CN114349851B - 新冠病毒中和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种新冠病毒的中和性抗体及其变体和应用。本发明从噬菌体展示抗体文库中，通过噬菌体淘选技术筛选获得了多株抗体，其能够特异性地与多种新冠病毒的S蛋白上的RBD结构域结合，从而抑制S蛋白与人ACE2蛋白的结合。本发明的中和抗体亲和力高，广谱性强，可以抑制新冠病毒对人的细胞侵染，起到中和病毒毒性的作用，可以用于制备预防和治疗新冠病毒疾病的药物，用于制备新冠病毒检测产品等，具有广泛的应用前景。

Description

新冠病毒中和抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及新冠病毒的中和性抗体及其制备方法和应用。

背景技术

新型冠状肺炎病毒(SARS-Cov-2)简称新冠病毒，可以侵染人的细胞并引起新冠肺炎，侵染的机理是新冠病毒利用其外壳上的棘突蛋白S与人的细胞表面的血管紧张素转化酶2(Ang iotensin converting enzyme 2，ACE2)结合后，新冠病毒遗传物质进入人的细胞进行复制并引发肺炎。新冠病毒的棘突蛋白S简称S蛋白，是新冠病毒毒力的关键因子，是决定新冠病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分。S蛋白由1200多个氨基酸残基组成，分为若干个结构域。S蛋白是通过其上的受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)RBD结构域结合而完成侵染的，因此，开发抗体来特异性地结合S蛋白的RBD并阻断其与ACE2的结合成为治疗和预防新冠肺炎的一种有效的方法。

新冠病毒不断出现变异菌株，对于治疗抗体的要求也越来越高，目前抗新冠病毒的抗体亲和力不高，表达量低，或广谱性不强，因此，迫切需要开发亲和力强、表达量高且具有广谱抗新冠病毒的抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新冠病毒的中和抗体及所述中和抗体的应用，解决上述新冠病毒抗体亲和性不高、广谱性差、表达量低等的技术问题。

本发明一方面提供了一种新冠病毒的中和抗体，包括VH部分；所述VH部分包括CDRH1、CDR H2和CDR H3；

所述CDR H1具有SEQ ID NO:1(KYSHLGF)、SEQ ID NO:4(EYSQLRF)或SEQ ID NO:7(KFSHLVF)所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:1、4或7所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列；

所述CDR H2具有SEQ ID NO:2(GLGAYEDG)、SEQ ID NO:5(GLGANEDG)或SEQ ID NO:8(GLGAYESG)所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:2、5或8所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列；

所述CDR H3具有SEQ ID NO:3(AALVVFSRDSPEFLAQNY)、SEQ ID NO:6(AALVIFSHDGPEFLAQNY)或SEQ ID NO:9(AALVVLSRDNTEFIAHNY)所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:3、6或9所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列。

本发明中，所示CDR可以以各种成对组合进行组合以产生多种中和性抗体。

在一些实施方式中，所述VH部分中，

所述CDR H1的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7。

所述CDR H2的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8。

所述CDR H3的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9。

在一些实施方式中，所述VH部分包括以下任何一种：

(1)包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR H1，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR H2，和包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR H3；或其变体；

(2)包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR H1，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR H2，和包含氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR H3；或其变体；

(3)包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR H1，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的CDR H2，和包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR H3；或其变体，

其中，所述变体是在所述多个CDR区中包含多个氨基酸突变后的抗体。在一些实施方式中，所述变体是在所述多个CDR区中共包含最高达约3个(例如1个、2个或3个)氨基酸突变后的抗体。

在一些实施方式中，所述VH部分还可以包括框架区。在一些实施方式中，所述框架区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10(DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASG)所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:11(LGWFRQAPGKEREGVAA)所示的FR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:12(YYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYC)所示的FR3，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:13(WGQGTQVTVSS)所示的FR4。

在一些实施方式中，所述VH部分的氨基酸序列：

如SEQ ID NO:14

(DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGKYSHLGFLGWFRQAPGKEREGVAAGLGAYEDGYYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYCAALVVFSRDSPEFLAQNYWGQGTQVTVSS)所示；或

如SEQ ID NO:15

(DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGEYSQLRFLGWFRQAPGKEREGVAAGLGANEDGYYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYCAALVIFSHDGPEFLAQNYWGQGTQVTVSS)所示；或

如SEQ ID NO:16

(DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGKFSHLVFLGWFRQAPGKEREGVAAGLGAYESGYYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYCAALVVLSRDNTEFIAHNYWGQGTQVTVSS)所示；或

具有与SEQ ID NO:14～16所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列。

在一些实施方式中，所述中和抗体为纳米抗体(VHH)，所述VHH氨基酸序列如SEQID NO:14～16任一所示，或者具有与SEQ ID NO:14～16所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列。

在一些实施方式中，所述中和抗体还包括Fc区，所述Fc区为人免疫球蛋白IgG1的Fc区。

在一些实施方式中，所述中和抗体为VHH+Fc。

在一些实施方式中，所述中和抗体为Fab+Fc。

在本发明的另一方面，提供一种核酸，其编码以上任一实施方案的中和抗体。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包括如上所述的核酸。

在本发明的另一方面，提供一种中和抗体噬菌体(噬菌粒)，其包括：噬菌体(噬菌粒)，以及展示于噬菌体表面的所述的纳米抗体。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其包含如上所述的表达载体或细胞中整合有如上所述的核酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述中和抗体的制备方法，包括：培养所述宿主细胞，从而获得中和抗体。进一步的，培养条件为能够产生所述中和抗体的条件。

在本发明的另一方面，提供一种所述中和抗体在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物或在制备检测新冠病毒产品中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种疫苗，其包括所述的中和抗体。

在本发明的另一方面，提供一种用于预防和/或治疗新冠病毒感染的药物组合物，其包括所述的中和抗体。进一步的，药物组合物包括但不限于是疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测新冠病毒的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的纳米抗体或所述的中和抗体噬菌体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

相对于现有技术，本发明的有益效果包括：本发明中的抗体具有亲和力高、特异性高、广谱性强的特点，可用于制备新冠病毒检测产品，制备预防新冠病毒的药物，制备抑制新冠病毒的药物，制备治疗新冠病毒引起疾病的药物等，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为新冠病毒中和抗体开发的技术路线总览图。

图2为中和抗体C5克隆的获得。其中，图2A为使用ELISA方法检测抗体B7、D3、C5与RBD蛋白和全长S蛋白的结合结果图(每组从左至右分别代表RBD-Fc，S-FL，Fc，milk)；图2B为使用竞争性ELISA实验检测抗体C5和B7与RBD蛋白竞争性结合ACE2的结果图；图2C为使用竞争性ELISA实验检测抗体C5和D3与全长S蛋白竞争性结合ACE2的结果图；图2D为纯化后C5抗体蛋白电泳图(左图)及使用BLI方法测定抗体C5与全长S蛋白结合的亲和力结果图(右图)。

图3为中和抗体C5克隆的优化。其中，图3A为将C5克隆为模板构建优化文库的流程图；图3B为使用ELISA方法检测文库筛选得到一系列的C5克隆的变体与RBD蛋白和全长S蛋白的结合结果图；图3C为纯化的C5D2和C5G2纳米抗体蛋白SDS-PAGE胶图(从左至右依次为M、C5G2、C5D2)；图3D为使用BLI方法测定C5D2与S蛋白的RBD(RBD-WT)结合的亲和力结果图；图3E为使用BLI方法测定C5G2与S蛋白的RBD(RBD-WT)结合的亲和力结果图。

图4为C5D2和C5G2的功能鉴定；其中，图4A为C5D2和C5G2分别与ACE2竞争结合S蛋白的结果图；图4B为C5D2和C5G2保护Bhk21(baby hamster kidney)细胞不受假病毒感染实验结果图(下方图中的浓度表示IC₅₀值)。

图5为C5D2和C5G2与新冠病毒变异菌株的RBD的交叉反应。其中，图5A为使用ELISA方法测定C5D2和C5G2与6种流行的新冠变异菌株的RBD蛋白结合的结果图；图5B为使用BLI方法测定C5D2与Delta(B.1.617.2)突变株RBD蛋白(RBD-Delta)结合的亲和力结果图；图5C为使用BLI方法测定C5G2与Delta(B.1.617.2)突变株RBD蛋白(RBD-Delta)结合的亲和力结果图。

其中，图2D、3D、3E、5B、5C从上到下三组曲线的浓度依次对应500nM、250nM、125nM。其中，每组包括两条曲线，波浪形曲线代表原始数据，平滑曲线是根据原始数据拟合的曲线。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

本发明提供了一种新冠病毒SARS-CoV-2的中和抗体，所述中和抗体的可变区包括3个互补决定区CDR H1、CDR H2和CDR H3，其中，

所述CDR H1具有SEQ ID NO:1、4或7所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:1、4或7所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列；

所述CDR H2具有SEQ ID NO:2、5或8所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:2、5或8所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列；

所述CDR H3具有SEQ ID NO:3、6或9所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:3、6或9所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列。

所述CDR可以以各种成对组合进行组合以产生许多中和性抗体。

在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDRH1，或其包含至多含约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR H2，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR H3，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体。在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR H1；氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR H2；和氨基酸序列SEQID NO:3的CDR H3；或其变体，所述变体在所述多个CDR区中共包含最高达约3个(例如约1个、2个或3个)氨基酸改变。在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQID NO:1的CDR H1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR H3。

在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDRH1，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR H2，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR H3，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体。在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR H1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR H2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR H3；或其变体，所述变体在所述多个CDR区中共包含最高达约3个(例如约1个、2个或3个)氨基酸改变。在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR H1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR H2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR H3。

在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDRH1，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR H2，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR H3，或其包含至多约3个(例如约1个、2个或3个中的任一者)氨基酸改变的变体。在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR H1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR H2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR H3；或其变体，所述变体在所述多个CDR区中共包含最高达约3个(例如约1个、2个或3个)氨基酸改变。在一些实施方式中，所述中和抗体的VH部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR H1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR H2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR H3。

所述抗体还可以包括如下所示的框架区序列FR1、FR2、FR3、FR4：

FR1的氨基酸序列为：SEQ ID NO:10；

FR2的氨基酸序列为：SEQ ID NO:11；

FR3的氨基酸序列为：SEQ ID NO:12；

FR4的氨基酸序列为：SEQ ID NO:13。

在一些实施方式中，所述框架区序列包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的FR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的FR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的FR3，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的FR4。

在一些实施方式中，所述中和抗体或中和抗体的VH部分的氨基酸序列如SEQ IDNO:14～16任一所示，或者具有与SEQ ID NO:14～16任一所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列。在一些实施方式中，所述中和抗体为纳米抗体(VHH)，所述VHH氨基酸序列如SEQ ID NO:14～16任一所示，或者具有与SEQ ID NO:14～16任一所示的氨基酸序列存在至少80％同源性的序列。

在一些实施方式中，所述中和抗体为Fab，其包含如上所述的可变区VH或纳米抗体(VHH)，还包含轻链可变区(VL)。

在一些实施方式中，所述中和抗体还包括恒定区(Fc区)，所述Fc区为人免疫球蛋白G1的Fc区。

在一些实施方式中，所述中和抗体为VH H+Fc。

在一些实施方式中，所述中和抗体为Fab+Fc。

本发明也包括所述的中和抗体的变异体、衍生物和类似物。如本文所用，术语“变异体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的中和抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根据本文的定义这些变异体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

此外，在所述的中和抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所述的纳米抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列)，或其它可促进所述的纳米抗体的活性、表达量或稳定性的序列。

本发明还提供了一种核酸，其编码以上任一实施方案的中和抗体或其变异体、衍生物和类似物。

本发明所述编码可变区或中和抗体的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明某些实施方案中，所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

所述的核酸可以提取自基因组的，也可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。

本发明还提供了一种重组表达载体，包括如上所述的核酸，即在骨架载体上包含所述的核酸。在一些实施方式中，所述骨架载体例如可以选自pET22b、pET28a、pET30a、pBAD、pcold、pQE、pKK等。进一步地，所述重组表达载体还含有启动子和终止子。

本发明还提供了一种中和抗体噬菌体(噬菌粒)，其包括：噬菌体(噬菌粒)，以及展示于噬菌体表面的所述的纳米抗体。在一实施方式中，噬菌体展示载体为pComb3XSS。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的表达载体或细胞中整合有如上所述的核酸。为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明纳米抗体的条件下培养该细胞，从而表达出纳米抗体；然后再分离出表达的纳米抗体。

所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

所述原核细胞例如来自于细菌。所述细菌选自选自大肠杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、粪副拟杆菌、梭杆菌、和短双歧杆菌中的一种或几种。优选地，为大肠杆菌，所述大肠杆菌选自BL21、BW25113、JM109、MG1655、DH5a、TOP10、HB101、BLR、C43(DE3)、C41(DE3)或TB1中的一种或几种；所述BL21选自BL21(DE2)、BL21(DE3)、BL21 star(DE3)或BL21(DE3)PlysS。进一步优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE2)。更进一步优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

所述真核细胞来自于真菌，所述真菌选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、毕赤酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母、栗酒裂殖酵母、白假丝酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉和杂色曲霉中的一种或几种。

本发明还提供了所述中和抗体的制备方法，包括：培养所述宿主细胞，从而获得中和抗体。进一步的，培养条件为能够产生所述中和抗体的条件。在获得编码本发明所述中和抗体或其变异体、衍生物的核酸序列(如DNA序列)之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞，通过培养转化后的宿主细胞，然后进行分离纯化，得到本发明所述的中和抗体。

本发明还提供了所述中和抗体在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物或在制备检测新冠病毒产品中的应用。在另一优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。较佳地，用于检测来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)中的新冠病毒。

本发明还提供一种用于预防和/或治疗新冠病毒感染的药物组合物，其包括所述的中和抗体以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、介质。进一步的，药物组合物包括但不限于是疫苗。

所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

本发明所提供的中和抗体或含所述中和抗体的药物组合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、阴道、口服或胃肠外给药；注射给药包括静脉注射、肌内注射和皮下注射等，经皮给药等。

所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。

本发明还提供一种用于检测新冠病毒感染的试剂盒，其包括本发明所述的中和抗体或中和抗体噬菌体(噬菌粒)。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体和说明检测新冠病毒的方法的使用说明书，所述的纳米抗体或中和抗体噬菌体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在，说明检测新冠病毒的方法的使用说明书。在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的噬菌体。例如，所述的噬菌体是M13丝状噬菌体。

本发明还提供了所述试剂盒的使用方法。在一实施方式中，将待测样品包被于固相载体上，以携带或不携带可检测标记物(以携带可检测标记物的抗抗体进一步结合)的所述的中和抗体或所述的中和抗体噬菌体作为检测抗体，检测新冠病毒的存在情况。作为一种实施方式，可以将待测样品包被于固相载体上，以本发明的中和抗体(或纳米抗体)作为检测抗体进行检测，所述的中和抗体(或纳米抗体)可连接一可检测标记物，或可以与连接可检测标记物的另一抗体(抗抗体)结合，从而获知待测样品中新冠病毒的存在情况。应理解，在获得了本发明的纳米抗体后，可以采取多种本领域已知的方式来实施新冠病毒的检测，这些方式均包含在本发明中。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。所述的待测样品是来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)。

在确定了本发明的试剂盒所采用的检测抗体后，可以采用本领域常规可用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物作为可检测标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中新冠病毒的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记。抗体标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗体。

为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控(对照)。所述的质控品例如采用新冠病毒标准品。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个新冠病毒的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

本发明还提供了一种预防和/或治疗新冠病毒感染的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明所述的中和抗体。

本发明还提供了一种待测样品中新冠病毒存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括：

如上所述的纳米抗体作为新冠病毒的检测抗体，通过如酶联免疫反应法来检测待测样品中新冠病毒的存在情况；并且，所述的方法为非诊断性的方法。

如无特别说明，本发明采用的试剂材料为普通市售品，可商购获得。

术语

如本文所用，所述的“至少80％同源性”是指序列与本文中的序列之间的同源性在80％以上，包含80％。具体包含且不限于80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。

如本文所用，所述的“纳米抗体”是指缺失轻链的重链抗体(如：来源于骆驼体内)，克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段。纳米抗体具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。

如本文所用，所述的“药物组合物”包括含有本文所述的中和抗体和可药用载体的组合物，或者含有本文所述的中和抗体和一种或多种已知的药用化合物或药用成分的组合物；药物组合物包括但不限于疫苗。

如本文所用，所述的“个体”或对象通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用上述的药物、组合物、制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。

如本文所用，所述的“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。

如本文所用，所述的“检测抗体”是指特异性地抗新冠病毒的抗体。

如本文所用，所述的“可检测标记物”是指位于检测抗体上的，用于确定待检测样品中新冠病毒的存在与否以及存在的量的标志物。如：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

如本文所用，所述的“与可检测标记物相对应的底物”是指可被检测抗体的标记物所催化显色，用于显示检测抗体与新冠病毒发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明的中和抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实验方法：

(1)ELISA方法测定抗体与全长S蛋白及RBD的结合

0.2ug Spike-trimer(S-FL)、RBD-Fc(RBD与Fc的融合蛋白)、Fc蛋白分别加入50ulPBS/well的96微孔板中，Fc蛋白作为阴性对照，4℃过夜孵育；次日甩去孔内液体，加入100ul/well 2％Milk(封闭液)于室温、120rpm孵育1h；完成孵育后甩去孔内液体，PTbuffer洗涤4次；25ul Nanobody-phage培养液上清与25ul PBS混合后分别加入包被Spike、RBD-Fc、Fc的孔内，室温、120rpm孵育1h；PT buffer洗涤6次，50ul/well anti-IgG-Hrp室温孵育30min；PT洗涤8次，加入TMB显色液显色，50ul/well 1M H₃PO₄终止显色，通过酶标仪检测OD450值。

(2)竞争性ELISA实验测定抗体对Spike/RBD与人ACE2结合的抑制作用

0.2ug Spike-trimer/RBD-Fc蛋白加入50ul PBS/well的96微孔板中，4℃过夜孵育；甩去孔内液体，100ul/well 2％Milk室温、120rpm孵育1h；甩去孔内液体，PT buffer洗涤4次；将Nanobody-phage按照体积梯度(50ul、40ul、30ul、20ul、10ul、0ul)加至包被Spike蛋白的孔内室温孵育1h；经过洗涤、二抗孵育、TMB显色后通过酶标仪检测OD450值，确定nanobody-phage的亚饱和浓度。

0.2ug Spike-trimer蛋白加入50ul PBS/well的96微孔板中，4℃过夜孵育；甩去孔内液体，100ul/well 2％Milk室温、120rpm孵育1h；甩去孔内液体，PT洗涤后加入亚饱和浓度nanobody-phage室温孵育1h，PT洗涤后加入浓度梯度(450nM、225nM、112.5nM、56.25nM、0nM)的ACE2-His蛋白，室温孵育1h；经过洗涤、二抗anti IgG-Hrp孵育后、TMB显色后通过酶标仪检测OD450值，通过Graphpad Prism绘制图片。

(3)构建蛋白表达载体pET22b-nanobody

根据C5、C5D2、C5G2克隆，设计Primer-F(SEQ ID NO:17:CCCAGCCGGCGATGGCCATGGATGATGTTCAGCTGGTTGAA)，Primer-R(SEQ ID NO:18:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCGCTGCTAACGGTAACTTG)。通过PCR(Polymerase Chain Reaction)获得C5系列nanobody(即C5,C5D2,C5G2)DNA片段。通过NcoⅠ和NotⅠ酶切pET22b载体，琼脂糖凝胶电泳后回收酶切后的线性载体片段。利用重组酶ExnaseⅡ(C112-01)通过同源序列将nanobody DNA片段引入线性pET22b载体。

(4)在大肠杆菌中蛋白的表达纯化

表达载体pET22b-nanobody转化至E.coli BL21(DE3)，次日挑取单克隆加入2YT培养基内37℃培养至OD600＝0.8，加入0.5mM IPTG于18℃培养16h。离心收集菌体及培养液上清，菌体分离后加入裂解液并通过超声波破碎仪破碎菌体，离心除去菌体碎片；分别将培养上清液、裂解上清液通过亲和层析法(Ni-NTA argose)收集蛋白，通过BCA法定量蛋白浓度，SDS-page电泳检测蛋白纯度。

(5)BLI法测定亲和力

BLI(Biolayer interferometry)所用设备为Octet RED96 System(ForteBio)，所用传感器为Ni-NTA biosensors(18-5101)，样品分析环境为30℃，1000rpm。带有6×Histag的nanobody固定到Ni-NTA biosensor，将浓度梯度(500nM、250nM、125nM、0nM(作为本底))的RBD-Fc蛋白作为分析物分别加入含200ul/well running buffer(1×PBS+0.5％BSA+0.05％Tween)的黑色96板内，仪器测量nanobody与RBD-Fc之间的结合及解离数据，使用Octet data analysis software version 9.0.0.14(ForteBio)分析数据。

(6)假病毒实验中和能力分析

所用假病毒为VSV(vesicular stomatitis virus)dG-SARS-Cov2 virus，通过VSVdG-EGFP-G(Addgene,31842)virus产生。所用细胞为表达人类ACE2的BHK21。将梯度稀释的高纯度Nanobody与VSVdG-SARS-Cov2 virus(MOI＝0.05)混合后37℃孵育1h。所有样品及病毒均通过10％的FBS-DMEM稀释。孵育后将混合物与BHK21-hACE2细胞孵育12h，通过OperaPhenix或Operetta CLS equipment(PerkinElmer)获得荧光图像，使用Columbus system(PerkinElmer)完成定量。每个梯度GFP阳性细胞的数目代表了侵染水平，与无抗体处理的对照组进行对比，计算中和能力。

本发明经过深入的研究，提供了一种新冠病毒的中和性抗体及其应用。请参照图1，本发明开发所述新冠病毒的中和抗体的方法及思路如下：从纳米抗体文库中，通过噬菌体展示技术筛选获得了多株能够与新冠病毒的S蛋白的RBD结构域结合的抗体，通过竞争性ELISA实验显示，获得既可以结合S蛋白的RBD结构域，又可以抑制ACE2与全长S蛋白和/或RBD的结合的抗体C5；通过在大肠杆菌中表达该抗体，确定其表达量并不太理想，在此基础上对该抗体C5进行随机突变，构建优化文库，通过大量实验筛选获得表达量高、亲和力高和广谱性强的两株抗体C5D2和C5G2。所述两株抗体C5D2和C5G2可以阻断S蛋白与ACE2的结合，可以用于新冠病毒的检测，也可以阻断新冠病毒与细胞结合，具有较高的亲和力和新冠病毒中和能力。

实施例1C5抗体的获得

C5抗体获得过程如图1所示。

1、通过噬菌体展示的方法，用纯化的新冠病毒全长S蛋白或者RBD结构域分别筛选自有的合成纳米抗体文库(专利申请号：2020111170942)，其中全长S蛋白筛选到克隆D3，RBD结构域筛选到克隆B7和C5，共得到了3个抗体分子。其中B7和C5克隆结合RBD结构域，D3克隆结合S蛋白上非RBD的区域。

用ELISA方法测定抗体与全长S蛋白及RBD的结合(见实验方法(1))，进一步证明(图2A)，D3克隆虽然和全长S蛋白结合，却不能与RBD结合；B7克隆和C5克隆(SEQ ID NO:10)既可以和RBD结合也可以和全长S蛋白结合。

2、虽然B7和C5克隆都可以结合RBD，但是竞争性ELISA实验测定抗体对Spike/RBD与人ACE2结合的抑制作用(见实验方法(2))，结果显示(图2B～2C)，只有C5克隆可以抑制全长S蛋白及RBD与人ACE2的结合，阻断S蛋白和人ACE2蛋白结合的功能，C5克隆显示了潜在的中和功能。

3、C5抗体蛋白表达量和结合RBD的亲和力测试

将编码C5克隆的cDNA克隆到表达载体pET22b中，构建获得蛋白表达载体pET22b-nanobody(见实验方法(3))，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达C5蛋白(见实验方法(4))，表达量为0.3mg/L。

用生物膜层干涉技术(Biolayer interferometry,BLI)(见实验方法(5))测定其与S蛋白相互作用的亲和力，结果见图2D，亲和力为KD＝1.80E-08M(mol/L)。该亲和力与S蛋白和ACE2结合的亲和力(1.14E-08M)相当(见表1)。该中和抗体的蛋白表达量和亲和力均不太理想。

实施例2C5D2和C5G2抗体的获得

本发明接下来采用抗体工程的方法，对C5克隆的CDR区进行突变改造，并构建新的噬菌体展示纳米抗体文库。

C5克隆变体文库构建示意图如图3A所示，以C5克隆为模板，对其互补决定区(CDR)进行随机突变，突变后的分子构建在噬菌体展示载体pComb3XSS上，文库的多样性经滴定测试为1e+8cfu(colony forming unit)。

如图3B所示，通过噬菌体展示筛选，得到10个C5克隆的变体，经ELISA测定抗体(phage水平)与全长S蛋白及RBD的结合(见实验方法(1))，结果显示它们均可以特异性地与RBD结合。

将这10个变体克隆均克隆至表达载体pET22b中，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达各变体蛋白(见实验方法(3)～(4))，其中，C5D2和C5G2克隆均有较高量的表达，表达量分别为3mg/L和5mg/L(图3C)。

采用BLI方法(见实验方法(5))测定C5D2和C5G2分别与RBD相互作用的亲和力，C5D2与RBD相互作用的亲和力极强，超出仪器的测量范围(<1.0e-12)，C5G2相互作用的亲和力为KD＝1.62E-09M，比C5的亲和力提高了11倍(图3D～3E)。

本实施例通过再次筛选，得到了C5D2(SEQ ID NO:15)和C5G2(SEQ ID NO:16)两个克隆变体，其与RBD有较强的亲和力和较高蛋白的表达量，同时保留抑制S蛋白和人ACE2蛋白结合的功能。

实施例3C5D2和C5G2的功能鉴定

纯化的C5D2和C5G2可以分别抑制RBD蛋白和ACE2的结合。

通过竞争性ELISA实验，测定C5D2和C5G2分别对RBD蛋白和ACE2的结合的抑制作用。即用不同浓度的纳米抗体蛋白(C5D2和C5G2)与RBD竞争包被在NUNC Maxisorp 96孔板上的ACE2蛋白(见实验方法(2))，结果如图4A所示，测得的IC50值分别为28nM和88nM，说明在蛋白水平上，C5D2和C5G2抑制RBD蛋白和ACE2的结合功能；而作为阴性对照的D3蛋白(即图4A中的S-D3)，对RBD蛋白和ACE2的结合没有抑制作用。

实施例4假病毒实验测定C5D2和C5G2变体蛋白抑制新冠病毒(假)对人细胞的侵染

用纯化的纳米抗体蛋白(C5D2和C5G2)来保护BHK21细胞(表达人的ACE2蛋白)免受多种新冠病毒(假)的侵染(见实验方法(6))。其中，mNb6(纳米抗体，来自文献https://www.science.org/doi/10.1126/science.abe3255，作为一个头对头的对照抗体)和D3蛋白作为阴性对照。

结果如图4B所示。从图4B中可以看出，本发明的两个纳米抗体C5D2和C5G2对病毒的野生型(SARS-CoV-WT)以及Alpha，Beta及Gamma突变株均具有较强的中和作用，IC50值均在纳摩尔(nM)级别，同时效果也远远好于对照抗体mNb6。对于Delta突变株，本发明的抗体没有检测到中和功能，mNb6有弱中和能力。进一步证明了C5D2和C5G2变体抗体可以高效的抑制新冠病毒(假)对人的细胞的侵染。

实施例5C5D2和C5G2与新冠病毒变异菌株的RBD的交叉反应

A.C5D2和C5G2与6种新冠病毒变异菌株的RBD蛋白结合的ELISA结果

新冠病毒变异菌株是指在原始野生型新冠病毒SARS-CoV-2WT的基础上发生突变之后的菌株。本发明表达和纯化了6种流行的新冠病毒变异菌株的RBD蛋白，这6种新冠病毒变异菌株的名称和突变位点见图5A(下图)。用ELISA方法检测这6种新冠病毒变异菌株的RBD蛋白和本发明的纳米抗体的交叉反应，原始野生型新冠病毒的RBD蛋白(简称RBD-WT)和ACE2蛋白作为阳性对照，Fc为阴性对照。如图5A(上图)所示，D3纳米单抗与6种突变的RBD蛋白及RBD-WT均不结合，C5D2和C5G2除了不结合B.1.617.1之外，和其它5种突变的RBD蛋白及RBD-WT均有结合。而ACE2蛋白和所有的6种突变的RBD蛋白及RBD-WT均有结合。此结果提示，C5D2和C5G2纳米单抗具有比较广谱的抗病毒感染能力。

实施例6C5D2和C5G2与Delta突变株(B.1.617.2)RBD蛋白结合的亲和力测定

本发明采用BLI的方法(见实验方法(5))测定C5D2和C5G2与Delta突变株(B.1.617.2)RBD蛋白结合的亲和力，如图5B～5C所示，亲和力分别为KD＝1.31E-08M(C5D2)和KD＝8.31E-08M(C5G2)。虽然与RBD蛋白相比，亲和力有了一定程度的降低，但仍维持在一个亲和力较强的水平。

表1、本发明中的纳米抗体与RBD(野生型和Delta突变型)相互作用的亲和力测定与RBD-WT的亲和力：

与RBD-Delta(B.1.617.2)的亲和力：

纳米抗体C5，C5D2和C5G2的氨基酸序列如下所示：

>C5

DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGKYSHLGFLGWFRQAPGKEREGVAAGLGAYEDGYYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYCAALVVFSRDSPEFLAQNYWGQGTQVTVSS

>C5D2

DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGEYSQLRFLGWFRQAPGKEREGVAAGLGANEDGYYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYCAALVIFSHDGPEFLAQNYWGQGTQVTVSS

>C5G2

DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGKFSHLVFLGWFRQAPGKEREGVAAGLGAYESGYYADSVKGRFTVSLDNAENTVYLQMNSLKPEDTALYYCAALVVLSRDNTEFIAHNYWGQGTQVTVSS

纳米抗体C5，C5D2和C5G2的功能区划分如表2所示：

表2、纳米抗体C5，C5D2和C5G2的功能区划分表

本发明提供了新冠病毒的中和性抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

序列表

<110> 上海纳为生物技术有限公司

<120> 新冠病毒中和抗体及其制备方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Tyr Ser His Leu Gly Phe

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Leu Gly Ala Tyr Glu Asp Gly

1 5

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ala Leu Val Val Phe Ser Arg Asp Ser Pro Glu Phe Leu Ala Gln

1 5 10 15

Asn Tyr

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Tyr Ser Gln Leu Arg Phe

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Leu Gly Ala Asn Glu Asp Gly

1 5

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Ala Leu Val Ile Phe Ser His Asp Gly Pro Glu Phe Leu Ala Gln

1 5 10 15

Asn Tyr

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Lys Phe Ser His Leu Val Phe

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Leu Gly Ala Tyr Glu Ser Gly

1 5

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Ala Leu Val Val Leu Ser Arg Asp Asn Thr Glu Phe Ile Ala His

1 5 10 15

Asn Tyr

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 12

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Leu Asp Asn

1 5 10 15

Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Tyr Ser His Leu Gly

20 25 30

Phe Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Glu Asp Gly Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Leu Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Leu Val Val Phe Ser Arg Asp Ser Pro Glu Phe Leu Ala Gln

100 105 110

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 15

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Glu Tyr Ser Gln Leu Arg

20 25 30

Phe Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Gly Leu Gly Ala Asn Glu Asp Gly Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Leu Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Leu Val Ile Phe Ser His Asp Gly Pro Glu Phe Leu Ala Gln

100 105 110

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 16

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Phe Ser His Leu Val

20 25 30

Phe Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Glu Ser Gly Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Leu Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Leu Val Val Leu Ser Arg Asp Asn Thr Glu Phe Ile Ala His

100 105 110

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccagccggc gatggccatg gatgatgttc agctggttga a 41

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tggtggtgct cgagtgcggc cgcgctgcta acggtaactt g 41

Claims (12)

1.一种新冠病毒的中和抗体，包括CDR H1、CDR H2和CDR H3，其特征在于，

所述CDR H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CDR H2的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述CDR H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，

所述CDR H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述CDR H2的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述CDR H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或，

所述CDR H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述CDR H2的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示，所述CDR H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述中和抗体为VHH。

2.如权利要求1所述的中和抗体，其特征在于，所述中和抗体还包括骨架区，所述骨架区的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO:10所示的FR1，

SEQ ID NO:11所示的FR2，

SEQ ID NO:12所示的FR3，和

SEQ ID NO:13所示的FR4。

3.根据权利要求1或2所述的中和抗体，其特征在于，所述VHH的氨基酸序列如SEQ IDNO: 14~16任一所示。

4.一种核酸，其包含编码权利要求1-3任一项所述的中和抗体的核苷酸。

5.一种重组表达载体，其包含如权利要求4所述的核酸。

6.一种中和抗体噬菌体，其包括：噬菌体，以及展示于噬菌体表面的如权利要求1-3任一项所述的中和抗体。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的重组表达载体或整合有如权利要求4所述的核酸。

8.如权利要求1-3任一项所述的中和抗体或如权利要求4所述的核酸或如权利要求5所述的重组表达载体或如权利要求6所述的中和抗体噬菌体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物或在制备检测新冠病毒产品中的应用。

9.一种用于预防和/或治疗新冠病毒感染的药物组合物，其包括如权利要求1-3任一项所述的中和抗体或如权利要求4所述的核酸或如权利要求5所述的重组表达载体或如权利要求6所述的中和抗体噬菌体或如权利要求7所述的宿主细胞。

10.一种用于检测新冠病毒感染的试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述的中和抗体或如权利要求6所述的中和抗体噬菌体。

11.如权利要求1-3任一项所述的中和抗体的制备方法，包括：在能够产生所述中和抗体的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，从而获得所述中和抗体。

12.一种检测待测样品中新冠病毒存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括：

以权利要求1-3任一项所述的中和抗体作为新冠病毒的检测抗体，检测待测样品中新冠病毒的存在情况；并且，所述的方法为非诊断性的方法。