL | media neta URL | |
| 0 ng ARNr típico | 710 | |||
| 10 ng ARNr típico | 22.467 | 20.954 | 21.711 | 21.001 |
| 25 ng ARNr típico | 40.802 | 43.360 | 42.081 | 41.371 |
| 50 ng ARNr típico | 86.300 | 92.517 | 89.409 | 88.699 |
| 100 ng ARNr típico | 181.211 | 165.301 | 173.256 | 172.546 |
| 0 ng ARNr BOV | 710 | |||
| 10 ng ARNr BOV | 31.871 | 30.823 | 31.347 | 30.637 |
| 25 ng ARNr BOV | 76.526 | 72.370 | 74.448 | 73.738 |
| 50 ng ARNr BOV | 136.198 | 135.937 | 136.068 | 135.358 |
| 100 ng ARNr BOV | 226.046 | 181.475 | 203.761 | 203.051 |
| 0 ng ARNr COU | 710 | |||
| 10 ng ARNr COU | 54.587 | 49.980 | 52.284 | 51.574 |
| 25 ng ARNr COU | 115.089 | 120.045 | 117.567 | 116.857 |
| 50 ng ARNr COU | 237.771 | 220.013 | 228.892 | 228.182 |
| 100 ng ARNr COU | 395.292 | 375.581 | 385.436 | 384.726 |
Este experimento ensayó la sensibilidad de la
mezcla sondas/sondas auxiliares del ejemplo 6 para la detección de
ARNr de M. kansasii en presencia de células no diana con su
ARNr y ADNr. Las células de M. avium, M. gastri y M.
tuberculosis se crecieron y lisaron como se ha descrito en el
ejemplo 2. Se prepararon muestras con la mezcla apropiada de
células no diana lisadas y de ARNr de M. kansasii en un
intervalo de 0 ng a 100 ng, como se indica, y la hibridación y la
detección se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 2. Los
resultados muestran una buena recuperación de la señal en presencia
de un gran número (aproximadamente 1,5 x 10^{7}) de células no
diana.
| 100 ng | 50 ng | 25 ng | 10 ng | 1 ng | 0 ng | |
| ARNr | ARNr | ARNr | ARNr | ARNr | ARNr | |
| ARNr sólo de M. kansasii | 187.549 | 109.790 | 55.499 | 21.888 | 3.018 | 794 |
| ARNr de M. kansasii + células de M. avium | 191.671 | 101.300 | 51.249 | 22.830 | 3.305 | 985 |
| porcentaje de recuperación | 102 | 92 | 92 | 104 | 109 | |
| ARNr de M. kansasii + células de M. gastri | 171.647 | 91.744 | 50.301 | 20.702 | 3.056 | 1.032 |
| porcentaje de recuperación | 92 | 84 | 91 | 95 | 101 | |
| ARNr de M. kansasii + células | 199.513 | 102.465 | 50.466 | 21.196 | 2.267 | 1.607 |
| de M. tuberculosis | ||||||
| porcentaje de recuperación | 106 | 93 | 91 | 97 | 75 |
Las realizaciones mostradas en los diversos
ejemplos descritos anteriormente confirman que los oligonucleótidos
descritos en este documento son capaces de detectar ácidos nucleicos
de M. kansasii y que pueden usarse en un ensayo para
distinguir M. kansasii de sus parientes filogenéticos más
próximos. Ninguno de los ejemplos descritos en este documento
pretende limitar la presente invención a las realizaciones de la
descripción precedente; realizaciones adicionales se encuentran
dentro de las reivindicaciones siguientes.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- GEN-PROBE INCORPORATED
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- 9880 Campus Point Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- 92121
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA LA DETECCIÓN DE MYCOBACTERIUM KANSASII
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 33
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn edición 1.0, versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGUAUCGCG CGCGAGCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGUAUCAC GCGUGAGCG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGUAUCAC GUGCAAGCG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTCGCGCG CGATACGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTCACGCG TGATACGCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTTGACACG TGATACGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTTGCACG TGATACGCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGCAGCGA AAGCGAGUCU GAAUAGG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUGUGUAGUGG CGUGUUCUGG ACCCGAAGCG G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTATTCAGA CTCGCTTTCG CTGCGGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTTCGGG TCCAGAACAC GCCACTACAC A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATTCAGAC TCGCTTTCGC TGCGGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTATCGCG CGCGAGCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTATCAC GCGTGAGCG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTATCAC GTGCAAGCG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCUCGCGCG CGAUACGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCUCACGCG UGAUACGCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCUUGCACG UGAUACGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCUUGCACG UGAUACGCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGCAGCGA AAGCGAGTCT GAATAGG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTGTAGTGG CGTGTTCTGG ACCCGAAGCG G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGUAUUCAGA CUCGCUUUCG CUGCGGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCUUCGGG UCCAGAACAC GCCACUACAC A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCUAUUCAGAC UCGCUUUCGC UGCGGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCGCG
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGUG
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGUGCG
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGCGC
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGCGU
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCACGU
\hfill7
Claims (25)
1. Una sonda para ensayos de hibridación para
detectar la presencia de Mycobacterium kansasii en una
muestra, teniendo dicha sonda una longitud de 10 a 100 bases y
teniendo una región de al menos 10 bases contiguas perfectamente
complementaria de una región de al menos 10 bases contiguas presente
en una secuencia diana seleccionada del grupo compuesto por ID SEC
Nº:5, ID SEC Nº:6, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:9, el complemento de ID
SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID SEC Nº:17, ID SEC Nº:18, ID SEC Nº:20, ID
SEC Nº:21, el complemento de ID SEC Nº:21 y ID SEC Nº:22, en la que
dicha sonda forma un dúplex detectable con ácido nucleico de
Mycobacterium kansasii en condiciones de hibridación
restrictivas, y en que dicha sonda no forma un híbrido detectable
con ácido nucleico de Mycobacterium avium, Mycobacterium
chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri,
Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium
intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium
simiae o Mycobacterium tuberculosis en dichas
condiciones.
2. La sonda de la reivindicación 1, en la que
la secuencia diana se selecciona del grupo compuesto por ID SEC
Nº:5, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:17 y ID SEC Nº:20.
3. La sonda de la reivindicación 1, en la que
la secuencia diana se selecciona del grupo compuesto por ID SEC
Nº:6, ID SEC Nº:9, el complemento de ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID
SEC Nº:18, ID SEC Nº:21 y el complemento de ID SEC Nº:21 y ID SEC
Nº:22.
4. La sonda de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de bases de dicha
sonda, incluyendo la región de 10 bases contiguas perfectamente
complementaria de una región de al menos 10 bases contiguas
presente en la secuencia diana, es complementaria al menos al 80% de
la secuencia de bases presente en la secuencia diana.
5. La sonda de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de bases de dicha
sonda, incluyendo la región de 10 bases contiguas perfectamente
complementaria de una región de al menos 10 bases contiguas
presente en la secuencia diana, es complementaria al menos al 90% de
la secuencia de bases presente en la secuencia diana.
6. La sonda de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de bases de dicha
sonda es perfectamente complementaria de la secuencia de bases
presente en la secuencia diana.
7. La sonda de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de bases de dicha
sonda tiene una longitud de 10 a 50 bases.
8. La sonda de la reivindicación 2, en la que
dicho Mycobacterium kansasii es la subespecie BOV de
Mycobacterium kansasii.
9. La sonda de la reivindicación 3, en la que
dicho Mycobacterium kansasii es la subespecie COU de
Mycobacterium kansasii.
10. La sonda de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha sonda incluye un
marcador.
11. Un dúplex detectable formado entre dicha
sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y ácido
nucleico de Mycobacterium kansasii.
12. Una mezcla de sondas para detectar la
presencia de Mycobacterium kansasii en una muestra,
comprendiendo dicha mezcla de sondas:
dicha sonda de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10; y
uno o varios oligonucleótidos auxiliares.
13. Una mezcla de sondas según la reivindicación
12, en la que cada uno de dichos, uno o varios, oligonucleótidos
auxiliares tiene una longitud de 10 a 100 bases y tiene una región
de al menos 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una
región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia de
referencia seleccionada del grupo compuesto por ID SEC Nº:11, ID
SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:14, ID SEC Nº:15, ID SEC Nº:23,
ID SEC Nº:24, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:26, ID SEC Nº:27 y
complementos de las mismas.
14. La mezcla de sondas de la reivindicación 13,
en la que la secuencia de referencia se selecciona del grupo
compuesto por ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:14, ID SEC
Nº:26, ID SEC Nº:15, ID SEC Nº:27 y complementos de las mismas.
15. Una mezcla de sondas para detectar la
presencia de Mycobacterium kansasii en una muestra,
comprendiendo dicha mezcla de sondas:
una primera sonda para ensayos de hibridación
según dicha sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 4 a
10, en que dicha secuencia diana se selecciona del grupo compuesto
por ID SEC Nº:5, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:17 y ID SEC Nº:20; y
una segunda sonda para ensayos de hibridación
según dicha sonda de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10,
en la que dicha secuencia diana se selecciona del grupo compuesto
por ID SEC Nº:6, ID SEC Nº:9, el complemento de ID SEC Nº:9, ID SEC
Nº:10, ID SEC Nº:18, ID SEC Nº:21, el complemento de ID SEC Nº:21 y
ID SEC Nº:22.
16. La mezcla de sondas de la reivindicación 15,
comprendiendo adicionalmente uno o varios oligonucleótidos
auxiliares.
17. La mezcla de sondas de la reivindicación 16,
en la que cada uno de dichos oligonucleótidos auxiliares tiene una
longitud de 10 a 100 bases y tiene una región de al menos 10 bases
contiguas perfectamente complementaria de una región de al menos 10
bases contiguas presente en una secuencia de referencia seleccionada
del grupo compuesto por ID SEC Nº:11, ID SEC Nº:12, ID SEC Nº:13,
ID SEC Nº:14, ID SEC Nº:15, ID SEC Nº:23, ID SEC Nº:24, ID SEC
Nº:25, ID SEC Nº:26, ID SEC Nº:27 y complementos de las mismas.
18. La mezcla de sondas de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, comprendiendo adicionalmente una tercera
sonda para ensayos de hibridación para detectar la presencia de
Mycobacterium kansasii en una muestra, teniendo dicha sonda
una longitud de 10 a 100 bases y teniendo una región de al menos 10
bases contiguas perfectamente complementaria de una región de al
menos 10 bases contiguas presente en una tercera secuencia diana
seleccionada del grupo compuesto por ID SEC Nº:4, ID SEC Nº:7, ID
SEC Nº:16 y ID SEC Nº:19, en la que dicha tercera sonda forma un
dúplex detectable con ácido nucleico de Mycobacterium
kansasii en condiciones de hibridación restrictivas y en la que
dicha tercera sonda no forma un dúplex detectable con ácido nucleico
de Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium
fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae,
Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare,
Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae o
Mycobacterium tuberculosis en dichas condiciones.
19. La mezcla de sondas de la reivindicación
18, en la que la secuencia de bases de dicha tercera sonda tiene
una longitud de 10 a 50 bases.
20. La mezcla de sondas de la reivindicación 18,
en la que la secuencia de bases de dicha tercera sonda, incluyendo
la región de 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una
región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia
diana, es complementaria al menos al 80% de la secuencia de bases
presente en la tercera secuencia diana.
21. La mezcla de sondas de la reivindicación 18,
en la que la secuencia de bases de dicha tercera sonda, incluyendo
la región de 10 bases contiguas perfectamente complementaria de una
región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia
diana, es complementaria al menos al 90% de la secuencia de bases
presente en la tercera secuencia diana.
22. La mezcla de sondas de la reivindicación 18,
en la que la secuencia de bases de dicha tercera sonda es
perfectamente complementaria de la secuencia de bases en la tercera
secuencia diana.
23. La mezcla de sondas de una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 22, en la que dicha tercera sonda incluye un
marcador.
24. Un procedimiento para detectar la presencia
de Mycobacterium kansasii en una muestra, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas de:
a) proporcionar a la muestra al menos una de
dichas sondas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o
una mezcla de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 12
a 23;
b) incubar dicha muestra en condiciones de
hibridación restrictivas, de modo que dicha sonda, o sondas,
hibride con ácido nucleico de Mycobacterium kansasii,
formando así un dúplex detectable, y en que dicha sonda no forme un
dúplex detectable con ácido nucleico de Mycobacterium avium,
Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium
gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum,
Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum,
Mycobacterium simiae o Mycobacterium tuberculosis en
dichas condiciones; y
c) detectar el dúplex de la etapa b), en caso de
que se forme, como una indicación de la presencia de
Mycobacterium kansasii en dicha muestra.
25. Un kit para detectar la presencia de
Mycobacterium kansasii, comprendiendo dicho kit una sonda
para ensayos de hibridación según dicha sonda de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10.
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