KR20230107609A - 항-호흡기 세포융합 바이러스 (rsv) 항체 세포-기반 역가 검정 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 RSV 리포터 바이러스를 사용하는 세포 배양 시스템에서 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 항-호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항체의 역가를 측정하는 방법을 기재한다. 본 개시내용은 또한 리포터 유전자를 운반하는 호흡기 세포융합 바이러스, 및 리포터 유전자를 운반하는 감염성 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 생산하기 위한 발현 벡터를 기재한다.
Description
본 개시내용은 A549 세포 및 RSV 리포터 바이러스를 갖는 배양된 시스템을 사용하여 항-호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항체 활성을 측정하기 위한 세포-기반 역가 검정을 기재한다.
인간 RSV 게놈은 11종의 단백질을 코딩하는 대략 15 kb의 단일-가닥 음성-센스 RNA 분자이다. 이들 단백질 중 2종은 비리온의 주요 표면 당단백질이다. 이들은 (i) 세포에 대한 바이러스 결합을 매개하는 부착 (G) 단백질, 및 (ii) 감염 사이클의 초기 단계에서의 바이러스 및 세포 막의 융합 및 특징적인 합포체를 형성하기 위한 감염된 세포의 막과 인접한 세포의 것의 융합 둘 다를 촉진하는 융합 (F) 단백질이다. 부착 단백질 G는 세포 표면 수용체에 결합하고 F와 상호작용한다. 이 상호작용은 F에서의 입체적 변화를 유발하여 막 융합을 유도하며, 이로써 숙주 세포 세포질 내로 바이러스 리보핵단백질 복합체를 방출한다.
F 단백질 또는 G 단백질에 대한 모노클로날 항체는 시험관내 중화 효과 및 생체내 예방적 효과를 갖는 것으로 제시되었다. 예를 들어, 문헌 [Beeler and Coelingh 1989, J. Virol. 63:2941-50; Garcia-Barreno et al., 1989, J. Virol. 63:925-32; Taylor et al., 1984, Immunology 52: 137-142; Walsh et al., 1984, Infection and Immunity 43:756-758]; 및 미국 특허 번호 5,842,307 및 6,818,216을 참조한다. F 당단백질 상 중화 에피토프는 원래 항체 탈출 변이체에서 변경된 아미노산을 확인하고 RSV F-유래된 펩티드에 대한 항체 결합을 평가함으로써 맵핑되었다.
여러 항-RSV 항체가 미성숙 또는 손상된 면역계를 갖는 유아 및 노령에서 RSV 감염에 대해 보호하기 위한 수동 면역요법제로서 사용하기 위해 임상 개발 중에 있다. 이러한 항-RSV 항체는 수동 면역요법제로서 효과적으로 작용하기 위해 고도로 강력해야 한다. 따라서, 예를 들어, 항-RSV 항체의 임상 배치의 역가를 확인하기 위한 세포-기반 역가 검정으로서의 RSV 중화 검정에 대한 필요가 있다.
바이러스 중화 검정의 산업 표준은 플라크 감소 중화 시험 (PRNT)이다 (McKimm-Breschkin JL. 2004). PRNT는 수동 플라크 계수에 기반하고 낮은 처리량이고, 상당한 자원을 필요로 하고, 높은 가변성을 갖는다. 따라서, 빠르고, 사용하기 쉽고, 낮은 가변성을 갖는 항-RSV 항체의 역가를 결정하기 위한 검정은 항-RSV 항체 임상 후보의 개발을 위한 자산일 것이다.
본 발명은 리포터 유전자를 코딩하도록 조작된 호흡기 세포융합 바이러스, 이러한 바이러스를 코딩하는 핵산, 및 세포 배양 시스템을 사용하여 항-RSV 항체 활성을 측정하기 위한 세포-기반 역가 검정을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 감염성 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 생산하기 위한 발현 벡터를 제공한다: a) 호흡기 세포융합 바이러스를 코딩하는 핵산 서열; 및 b) RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자로서, 리포터 유전자 및 플랭킹 RSV 유전자 시작 및 RSV 유전자 종료 서열이 호흡기 세포융합 바이러스의 P와 M 유전자 사이에 위치된 것인 리포터 유전자.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스를 제공한다: a) 호흡기 세포융합 바이러스를 코딩하는 핵산 서열; 및 b) RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자로서, 리포터 유전자 및 플랭킹 RSV 유전자 시작 및 RSV 유전자 종료 서열이 호흡기 세포융합 바이러스의 P와 M 유전자 사이에 위치된 것인 리포터 유전자.
상기 발현 벡터 및 호흡기 세포융합 바이러스의 일부 실시양태에서, a) 리포터 유전자는 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하거나; 또는 b) 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 발광 효소는 루시페라제이다. 일부 실시양태에서, RSV 유전자 시작 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 16이고 RSV 유전자 종료 서열은 서열식별번호: 17이다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자의 서열은 서열식별번호: 18이다. 일부 실시양태에서, RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자는 서열식별번호: 15이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 세포융합 바이러스는 균주 A2이거나 또는 서열식별번호: 14의 핵산을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 항-호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성을 측정하는 방법을 제공한다: a) (i) 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편, (ii) 리포터 유전자를 포함하는 RSV 바이러스, 및 (iii) RSV 바이러스에 의해 감염가능한 1개 이상의 세포를 조합하는 단계; 및 b) 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계.
상기 방법의 일부 실시양태에서, RSV 바이러스에 의해 감염가능한 1개 이상의 세포는 RSV 바이러스가 첨가되기 전에 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합된다. 일부 실시양태에서, a) 리포터 유전자는 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계는 발광 기질의 발광을 검출하는 것을 포함하거나; 또는 b) 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계는 형광 단백질로부터의 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 발광 효소이다. 일부 실시양태에서, 발광 효소는 루시페라제이다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 UV 파장에서 여기된 단백질, 예컨대 Sirius, Sandercyanin, shBFP-N158S/L173I이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 청색 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 Azurite, EBFP2, mKalama1, mTagBFP2, TagBFP, 또는 shBFP이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 시안 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 ECFP, Cerulean, mCerulean3, SCFP3A, CyPet, mTurquoise, mTurquoise2, TagCFP, mTFP1, 단량체성 Midoriishi-Cyan, 또는 Aquamarine이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 녹색 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 GFP, TurboGFP, TagGFP2, mUKG, Superfolder GFP, Emerald, EGFP, 단량체성 Azami Green, mWasabi, Clover, mNeonGreen, NowGFP, 또는 mClover3이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 황색 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 TagYFP, EYFP, Topaz, Venus SYFP2, Citrine, Ypet, IanRFP-deltaS83, mPapaya1, 또는 mCyRFP1이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 주황색 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 단량체성 Kusabira-Orange, mOrange, mOrange2, mKOkappa, 또는 mKO2이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 적색 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 TagRFP, TagRFP-T, RRvT, mRuby, mRuby2, mTangerine, mApple, mStrawberry, FusionRed, mCherry, mNectarine, mRuby3, mScarlet, 또는 mScarlet-I이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 초적 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 mKate2, hcRed-Tandem, mPlum, mRaspberry, mNeptune, NirFP, TagRFP657, TagRFP675, mCardinal, mStable, mMaroon1, 또는 mGarnet2이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 근적외선 파장의 광에 의해 여기된 단백질, 예컨대 iFP1.4, iRFP713 (iRFP), iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP720, iFP2.0, mIFP, TDsmURFP, 또는 miRFP670이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 Sapphire, T-Sapphire, 또는 mAmetrine이다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 mKeima, mBeRFP, LSS-mKate2, LSS-mKate1, LSSmOrange, CyOFP1, 또는 Sandercyanin과 같은 긴 스토크스 이동을 갖는다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 루시페라제 기질을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, RSV 바이러스에 의해 감염가능한 1개 이상의 세포는 A549 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 항-호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성을 측정하는 방법을 제공한다: a) 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 루시페라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 RSV 바이러스를 조합하는 단계; b) 단계 a)의 혼합물을 1개 이상의 A549 세포에 첨가하는 단계; c) 루시페라제 기질을 단계 b)의 혼합물에 첨가하는 단계; 및 d) 루시페라제 기질의 발광을 검출하는 단계.
리포터 유전자가 루시페라제인 상기 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 루시페라제를 코딩하는 핵산 서열은 나노루시페라제를 코딩한다.
상기 측면 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: (a) HC-CDR1이 서열식별번호: 1이고, HC-CDR2가 서열식별번호: 2이고, HC-CDR3이 서열식별번호: 3인 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HC-CDR); 및 (b) LC-CDR1이 서열식별번호: 4이고, LC-CDR2가 서열식별번호: 5이고, LC-CDR3이 서열식별번호: 6인 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LC-CDR). 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 8의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 9를 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 10을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 9의 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 2개의 경쇄를 포함하는 항체이다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, RSV 바이러스는 a) 호흡기 세포융합 바이러스를 코딩하는 핵산 서열; 및 b) RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자로서, 리포터 유전자 및 플랭킹 RSV 유전자 시작 및 RSV 유전자 종료 서열이 호흡기 세포융합 바이러스의 P와 M 유전자 사이에 위치된 것인 리포터 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, a) 리포터 유전자는 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계는 발광 기질의 발광을 검출하는 것을 포함하거나; 또는 b) 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계는 형광 단백질로부터의 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발광 효소는 루시페라제이다. 일부 실시양태에서, RSV 유전자 시작 서열은 서열식별번호: 16이고 RSV 유전자 종료 서열은 서열식별번호: 17이다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자의 서열은 서열식별번호: 18이다. 일부 실시양태에서, RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자는 서열식별번호: 15이다. 일부 실시양태에서, 호흡기 세포융합 바이러스는 균주 A2이거나 또는 서열식별번호: 14의 핵산을 포함한다.
도 1은 항-RSV 항체 A를 사용한 세포-기반 역가 검정의 개략도를 제시한다.
도 2a-2c는 예시적인 희석 플레이트 맵을 제시한다. 플레이트 1-3에 대한 맵은 각각 도 2a, 2b 및 2c에 제시된다.
도 3은 항체 A에 대한 세포-기반 역가 검정의 전형적인 결과의 그래프를 제시한다.
도 2a-2c는 예시적인 희석 플레이트 맵을 제시한다. 플레이트 1-3에 대한 맵은 각각 도 2a, 2b 및 2c에 제시된다.
도 3은 항체 A에 대한 세포-기반 역가 검정의 전형적인 결과의 그래프를 제시한다.
예를 들어 A549 세포를 포함하는 세포를 갖는 배양된 시스템을 사용하여 항-RSV 항체 활성을 측정하기 위한 세포-기반 역가 검정이 본원에 개시된다. 하나의 실시양태에서, 검정은 RSV 리포터 바이러스, RSV-NLucP를 이용하며, 이는 RSV 게놈 내에 나노루크(NanoLuc)® 루시페라제 효소에 대한 유전자를 코딩한다. 세포를 감염시킨 후, RSV-NLucP는 나노루크® 루시페라제를 발현하며, 이는 루시페라제 기질의 첨가 시 발광 신호를 생성한다. 발광 신호는 RSV-NLucP 감염성에 대해 정비례한다. 항-RSV 항체의 도입은 숙주 세포로의 RSV-NLucP의 진입을 차단하고 따라서 발광 신호를 억제한다. 하나의 실시양태에서, 항-RSV 항체는 서열식별번호: 9의 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 2개의 경쇄를 갖는 항체 A이다. 검정은 강력하고, 정량적이고 정확하다.
특정 기술 및 과학 용어는 하기 정의된다. 본 명세서에서 다른 곳에 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 바와 같은, 단수 형태의 단어는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 이들의 상응하는 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 또는 결합 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화, 완전 인간 항체, 키메라 항체 및 낙타화된 단일 도메인 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "모 항체"는 의도된 사용을 위한 항체의 변형, 예컨대 인간 치료제로서 사용하기 위한 항체의 인간화 전에 항원에 대한 면역계의 노출에 의해 수득된 항체이다.
일반적으로, 기본 (또는 "전장") 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 더 많은 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 문맥에서, 용어 "도메인" 및 "영역"은 적절한 경우에, 상호교환적으로 사용될 수 있다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는, 일반적으로, 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 또한 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 3개의 초가변 영역을 포함하며, 이는 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치된다. CDR은 통상적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는, N-말단에서 C-말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 지정은, 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 or Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은, "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 지칭한다. 항체 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자, 예를 들어 sc-Fv; 나노바디 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
명시된 표적 단백질"에 특이적으로 결합하는" 항체는 다른 단백질과 비교하여 해당 표적에 대한 우선적 결합을 나타내는 항체이나, 이 특이성은 절대적인 결합 특이성을 필요로 하지 않는다. 항체는 그의 결합이, 예를 들어 목적하지 않는 결과, 예컨대 위양성을 생산하지 않으면서 샘플에서의 표적 단백질의 존재를 결정하는 경우에 그의 의도된 표적에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명에 유용한 항체, 또는 그의 결합 단편은 비-표적 단백질과의 친화도보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게는 적어도 10배 더 큰, 보다 바람직하게는 적어도 20-배 더 큰, 및 가장 바람직하게는 적어도 100-배 더 큰 친화도로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 항체는 그가 제공된 아미노산 서열, 예를 들어 RSV 항원의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하나 해당 서열이 결여된 단백질에 결합하지 않는 경우에, 해당 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.
"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 (예를 들어, 인간)으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 항체 뿐만 아니라 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 지칭한다.
"인간 항체"는 오직 인간 이뮤노글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우에 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각 오직 마우스 또는 래트 이뮤노글로불린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다.
"인간화 항체"는 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 뿐만 아니라 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 이러한 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 접두사 "hum", "hu" 또는 "h"는 인간화 항체를 모 설치류 항체와 구별하는데 필요한 경우 항체 클론 명칭에 부가된다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이지만, 특정 아미노산 치환이 친화도를 증가시키기 위해, 인간화 항체의 안정성을 증가시키기 위해, 또는 다른 이유를 위해 포함될 수 있다.
"포함하는" 또는 변이, 예컨대 "포함한다" 또는 "로 구성된"은 언어 또는 필요한 암시를 표현하기 위해 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 포괄적 의미로, 즉, 언급된 특색의 존재를 명시하나 본 발명의 실시양태 중 임의의 것의 작동 또는 유용성을 물질적으로 증진시킬 수 있는 추가 특색의 존재 또는 부가를 배제하지 않도록 사용된다.
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 변화가 단백질의 생물학적 활성 또는 다른 목적하는 특성, 예컨대 항원 친화도 및/또는 특이성을 변경하지 않으면서 빈번히 이루어질 수 있도록, 유사한 특징 (예를 들어 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 형태 및 강성률 등)을 갖는 다른 아미노산으로의 단백질에서의 아미노산의 치환을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들어, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 보다 적다. 예시적인 보존적 치환은 하기 표 1에 제시된다.
표 1. 예시적인 보존적 아미노산 치환
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은, "본질적으로 이루어진다", 및 변이, 예컨대 "본질적으로 이루어지다" 또는 "본질적으로 이루어진"은 임의의 언급된 요소 또는 요소의 그룹의 포함, 및 명시된 투여 요법, 방법, 또는 조성물의 기본 또는 신규 특성을 물질적으로 변화시키지 않는, 언급된 요소와 유사하거나 또는 상이한 특성의 다른 요소의 임의적인 포함을 나타낸다. 비-제한적인 예로서, 언급된 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 항-RSV 항체는 또한 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 결합 화합물의 특성에 물질적으로 영향을 미치지 않는 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 CDR 영역을 배제하는 이뮤노글로불린 가변 영역을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "카바트"는 문헌 [Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)]에 의해 개척된 이뮤노글로불린 정렬 및 넘버링 시스템을 의미한다.
"항-RSV 항체"는, 바람직하게는 RSV A 균주 및 B 균주 둘 다로부터의 인간 RSV F 단백질에 결합하고, 융합-전 F 단백질 및 융합-후 F 단백질 둘 다에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 의미한다. 일부 실시양태에서, 항-RSV F-단백질 항체는 단리된다. 본원에 기재된 항체는 F 단백질의 부위 IV에서의 에피토프에 결합한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태 중 임의의 것에서, 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열은 포함하지 않고/거나 경쇄 또는 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다.
하나의 실시양태에서, 항-RSV F-단백질 항체는 완전 인간이다.
본원에 사용된 바와 같은, 항-RSV F-단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. "인간 RSV에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약 1 nM 또는 더 높은 친화도 (예를 들어, 1 nM-2 pM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 또는 2 pM)의 Kd로 융합-전 또는 융합-후 인간 RSV F 단백질에 결합하나, RSV F 단백질 서열이 결여된 다른 단백질에 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 하나의 실시양태에서, 인간 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 또한 소 RSV F 단백질과 교차-반응성이다. 본원에 사용된 바와 같은 "교차-반응성"은 다른 종으로부터의 상동성 단백질과 반응하는 항체의 능력을 지칭한다. 항체가 인간 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하는지 여부는 관련 기술분야에 공지된 임의의 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 검정의 예는 표면 플라스몬 공명 (예를 들어, 비아코어(BIACORE)) 또는 유사한 기술 (예를 들어, 키넥사(KinExa) 또는 옥텟(OCTET))을 포함한다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 "Fab 단편"이다. "Fab 단편"은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab 단편"은 항체의 파파인 절단의 산물일 수 있다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fc 영역을 포함한다. "Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab' 단편이다. "Fab' 단편"은 1개의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 1개의 중쇄의 일부 또는 단편을 함유하며, 이에 따라 쇄간 디술피드 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab') 2 분자를 형성할 수 있다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 F(ab')2 단편이다. "F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이에 따라 쇄간 디술피드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성된다. F(ab') 2 단편은 따라서 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "F(ab')2 단편"은 항체의 펩신 절단의 산물일 수 있다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fv 단편이다. "Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하나, 불변 영역이 결여된다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 scFv 단편이다. 용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv로 하여금 항원-결합을 위한 목적하는 구조를 형성하게 하는 폴리펩티드 링커를 VH와 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,260,203을 참조한다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 도메인 항체이다. "도메인 항체"는 단지 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적으로 기능적 이뮤노글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 VH 영역은 펩티드 링커로 공유 연결되어 2가 도메인 항체를 형성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일하거나 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 2가 항체이다. "2가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중특이적일 수 있다 (하기 참조).
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 디아바디이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 여기서 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH). 동일한 쇄 상 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 보다 완전히 기재되어 있다. 조작된 항체 변이체의 검토를 위해 일반적으로 문헌 [Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136]을 참조한다.
전형적으로, 일부 방식으로 변형된 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 활성이 몰 기준으로 표현될 때 (모 항체와 비교하여) 그의 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 모 항체보다 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상의 RSV F-단백질 결합 친화도를 보유한다. 또한 항체 또는 항원-결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환 (항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존된 변이체"로 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단리된 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편이다. "단리된" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이들이 생산된 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질, 예컨대 세포 잔해 및 성장 배지를 포함한다. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로 발현 시스템 구성요소, 예컨대 숙주 세포로부터의 생물학적 분자 또는 그의 성장 배지가 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재 또는 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제의 구성요소를 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.
상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질 항체의 집단, 즉, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열이 동일한 집단을 포함하는 항체 분자를 지칭한다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 이들의 가변 도메인, 특히 보통 상이한 에피토프에 특이적인 이들의 CDR에서 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질 집단의 항체로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 의해 먼저 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]을 참조한다.
하나의 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 9의 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 2개의 경쇄를 포함하는 항체 A이다.
하나의 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 8을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉 경쇄 가변 도메인에서의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄 가변 도메인에서의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] (서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조하고; 또한 문헌 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917] (구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDR 잔기로서 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 이들 가변 도메인 잔기를 지칭한다.
"단리된 핵산 분자" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 단리된 폴리뉴클레오티드가 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않거나, 또는 그가 천연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이들의 일부 조합을 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"가 무손상 염색체를 포함하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는, 명시된 서열에 더하여, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개 또는 그 초과의 다른 단백질 또는 그의 일부 또는 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 언급된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "바이러스", "바이러스성 입자", "바이러스 입자", 또는 "재조합 감염성 바이러스 입자"는 세포 외부에 위치되는, 바이러스 핵산으로부터 유래된 단일 입자를 지칭한다. 바이러스성 입자는 따라서 성숙 및 감염성 형태의 바이러스를 나타낸다. 바이러스성 입자가 유전자 정보를 함유하기 때문에, 이는 복제할 수 있고/거나 이는 감수성 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 바이러스의 복잡성에 따라, 바이러스성 입자는 핵산 및 폴리펩티드 서열 및, 임의로 바람직하게는 숙주 세포로부터 유래된 지질 막의 형태의 지질을 포함한다. 핵산 서열을 갖는 바이러스는 "유전자 페이로드"로 불리는, 비-본래의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드 서열", "핵산 서열" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에서의 일련의 뉴클레오티드 염기 (또한 "뉴클레오티드"로 불림)이고, 2개 이상의 뉴클레오티드의 임의의 쇄를 의미한다.
본원의 핵산은 천연 조절 (발현 제어) 서열에 의해 플랭킹될 수 있거나, 또는 프로모터, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 다른 리보솜 결합 부위 서열, 인핸서, 반응 요소, 억제인자, 신호 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 5'- 및 3'-비-코딩 영역 등을 포함하는 이종성 서열과 회합될 수 있다.
"코딩 서열" 또는 발현 산물, 예컨대 RNA, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소를 을 "코딩하는" 서열은, 발현될 때, 산물의 생산을 초래하는 뉴클레오티드 서열이다.
용어 "유전자"는 1개 이상의 RNA 분자, 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하는 리보뉴클레오티드 또는 아미노산의 특정 서열을 코딩하거나 또는 이에 상응하는 DNA 서열을 의미하고, 예를 들어, 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 조절 DNA 서열, 예컨대 프로모터 서열을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 유전자는 DNA로부터 RNA로 전사될 수 있으며 이는 아미노산 서열로 번역될 수 있거나 또는 번역될 수 없다.
일반적으로, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포에서 (예를 들어, 직접적으로 또는 다른 프로모터-결합된 단백질 또는 물질을 통해) RNA 폴리머라제에 결합하고 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은, 일반적으로, 그의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 결합되고, 임의의 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소한의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)로 연장한다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위 (예를 들어, 뉴클레아제 S1로 맵핑함으로써 편리하게 정의됨) 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)이 발견될 수 있다. 프로모터는 인핸서 및 억제자 서열을 포함하는 다른 발현 제어 서열 또는 리포터 유전자와 작동가능하게 회합될 수 있다.
코딩 서열은 서열이 RNA, 바람직하게는 mRNA로의 코딩 서열의 RNA 폴리머라제 매개된 전사를 지시하고, 이어서 RNA 스플라이싱되고 (그가 인트론을 함유하는 경우), 임의로, 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역될 수 있을 때 세포에서 전사 및 번역 제어 서열"의 제어 하"에 있거나, 이"와 기능적으로 회합"되거나, 이"에 작동가능하게 연결"되거나, 또는 이"와 작동가능하게 회합"된다.
용어 "발현한다" 및 "발현"은 유전자, RNA 또는 DNA 서열의 정보가 나타나지도록 허용하거나 또는 초래하는 것; 예를 들어, 상응하는 유전자의 전사 및 번역에 수반된 세포 기능을 활성화시킴으로써 단백질을 생산하는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포에서 또는 이에 의해 발현되어 "발현 산물", 예컨대 RNA (예를 들어, mRNA) 또는 단백질을 형성한다. 발현 산물 그 자체는 또한 세포에 의해 "발현되는" 것으로 언급될 수 있다.
용어 "상류"는 유전자가 다른 유전자의 5'단부에 있는 것을 지칭한다.
용어 "형질전환"은 세포로의 핵산의 도입을 의미한다. 도입된 유전자 또는 서열은 "클론"으로 불릴 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받는 숙주 세포는 "형질전환"되었고 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포로 도입된 DNA 또는 RNA는 숙주 세포와 동일한 속 또는 종의 세포를 포함하는 임의의 공급원, 또는 상이한 속 또는 종의 세포로부터 비롯될 수 있다.
"리포터 유전자"는 형광, 발광, 색 변화, 효소 검정, 또는 조직화학에 의해 검출가능한 단백질을 코딩하는 유전자이다. 예를 들어, 리포터 유전자에 의해 코딩된 형광 리포터 단백질은 특정 파장의 광에 노출될 때 형광을 발하는 형광 단백질일 수 있다 (예를 들어, GFP). 리포터 단백질은 기질과의 반응을 촉매하여 해당 기질에서의 관측가능한 변화를 생산하는 리포터 효소일 수 있다. 효소, 예컨대 루시페라제 (예시적인 기질 루시페린) 또는 β-락타마제 (예시적인 기질 CCF4)는 기질 절단에 대한 발광을 초래하거나 또는 형광을 허용할 수 있고, 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 (예시적인 기질 X-gal (5-브로모-4-클로로- 3-인돌일-P-D-갈락토피라노시드)) 및 분비된 알칼리 포스파타제 (예시적인 기질 PNPP (p-니트로페닐 포스페이트, 이나트륨 염))는 기질 절단 시 시각화가능한 침전물을 초래할 수 있다. 용어 "발광 기질"은 리포터 효소에 의한 촉매작용 시 발광하는 기질, 예를 들어 루시페린이다. 용어 "발광 효소" 또는 "발광 리포터 효소"는 발광 기질과의 반응을 촉매하는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 항체 결합 상호작용에 의해 검출가능하다.
용어 "발광 기질"은 리포터 효소에 의한 촉매작용 시 발광하는 기질, 예를 들어 루시페린을 지칭한다. 용어 "발광 효소" 또는 "발광 리포터 효소"는 발광 기질과의 반응을 촉매하는 효소, 예를 들어 루시페라제 또는 나노루시페라제를 지칭한다. 루시페라제를 코딩하는 다양한 루시페라제 유전자는 본 발명에 사용하기 위해 상업적으로 입수가능하며, 반딧불이, 바다 팬지 (레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)), 패충류 (사이프리디나 힐겐도르피(Cypridina hilgendorfii)), 및 요각류 (가우시아 프린셉스(Gaussia princeps))로부터의 루시페라제 유전자를 포함한다 (본원에 참조로서 포함된 문헌 [Bioconjug Chem. 2016 May 18; 27(5): 1175-1187] 참조). 하나의 루시페라제 효소는 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)으로부터 구입될 수 있는 심해 새우 (오플로포러스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris))로부터 유래된 변형된 19 kDa 루시페라제인 나노루크® (또한 Nluc로 불림)이다. Nluc는 세포에서 발현될 때 높은 강도, 글로우-유형 발광을 생산하는데 기질 푸리마진을 사용한다.
용어 "형광 단백질"은 또 다른 파장에서의 광에 의한 여기 후 일부 파장에서의 광을 방출하는 단백질을 지칭한다. 녹색 스펙트럼 범위에서 방출하는 예시적인 형광 단백질은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 녹색 형광 단백질 (GFP); 증진된 GFP (eGFP); 슈퍼폴더 GFP; AcGFPl; 및 ZsGreenl. 청색 스펙트럼 범위에서의 광을 방출하는 예시적인 형광 단백질은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 증진된 청색 형광 단백질 (EBFP), EBFP2, Azurite, 및 mKalama. 시안 스펙트럼 범위에서의 광을 방출하는 예시적인 형광 단백질은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 시안 형광 단백질 (CFP); 증진된 CFP (ECFP); Cerulean; mHoneydew; 및 CyPet. 황색 스펙트럼 범위에서의 광을 방출하는 예시적인 형광 단백질은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 황색 형광 단백질 (YFP); Citrine; Venus; mBanana; ZsYellow 1; 및 Ypet. 주황색 스펙트럼 범위에서 방출하는 예시적인 형광 단백질은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: mOrange; tdTomato. 적색 및 초적광 스펙트럼 범위에서의 광을 방출하는 예시적인 형광 단백질은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: DsRed; DsRed-단량체; DsRed-Express2; mRFPi; mCherry; mStrawberry; mRaspberry; niPluni; E2-Crimson; iRFP670; iRFP682; iRFP702; iRFP720. 형광 단백질의 예시적인 목록 및 이들의 특징은 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Day and Davidson, Chem Soc Rev 2009 October; 38(10): 2887-2921]에서 발견될 수 있다.
형광 단백질은 특정 파장의 광에 노출될 때 형광 공명 에너지 전이 (FRET)를 통해 에너지를 전달하고 받는 형광 단백질의 키메라 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍에서의 수용자는 또 다른 파장의 광에 노출된 공여자 분자로부터 에너지를 수용한 후 특정 파장에서의 광을 방출할 수 있다. 예시적인 키메라 FRET 쌍은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: ECFP-EYFP; mTurquoise2-SeYFP; EGFP-mCherry; 및 Clover-mRuby. 일부 실시양태에서, 키메라 형광 분자의 수용자 분자는 그의 바람직한 파장의 광에 노출된 공여자 분자의 광 방출을 켄칭할 수 있다. 키메라 형광 단백질의 상이한 부분 사이를 켄칭하는 것은 광활성화가능한 수용자를 사용하여 발생할 수 있다. 예를 들어, 키메라 형광 단백질은 광활성화가능한 GFP를 포함할 수 있으며 이는 이어서 CFP에 의한 광전자 방출을 켄칭할 수 있다. FRET 단백질의 예는 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Ehldebrandt et al., Sensors (Basel). 2016 Sep; 16(9): 1488]에 논의되어 있다.
"판독-출력 신호"는 리포터 유전자 단백질 발현으로부터 생산된 신호를 지칭한다. 신호는 단백질 또는 단백질과 기질의 반응에 의해 방출될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 신호는 형광 또는 발광이다.
"안정하게 형질감염된"은 외래 유전자가 숙주 게놈의 부분이고 따라서 복제되는 것을 지칭한다. 이는 전형적으로 세포를 외래 유전자로 일시적으로 형질감염시킴으로써 개시되나 면밀한 선택 및 증폭 공정을 통하고, 안정한 클론이 생성된다. 안정한 클론을 선택하는 하나의 방법은 이들의 게놈으로 성공적으로 통합된 유전자를 갖는 임의의 세포의 선택을 가능하게 하기 위해 플라스미드 DNA 상에 발현된 선택가능한 마커를 사용하는 것이다. 사용된 통상적인 방법은 또한 항생제 내성을 발현하는 유전자를 함유하도록 플라스미드 DNA를 설계하는 것이다. 장기간 동안 세포의 계속된 항생제 처리는 오직 안정하게-형질감염된 세포의 확장을 초래한다. 이들 안정하게-형질감염된 세포의 후손은 또한 외래 유전자를 발현하며, 안정하게 형질감염된 세포주를 초래한다.
용어 "벡터"는 숙주를 형질전환시키고, 임의로, 도입된 서열의 발현 및/또는 복제를 촉진하기 위해, DNA 또는 RNA 서열이 숙주 세포로 도입될 수 있는 비히클 (예를 들어, 플라스미드)를 포함한다.
"검정 배지"는 세포를 위한 영양(들), 예컨대 글루코스, 비타민, 아미노산, 또는 이들의 조합 및 혈청, 및 임의로 항생제 및 완충제를 포함하는 용액을 지칭한다.
일부 실시양태에서, A549 안정한 세포주가 항-RSV 기능적 세포-기반 검정에서 항-RSV 항체를 시험하는데 사용된다. A549 세포주는 인간 암종으로부터 유래된 폐 상피 세포주이다.
일반적인 방법
분자 생물학의 표준 방법은 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 문헌 [Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에 나타나며, 이는 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3), 및 생물정보학 (Vol. 4)을 기재한다.
면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 포함하는 단백질 정제 방법이 기재되어 있다 (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역-후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 글리코실화가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제, 및 단편화가 기재되어 있다 (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). 리간드/수용체 상호작용을 특징규명하는 표준 기술이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
모노클로날, 폴리클로날, 및 인간화 항체는 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499]; 미국 특허 번호 6,329,511 참조).
인간화에 대한 대안은 파지 상에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스에서의 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다 (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).
항원의 정제는 항체의 생성에 필요하지 않다. 동물은 관심 항원을 보유하는 세포로 면역화될 수 있다. 이어서 비장세포가 면역화된 동물로부터 단리될 수 있고, 비장세포는 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., supra; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).
형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함하는 유세포 분석 방법이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2 nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위해, 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 핵산, 폴리펩티드, 및 항체를 변형시키는데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 (Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
실시예
본원에 사용된 약어에 대한 정의가 하기 제공된다.
BSC 생물 안전 캐비닛
BSL 생물 안전 수준
CDR 상보성 결정 영역
COA 분석 증명서
Conc. 농도
DP 완제의약품
DS 원료의약품
ELN 전자 연구 노트
FBS HI 열 불활성화된 소 태아 혈청
h 시간
HC 중쇄
LC 경쇄
mg 밀리그램
min/min. 분
mL 밀리리터
No. 번호
RPM 분당 회전수
RSV 호흡기 세포융합 바이러스
RSV-NLucP 호흡기 세포융합 바이러스-나노루크 루시페라제-PEST
RT 실온
SDS 안전 데이터 시트
SOP 표준 작업 절차
TC-처리 조직 배양물-처리
Temp. 온도
uL/μL 마이크로 리터
WCB 제조용 세포 은행
WVS 제조용 바이러스 시드
본원에 기재된 실시예에 사용된 장비는 하기 표 1에 열거된다. 동등한 장비가 또한 사용될 수 있다.
실시예에 사용된 소모품 및 물질은 하기 표 2에 제공된다.
실시예에 사용된 시약은 하기 표 3에 제공된다.
표준 및 대조군
하기 실시예에 사용된 표준 및 대조군은 하기와 같이 기재된다. 현재 검증된 항체 A 참조 표준 로트가 각각의 검정에 사용되었다. 검정 대조군 물질은 참조 표준 로트와 상이한 원료의약품 물질이었다. 현재 검증된 검정 대조군 로트가 예상대로 방법 및 관련된 장비 기능을 보장하기 위해 각각의 희석 플레이트에 사용되었다.
이 방법은 항-RSV 항체, 예컨대 항체 A 원료의약품 및 완제의약품 방출 및 안정성 샘플을 시험하는데, 뿐만 아니라 다양한 연구, 예를 들어, 연장된 특징규명, 분석적인 동등성 등을 지지하는 기타 샘플에 적합하다.
실시예 1. RSV-NLucP (RSV-NLP)의 생성
호흡기 세포융합 바이러스 P3 (RSV-P3)이 리포터 유전자를 운반하는데 먼저 사용되었으며, RSV-P3의 M 및 G 단백질에 대한 코딩 서열 사이에 나노루시페라제 및 루시페라제를 배치하였다. 그러나, 리포터의 발현은 성공적이지 않았다. RSV 균주 A2에 대한 P 및 M 유전자에 대한 코딩 서열 사이의 나노루시페라제 리포터 유전자의 삽입은 하기 기재된 바와 같이 성공적이었다.
호흡기 세포융합 바이러스 A2 (RSV-A2)를 코딩하는 핵산 서열을 다수의 부분을 사용하여 pSMART 벡터 내로 클로닝하였다. Mlu 제한 부위에 의해 플랭킹된 rpsL을 포함하는 유전자 카세트 (rpsL-neo 선택/대응-선택 카세트; pRedET (tcR) 플라스미드; 진브릿지스(GeneBridges), 독일 하이델베르크)를 하기 재조합조작(recombineering) 기술을 사용하여 P와 M 사이의 유전자간 서열 내로 클로닝하였다.
rpsL 카세트의 증폭
rpsL-neo 카세트 (서열식별번호: 11)를 서열식별번호: 12 및 13의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. Q5 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용한 PCR 증폭은 하기 PCR 사이클로 Dam+ 이. 콜라이(E. Coli)로부터 단리된 1-2 ng rpsL-neo pRedET (tcR) 플라스미드 주형을 사용하였다: 30 사이클 동안, 15초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 1분 동안 72℃. Dam+ 이. 콜라이에 의해 메틸화된 플라스미드 주형을 제거하기 위해, 1-2 μl DpnI를 25μl 반응당 첨가하고, 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI는 메틸화된 rpsL 플라스미드 주형을 절단하나, 비메틸화된 PCR 산물을 절단하지 않는다. DpnI-소화된 PCR 산물을 겔-정제하였다. 강한 PCR 밴드를 정제하고, 50μl ddH2O 중에 용리하고, 이어서 전기적격 SW102 세포 (2.5μl, 대략 10-30 ng)를 형질전환시키는데 사용하였다.
RSV-A2 BAC 내로의 rpsL-neo 카세트의 삽입 (A2-rpsL BAC 제조)
RSV-A2 BAC를 함유하는 SW102 세포의 밤새 배양물을 5 ml LB 및 클로람페니콜에 접종하고 32℃에서 인큐베이션하였다. 표적 BAC를 함유하는 밤새 SW102 배양물 중 일부 (500μl)를 50 ml 배플 삼각 플라스크에서 클로람페니콜 (12.5 mg/ml)을 갖는 25 ml LB 중에 희석하고 32℃에서 진탕 수조에서 대략 0.6 (0.55-0.6)의 OD600까지 3-4시간 동안 인큐베이션하였다. 접종된 세포 중 또 다른 일부 (10 ml)를 또 다른 배플 50 ml 삼각 플라스크로 이동시키고 정확히 15분 동안 진탕 수조에서 42℃에서 열-충격하였다. 남은 배양물을 32℃에서 비-유도된 대조군으로서 방치하였다. 15분 후, 유도된 및 비-유도된 샘플을 간단하게 얼음/수조 슬러리에서 식히고 이어서 2개의 15 ml 튜브로 이동시키고 0℃에서 5분 동안 5000 RPM에서 회전된 원심분리기를 사용하여 펠릿화하였다. 상청액을 제거하였고, 펠릿을 얼음/수조 슬러리에서 튜브를 서서히 소용돌이 치게함으로써 1 ml 차가운 ddH2O 중에 재현탁시켰다. 재현탁시킬 때, 또 다른 9 ml 차가운 ddH2O를 첨가하였고 샘플을 재-펠릿화하였다. 재현탁/재-펠릿화 단계를 반복하였다. 두 번째 세척 및 원심분리 단계 후, 모든 상청액을 튜브를 역전시킴으로써 제거하였고, 펠릿 (각각 대략 50 ml)을 PCR 산물로 전기천공할 때까지 얼음 상에서 유지시켰다.
전기적격 SW102 세포를 이어서 형질전환시켰다. 각각의 전기천공은 25 mF, 1.75 kV, 및 200 옴의 0.1 cm 큐벳 (바이오라드(BioRad))에서 25μl 세포를 사용하였다. PCR 산물의 전기천공 후, 박테리아를 1시간 동안 32℃ 진탕 수조에서 1 ml LB (15 ml 튜브) 중에 회수하였다. 회수 기간 후, 박테리아를 LB/클로람페니콜+카나마이신 아가 플레이트 상에 배치하고 32℃에서 유지하였다. 클론을 고르고 콜로니 PCR을 사용하여 체크하였다.
나노루시페라제 카세트 (GS-Nlucp-GE 카세트)의 PCR 증폭
RSV NS2의 유전자 시작 (GS) 및 유전자 종료 (GE) 서열에 의해 플랭킹된 나노루시페라제 유전자 (GS-Nlucp-GE; 서열식별번호: 15)를 포함하는 나노루시페라제 유전자 카세트를 서열식별번호: 19 및 20의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
Q5 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 매사추세츠주 입스위치)를 사용한 PCR 증폭은 하기 PCR 사이클로 Dam+ 이. 콜라이로부터 단리된 1-2 ng 주형 (GS-Nlucp-GE 플라스미드)을 사용하였다: 30 사이클 동안, 15초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 1분 동안 72℃. Dam+ 이. 콜라이에 의해 메틸화된 플라스미드 주형을 제거하기 위해, 1-2μl DpnI를 25μl 반응당 첨가하고, 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI는 메틸화된 rpsL 플라스미드 주형을 절단하나, 비메틸화된 PCR 산물을 절단하지 않는다. DpnI-소화된 PCR 산물을 퀴아젠(Qiagen) 퀵 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
A2-rpsL BAC로의 박테리아 형질전환
A2-rpsL BAC를 함유하는 세포를 배양하였고 (20 ml), DNA를 세포로부터 단리하고 30ul 물 중에 용리하였다. A2-rpsL BAC (1μl)를 이어서 사용하여 복제 적격 이. 콜라이를 전기천공 (25 mF, 1.75 kV 및 200 옴의 0.1 cm 큐벳에서의 25μl의 세포)을 통해 형질전환시켰다. 전기천공 후, 박테리아를 1시간 동안 32℃ 진탕 수조에서 1 ml LB (15 ml 튜브) 중에 회수하였다. 회수 기간 후 박테리아를 LB/클로람페니콜+카나마이신 아가 플레이트 상에 배치하고 32℃에서 유지하였다.
rpsL 카세트를 GS-Nlucp-GE 카세트로 대체하기 위한 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)
A2-rpsL BAC-형질전환된 박테리아를 LB +클로람페니콜+0.01% 아라비노오스 중 200ml의 부피로 배양하였다. A2-rpsL BAC를 이어서 백맥스(BACMAX)™ DNA 정제 키트 (캠바이오(Cambio), 영국 캠브릿지)를 사용하여 정제하였다.
정제된 A2-rpsL BAC를 1μl DpnI를 사용하여 소화시켜 37℃에서 1시간 동안 주형 DNA를 소화시켰고, PCR 산물을 퀴아퀵(Qiaquick) PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)를 사용하여 세정하였다.
어셈블리 산물을 정제된 A2-rpsL BAC 단편 (Mlu I 소화; 9ul), GS-Nlucp-GE 카세트 PCR 산물 (1:20 희석액; 1μl), ddH2O (8μl), 및 깁슨 어셈블리 마스터 혼합물 (2X) (10μl)을 사용하여 혼합하였다. 어셈블리 산물을 50℃로 15분 동안 가온하고, 이어서 냉각하였다.
적격 세포를 얼음 상에 해동시켰고, 20 μl의 냉각된 어셈블리 산물을 적격 세포에 첨가하고, 서서히 혼합하였다. 혼합물을 얼음 상에 30분 동안 배치하고, 이어서 42℃에서 30초 동안 열 충격하였다. 튜브를 이어서 2분 동안 얼음으로 이동시켰고, 500 μl의 실온 SOC 배지를 튜브에 첨가하였다. 튜브를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 격렬히 진탕시키거나 (250 rpm) 또는 회전시켰다. 세포 (100 μl)를 이어서 가온된 선택 플레이트 (37℃) 상에 펼치고 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다.
2개의 양성 플레이트의 각각으로부터 2개의 콜로니를 고르고, 클로람페니콜을 갖는 5ml LB에 접종하고 밤새 진탕하면서 성장시켰다. 나노루크P에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 서열식별번호: 19 및 20)를 사용하는 콜로니 PCR을 사용하여 산물을 증폭시켰다. 2분 동안 98℃ PCR 사이클 초기 변성에 이어, 10초 동안 98℃, 30초 동안 52℃, 및 2분 30초 동안 72℃의 35 사이클. 최종 연장은 2분 동안 72℃이었다.
생성된 플라스미드 pSMART RS A2 NLucP는 서열식별번호: 21에 열거된다.
실시예 2. 바이러스 구제
초기 세포 배양
형질감염을 위해, "공여자" 배양물로부터의 BSR T7/5 세포를 형질감염 시점에 80-90% 융합성이도록 6 웰 플레이트로 서브계대배양하였다. 1개의 25 cm2 배양물을 사용하여 1개의 6 웰 플레이트를 제조하였다 (1:2.5 계대 비율) (또는 2 ml의 4e5개 세포/ml).
6-웰 세포 배양 플레이트를 25 cm2 공여자 배양물로부터 형질감염을 위해 제조하였다. 성장 배지를 플라스크로부터 흡입하였고, 이어서 25 cm2 플라스크당 0.25 mL의 따듯한 트립신-EDTA를 첨가하였다. 플라스크를 진탕시켜 트립신-EDTA를 분배하고 37℃에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포가 플라스크로부터 떨어져 나오기 시작할 때, 12 mL의 배지를 각각의 플라스크에 첨가하였고, 세포를 피펫팅함으로써 현탁시켰다. 2 mL의 세포 현탁액을 6-웰 세포 배양 플레이트에서 각각의 웰에 첨가하였다. 세포 배양 플레이트를 37℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
형질감염을 위한 시약 제조
리포펙타민(Lipofectamine) 및 플라스미드/헬퍼 플라스미드를 3:1 비율 (μL/μg)로, 뿐만 아니라 리포펙타민-단독 및 야생형 바이러스-단독 대조군을 혼합하였다. 각각의 구성요소를 Opti-MEM과 희석하여 100 μl의 리포펙타민/플라스미드/헬퍼 플라스미드 (3:1), 리포펙타민-단독 대조군, 및 야생형 바이러스-단독 대조군을 제조하였다. 각각의 희석액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
희석된 리포펙타민/플라스미드/헬퍼 플라스미드 및 대조군을 인큐베이션한 후, 하기 6개의 구성요소를 1개의 바이알에서 조합하고, 서서히 혼합하고 형질감염 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다 (형질감염 혼합물은 총 600 μL, Opti-MEM, 리포펙틴, 및 DNA이어야함).
각각의 구성요소의 하기 양이 형질감염당 사용되었다:
i. RSV 항게놈 0.8 μg (8 μl의 0.1 μg/μL ) + 92 μL Opti-MEM
ii. pCDNA3-L, L 단백질 0.2 μg (2 μl의 0.1 μg/μL) + 98 μL Opti-MEM
iii. pCDNA3-N, N 단백질 0.4 μg (4 μl의 0.1 μg/μL) + 96 μL Opti-MEM
iv. pCDNA3-P, P 단백질 0.4 μg (4 μl의 0.1 μg/μL) + 96 μL Opti-MEM
v. pCDNA3-M2-1, M2-1 단백질 0.4 μg (4 μl의 0.1 μg/μL) + 96 μL Opti-MEM
vi. 리포펙타민 2000 6.6 μL + 93.4 μL Opti-MEM
세포 형질감염
BSR T7/5 세포 배양 웰로부터의 배지를 흡입하였고, 세포를 1 mL 따듯한 Opti-MEM으로 2회 세척하였다. 최종 세척물을 흡입한 후, 600 μl의 형질감염 혼합물을 각각의 배양 웰에 첨가하였고, 배양된 세포를 2시간 동안 실온에서 낮은 속도로 진탕기/로커 플레이트 세트 상에서 인큐베이션하였다. 2시간 후, 추가적인 600 μL 따듯한 Opti-MEM을 웰당 첨가하고 37℃에서 밤새 (8-12시간) 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 형질감염 혼합물을 웰로부터 흡입하고 폐기하였고, 각각의 웰을 1 mL 따듯한 멸균 PBS로 1회 세척하고 웰당 2 mL의 따듯한 성장 배지로 대체하였다. 배양된 세포를 이어서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
세포를 이어서 상기 기재된 트립신-EDTA 절차를 사용하여 25 cm2 플라스크로 1:3 표면적 비율로 서브-계대배양하였다. 세포 형태학이 약하게 나타난 경우에, 표면적 비율은 따라서 최대 심지어 1:1 비율로 감소되었다 (6 웰 플레이트에서의 각각의 웰의 표면적은 10 cm2임). 세포는 회수를 회수하면서 3% FBS를 갖는 DMEM에 남아있었다. 플라스크를 세포 병변 효과 (CPE)에 대해 모니터링하고 필요에 따라 새로운 25 cm2 플라스크로 1:3 표면적 비율로 서브-계대배양하였다 (대략 48시간마다). CPE는 먼저 미니-합포체로서 나타났고 이어서 세포 덩어리로 모아져 성장하였다. CPE가 플라스크 전체에 걸쳐 명백할 때, 세포를 성장 배지로 스크레이핑하고, 냉동바이알로 분취하고, -80℃ 이하에서 동결시켰다.
실시예 3. 실험실내 시약의 제조
a) A549 성장 배지 제조
표 4: A549 성장 배지 (주: 부피는 비례하여 확대되거나 또는 축소될 수 있음)
표 4 구성요소를 첨가하여 500 mL의 A549 세포 성장 배지를 구성하였다. A549 세포 성장 배지를 0.2 마이크론 500-mL (또는 다른 적절한 부피) PES 여과 단위를 통해 멸균 여과하였다.
b) A549 감염 배지 제조
표 5: A549 감염 배지 (주: 부피는 비례하여 확대되거나 또는 축소될 수 있음)
표 5 구성요소를 첨가하여 500 mL의 A549 감염 배지를 구성하였다. A549 감염 배지를 0.2 마이크론 500-mL (또는 다른 적절한 부피) PES 여과 단위를 통해 멸균-여과하였다.
실시예 4. 시험 샘플을 제조하고 판독-출력 신호를 측정하기 위한 절차
시험 샘플을 제조하고 판독-출력 신호를 측정하기 위한 절차는 도 1에 제시된다. 상세한 절차는 하기 제공된다.
1일차: 세포 시딩
A549 성장 배지를 RT로, 약 30분 동안 평형화시켰다. 성장 배지를 흡입하였고, 세포를 전체 단층이 코팅되는 것을 보장하기 위해 흔들면서 15 mL의 PBS로 세척하였다. PBS를 흡입한 후, 5 mL의 세포 해리 완충 용액을 전체 단층이 코팅되는 것을 보장하기 위해 흔들면서 첨가하였다. 각각의 플라스크를 세포가 플라스크로부터 떨어져 나올 때까지 (약 10-15분) 37±1℃, 5±1% CO2에서의 습도로 인큐베이션하였다. 각각의 플라스크를 탭핑하여 세포를 분산시켰다.
20 mL의 A549 성장 배지를 각각의 플라스크에 첨가하였고, 모든 플라스크 내용물을 단일 멸균 용기로 이동시켰다. 세포 현탁액을 혈청학적 피펫으로 덩어리가 가시적이지 않을 때까지 천천히 4-5회 피펫팅함으로써 혼합하였다. 세포를 이어서 수동으로 또는 바이-셀(Vi-Cell)을 사용하여 계수하였다. 세포를 이어서 멸균 PET 병 또는 동등한 용기에서 A549 성장 배지 중에 2x105개 세포/mL로 현탁시켰다.
100μl 세포 현탁액을 96-웰 플레이트 내로 분배하고 (웰당 100μl, 웰당 약 20,000개 세포), 세포가 96-웰 플레이트의 바닥에 균질하게 정착하는 것을 보장하기 위해 편평한 표면 상에서 RT에서 35 ± 5분 동안 인큐베이션하였다. 시딩된 플레이트를 37±1℃, 5±1% CO2 인큐베이터에서의 습도에서 20-26시간 동안 인큐베이션하였다.
2일차: 샘플 희석, 바이러스 중화 및 감염
표준, 검정 대조군 및 시험 샘플의 제조
모든 희석액은 BSC 부류 II에서 제조된다. 제조 동안 와류시키거나 또는 피펫팅함으로써 각각의 희석액을 철저히 혼합한다. 각각의 검정 플레이트에 대해, 항체 A의 희석액은 각각의 플레이트 상에서 단독으로 수행되고 이중으로 시험된다 (즉, 각각의 검정 희석액은 2개의 웰로 로딩됨). 하기 표에서의 부피는 비례하여 확대될 수 있다.
항체 A 참조 표준을 A549 감염 배지 중에 16 μg/mL로 희석하였다.
표 6: 예시적 희석 계획 (참조 표준 농도가 101.4 mg/mL인 경우):
희석 항체 A 검정 대조군을 A549 감염 배지 중에 16 μg/mL로 희석하였다.
표 7: 예시적 희석 계획 (검정 대조군 농도가 101.4 mg/mL인 경우)
표 8: 예시적 희석 계획 (검정 대조군 농도가 150 mg/mL인 경우)
항체 A 시험 샘플(들)을 A549 감염 배지 중에 16 μg/mL로 희석하였다.
표 9: 예시적 희석 계획 (시험 샘플 농도가 100 mg/mL인 경우)
표 10: 예시적 희석 계획 (시험 샘플 농도가 150 mg/mL인 경우)
희석 플레이트 셋업
플레이트 1-3에 대한 희석 플레이트 맵은 도 2a, 2b 및 2c에 제시된다. 상세한 절차는 하기 기재된다.
감염 배지 (90 μL)를 희석 플레이트의 웰로, 이어서 항체 A 참조 표준, 검정 대조군, 및 시험 샘플의 120 μl의 희석액을 이중으로 도 2a-2c에 제시된 희석 플레이트 맵에 따라 희석 플레이트 웰로 분배하였다. 4-배 연속 희석은 1열부터 11열까지, 30 μL를 그 다음 열로 이동시킴으로써 수행되었다.
바이러스 중화
동결된 RSV-NLucP를 37℃ 수조에서 작은 부분의 얼음이 남을 때까지 서서히 교반하면서 빠르게 해동시켰다. 바이러스가 완전히 해동되면, 바이알 표면을 세정하고 승인된 소독제로 닦아냈고 바이알을 생물 안전 캐비닛 (BSC)으로 이동시켰다.
목적하는 부피의 바이러스 희석액을 표 11에 제시된 바와 같이 제조하였다.
표 11: 1-3 검정 플레이트에 대한 예시적 바이러스 희석액
주: 바이러스 희석 배수는 새로운 로트 자격의 결과로서 조정될 수 있다.
희석된 바이러스 (90μl)를 각각의 플레이트의 열마다 11-1열의 각각의 웰에 (11열에서 거꾸로 1열까지) 첨가하였다. 감염 배지 (90μl)를 12-열 B-D행 웰 (세포 대조군)에 첨가하였다. 희석된 바이러스 (90μl)를 12-열 E-G행 웰 (바이러스 대조군)에 첨가하였다. 감염 배지 (180μl)를 A행 및 H행 웰에 첨가하였다. 플레이트를 150-200 rpm 진탕하면서 2분 동안 인큐베이션하고, 이어서 37±1℃, 5±1% CO2 인큐베이터에서의 습도로 35±5분 동안 인큐베이션하였다 (중화). 각각의 플레이트의 바이러스 중화 시간을 기록하였다.
감염
인큐베이션 후, 세포 플레이트를 세포가 70%-100% 융합성이고 임의의 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 현미경 하에 검사하였다. 세포 플레이트를 RT로 10-15분 동안 BSC에서 평형화시켰고, 이어서 배양 배지를 폐기물 용기로 옮겨 따르고 흡수 타월 상에 거꾸로 서서히 탭핑하여 잔류 배지를 제거하였다. 바이러스-샘플 혼합물 (90 μL)을 행마다 (A행 내지 H행) 각각의 세포 배양 플레이트에서 상응하는 웰로 이동시켰다. 플레이트를 이어서 37±1℃, 5±1% CO2에서의 습도에서 21 ± 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 플레이트의 접종 시간을 기록하였다.
3일차: 나노-글로® 시약으로의 감염된 세포 플레이트의 검출
감염 후 21 ± 1시간 후, 세포 플레이트를 10-15분 동안 RT에서 평형화시켰다. 나노-글로® 시약을 제조하고 제조업체 설명서에 따라 재구성하였고, 이어서 세포 플레이트의 웰에 첨가하였다. 세포 플레이트를 광으로부터 보호하고, 진탕기 (200 rpm) 상에서 10-15분 동안 RT에서 인큐베이션하고, 기록하였다.
인큐베이션 후, 플레이트를 하기 표 12에 열거된 바와 같이 스펙트라맥스(Spectramax) M5 또는 M5e 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
표 12: 스펙트라맥스 M5 또는 M5e 플레이트 판독기 기구에 대한 세팅
시스템 적합성 요건
시스템 적합성을 검정 시행의 각각의 세포 플레이트에서 평가하였다. 참조 표준 및 검정 대조군은 표 13의 모든 검정 수용 기준을 만족해야 한다. 시스템 적합성 요건 실패는 해당 세포 플레이트 상 모든 샘플 시험 결과를 실격시켰다.
데이터 취득
상대 발광 단위 (RLU) 계수를 함유하는 원 데이터는 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 소프트웨어를 사용하여 포획하였다.
계산
참조 표준에 대한 시험 샘플의 역가 (상대 역가)를 4-파라미터 로지스틱 회귀에 의존하는 대신에 계산하였다. 상대 역가를 계산하는 것은 복제된 웰의 양의 감소 및 더 적은 시험될 항체 농도를 허용한다. 결과적으로, 이는 검정 품질을 확인하기 위해 참조 표준 웰 뿐만 아니라 검정 대조군 웰을 첨가하기 위한 검정 웰에 공간을 허용한다.
평균 상대 발광 단위 (RLU)를 S자형 용량-반응 곡선을 생성하는 항체 A 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 데이터를 4-파라미터 로지스틱 (4 PL) 방정식에 맞췄다:
여기서 y는 평균 발광 신호이고, D는 하단 점근선이고, A는 상단 점근선이고, x는 항체 A 농도 (ng/mL)이고, C는 변곡점 또는 IC50 (ng/mL)이고, B는 4PL 곡선 피트의 기울기 파라미터이다. 원 데이터를 서로 독립적으로 각각의 개별 시험 물품 (즉, 참조, 대조군, 및 샘플)에 대해 맞췄으며 (예를 들어 무제한 피트), 이로부터 각각의 개별 용량-반응 곡선에 대한 파라미터 A, B, C, 및 D를 계산하고 기록하였다.
결정된 A 및 D 파라미터를 사용하여 하기 식을 사용하여 참조와 시험 샘플 (또는 대조군) 사이의 상단 점근선의 상대 백분율 차이 (%A 차이) 및 하단 점근선의 상대 백분율 차이 (%D 차이)를 계산하였다:
결정된 B (기울기) 파라미터를 하기 방정식을 사용하는 기울기 비율의 계산에 사용하였다:
참조 표준에 대해 계산된 A 및 D 파라미터를 사용하여 하기와 같이 점근선의 비율을 계산한다:
오차 제곱 합 (SSE)은 적합 지수를 평가하고 맞춰진 데이터 (예측)로부터의 관측 반응 값 (실험)의 총 편차를 측정한다.
여기서 n은 관측의 수이고 (농도 지점의 총 수에 따라 11과 동일함), yi는 관측 데이터 값이고 fi는 피트로부터의 예측 값이다. SSE를 상이한 기구 사이 절대 신호 강도에서의 가능한 차이를 차지하는 정규화된 데이터에 기반하여 결정하였다.
무제한 분석 후, 원 데이터를 제한 4PL 피트에 맞췄으며, 여기서 참조 곡선을 플레이트 상 각각의 개별 샘플 (또는 대조군)과 쌍을 형성하여, 즉, 참조 vs. 샘플 1, 또는 참조 vs. 샘플 2, 또는 참조 vs. 샘플 3, 또는 참조 vs. 검정 대조군으로서 분석하였다. 쌍에서의 두 곡선을 동일한 파라미터 A, 동일한 파라미터 D, 및 동일한 파라미터 B에 맞췄으며, 이는 단지 파라미터 C로 하여금 최적 피트를 위해 변동하게 한다 (예를 들어 평행선 분석; PLA). PLA 결과는 별개의 그래프 상에 각각의 쌍에 대해 제시되었다.
PLA 분석을 사용하여 곡선의 쌍을 맞춤으로써, 시험 샘플 또는 대조군의 역가를 하기 방정식을 사용하여 계산하였다:
3개의 상대 역가 값의 기하 평균 (GeoMean)으로서의 보고가능한 역가 결과를 하기 방정식을 사용하여 계산하였다:
여기서 평균 (Log10 역가)은 섹션 6.2.0에 계산된 3개의 상대 역가 값의 십진 로그 값의 평균이다.
3개의 상대 역가 값의 기하 표준 편차 (%GSD)로서의 보고가능한 역가의 가변성은 하기 방정식을 사용한다:
여기서 St.Dev.(Log10 역가)는 3개의 상대 역가 값의 십진 로그 값의 표준 편차이다. 모든 3개의 플레이트가 수용 기준을 통과하지 않을 경우, 샘플 시험을 유효 시험 수용 기준에 따라 반복하였다 (하기 참조).
유효 시험 수용 기준
표 13: (각각의 검정 플레이트에 대한) 검정 수용 기준:
검정 대조군 물질은 상기 기재된다 (표준 및 대조군). 수용 기준은 추후 보다 많은 데이터가 이용가능할 때 재평가될 수 있다. 검정 수용 기준 중 임의의 것이 실패한 경우에, 해당 플레이트로부터의 모든 샘플 데이터를 거절하였고, 실패된 플레이트를 재-측정하였다.
표 14: (각각의 검정 플레이트에 대한) 샘플 수용 기준
샘플 수용 기준 중 임의의 것이 특정 샘플에 대해 실패한 경우에, 해당 샘플 데이터를 거절하였고, 실패된 샘플을 재-측정하였다. 재-측정된 시험 동안, 반복 플레이트 상 샘플 위치는 원래 플레이트와 동일하였다.
기하 평균 상대 역가의 유효성에 대한 수용 기준 (보고가능한 결과):
3개의 유효 상대 역가 값의 %GSD는 ≤ 50%이었다. % GSD > 50%인 경우에, 모든 데이터를 평가하였고, 결과를 모든 3개의 유효 플레이트 사이에서 비교하였다. 평가 시, 비전형적인 결과가 확인된 경우에, 이들 플레이트(들)를 무효화하고 원래 플레이트(들)에서와 동일한 플레이트 수(들) 및 샘플 위치를 유지하면서 반복하였다. 비전형적인 거동이 플레이트 중 임의의 것에서 확인되지 않은 경우에, 모든 3개의 플레이트를 무효화하고 반복하였다.
시험 결과 보고:
표 13 및 14에 열거된 모든 유효 수용 기준이 성공적으로 만족되고, 3개의 유효 상대 역가 값의 %GSD가 ≤ 50%인 경우에, 동일한 소수점으로 반올림된 3개의 상대 역가 값의 기하 평균을 보고하였다.
시험 샘플의 상대 역가는 동시에 분석된 항체 A 참조 표준에 대한 백분율로서 표현된다. 항체 A 시험 샘플의 역가의 보고가능한 값을 3개의 독립적으로 취급된 검정 플레이트로부터 수득된 3개의 상대 역가 결정의 기하 평균으로서 계산하였다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공개문헌, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어 진뱅크(Genbank) 서열 또는 진ID(GeneID) 엔트리), 특허 출원, 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 표시된 바와 동일한 정도로 참조로서 포함된다. 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 의한, 참조로서 포함의 이 진술은 출원인에 의해 이러한 인용이 참조로서 포함의 전용 진술에 바로 인접하지 않더라도, 각각의 모든 개별 공개문헌, 데이터베이스 항목 (예를 들어 진뱅크 서열 또는 진아이디 항목), 특허 출원, 또는 특허에 관한 것으로 의도되며, 이들 각각은 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 확인된다. 존재하는 경우, 명세서 내 참조로서 포함의 전용 진술의 포함은 참조로서 포함의 이 일반적인 진술을 어떠한 방식으로도 약화시키지 않는다. 본원의 참고문헌의 인용은 참고문헌이 관련된 선행 기술이라는 인정으로서 의도되지 않고, 이들 공개문헌 또는 문서의 내용 또는 일자에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다. 참고문헌이 본 명세서에 제공된 정의와 상충하는 청구된 용어에 대한 정의를 제공하지 않는 한, 본 명세서에 제공된 정의가 청구된 발명을 해석하는데 사용될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Merck Sharp & Dohme Corp.
Sun , Dengyun
Bilello, John P.
Gurney, Kevin B.
Han, Ping
He, Xi
Tou, Amy Hsu
Wang, Dai
<120> ANTI-RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV) ANTIBODY CELL-BASED
POTENCY ASSAY
<130> 25140-WO-PCT
<150> 63/112978
<151> 2020-11-12
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Val Lys Gly
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<213> Artificial Sequence
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Gly Ala Pro Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
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<213> Artificial Sequence
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<223> Antibody A LC-CDR1
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Arg Thr Ser Gln Asp Val Arg Gly Ala Leu Ala
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Antibody A VH
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Ser
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Phe Ile Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Gly Ala Pro Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Ser Phe Ile Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Tyr Ala Ala
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100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody A Heavy chain
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Ser
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Ser Phe Ile Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
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Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
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405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
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<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody A Light chain
<400> 10
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1 5 10 15
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20 25 30
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rpsL-neo cassette
<400> 11
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aaaaccagga gctatttaat ggcaacagtt aaccagctgg tacgcaaacc acgtgctcgc 180
aaagttgcga aaagcaacgt gcctgcgctg gaagcatgcc cgcaaaaacg tggcgtatgt 240
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gttcgtctga ctaacggttt cgaagtgact tcctacatcg gtggtgaagg tcacaacctg 360
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ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 960
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 1020
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 1080
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for rpsL cassette
<400> 12
cttcgtgaag cttgttcacg tatgtttcca tatttgcccc accctacgcg tggcctggtg 60
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<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for rpsL cassette
<400> 13
ctaaccaccc ggaaaaaatc tataatatag ttacaaaaaa aggaaacgcg tcagaagaac 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV A2
<400> 14
acttgcataa accaaaaaaa tggggcaaat aagaatttga taagtaccac ttaaatttaa 60
ctcccttggt tagagatggg cagcaattca ttgagtatga taaaagttag attacaaaat 120
ttgtttgaca atgatgaagt agcattgtta aaaataacat gctatactga taaattaata 180
catttaacta acgctttggc taaggcagtg atacatacaa tcaaattgaa tggcattgtg 240
tttgtgcatg ttattacaag tagtgatatt tgccctaata ataatattgt agtaaaatcc 300
aatttcacaa caatgccagt actacaaaat ggaggttata tatgggaaat gatggaatta 360
acacattgct ctcaacctaa tggtctacta gatgacaatt gtgaaattaa attctccaaa 420
aaactaagtg attcaacaat gaccaattat atgaatcaat tatctgaatt acttggattt 480
gatcttaatc cataaattat aattaatatc aactagcaaa tcaatgtcac taacaccatt 540
agttaatata aaacttaaca gaagacaaaa atggggcaaa taaatcaatt cagccaaccc 600
aaccatggac acaacccaca atgataatac accacaaaga ctgatgatca cagacatgag 660
accgttgtca cttgagacca taataacatc actaaccaga gacatcataa cacacaaatt 720
tatatacttg ataaatcatg aatgcatagt gagaaaactt gatgaaaaac aggccacatt 780
tacattcctg gtcaactatg aaatgaaact attacacaaa gtaggaagca ctaaatataa 840
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tgatgggttc ttagaatgca ttggcattaa gcctacaaag catactccca taatatacaa 960
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tgcataacta tactccatag tccagatgga gcctgaaaat tatagtaatt taaaattaag 1080
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ggcatgttat taatcacaga agatgctaat cataaattca ctgggttaat aggtatgtta 1320
tatgcgatgt ctaggttagg aagagaagac accataaaaa tactcagaga tgcgggatat 1380
catgtaaaag caaatggagt agatgtaaca acacatcgtc aagacattaa tggaaaagaa 1440
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aatattatgt taggacatgc tagtgtgcaa gcagaaatgg aacaagttgt tgaggtttat 1980
gaatatgccc aaaaattggg tggtgaagca ggattctacc atatattgaa caacccaaaa 2040
gcatcattat tatctttgac tcaatttcct cacttctcca gtgtagtatt aggcaatgct 2100
gctggcctag gcataatggg agagtacaga ggtacaccga ggaatcaaga tctatatgat 2160
gcagcaaagg catatgctga acaactcaaa gaaaatggtg tgattaacta cagtgtacta 2220
gacttgacag cagaagaact agaggctatc aaacatcagc ttaatccaaa agataatgat 2280
gtagagcttt gagttaataa aaaatggggc aaataaatca tcatggaaaa gtttgctcct 2340
gaattccatg gagaagatgc aaacaacagg gctactaaat tcctagaatc aataaagggc 2400
aaattcacat cacccaaaga tcccaagaaa aaagatagta tcatatctgt caactcaata 2460
gatatagaag taaccaaaga aagccctata acatcaaatt caactattat caacccaaca 2520
aatgagacag atgatactgc agggaacaag cccaattatc aaagaaaacc tctagtaagt 2580
ttcaaagaag accctacacc aagtgataat cccttttcta aactatacaa agaaaccata 2640
gaaacatttg ataacaatga agaagaatcc agctattcat acgaagaaat aaatgatcag 2700
acaaacgata atataacagc aagattagat aggattgatg aaaaattaag tgaaatacta 2760
ggaatgcttc acacattagt agtggcaagt gcaggaccta catctgctcg ggatggtata 2820
agagatgcca tgattggttt aagagaagaa atgatagaaa aaatcagaac tgaagcatta 2880
atgaccaatg acagattaga agctatggca agactcagga atgaggaaag tgaaaagatg 2940
gcaaaagaca catcagatga agtgtctctc aatccaacat cagagaaatt gaacaaccta 3000
ttggaaggga atgatagtga caatgatcta tcacttgaag atttctgatt agttaccact 3060
cttcacatca acacacaata ccaacagaag accaacaaac taaccaaccc aatcatccaa 3120
ccaaacatcc atccgccaat cagccaaaca gccaacaaaa caaccagcca atccaaaact 3180
aaccacccgg aaaaaatcta taatatagtt acaaaaaaag gaaagggtgg ggcaaatatg 3240
gaaacatacg tgaacaagct tcacgaaggc tccacataca cagctgctgt tcaatacaat 3300
gtcttagaaa aagacgatga ccctgcatca cttacaatat gggtgcccat gttccaatca 3360
tctatgccag cagatttact tataaaagaa ctagctaatg tcaacatact agtgaaacaa 3420
atatccacac ccaagggacc ttcactaaga gtcatgataa actcaagaag tgcagtgcta 3480
gcacaaatgc ccagcaaatt taccatatgc gctaatgtgt ccttggatga aagaagcaaa 3540
ctagcatatg atgtaaccac accctgtgaa atcaaggcat gtagtctaac atgcctaaaa 3600
tcaaaaaata tgttgactac agttaaagat ctcactatga agacactcaa ccctacacat 3660
gatattattg ctttatgtga atttgaaaac atagtaacat caaaaaaagt cataatacca 3720
acatacctaa gatccatcag tgtcagaaat aaagatctga acacacttga aaatataaca 3780
accactgaat tcaaaaatgc tatcacaaat gcaaaaatca tcccttactc aggattacta 3840
ttagtcatca cagtgactga caacaaagga gcattcaaat acataaagcc acaaagtcaa 3900
ttcatagtag atcttggagc ttacctagaa aaagaaagta tatattatgt taccacaaat 3960
tggaagcaca cagctacacg atttgcaatc aaacccatgg aagattaacc tttttcctct 4020
acatcagtgt gttaattcat acaaactttc tacctacatt cttcacttca ccatcacaat 4080
cacaaacact ctgtggttca accaatcaaa caaaacttat ctgaagtccc agatcatccc 4140
aagtcattgt ttatcagatc tagtactcaa ataagttaat aaaaaatata cacatggggc 4200
aaataatcat tggaggaaat ccaactaatc acaatatctg ttaacataga caagtccaca 4260
caccatacag aatcaaccaa tggaaaatac atccataaca atagaattct caagcaaatt 4320
ctggccttac tttacactaa tacacatgat cacaacaata atctctttgc taatcataat 4380
ctccatcatg attgcaatac taaacaaact ttgtgaatat aacgtattcc ataacaaaac 4440
ctttgagtta ccaagagctc gagtcaacac atagcattca tcaatccaac agcccaaaac 4500
agtaaccttg catttaaaaa tgaacaaccc ctacctcttt acaacacctc attaacatcc 4560
caccatgcaa accactatcc atactataaa gtagttaatt aaaaatagtc ataacaatga 4620
actaggatat caagactaac aataacattg gggcaaatgc aaacatgtcc aaaaacaagg 4680
accaacgcac cgctaagaca ttagaaagga cctgggacac tctcaatcat ttattattca 4740
tatcatcgtg cttatataag ttaaatctta aatctgtagc acaaatcaca ttatccattc 4800
tggcaatgat aatctcaact tcacttataa ttgcagccat catattcata gcctcggcaa 4860
accacaaagt cacaccaaca actgcaatca tacaagatgc aacaagccag atcaagaaca 4920
caaccccaac atacctcacc cagaatcctc agcttggaat cagtccctct aatccgtctg 4980
aaattacatc acaaatcacc accatactag cttcaacaac accaggagtc aagtcaaccc 5040
tgcaatccac aacagtcaag accaaaaaca caacaacaac tcaaacacaa cccagcaagc 5100
ccaccacaaa acaacgccaa aacaaaccac caagcaaacc caataatgat tttcactttg 5160
aagtgttcaa ctttgtaccc tgcagcatat gcagcaacaa tccaacctgc tgggctatct 5220
gcaaaagaat accaaacaaa aaaccaggaa agaaaaccac taccaagccc acaaaaaaac 5280
caaccctcaa gacaaccaaa aaagatccca aacctcaaac cactaaatca aaggaagtac 5340
ccaccaccaa gcccacagaa gagccaacca tcaacaccac caaaacaaac atcataacta 5400
cactactcac ctccaacacc acaggaaatc cagaactcac aagtcaaatg gaaaccttcc 5460
actcaacttc ctccgaaggc aatccaagcc cttctcaagt ctctacaaca tccgagtacc 5520
catcacaacc ttcatctcca cccaacacac cacgccagta gttacttaaa aacatattat 5580
cacaaaaagc catgaccaac ttaaacagaa tcaaaataaa ctctggggca aataacaatg 5640
gagttgctaa tcctcaaagc aaatgcaatt accacaatcc tcactgcagt cacattttgt 5700
tttgcttctg gtcaaaacat cactgaagaa ttttatcaat caacatgcag tgcagttagc 5760
aaaggctatc ttagtgctct gagaactggt tggtatacca gtgttataac tatagaatta 5820
agtaatatca aggaaaataa gtgtaatgga acagatgcta aggtaaaatt gataaaacaa 5880
gaattagata aatataaaaa tgctgtaaca gaattgcagt tgctcatgca aagcacacca 5940
ccaacaaaca atcgagccag aagagaacta ccaaggttta tgaattatac actcaacaat 6000
gccaaaaaaa ccaatgtaac attaagcaag aaaaggaaaa gaagatttct tgtttttttg 6060
ttaggtgttg gatctgcaat cgccagtggc gttgctgtat ctaaggtcct gcacctagaa 6120
ggggaagtga acaagatcaa aagtgctcta ctatccacaa acaaggctct agtcagctta 6180
tcaaatggag ttagtgtctt aaccagcaaa gtgttagacc tcaaaaacta tatagataaa 6240
caattgttac ctattgtgaa caagcaaagc tgcagcatat caaatataga aactgtgata 6300
gagttccaac aaaagaacaa cagactacta gagattacca gggaatttag tgttaatgca 6360
ggtgtaacta cacctgtaag cacttacatg ttaactaata gtgaattatt gtcattaatc 6420
aatgatatgc ctataacaaa tgatcagaaa aagttaatgt ccaacaatgt tcaaatagtt 6480
agacagcaaa gttactctat catgtccata ataaaagagg aagtcttagc atatgtagta 6540
caattaccac tatatggtgt tatagataca ccctgttgga aactacacac atcccctcta 6600
tgtacaacca acacaaaaga agggtccaac atctgtttaa caagaactga cagaggatgg 6660
tactgtgaca atgcaggatc agtatctttc ttcccacaag ctgaaacatg taaagttcaa 6720
tcaaatcgag tattttgtga cacaatgaac agtttaacat taccaagtga aataaatctc 6780
tgcaatgttg acatattcaa ccccaaatat gattgtaaaa ttatgacttc aaaaacagat 6840
gtaagcagct ccgttatcac atctctagga gccattgtgt catgctatgg caaaactaaa 6900
tgtacagcat ccaataaaaa tcgtggaatc ataaagacat tttctaacgg gtgcgattat 6960
gtatcaaata aagggatgga cactgtgtct gtaggtaaca cattatatta tgtaaataag 7020
caagaaggta aaagtctcta tgtaaaaggt gaaccaataa taaatttcta tgacccatta 7080
gtattcccct ctgatgaatt tgatgcatca atatctcaag tcaacgagaa gattaaccag 7140
agcctagcat ttattcgtaa atccgatgaa ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc 7200
accacaaata tcatgataac tactataatt atagtgatta tagtaatatt gttatcatta 7260
attgctgttg gactgctctt atactgtaag gccagaagca caccagtcac actaagcaaa 7320
gatcaactga gtggtataaa taatattgca tttagtaact aaataaaaat agcacctaat 7380
catgttctta caatggttta ctatctgctc atagacaacc catctgtcat tggattttct 7440
taaaatctga acttcatcga aactctcatc tataaaccat ctcacttaca ctatttaagt 7500
agattcctag tttatagtta tataaaacac aattgaatgc cagattaact taccatctgt 7560
aaaaatgaaa actggggcaa atatgtcacg aaggaatcct tgcaaatttg aaattcgagg 7620
tcattgctta aatggtaaga ggtgtcattt tagtcataat tattttgaat ggccacccca 7680
tgcactgctt gtaagacaaa actttatgtt aaacagaata cttaagtcta tggataaaag 7740
tatagatacc ttatcagaaa taagtggagc tgcagagttg gacagaacag aagagtatgc 7800
tcttggtgta gttggagtgc tagagagtta tataggatca ataaacaata taactaaaca 7860
atcagcatgt gttgccatga gcaaactcct cactgaactc aatagtgatg atatcaaaaa 7920
gctgagggac aatgaagagc taaattcacc caagataaga gtgtacaata ctgtcatatc 7980
atatattgaa agcaacagga aaaacaataa acaaactatc catctgttaa aaagattgcc 8040
agcagacgta ttgaagaaaa ccatcaaaaa cacattggat atccataaga gcataaccat 8100
caacaaccca aaagaatcaa ctgttagtga tacaaatgac catgccaaaa ataatgatac 8160
tacctgacaa atatccttgt agtataactt ccatactaat aacaagtaga tgtagagtta 8220
ctatgtataa tcaaaagaac acactatatt tcaatcaaaa caacccaaat aaccatatgt 8280
actcaccgaa tcaaacattc aatgaaatcc attggacctc tcaagaattg attgacacaa 8340
ttcaaatttt tctacaacat ctaggtatta ttgaggatat atatacaata tatatattag 8400
tgtcataaca ctcaattcta acactcacca catcgttaca ttattaattc aaacaattca 8460
agttgtggga caaaatggat cccattatta atggaaattc tgctaatgtt tatctaaccg 8520
atagttattt aaaaggtgtt atctctttct cagagtgtaa tgctttagga agttacatat 8580
tcaatggtcc ttatctcaaa aatgattata ccaacttaat tagtagacaa aatccattaa 8640
tagaacacat gaatctaaag aaactaaata taacacagtc cttaatatct aagtatcata 8700
aaggtgaaat aaaattagaa gaacctactt attttcagtc attacttatg acatacaaga 8760
gtatgacctc gtcagaacag attgctacca ctaatttact taaaaagata ataagaagag 8820
ctatagaaat aagtgatgtc aaagtctatg ctatattgaa taaactaggg cttaaagaaa 8880
aggacaagat taaatccaac aatggacaag atgaagacaa ctcagttatt acgaccataa 8940
tcaaagatga tatactttca gctgttaaag ataatcaatc tcatcttaaa gcagacaaaa 9000
atcactctac aaaacaaaaa gacacaatca aaacaacact cttgaagaaa ttgatgtgtt 9060
caatgcaaca tcctccatca tggttaatac attggtttaa cttatacaca aaattaaaca 9120
acatattaac acagtatcga tcaaatgagg taaaaaacca tgggtttaca ttgatagata 9180
atcaaactct tagtggattt caatttattt tgaaccaata tggttgtata gtttatcata 9240
aggaactcaa aagaattact gtgacaacct ataatcaatt cttgacatgg aaagatatta 9300
gccttagtag attaaatgtt tgtttaatta catggattag taactgcttg aacacattaa 9360
ataaaagctt aggcttaaga tgcggattca ataatgttat cttgacacaa ctattccttt 9420
atggagattg tatactaaag ctatttcaca atgaggggtt ctacataata aaagaggtag 9480
agggatttat tatgtctcta attttaaata taacagaaga agatcaattc agaaaacgat 9540
tttataatag tatgctcaac aacatcacag atgctgctaa taaagctcag aaaaatctgc 9600
tatcaagagt atgtcataca ttattagata agacagtgtc cgataatata ataaatggca 9660
gatggataat tctattaagt aagttcctta aattaattaa gcttgcaggt gacaataacc 9720
ttaacaatct gagtgaacta tattttttgt tcagaatatt tggacaccca atggtagatg 9780
aaagacaagc catggatgct gttaaaatta attgcaatga gaccaaattt tacttgttaa 9840
gcagtctgag tatgttaaga ggtgccttta tatatagaat tataaaaggg tttgtaaata 9900
attacaacag atggcctact ttaagaaatg ctattgtttt acccttaaga tggttaactt 9960
actataaact aaacacttat ccttctttgt tggaacttac agaaagagat ttgattgtgt 10020
tatcaggact acgtttctat cgtgagtttc ggttgcctaa aaaagtggat cttgaaatga 10080
ttataaatga taaagctata tcacctccta aaaatttgat atggactagt ttccctagaa 10140
attacatgcc atcacacata caaaactata tagaacatga aaaattaaaa ttttccgaga 10200
gtgataaatc aagaagagta ttagagtatt atttaagaga taacaaattc aatgaatgtg 10260
atttatacaa ctgtgtagtt aatcaaagtt atctcaacaa ccctaatcat gtggtatcat 10320
tgacaggcaa agaaagagaa ctcagtgtag gtagaatgtt tgcaatgcaa ccgggaatgt 10380
tcagacaggt tcaaatattg gcagagaaaa tgatagctga aaacatttta caattctttc 10440
ctgaaagtct tacaagatat ggtgatctag aactacaaaa aatattagaa ttgaaagcag 10500
gaataagtaa caaatcaaat cgctacaatg ataattacaa caattacatt agtaagtgct 10560
ctatcatcac agatctcagc aaattcaatc aagcatttcg atatgaaacg tcatgtattt 10620
gtagtgatgt gctggatgaa ctgcatggtg tacaatctct attttcctgg ttacatttaa 10680
ctattcctca tgtcacaata atatgcacat ataggcatgc acccccctat ataggagatc 10740
atattgtaga tcttaacaat gtagatgaac aaagtggatt atatagatat cacatgggtg 10800
gcatcgaagg gtggtgtcaa aaactgtgga ccatagaagc tatatcacta ttggatctaa 10860
tatctctcaa agggaaattc tcaattactg ctttaattaa tggtgacaat caatcaatag 10920
atataagcaa accaatcaga ctcatggaag gtcaaactca tgctcaagca gattatttgc 10980
tagcattaaa tagccttaaa ttactgtata aagagtatgc aggcataggc cacaaattaa 11040
aaggaactga gacttatata tcacgagata tgcaatttat gagtaaaaca attcaacata 11100
acggtgtata ttacccagct agtataaaga aagtcctaag agtgggaccg tggataaaca 11160
ctatacttga tgatttcaaa gtgagtctag aatctatagg tagtttgaca caagaattag 11220
aatatagagg tgaaagtcta ttatgcagtt taatatttag aaatgtatgg ttatataatc 11280
agattgctct acaattaaaa aatcatgcat tatgtaacaa taaactatat ttggacatat 11340
taaaggttct gaaacactta aaaacctttt ttaatcttga taatattgat acagcattaa 11400
cattgtatat gaatttaccc atgttatttg gtggtggtga tcccaacttg ttatatcgaa 11460
gtttctatag aagaactcct gacttcctca cagaggctat agttcactct gtgttcatac 11520
ttagttatta tacaaaccat gacttaaaag ataaacttca agatctgtca gatgatagat 11580
tgaataagtt cttaacatgc ataatcacgt ttgacaaaaa ccctaatgct gaattcgtaa 11640
cattgatgag agatcctcaa gctttagggt ctgagagaca agctaaaatt actagcgaaa 11700
tcaatagact ggcagttaca gaggttttga gtacagctcc aaacaaaata ttctccaaaa 11760
gtgcacaaca ttatactact acagagatag atctaaatga tattatgcaa aatatagaac 11820
ctacatatcc tcatgggcta agagttgttt atgaaagttt acccttttat aaagcagaga 11880
aaatagtaaa tcttatatca ggtacaaaat ctataactaa catactggaa aaaacttctg 11940
ccatagactt aacagatatt gatagagcca ctgagatgat gaggaaaaac ataactttgc 12000
ttataaggat acttccattg gattgtaaca gagataaaag agagatattg agtatggaaa 12060
acctaagtat tactgaatta agcaaatatg ttagggaaag atcttggtct ttatccaata 12120
tagttggtgt tacatcaccc agtatcatgt atacaatgga catcaaatat actacaagca 12180
ctatatctag tggcataatt atagagaaat ataatgttaa cagtttaaca cgtggtgaga 12240
gaggacccac taaaccatgg gttggttcat ctacacaaga gaaaaaaaca atgccagttt 12300
ataatagaca agtcttaacc aaaaaacaga gagatcaaat agatctatta gcaaaattgg 12360
attgggtgta tgcatctata gataacaagg atgaattcat ggaagaactc agcataggaa 12420
cccttgggtt aacatatgaa aaggccaaga aattatttcc acaatattta agtgtcaatt 12480
atttgcatcg ccttacagtc agtagtagac catgtgaatt ccctgcatca ataccagctt 12540
atagaacaac aaattatcac tttgacacta gccctattaa tcgcatatta acagaaaagt 12600
atggtgatga agatattgac atagtattcc aaaactgtat aagctttggc cttagtttaa 12660
tgtcagtagt agaacaattt actaatgtat gtcctaacag aattattctc atacctaagc 12720
ttaatgagat acatttgatg aaacctccca tattcacagg tgatgttgat attcacaagt 12780
taaaacaagt gatacaaaaa cagcatatgt ttttaccaga caaaataagt ttgactcaat 12840
atgtggaatt attcttaagt aataaaacac tcaaatctgg atctcatgtt aattctaatt 12900
taatattggc acataaaata tctgactatt ttcataatac ttacatttta agtactaatt 12960
tagctggaca ttggattctg attatacaac ttatgaaaga ttctaaaggt atttttgaaa 13020
aagattgggg agagggatat ataactgatc atatgtttat taatttgaaa gttttcttca 13080
atgcttataa gacctatctc ttgtgttttc ataaaggtta tggcaaagca aagctggagt 13140
gtgatatgaa cacttcagat cttctatgtg tattggaatt aatagacagt agttattgga 13200
agtctatgtc taaggtattt ttagaacaaa aagttatcaa atacattctt agccaagatg 13260
caagtttaca tagagtaaaa ggatgtcata gcttcaaatt atggtttctt aaacgtctta 13320
atgtagcaga attcacagtt tgcccttggg ttgttaacat agattatcat ccaacacata 13380
tgaaagcaat attaacttat atagatcttg ttagaatggg attgataaat atagatagaa 13440
tacacattaa aaataaacac aaattcaatg atgaatttta tacttctaat ctcttctaca 13500
ttaattataa cttctcagat aatactcatc tattaactaa acatataagg attgctaatt 13560
ctgaattaga aaataattac aacaaattat atcatcctac accagaaacc ctagagaata 13620
tactagccaa tccgattaaa agtaatgaca aaaagacact gaatgactat tgtataggta 13680
aaaatgttga ctcaataatg ttaccattgt tatctaataa gaagcttatt aaatcgtctg 13740
caatgattag aaccaattac agcaaacaag atttgtataa tttattccct atggttgtga 13800
ttgatagaat tatagatcat tcaggcaata cagccaaatc caaccaactt tacactacta 13860
cttcccacca aatatcttta gtccacaata gcacatcact ttactgcatg cttccttggc 13920
atcatattaa tagattcaat tttgtattta gttctacagg ttgtaaaatt agtatagagt 13980
atattttaaa agatcttaaa attaaagatc ccaattgtat agcattcata ggtgaaggag 14040
cagggaattt attattgcgt acagtagtgg aacttcatcc tgacataaga tatatttaca 14100
gaagtctgaa agattgcaat gatcatagtt tacctattga gtttttaagg ctgtacaatg 14160
gacatatcaa cattgattat ggtgaaaatt tgaccattcc tgctacagat gcaaccaaca 14220
acattcattg gtcttattta catataaagt ttgctgaacc tatcagtctt tttgtctgtg 14280
atgccgaatt gtctgtaaca gtcaactgga gtaaaattat aatagaatgg agcaagcatg 14340
taagaaagtg caagtactgt tcctcagtta ataaatgtat gttaatagta aaatatcatg 14400
ctcaagatga tattgatttc aaattagaca atataactat attaaaaact tatgtatgct 14460
taggcagtaa gttaaaggga tcggaggttt acttagtcct tacaataggt cctgcgaata 14520
tattcccagt atttaatgta gtacaaaatg ctaaattgat actatcaaga accaaaaatt 14580
tcatcatgcc taagaaagct gataaagagt ctattgatgc aaatattaaa agtttgatac 14640
cctttctttg ttaccctata acaaaaaaag gaattaatac tgcattgtca aaactaaaga 14700
gtgttgttag tggagatata ctatcatatt ctatagctgg acgtaatgaa gttttcagca 14760
ataaacttat aaatcataag catatgaaca tcttaaaatg gttcaatcat gttttaaatt 14820
tcagatcaac agaactaaac tataaccatt tatatatggt agaatctaca tatccttacc 14880
taagtgaatt gttaaacagc ttgacaacca atgaacttaa aaaactgatt aaaatcacag 14940
gtagtctgtt atacaacttt cataatgaat aatgaataaa gatcttataa taaaaattcc 15000
catagctata cactaacact gtattcaatt atagttatta aaaattaaaa atcatataat 15060
tttttaaata acttttagtg aactaatcct aaagttatca ttttaatctt ggaggaataa 15120
atttaaaccc taatctaatt ggtttatatg tgtattaact aaattacgag atattagttt 15180
ttgacacttt ttttctcgt 15199
<210> 15
<211> 671
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GS-NlucP-GE
<400> 15
ggggcaaata aatcaatggt cttcacactc gaagatttcg ttggggactg gcgacagaca 60
gccggctaca acctggacca agtccttgaa cagggaggtg tgtccagttt gtttcagaat 120
ctcggggtgt ccgtaactcc gatccaaagg attgtcctga gcggtgaaaa tgggctgaag 180
atcgacatcc atgtcatcat cccgtatgaa ggtctgagcg gcgaccaaat gggccagatc 240
gaaaaaattt ttaaggtggt gtaccctgtg gatgatcatc actttaaggt gatcctgcac 300
tatggcacac tggtaatcga cggggttacg ccgaacatga tcgactattt cggacggccg 360
tatgaaggca tcgccgtgtt cgacggcaaa aagatcactg taacagggac cctgtggaac 420
ggcaacaaaa ttatcgacga gcgcctgatc aaccccgacg gctccctgct gttccgagta 480
accatcaacg gagtgaccgg ctggcggctg tgcgaacgca ttctggcgaa ttctcacggc 540
tttccgcctg aggttgaaga gcaagccgcc ggtacattgc ctatgtcctg cgcacaagaa 600
agcggtatgg accggcaccc agccgcttgt gcttcagctc gcatcaacgt ctaaattata 660
gtaatttaaa a 671
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV gene start sequence
<400> 16
ggggcaaata aatca 15
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV gene end sequence
<400> 17
attatagtaa tttaaaa 17
<210> 18
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NanolucP gene
<400> 18
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgaattctc acggctttcc gcctgaggtt 540
gaagagcaag ccgccggtac attgcctatg tcctgcgcac aagaaagcgg tatggaccgg 600
cacccagccg cttgtgcttc agctcgcatc aacgtctaa 639
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for NanolucP
<400> 19
tatagttaca aaaaaaggaa ggggcaaata aatcaatggt cttcacactc gaagatt 57
<210> 20
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for NanolucP
<400> 20
ttccatattt gccccaccct ttttaaatta ctataattta gacgttgatg cgagctg 57
<210> 21
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gattgataga attatagatc attcaggcaa tacagccaaa tccaaccaac tttacactac 14580
tacttcccac caaatatctt tagtccacaa tagcacatca ctttactgca tgcttccttg 14640
gcatcatatt aatagattca attttgtatt tagttctaca ggttgtaaaa ttagtataga 14700
gtatatttta aaagatctta aaattaaaga tcccaattgt atagcattca taggtgaagg 14760
agcagggaat ttattattgc gtacagtagt ggaacttcat cctgacataa gatatattta 14820
cagaagtctg aaagattgca atgatcatag tttacctatt gagtttttaa ggctgtacaa 14880
tggacatatc aacattgatt atggtgaaaa tttgaccatt cctgctacag atgcaaccaa 14940
caacattcat tggtcttatt tacatataaa gtttgctgaa cctatcagtc tttttgtctg 15000
tgatgccgaa ttgtctgtaa cagtcaactg gagtaaaatt ataatagaat ggagcaagca 15060
tgtaagaaag tgcaagtact gttcctcagt taataaatgt atgttaatag taaaatatca 15120
tgctcaagat gatattgatt tcaaattaga caatataact atattaaaaa cttatgtatg 15180
cttaggcagt aagttaaagg gatcggaggt ttacttagtc cttacaatag gtcctgcgaa 15240
tatattccca gtatttaatg tagtacaaaa tgctaaattg atactatcaa gaaccaaaaa 15300
tttcatcatg cctaagaaag ctgataaaga gtctattgat gcaaatatta aaagtttgat 15360
accctttctt tgttacccta taacaaaaaa aggaattaat actgcattgt caaaactaaa 15420
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caataaactt ataaatcata agcatatgaa catcttaaaa tggttcaatc atgttttaaa 15540
tttcagatca acagaactaa actataacca tttatatatg gtagaatcta catatcctta 15600
cctaagtgaa ttgttaaaca gcttgacaac caatgaactt aaaaaactga ttaaaatcac 15660
aggtagtctg ttatacaact ttcataatga ataatgaata aagatcttat aataaaaatt 15720
cccatagcta tacactaaca ctgtattcaa ttatagttat taaaaattaa aaatcatata 15780
attttttaaa taacttttag tgaactaatc ctaaagttat cattttaatc ttggaggaat 15840
aaatttaaac cctaatctaa ttggtttata tgtgtattaa ctaaattacg agatattagt 15900
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actgagtgga tatgctgttt ttgtctgtta aacagagaag ctggctgtta tccactgaga 16740
agcgaacgaa acagtcggga aaatctccca ttatcgtaga gatccgcatt attaatctca 16800
ggagcctgtg tagcgtttat aggaagtagt gttctgtcat gatgcctgca agcggtaacg 16860
aaaacgattt gaatatgcct tcaggaacaa tagaaatctt cgtgcggtgt tacgttgaag 16920
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ttttataatt atttttttta tagtttttag atcttctttt ttagagcgcc ttgtaggcct 17820
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cagaagaagc tgttttttca caaagttatc cctgcttatt gactcttttt tatttagtgt 18000
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gctcaatact caaccggttg aagatacttc gttatcgaca ccagctgccc cgatggtgga 20640
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gggtaacgat tatcgcccaa caagtgctta tgaacgtggt cagcgttatg caagccgatt 21060
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atttgaagct gaagaagtta tcactctttt aacttctgtg cttaaaacgt catctgcatc 21360
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cgataaaatg gtgcttaacc tggacaggtc tcgtgttcca actgagtgta tagagaaaat 21480
tgaggccatt cttaaggaac ttgaaaagcc agcaccctga tgcgaccacg ttttagtcta 21540
cgtttatctg tctttactta atgtcctttg ttacaggcca gaaagcataa ctggcctgaa 21600
tattctctct gggcccactg ttccacttgt atcgtcggtc tgataatcag actgggacca 21660
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ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg 21900
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gtcggtctga ttatcggtct gggaccacgg tcccacttgt attgtcgatc agactatcag 22080
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aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg 23400
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agtcacgt 23708
<210> 22
<211> 15565
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV A2 NLucP (without vector)
<400> 22
atgggcagca attcattgag tatgataaaa gttagattac aaaatttgtt tgacaatgat 60
gaagtagcat tgttaaaaat aacatgctat actgataaat taatacattt aactaacgct 120
ttggctaagg cagtgataca tacaatcaaa ttgaatggca ttgtgtttgt gcatgttatt 180
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ccagtactac aaaatggagg ttatatatgg gaaatgatgg aattaacaca ttgctctcaa 300
cctaatggtc tactagatga caattgtgaa attaaattct ccaaaaaact aagtgattca 360
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attataatta atatcaacta gcaaatcaat gtcactaaca ccattagtta atataaaact 480
taacagaaga caaaaatggg gcaaataaat caattcagcc aacccaacca tggacacaac 540
ccacaatgat aatacaccac aaagactgat gatcacagac atgagaccgt tgtcacttga 600
gaccataata acatcactaa ccagagacat cataacacac aaatttatat acttgataaa 660
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ctatgaaatg aaactattac acaaagtagg aagcactaaa tataaaaaat atactgaata 780
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ggggacagat ctggtcttac agccgtgatt aggagagcta ataatgtcct aaaaaatgaa 1620
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cagtgtgtta attcatacaa actttctacc tacattcttc acttcaccat cacaatcaca 4680
aacactctgt ggttcaacca atcaaacaaa acttatctga agtcccagat catcccaagt 4740
cattgtttat cagatctagt actcaaataa gttaataaaa aatatacaca tggggcaaat 4800
aatcattgga ggaaatccaa ctaatcacaa tatctgttaa catagacaag tccacacacc 4860
atacagaatc aaccaatgga aaatacatcc ataacaatag aattctcaag caaattctgg 4920
ccttacttta cactaataca catgatcaca acaataatct ctttgctaat cataatctcc 4980
atcatgattg caatactaaa caaactttgt gaatataacg tattccataa caaaaccttt 5040
gagttaccaa gagctcgagt caacacatag cattcatcaa tccaacagcc caaaacagta 5100
accttgcatt taaaaatgaa caacccctac ctctttacaa cacctcatta acatcccacc 5160
atgcaaacca ctatccatac tataaagtag ttaattaaaa atagtcataa caatgaacta 5220
ggatatcaag actaacaata acattggggc aaatgcaaac atgtccaaaa acaaggacca 5280
acgcaccgct aagacattag aaaggacctg ggacactctc aatcatttat tattcatatc 5340
atcgtgctta tataagttaa atcttaaatc tgtagcacaa atcacattat ccattctggc 5400
aatgataatc tcaacttcac ttataattgc agccatcata ttcatagcct cggcaaacca 5460
caaagtcaca ccaacaactg caatcataca agatgcaaca agccagatca agaacacaac 5520
cccaacatac ctcacccaga atcctcagct tggaatcagt ccctctaatc cgtctgaaat 5580
tacatcacaa atcaccacca tactagcttc aacaacacca ggagtcaagt caaccctgca 5640
atccacaaca gtcaagacca aaaacacaac aacaactcaa acacaaccca gcaagcccac 5700
cacaaaacaa cgccaaaaca aaccaccaag caaacccaat aatgattttc actttgaagt 5760
gttcaacttt gtaccctgca gcatatgcag caacaatcca acctgctggg ctatctgcaa 5820
aagaatacca aacaaaaaac caggaaagaa aaccactacc aagcccacaa aaaaaccaac 5880
cctcaagaca accaaaaaag atcccaaacc tcaaaccact aaatcaaagg aagtacccac 5940
caccaagccc acagaagagc caaccatcaa caccaccaaa acaaacatca taactacact 6000
actcacctcc aacaccacag gaaatccaga actcacaagt caaatggaaa ccttccactc 6060
aacttcctcc gaaggcaatc caagcccttc tcaagtctct acaacatccg agtacccatc 6120
acaaccttca tctccaccca acacaccacg ccagtagtta cttaaaaaca tattatcaca 6180
aaaagccatg accaacttaa acagaatcaa aataaactct ggggcaaata acaatggagt 6240
tgctaatcct caaagcaaat gcaattacca caatcctcac tgcagtcaca ttttgttttg 6300
cttctggtca aaacatcact gaagaatttt atcaatcaac atgcagtgca gttagcaaag 6360
gctatcttag tgctctgaga actggttggt ataccagtgt tataactata gaattaagta 6420
atatcaagga aaataagtgt aatggaacag atgctaaggt aaaattgata aaacaagaat 6480
tagataaata taaaaatgct gtaacagaat tgcagttgct catgcaaagc acaccaccaa 6540
caaacaatcg agccagaaga gaactaccaa ggtttatgaa ttatacactc aacaatgcca 6600
aaaaaaccaa tgtaacatta agcaagaaaa ggaaaagaag atttcttgtt tttttgttag 6660
gtgttggatc tgcaatcgcc agtggcgttg ctgtatctaa ggtcctgcac ctagaagggg 6720
aagtgaacaa gatcaaaagt gctctactat ccacaaacaa ggctctagtc agcttatcaa 6780
atggagttag tgtcttaacc agcaaagtgt tagacctcaa aaactatata gataaacaat 6840
tgttacctat tgtgaacaag caaagctgca gcatatcaaa tatagaaact gtgatagagt 6900
tccaacaaaa gaacaacaga ctactagaga ttaccaggga atttagtgtt aatgcaggtg 6960
taactacacc tgtaagcact tacatgttaa ctaatagtga attattgtca ttaatcaatg 7020
atatgcctat aacaaatgat cagaaaaagt taatgtccaa caatgttcaa atagttagac 7080
agcaaagtta ctctatcatg tccataataa aagaggaagt cttagcatat gtagtacaat 7140
taccactata tggtgttata gatacaccct gttggaaact acacacatcc cctctatgta 7200
caaccaacac aaaagaaggg tccaacatct gtttaacaag aactgacaga ggatggtact 7260
gtgacaatgc aggatcagta tctttcttcc cacaagctga aacatgtaaa gttcaatcaa 7320
atcgagtatt ttgtgacaca atgaacagtt taacattacc aagtgaaata aatctctgca 7380
atgttgacat attcaacccc aaatatgatt gtaaaattat gacttcaaaa acagatgtaa 7440
gcagctccgt tatcacatct ctaggagcca ttgtgtcatg ctatggcaaa actaaatgta 7500
cagcatccaa taaaaatcgt ggaatcataa agacattttc taacgggtgc gattatgtat 7560
caaataaagg gatggacact gtgtctgtag gtaacacatt atattatgta aataagcaag 7620
aaggtaaaag tctctatgta aaaggtgaac caataataaa tttctatgac ccattagtat 7680
tcccctctga tgaatttgat gcatcaatat ctcaagtcaa cgagaagatt aaccagagcc 7740
tagcatttat tcgtaaatcc gatgaattat tacataatgt aaatgctggt aaatccacca 7800
caaatatcat gataactact ataattatag tgattatagt aatattgtta tcattaattg 7860
ctgttggact gctcttatac tgtaaggcca gaagcacacc agtcacacta agcaaagatc 7920
aactgagtgg tataaataat attgcattta gtaactaaat aaaaatagca cctaatcatg 7980
ttcttacaat ggtttactat ctgctcatag acaacccatc tgtcattgga ttttcttaaa 8040
atctgaactt catcgaaact ctcatctata aaccatctca cttacactat ttaagtagat 8100
tcctagttta tagttatata aaacacaatt gaatgccaga ttaacttacc atctgtaaaa 8160
atgaaaactg gggcaaatat gtcacgaagg aatccttgca aatttgaaat tcgaggtcat 8220
tgcttaaatg gtaagaggtg tcattttagt cataattatt ttgaatggcc accccatgca 8280
ctgcttgtaa gacaaaactt tatgttaaac agaatactta agtctatgga taaaagtata 8340
gataccttat cagaaataag tggagctgca gagttggaca gaacagaaga gtatgctctt 8400
ggtgtagttg gagtgctaga gagttatata ggatcaataa acaatataac taaacaatca 8460
gcatgtgttg ccatgagcaa actcctcact gaactcaata gtgatgatat caaaaagctg 8520
agggacaatg aagagctaaa ttcacccaag ataagagtgt acaatactgt catatcatat 8580
attgaaagca acaggaaaaa caataaacaa actatccatc tgttaaaaag attgccagca 8640
gacgtattga agaaaaccat caaaaacaca ttggatatcc ataagagcat aaccatcaac 8700
aacccaaaag aatcaactgt tagtgataca aatgaccatg ccaaaaataa tgatactacc 8760
tgacaaatat ccttgtagta taacttccat actaataaca agtagatgta gagttactat 8820
gtataatcaa aagaacacac tatatttcaa tcaaaacaac ccaaataacc atatgtactc 8880
accgaatcaa acattcaatg aaatccattg gacctctcaa gaattgattg acacaattca 8940
aatttttcta caacatctag gtattattga ggatatatat acaatatata tattagtgtc 9000
ataacactca attctaacac tcaccacatc gttacattat taattcaaac aattcaagtt 9060
gtgggacaaa atggatccca ttattaatgg aaattctgct aatgtttatc taaccgatag 9120
ttatttaaaa ggtgttatct ctttctcaga gtgtaatgct ttaggaagtt acatattcaa 9180
tggtccttat ctcaaaaatg attataccaa cttaattagt agacaaaatc cattaataga 9240
acacatgaat ctaaagaaac taaatataac acagtcctta atatctaagt atcataaagg 9300
tgaaataaaa ttagaagaac ctacttattt tcagtcatta cttatgacat acaagagtat 9360
gacctcgtca gaacagattg ctaccactaa tttacttaaa aagataataa gaagagctat 9420
agaaataagt gatgtcaaag tctatgctat attgaataaa ctagggctta aagaaaagga 9480
caagattaaa tccaacaatg gacaagatga agacaactca gttattacga ccataatcaa 9540
agatgatata ctttcagctg ttaaagataa tcaatctcat cttaaagcag acaaaaatca 9600
ctctacaaaa caaaaagaca caatcaaaac aacactcttg aagaaattga tgtgttcaat 9660
gcaacatcct ccatcatggt taatacattg gtttaactta tacacaaaat taaacaacat 9720
attaacacag tatcgatcaa atgaggtaaa aaaccatggg tttacattga tagataatca 9780
aactcttagt ggatttcaat ttattttgaa ccaatatggt tgtatagttt atcataagga 9840
actcaaaaga attactgtga caacctataa tcaattcttg acatggaaag atattagcct 9900
tagtagatta aatgtttgtt taattacatg gattagtaac tgcttgaaca cattaaataa 9960
aagcttaggc ttaagatgcg gattcaataa tgttatcttg acacaactat tcctttatgg 10020
agattgtata ctaaagctat ttcacaatga ggggttctac ataataaaag aggtagaggg 10080
atttattatg tctctaattt taaatataac agaagaagat caattcagaa aacgatttta 10140
taatagtatg ctcaacaaca tcacagatgc tgctaataaa gctcagaaaa atctgctatc 10200
aagagtatgt catacattat tagataagac agtgtccgat aatataataa atggcagatg 10260
gataattcta ttaagtaagt tccttaaatt aattaagctt gcaggtgaca ataaccttaa 10320
caatctgagt gaactatatt ttttgttcag aatatttgga cacccaatgg tagatgaaag 10380
acaagccatg gatgctgtta aaattaattg caatgagacc aaattttact tgttaagcag 10440
tctgagtatg ttaagaggtg cctttatata tagaattata aaagggtttg taaataatta 10500
caacagatgg cctactttaa gaaatgctat tgttttaccc ttaagatggt taacttacta 10560
taaactaaac acttatcctt ctttgttgga acttacagaa agagatttga ttgtgttatc 10620
aggactacgt ttctatcgtg agtttcggtt gcctaaaaaa gtggatcttg aaatgattat 10680
aaatgataaa gctatatcac ctcctaaaaa tttgatatgg actagtttcc ctagaaatta 10740
catgccatca cacatacaaa actatataga acatgaaaaa ttaaaatttt ccgagagtga 10800
taaatcaaga agagtattag agtattattt aagagataac aaattcaatg aatgtgattt 10860
atacaactgt gtagttaatc aaagttatct caacaaccct aatcatgtgg tatcattgac 10920
aggcaaagaa agagaactca gtgtaggtag aatgtttgca atgcaaccgg gaatgttcag 10980
acaggttcaa atattggcag agaaaatgat agctgaaaac attttacaat tctttcctga 11040
aagtcttaca agatatggtg atctagaact acaaaaaata ttagaattga aagcaggaat 11100
aagtaacaaa tcaaatcgct acaatgataa ttacaacaat tacattagta agtgctctat 11160
catcacagat ctcagcaaat tcaatcaagc atttcgatat gaaacgtcat gtatttgtag 11220
tgatgtgctg gatgaactgc atggtgtaca atctctattt tcctggttac atttaactat 11280
tcctcatgtc acaataatat gcacatatag gcatgcaccc ccctatatag gagatcatat 11340
tgtagatctt aacaatgtag atgaacaaag tggattatat agatatcaca tgggtggcat 11400
cgaagggtgg tgtcaaaaac tgtggaccat agaagctata tcactattgg atctaatatc 11460
tctcaaaggg aaattctcaa ttactgcttt aattaatggt gacaatcaat caatagatat 11520
aagcaaacca atcagactca tggaaggtca aactcatgct caagcagatt atttgctagc 11580
attaaatagc cttaaattac tgtataaaga gtatgcaggc ataggccaca aattaaaagg 11640
aactgagact tatatatcac gagatatgca atttatgagt aaaacaattc aacataacgg 11700
tgtatattac ccagctagta taaagaaagt cctaagagtg ggaccgtgga taaacactat 11760
acttgatgat ttcaaagtga gtctagaatc tataggtagt ttgacacaag aattagaata 11820
tagaggtgaa agtctattat gcagtttaat atttagaaat gtatggttat ataatcagat 11880
tgctctacaa ttaaaaaatc atgcattatg taacaataaa ctatatttgg acatattaaa 11940
ggttctgaaa cacttaaaaa ccttttttaa tcttgataat attgatacag cattaacatt 12000
gtatatgaat ttacccatgt tatttggtgg tggtgatccc aacttgttat atcgaagttt 12060
ctatagaaga actcctgact tcctcacaga ggctatagtt cactctgtgt tcatacttag 12120
ttattataca aaccatgact taaaagataa acttcaagat ctgtcagatg atagattgaa 12180
taagttctta acatgcataa tcacgtttga caaaaaccct aatgctgaat tcgtaacatt 12240
gatgagagat cctcaagctt tagggtctga gagacaagct aaaattacta gcgaaatcaa 12300
tagactggca gttacagagg ttttgagtac agctccaaac aaaatattct ccaaaagtgc 12360
acaacattat actactacag agatagatct aaatgatatt atgcaaaata tagaacctac 12420
atatcctcat gggctaagag ttgtttatga aagtttaccc ttttataaag cagagaaaat 12480
agtaaatctt atatcaggta caaaatctat aactaacata ctggaaaaaa cttctgccat 12540
agacttaaca gatattgata gagccactga gatgatgagg aaaaacataa ctttgcttat 12600
aaggatactt ccattggatt gtaacagaga taaaagagag atattgagta tggaaaacct 12660
aagtattact gaattaagca aatatgttag ggaaagatct tggtctttat ccaatatagt 12720
tggtgttaca tcacccagta tcatgtatac aatggacatc aaatatacta caagcactat 12780
atctagtggc ataattatag agaaatataa tgttaacagt ttaacacgtg gtgagagagg 12840
acccactaaa ccatgggttg gttcatctac acaagagaaa aaaacaatgc cagtttataa 12900
tagacaagtc ttaaccaaaa aacagagaga tcaaatagat ctattagcaa aattggattg 12960
ggtgtatgca tctatagata acaaggatga attcatggaa gaactcagca taggaaccct 13020
tgggttaaca tatgaaaagg ccaagaaatt atttccacaa tatttaagtg tcaattattt 13080
gcatcgcctt acagtcagta gtagaccatg tgaattccct gcatcaatac cagcttatag 13140
aacaacaaat tatcactttg acactagccc tattaatcgc atattaacag aaaagtatgg 13200
tgatgaagat attgacatag tattccaaaa ctgtataagc tttggcctta gtttaatgtc 13260
agtagtagaa caatttacta atgtatgtcc taacagaatt attctcatac ctaagcttaa 13320
tgagatacat ttgatgaaac ctcccatatt cacaggtgat gttgatattc acaagttaaa 13380
acaagtgata caaaaacagc atatgttttt accagacaaa ataagtttga ctcaatatgt 13440
ggaattattc ttaagtaata aaacactcaa atctggatct catgttaatt ctaatttaat 13500
attggcacat aaaatatctg actattttca taatacttac attttaagta ctaatttagc 13560
tggacattgg attctgatta tacaacttat gaaagattct aaaggtattt ttgaaaaaga 13620
ttggggagag ggatatataa ctgatcatat gtttattaat ttgaaagttt tcttcaatgc 13680
ttataagacc tatctcttgt gttttcataa aggttatggc aaagcaaagc tggagtgtga 13740
tatgaacact tcagatcttc tatgtgtatt ggaattaata gacagtagtt attggaagtc 13800
tatgtctaag gtatttttag aacaaaaagt tatcaaatac attcttagcc aagatgcaag 13860
tttacataga gtaaaaggat gtcatagctt caaattatgg tttcttaaac gtcttaatgt 13920
agcagaattc acagtttgcc cttgggttgt taacatagat tatcatccaa cacatatgaa 13980
agcaatatta acttatatag atcttgttag aatgggattg ataaatatag atagaataca 14040
cattaaaaat aaacacaaat tcaatgatga attttatact tctaatctct tctacattaa 14100
ttataacttc tcagataata ctcatctatt aactaaacat ataaggattg ctaattctga 14160
attagaaaat aattacaaca aattatatca tcctacacca gaaaccctag agaatatact 14220
agccaatccg attaaaagta atgacaaaaa gacactgaat gactattgta taggtaaaaa 14280
tgttgactca ataatgttac cattgttatc taataagaag cttattaaat cgtctgcaat 14340
gattagaacc aattacagca aacaagattt gtataattta ttccctatgg ttgtgattga 14400
tagaattata gatcattcag gcaatacagc caaatccaac caactttaca ctactacttc 14460
ccaccaaata tctttagtcc acaatagcac atcactttac tgcatgcttc cttggcatca 14520
tattaataga ttcaattttg tatttagttc tacaggttgt aaaattagta tagagtatat 14580
tttaaaagat cttaaaatta aagatcccaa ttgtatagca ttcataggtg aaggagcagg 14640
gaatttatta ttgcgtacag tagtggaact tcatcctgac ataagatata tttacagaag 14700
tctgaaagat tgcaatgatc atagtttacc tattgagttt ttaaggctgt acaatggaca 14760
tatcaacatt gattatggtg aaaatttgac cattcctgct acagatgcaa ccaacaacat 14820
tcattggtct tatttacata taaagtttgc tgaacctatc agtctttttg tctgtgatgc 14880
cgaattgtct gtaacagtca actggagtaa aattataata gaatggagca agcatgtaag 14940
aaagtgcaag tactgttcct cagttaataa atgtatgtta atagtaaaat atcatgctca 15000
agatgatatt gatttcaaat tagacaatat aactatatta aaaacttatg tatgcttagg 15060
cagtaagtta aagggatcgg aggtttactt agtccttaca ataggtcctg cgaatatatt 15120
cccagtattt aatgtagtac aaaatgctaa attgatacta tcaagaacca aaaatttcat 15180
catgcctaag aaagctgata aagagtctat tgatgcaaat attaaaagtt tgataccctt 15240
tctttgttac cctataacaa aaaaaggaat taatactgca ttgtcaaaac taaagagtgt 15300
tgttagtgga gatatactat catattctat agctggacgt aatgaagttt tcagcaataa 15360
acttataaat cataagcata tgaacatctt aaaatggttc aatcatgttt taaatttcag 15420
atcaacagaa ctaaactata accatttata tatggtagaa tctacatatc cttacctaag 15480
tgaattgtta aacagcttga caaccaatga acttaaaaaa ctgattaaaa tcacaggtag 15540
tctgttatac aactttcata atgaa 15565
Claims (33)
- 하기를 포함하는 감염성 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 생산하기 위한 발현 벡터:
a) 호흡기 세포융합 바이러스를 코딩하는 핵산 서열; 및
b) RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자로서, 리포터 유전자 및 플랭킹 RSV 유전자 시작 및 RSV 유전자 종료 서열이 호흡기 세포융합 바이러스의 P와 M 유전자 사이에 위치된 것인 리포터 유전자. - 제1항에 있어서,
a) 리포터 유전자가 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하거나; 또는
b) 리포터 유전자가 형광 단백질을 코딩하는 것인
발현 벡터. - 제2항에 있어서, 발광 효소가 루시페라제인 발현 벡터.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 유전자 시작 서열이 서열식별번호: 16이고 RSV 유전자 종료 서열이 서열식별번호: 17인 발현 벡터.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자의 서열이 서열식별번호: 18인 발현 벡터.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 유전자 시작 및 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자가 서열식별번호: 15인 발현 벡터.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 세포융합 바이러스가 균주 A2이거나 또는 서열식별번호: 14를 포함하는 것인 발현 벡터.
- 하기를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스:
a) 호흡기 세포융합 바이러스를 코딩하는 핵산 서열; 및
b) RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자로서, 리포터 유전자 및 플랭킹 RSV 유전자 시작 및 RSV 유전자 종료 서열이 호흡기 세포융합 바이러스의 P와 M 유전자 사이에 위치된 것인 리포터 유전자. - 제8항에 있어서,
a) 리포터 유전자가 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하거나; 또는
b) 리포터 유전자가 형광 단백질을 코딩하는 것인
호흡기 세포융합 바이러스. - 제9항에 있어서, 발광 효소가 루시페라제인 호흡기 세포융합 바이러스.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 유전자 시작 서열이 서열식별번호: 16이고 RSV 유전자 종료 서열이 서열식별번호: 17인 호흡기 세포융합 바이러스.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자의 서열이 서열식별번호: 18인 호흡기 세포융합 바이러스.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 유전자 시작 및 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자가 서열식별번호: 15인 호흡기 세포융합 바이러스.
- 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 세포융합 바이러스가 균주 A2이거나 또는 서열식별번호: 14를 포함하는 것인 호흡기 세포융합 바이러스.
- 하기 단계를 포함하는, 항-호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성을 측정하는 방법:
a) (i) 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편, (ii) 리포터 유전자를 포함하는 RSV 바이러스, 및 (iii) RSV 바이러스에 의해 감염가능한 1개 이상의 세포를 조합하는 단계; 및
b) 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계. - 제15항에 있어서, (i)의 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) 및 (ii)의 조합된 혼합물을 (iii)의 RSV 바이러스에 의해 감염가능한 1개 이상의 세포에 첨가하기 전에 RSV 바이러스 (ii)와 조합되는 것인 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서,
a) 리포터 유전자가 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계가 발광 기질의 발광을 검출하는 것을 포함하거나; 또는
b) 리포터 유전자가 형광 단백질을 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계가 형광 단백질로부터의 형광 방출을 검출하는 것을 포함하는 것인
방법. - 제17항에 있어서, 발광 효소가 루시페라제인 방법.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 루시페라제 기질을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 바이러스에 의해 감염가능한 1개 이상의 세포가 A549 세포인 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 항-호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 활성을 측정하는 방법:
a) 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 루시페라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 RSV 바이러스를 조합하는 단계;
b) 단계 a)의 혼합물을 1개 이상의 A549 세포에 첨가하는 단계;
c) 루시페라제 기질을 단계 b)의 혼합물에 첨가하는 단계; 및
d) 루시페라제 기질의 발광을 검출하는 단계. - 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 루시페라제를 코딩하는 핵산 서열이 나노루시페라제를 코딩하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) HC-CDR1이 서열식별번호: 1이고, HC-CDR2가 서열식별번호: 2이고, HC-CDR3이 서열식별번호: 3인 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HC-CDR); 및
(b) LC-CDR1이 서열식별번호: 4이고, LC-CDR2가 서열식별번호: 5이고, LC-CDR3이 서열식별번호: 6인 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LC-CDR). - 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 7의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 8의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 9를 포함하고 경쇄는 서열식별번호: 10을 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 9의 2개의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 2개의 경쇄를 포함하는 항체인 방법.
- 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 바이러스가 하기를 포함하는 것인 방법:
a) 호흡기 세포융합 바이러스를 코딩하는 핵산 서열; 및
b) RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자로서, 리포터 유전자 및 플랭킹 RSV 유전자 시작 및 RSV 유전자 종료 서열이 호흡기 세포융합 바이러스의 P와 M 유전자 사이에 위치된 것인 리포터 유전자. - 제27항에 있어서,
a) 리포터 유전자가 발광 기질을 촉매하는 발광 효소를 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계가 발광 기질의 발광을 검출하는 것을 포함하거나; 또는
b) 리포터 유전자가 형광 단백질을 코딩하며, 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계가 형광 단백질로부터의 형광 방출을 검출하는 것을 포함하는 것인
방법. - 제28항에 있어서, 발광 효소가 루시페라제인 방법.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 유전자 시작 서열이 서열식별번호: 16이고 RSV 유전자 종료 서열이 서열식별번호: 17인 방법.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자의 서열이 서열식별번호: 18인 방법.
- 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 유전자 시작 서열 및 RSV 유전자 종료 서열에 의해 플랭킹된 리포터 유전자가 서열식별번호: 15인 방법.
- 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 세포융합 바이러스가 균주 A2이거나 또는 서열식별번호: 14를 포함하는 것인 방법.
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