JP2002253259A - 抗ビスフェノールa抗体をコードする遺伝子、組換えタンパク質およびその製造方法 - Google Patents
抗ビスフェノールa抗体をコードする遺伝子、組換えタンパク質およびその製造方法Info
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- JP2002253259A JP2002253259A JP2001058673A JP2001058673A JP2002253259A JP 2002253259 A JP2002253259 A JP 2002253259A JP 2001058673 A JP2001058673 A JP 2001058673A JP 2001058673 A JP2001058673 A JP 2001058673A JP 2002253259 A JP2002253259 A JP 2002253259A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗ビスフェノールA抗体をコードするDN
A、前記DNAを用いて製造された組換えタンパク質及
び前記組換えタンパク質を用いるビスフェノールAの測
定方法等を提供すること。 【解決手段】 所定のアミノ酸配列からなる抗ビスフェ
ノールA抗体の重鎖又は軽鎖可変領域をコードするDN
A、所定の塩基配列からなり、抗ビスフェノールA抗体
の重鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA、及びこれ
らのDNAが変異した配列を有するDNAからなる群よ
り選ばれるDNAであって、かつビスフェノールAと相
互作用する組換えタンパク質を構成可能であるDNA、
前記DNAを含むベクター、前記ベクターを導入してな
る形質転換体、前記形質転換体を培養することを特徴と
する組換えタンパク質の製造方法及び製造された組換え
タンパク質、並びに前記組換えタンパク質を用いるビス
フェノールAの測定キット及び測定方法。
A、前記DNAを用いて製造された組換えタンパク質及
び前記組換えタンパク質を用いるビスフェノールAの測
定方法等を提供すること。 【解決手段】 所定のアミノ酸配列からなる抗ビスフェ
ノールA抗体の重鎖又は軽鎖可変領域をコードするDN
A、所定の塩基配列からなり、抗ビスフェノールA抗体
の重鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA、及びこれ
らのDNAが変異した配列を有するDNAからなる群よ
り選ばれるDNAであって、かつビスフェノールAと相
互作用する組換えタンパク質を構成可能であるDNA、
前記DNAを含むベクター、前記ベクターを導入してな
る形質転換体、前記形質転換体を培養することを特徴と
する組換えタンパク質の製造方法及び製造された組換え
タンパク質、並びに前記組換えタンパク質を用いるビス
フェノールAの測定キット及び測定方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、2 ,2 ’- ビス
(4 ’- オキシフェニル)プロパン( 以下、本明細書中
ではビスフェノールAと記載する) に対する抗体をコー
ドするDNA、特に抗体の可変領域をコードするDNA
等に関する。本発明は、さらに、前記DNAから発現し
た組換えタンパク質およびそれを用いるビスフェノール
Aの測定方法等に関する。
(4 ’- オキシフェニル)プロパン( 以下、本明細書中
ではビスフェノールAと記載する) に対する抗体をコー
ドするDNA、特に抗体の可変領域をコードするDNA
等に関する。本発明は、さらに、前記DNAから発現し
た組換えタンパク質およびそれを用いるビスフェノール
Aの測定方法等に関する。
【0002】
【従来の技術】ビスフェノールAは、下記式(1):
【化1】 で表される構造を有する化合物であり、ポリカーボネー
トおよびエポキシ樹脂の原料モノマーとして広く用いら
れている。ビスフェノールAは、工場廃水やプラスチッ
ク製品、または産業廃棄物置き場から水環境中に流出
し、しばしば環境を汚染するが、本化合物が外因性内分
泌撹乱化学物質であると指摘されていることから、その
モニタリングが重要な課題となっている。
トおよびエポキシ樹脂の原料モノマーとして広く用いら
れている。ビスフェノールAは、工場廃水やプラスチッ
ク製品、または産業廃棄物置き場から水環境中に流出
し、しばしば環境を汚染するが、本化合物が外因性内分
泌撹乱化学物質であると指摘されていることから、その
モニタリングが重要な課題となっている。
【0003】従来、ビスフェノールAを始めとする化学
物質の測定には化学分析法が用いられてきた。例えば、
ビスフェノールAの水中濃度をモニタリングする場合に
は、試料から抽出・精製後、ガスクロマトグラフィーを
用いて測定されてきた。化学分析は、精度の点では問題
はないものの操作が煩雑で測定に時問がかかるため、よ
り迅速、簡便かつ経済的にモニタリングすることのでき
る新しい測定法の開発が求められていた。
物質の測定には化学分析法が用いられてきた。例えば、
ビスフェノールAの水中濃度をモニタリングする場合に
は、試料から抽出・精製後、ガスクロマトグラフィーを
用いて測定されてきた。化学分析は、精度の点では問題
はないものの操作が煩雑で測定に時問がかかるため、よ
り迅速、簡便かつ経済的にモニタリングすることのでき
る新しい測定法の開発が求められていた。
【0004】一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を
利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れてい
るばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法であ
る。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の
病態解析法の一つとして大きな役割を担ってきたが、ビ
スフェノールAのような環境負荷化学物質の測定へも適
用が進んでいる。ビスフェノールAにおいてもすでに抗
体が調製され免疫学的測定法の開発が行われた。
利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れてい
るばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法であ
る。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の
病態解析法の一つとして大きな役割を担ってきたが、ビ
スフェノールAのような環境負荷化学物質の測定へも適
用が進んでいる。ビスフェノールAにおいてもすでに抗
体が調製され免疫学的測定法の開発が行われた。
【0005】一般に、抗体を構成する免疫グロブリン
は、分子量5万〜7万の重鎖(H鎖とも言う) と2万〜3
万の軽鎖(L鎖ともいう) とから構成される。免疫グロブ
リンの基本となるペプチド鎖構造は、それぞれ相同な2
本の重鎖および2本の軽鎖が、ジスルフィド結合および
非共有結合することによって構成される。分子量は15
万〜19万である。重鎖、軽鎖ともにN 末端に位置する
領域は可変領域と呼ばれ、同一個体から得られた免疫グ
ロブリンであっても、各分子毎にそのアミノ酸配列が異
なる。一方、これよりC 末端側のアミノ酸配列は定常領
域(または「Fc領域」) と呼ばれ、各分子毎でほぼ一定
である。抗体の抗原結合部位は重鎖および軽鎖の可変領
域によって構成され、結合の反応性や特異性はこの部位
のアミノ酸配列で決まる。可変領域のうち特に違いが著
しい部分を超可変領域という。
は、分子量5万〜7万の重鎖(H鎖とも言う) と2万〜3
万の軽鎖(L鎖ともいう) とから構成される。免疫グロブ
リンの基本となるペプチド鎖構造は、それぞれ相同な2
本の重鎖および2本の軽鎖が、ジスルフィド結合および
非共有結合することによって構成される。分子量は15
万〜19万である。重鎖、軽鎖ともにN 末端に位置する
領域は可変領域と呼ばれ、同一個体から得られた免疫グ
ロブリンであっても、各分子毎にそのアミノ酸配列が異
なる。一方、これよりC 末端側のアミノ酸配列は定常領
域(または「Fc領域」) と呼ばれ、各分子毎でほぼ一定
である。抗体の抗原結合部位は重鎖および軽鎖の可変領
域によって構成され、結合の反応性や特異性はこの部位
のアミノ酸配列で決まる。可変領域のうち特に違いが著
しい部分を超可変領域という。
【0006】しかし、免疫学的測定法は、その開発に必
須な抗体の調製に時間と労力を必要とする。抗体には一
般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中
に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナ
ル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマ
の分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナ
ル抗体がある。これらの抗体は反応性において十分な性
能を持つが、前者のポリクローナル抗体では調製の都度
動物を用いて長期間免疫しなければならないこと、また
調製ロットごとに反応性が異なる問題点があった。また
後者のモノクローナル抗体ではハイブリドーマの扱いに
習熟しなければならず、抗体の調製に時間とコストがか
かる問題点があった。免疫学的測定法はそれ自体非常に
優れた分析法といえるが、上記のように抗体の調製が煩
雑なためにより安価で安定した抗体の大量調製法が望ま
れてきた。
須な抗体の調製に時間と労力を必要とする。抗体には一
般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中
に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナ
ル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマ
の分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナ
ル抗体がある。これらの抗体は反応性において十分な性
能を持つが、前者のポリクローナル抗体では調製の都度
動物を用いて長期間免疫しなければならないこと、また
調製ロットごとに反応性が異なる問題点があった。また
後者のモノクローナル抗体ではハイブリドーマの扱いに
習熟しなければならず、抗体の調製に時間とコストがか
かる問題点があった。免疫学的測定法はそれ自体非常に
優れた分析法といえるが、上記のように抗体の調製が煩
雑なためにより安価で安定した抗体の大量調製法が望ま
れてきた。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】これらの問題を解決す
る方法として、近年開発が進んでいる遺伝子工学的な抗
体製造法が考えられる。しかし、ビスフェノールAに対
する抗体に関しては、これまで遺伝子工学的に製造され
たことがないばかりでなく、ビスフェノールAとの結合
領域のアミノ酸配列もまったく明らかになっていなかっ
た。
る方法として、近年開発が進んでいる遺伝子工学的な抗
体製造法が考えられる。しかし、ビスフェノールAに対
する抗体に関しては、これまで遺伝子工学的に製造され
たことがないばかりでなく、ビスフェノールAとの結合
領域のアミノ酸配列もまったく明らかになっていなかっ
た。
【0008】そこで、本発明の目的は、抗ビスフェノー
ルA抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードす
るDNAを提供することにある。
ルA抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードす
るDNAを提供することにある。
【0009】また、本発明は、前記DNAを含むベクタ
ーおよび当該ベクターを導入した形質転換体を提供する
ことにある。
ーおよび当該ベクターを導入した形質転換体を提供する
ことにある。
【0010】また、本発明は、前記形質転換体を用いた
抗ビスフェノールAの重鎖および/または軽鎖の可変領
域の製造方法および製造された組換えタンパク質を提供
することにある。
抗ビスフェノールAの重鎖および/または軽鎖の可変領
域の製造方法および製造された組換えタンパク質を提供
することにある。
【0011】さらに、本発明は、前記組換えタンパク質
を用いたビスフェノールAの測定方法および測定キット
を提供することにある。
を用いたビスフェノールAの測定方法および測定キット
を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく、ビスフェノールAに対する抗体のDNA
の分離およびその抗原結合領域のアミノ酸配列の解明に
成功し、本発明を完成するに至った。
を達成すべく、ビスフェノールAに対する抗体のDNA
の分離およびその抗原結合領域のアミノ酸配列の解明に
成功し、本発明を完成するに至った。
【0013】すなわち、本発明は、(a) 配列番号:
2、4、6、8、10、12、14または16に記載の
アミノ酸配列からなる抗ビスフェノールA抗体の重鎖可
変領域または軽鎖可変領域をコードするDNA、(b)
配列番号:2、4、6、8、10、12、14または
16に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のア
ミノ酸残基が欠失、置換および/または付加された配列
からなるペプチドをコードするDNA、(c) 配列番
号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載
の塩基配列からなり、抗ビスフェノールA抗体の重鎖可
変領域または軽鎖可変領域をコードするDNA、(d)
配列番号:1、3、5、7、9、11、13または1
5に記載の塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠
失、置換および/または付加された配列からなるDN
A、ならびに(e) 配列番号:1、3、5、7、9、
11、13または15に記載の塩基配列からなるDNA
の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するDNA、からなる群より選ばれるDNAであって、
かつビスフェノールAと相互作用する組換えタンパク質
を構成可能であるDNAに関する。
2、4、6、8、10、12、14または16に記載の
アミノ酸配列からなる抗ビスフェノールA抗体の重鎖可
変領域または軽鎖可変領域をコードするDNA、(b)
配列番号:2、4、6、8、10、12、14または
16に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のア
ミノ酸残基が欠失、置換および/または付加された配列
からなるペプチドをコードするDNA、(c) 配列番
号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載
の塩基配列からなり、抗ビスフェノールA抗体の重鎖可
変領域または軽鎖可変領域をコードするDNA、(d)
配列番号:1、3、5、7、9、11、13または1
5に記載の塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠
失、置換および/または付加された配列からなるDN
A、ならびに(e) 配列番号:1、3、5、7、9、
11、13または15に記載の塩基配列からなるDNA
の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するDNA、からなる群より選ばれるDNAであって、
かつビスフェノールAと相互作用する組換えタンパク質
を構成可能であるDNAに関する。
【0014】本発明のDNAは、抗ビスフェノールA抗
体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするDN
Aである。前記可変領域とは、ビスフェノールAに特異
的に結合する部位をいう。抗体の起源としては特に制限
されず、抗体作製に用いられる通常の実験動物が挙げら
れるが、モノクローナル抗体の作製に汎用されているマ
ウスが好ましい。
体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするDN
Aである。前記可変領域とは、ビスフェノールAに特異
的に結合する部位をいう。抗体の起源としては特に制限
されず、抗体作製に用いられる通常の実験動物が挙げら
れるが、モノクローナル抗体の作製に汎用されているマ
ウスが好ましい。
【0015】具体的には、配列番号:2、4、6、8、
10、12、14または16に記載のアミノ酸配列から
なるペプチドをコードするDNA、より具体的には、配
列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に
記載の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
10、12、14または16に記載のアミノ酸配列から
なるペプチドをコードするDNA、より具体的には、配
列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に
記載の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【0016】なお、配列番号:2、4、6、8、10、
12、14または16に記載のアミノ酸配列において1
もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換および/また
は付加された配列からなるペプチドをコードするDN
A、あるいは、配列番号:1、3、5、7、9、11、
13または15に記載の塩基配列において1もしくは複
数の塩基が欠失、置換および/または付加された配列か
らなるDNAであっても、ビスフェノールAと相互作用
する組換えタンパク質を構成可能である限り本発明のD
NAに含まれる。
12、14または16に記載のアミノ酸配列において1
もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換および/また
は付加された配列からなるペプチドをコードするDN
A、あるいは、配列番号:1、3、5、7、9、11、
13または15に記載の塩基配列において1もしくは複
数の塩基が欠失、置換および/または付加された配列か
らなるDNAであっても、ビスフェノールAと相互作用
する組換えタンパク質を構成可能である限り本発明のD
NAに含まれる。
【0017】ここで、「ビスフェノールAと相互作用す
る組換えタンパク質を構成可能である」とは、本発明の
DNAから転写・翻訳される組換えタンパク質がビスフ
ェノールAに特異的に結合する部位を形成することがで
きることをいう。
る組換えタンパク質を構成可能である」とは、本発明の
DNAから転写・翻訳される組換えタンパク質がビスフ
ェノールAに特異的に結合する部位を形成することがで
きることをいう。
【0018】前記アミノ酸残基および塩基の欠失、置換
または付加を行なう手法は、例えば、部位特異的突然変
異誘発(Methods in Enzymology, 100, 448 (1983)) や
PCR(Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, New York,(1989); "PCR A Practical Appro
ach" IRL Press (1989))により、当業者ならば容易に行
なうことができる。
または付加を行なう手法は、例えば、部位特異的突然変
異誘発(Methods in Enzymology, 100, 448 (1983)) や
PCR(Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, New York,(1989); "PCR A Practical Appro
ach" IRL Press (1989))により、当業者ならば容易に行
なうことができる。
【0019】さらに、本発明のDNAは、配列番号:
1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩
基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするDNAであって、かつビスフ
ェノールAと相互作用する組換えタンパク質を構成可能
であるものも包含する。
1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩
基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするDNAであって、かつビスフ
ェノールAと相互作用する組換えタンパク質を構成可能
であるものも包含する。
【0020】本明細書において、「ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、6×SS
C(20×SSCは、333mMクエン酸ナトリウム、
333mMNaClを示す)、0.5%SDSおよび50
%ホルムアミドの溶液中で42℃にて加温した後、0.1
×SSC、0.5%SDSの溶液中で68℃にて洗浄する
条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが
観察されることをいう。
条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、6×SS
C(20×SSCは、333mMクエン酸ナトリウム、
333mMNaClを示す)、0.5%SDSおよび50
%ホルムアミドの溶液中で42℃にて加温した後、0.1
×SSC、0.5%SDSの溶液中で68℃にて洗浄する
条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが
観察されることをいう。
【0021】本発明は、前記DNAを含むベクターに関
する。含まれるDNAは、1種でも2種でもよく、2種
のDNAの間に介在配列を有していてもよい。介在配列
は、後述するリンカーをコードするDNAが好ましい。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベク
ター、コスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げら
れるが、取り扱いやすさという観点からプラスミドベク
ターが好ましい。
する。含まれるDNAは、1種でも2種でもよく、2種
のDNAの間に介在配列を有していてもよい。介在配列
は、後述するリンカーをコードするDNAが好ましい。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベク
ター、コスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げら
れるが、取り扱いやすさという観点からプラスミドベク
ターが好ましい。
【0022】前記ベクターとしては、市販品または公知
のものを使用することができ、細菌発現用ベクターとし
ては、pET 、pGEX、pBADなど、酵母発現用ベクターとし
ては、pYES、pYC など、動物細胞発現用ベクターとして
は、pSin、pGene など、昆虫細胞発現用ベクターとして
は、pIZ 、pIB など、植物細胞発現用ベクターとして
は、pBI121などが挙げられる。
のものを使用することができ、細菌発現用ベクターとし
ては、pET 、pGEX、pBADなど、酵母発現用ベクターとし
ては、pYES、pYC など、動物細胞発現用ベクターとして
は、pSin、pGene など、昆虫細胞発現用ベクターとして
は、pIZ 、pIB など、植物細胞発現用ベクターとして
は、pBI121などが挙げられる。
【0023】前記発現用ベクターには、哺乳動物、微生
物、ウイルスまたは昆虫等の遺伝子から誘導された適当
な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列が含まれてい
る。調節配列の例としては、遺伝子発現に調節的役割を
持つ配列(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)
、所望であれば転写を制御するためのオペレーター配
列、mRNAリボソーム結合部位をコードする配列、転写や
翻訳の開始および終止を制御する適当な配列ならびにシ
グナルペプチドをコードする配列等が含まれる。
物、ウイルスまたは昆虫等の遺伝子から誘導された適当
な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列が含まれてい
る。調節配列の例としては、遺伝子発現に調節的役割を
持つ配列(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)
、所望であれば転写を制御するためのオペレーター配
列、mRNAリボソーム結合部位をコードする配列、転写や
翻訳の開始および終止を制御する適当な配列ならびにシ
グナルペプチドをコードする配列等が含まれる。
【0024】これらの調節配列が抗体可変領域のDNA
の発現に関係する場合は、これらの配列が適当な配置で
連結している。例えば、プロモーターの塩基配列は抗体
可変領域の塩基配列の転写を制御するように、リボソー
ム結合部位は翻訳を促進するようにまた、シグナルペプ
チドをコードする配列は翻訳後の抗体可変領域の分泌を
促進するように配置している。
の発現に関係する場合は、これらの配列が適当な配置で
連結している。例えば、プロモーターの塩基配列は抗体
可変領域の塩基配列の転写を制御するように、リボソー
ム結合部位は翻訳を促進するようにまた、シグナルペプ
チドをコードする配列は翻訳後の抗体可変領域の分泌を
促進するように配置している。
【0025】前記ベクターに本発明のDNAを連結する
には、当業者であれば前記モレキュラークローニング
(Molecular Cloning)等に記載された公知の方法で容易
に行うことができる。
には、当業者であれば前記モレキュラークローニング
(Molecular Cloning)等に記載された公知の方法で容易
に行うことができる。
【0026】また、本発明は、前記ベクターを導入した
形質転換体に関する。本発明の形質転換体は、前記ベク
ターを所望の宿主細胞に導入することにより得られるも
のである。宿主細胞としては、抗体の可変領域組換えタ
ンパク質の発現が可能であれば特に制限されず、原核生
物、真菌またはより高度な真核生物細胞が含まれる。原
核生物にはグラム陰性またはグラム陽性の細菌、例え
ば、大腸菌や枯草菌など多くの種が含まれる。真菌に
は、例えばサッカロミセスが含まれる。より高度な真核
生物細胞には、哺乳動物、昆虫、植物などを起源とする
確立された細胞系が含まれる。宿主細胞は、用いるベク
ターに応じて選ばれる。
形質転換体に関する。本発明の形質転換体は、前記ベク
ターを所望の宿主細胞に導入することにより得られるも
のである。宿主細胞としては、抗体の可変領域組換えタ
ンパク質の発現が可能であれば特に制限されず、原核生
物、真菌またはより高度な真核生物細胞が含まれる。原
核生物にはグラム陰性またはグラム陽性の細菌、例え
ば、大腸菌や枯草菌など多くの種が含まれる。真菌に
は、例えばサッカロミセスが含まれる。より高度な真核
生物細胞には、哺乳動物、昆虫、植物などを起源とする
確立された細胞系が含まれる。宿主細胞は、用いるベク
ターに応じて選ばれる。
【0027】ベクターを導入する方法としては、例え
ば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEA
Eデキストラン法、エレクトロポレーション法(F.M.Au
subelらの編纂によるCurrent Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons(1987))等の公知の方法を
用いればよい。
ば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEA
Eデキストラン法、エレクトロポレーション法(F.M.Au
subelらの編纂によるCurrent Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons(1987))等の公知の方法を
用いればよい。
【0028】また、本発明は、前記形質転換体を培養
し、当該培養物から抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変
領域および/または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク
質を回収する工程を含む、抗ビスフェノールA抗体の重
鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含有する組換
えタンパク質を製造する方法に関する。
し、当該培養物から抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変
領域および/または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク
質を回収する工程を含む、抗ビスフェノールA抗体の重
鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含有する組換
えタンパク質を製造する方法に関する。
【0029】形質転換体の培養は、宿主細胞およびベク
ターに応じて常法により行うことができる。組換えタン
パク質の回収は、培養細胞もしくは培養液から、タンパ
ク質の抽出、濃縮、精製等の公知の技術を用いて行うこ
とができる。具体的には、抗体可変領域の組換えタンパ
ク質は、凍結融解循環、音波処理、機械的崩壊または細
胞溶解剤を用いて抽出することができる。また、限外ろ
過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフ
ィーなどを用いて濃縮・精製することができる。これら
の濃縮・精製法を適当に組み合わせて組換えタンパク質
を調製する。
ターに応じて常法により行うことができる。組換えタン
パク質の回収は、培養細胞もしくは培養液から、タンパ
ク質の抽出、濃縮、精製等の公知の技術を用いて行うこ
とができる。具体的には、抗体可変領域の組換えタンパ
ク質は、凍結融解循環、音波処理、機械的崩壊または細
胞溶解剤を用いて抽出することができる。また、限外ろ
過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフ
ィーなどを用いて濃縮・精製することができる。これら
の濃縮・精製法を適当に組み合わせて組換えタンパク質
を調製する。
【0030】また、本発明は、前記方法によって製造さ
れた、抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域および/
または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質に関する。
抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域
は、リンカーで連結していることが好ましい。
れた、抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域および/
または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質に関する。
抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域
は、リンカーで連結していることが好ましい。
【0031】本発明においては、前記重鎖可変領域およ
び軽鎖可変領域をコードするDNAをリンカーをコード
するDNAで繋いでベクターに挿入したものを宿主細胞
内で発現させることにより、抗原結合能を持った一本鎖
の組換え抗体タンパク質(scFv)が得られる。
び軽鎖可変領域をコードするDNAをリンカーをコード
するDNAで繋いでベクターに挿入したものを宿主細胞
内で発現させることにより、抗原結合能を持った一本鎖
の組換え抗体タンパク質(scFv)が得られる。
【0032】前記リンカーとしては、限定されるわけで
はないが、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号:29)が
タンデムに繰り返された配列が挙げられ、好ましい繰り
返し回数は3回である。リンカーをコードするDNAは
特に限定されないが、6塩基〜60塩基程度が好まし
い。より具体的には、前記アミノ酸残基の繰り返し配
列、例えばこのようなリンカーをコードするDNAとし
て、Linker Primer Mix (アマシャムファルマシアバイ
オテク)を使用することができる。
はないが、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号:29)が
タンデムに繰り返された配列が挙げられ、好ましい繰り
返し回数は3回である。リンカーをコードするDNAは
特に限定されないが、6塩基〜60塩基程度が好まし
い。より具体的には、前記アミノ酸残基の繰り返し配
列、例えばこのようなリンカーをコードするDNAとし
て、Linker Primer Mix (アマシャムファルマシアバイ
オテク)を使用することができる。
【0033】また、本発明の組換えタンパク質は、可変
領域をコードするDNAを他のタンパク質またはペプチ
ドをコードするDNAと連結させて発現させることによ
り、融合タンパク質としてもよい。このような融合タン
パク質は、可変領域ポリペプチドのN末端領域のシグナ
ルまたはリーダーペプチドを含む。シグナルペプチド
は、ポリペプチド鎖の翻訳後にその合成部位から細胞膜
または細胞壁の外側への分泌を促進する。限定されるわ
けではないが、実施例5に記載のpET-27b ベクターには
シグナルペプチドをコードするDNAとして、pelBシグ
ナル配列を含む。
領域をコードするDNAを他のタンパク質またはペプチ
ドをコードするDNAと連結させて発現させることによ
り、融合タンパク質としてもよい。このような融合タン
パク質は、可変領域ポリペプチドのN末端領域のシグナ
ルまたはリーダーペプチドを含む。シグナルペプチド
は、ポリペプチド鎖の翻訳後にその合成部位から細胞膜
または細胞壁の外側への分泌を促進する。限定されるわ
けではないが、実施例5に記載のpET-27b ベクターには
シグナルペプチドをコードするDNAとして、pelBシグ
ナル配列を含む。
【0034】本発明の組換えタンパク質は、可変領域を
コードするDNAと定常領域をコードするDNAとを結
合させて発現させたものであってもよい。定常領域は、
可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、ある
いは異なる抗体に由来するものであってもよい。抗体の
定常領域は、プロテインAまたはプロテインGと結合す
ることができ、また、定常領域への特異抗体によって認
識される。この特性は、組換えタンパク質の検出・分離
・精製に有効である。
コードするDNAと定常領域をコードするDNAとを結
合させて発現させたものであってもよい。定常領域は、
可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、ある
いは異なる抗体に由来するものであってもよい。抗体の
定常領域は、プロテインAまたはプロテインGと結合す
ることができ、また、定常領域への特異抗体によって認
識される。この特性は、組換えタンパク質の検出・分離
・精製に有効である。
【0035】また、本発明は、前記組換えタンパク質を
含むビスフェノールAの測定キットに関する。本発明の
測定キットは、ビスフェノールAに特異的に結合する組
換えタンパク質を含むことにより、ビスフェノールAを
簡便に測定することができ、後述のビスフェノールAの
測定方法に好適に使用することができる。前記キット
は、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もし
くは標識されたビスフェノールA、緩衝液、検出試薬お
よび/またはビスフェノールA標準溶液等を含む。
含むビスフェノールAの測定キットに関する。本発明の
測定キットは、ビスフェノールAに特異的に結合する組
換えタンパク質を含むことにより、ビスフェノールAを
簡便に測定することができ、後述のビスフェノールAの
測定方法に好適に使用することができる。前記キット
は、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もし
くは標識されたビスフェノールA、緩衝液、検出試薬お
よび/またはビスフェノールA標準溶液等を含む。
【0036】さらに、本発明は、前記組換えタンパク質
またはキットを用いることを特徴とするビスフェノール
Aの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原
−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放
射性同位元素免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法
(ELISA)、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イ
ムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol.,
92, 147-523 (1983) ,Antibodies Vol.II IRL Press O
xford (1989)) が挙げられるが、感度や簡便性等の点か
らELISAが好ましい。ELISAに用いる酵素とし
ては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーアゼ等が挙げられ
る。
またはキットを用いることを特徴とするビスフェノール
Aの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原
−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放
射性同位元素免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法
(ELISA)、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イ
ムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol.,
92, 147-523 (1983) ,Antibodies Vol.II IRL Press O
xford (1989)) が挙げられるが、感度や簡便性等の点か
らELISAが好ましい。ELISAに用いる酵素とし
ては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーアゼ等が挙げられ
る。
【0037】測定対象であるビスフェノールAには、前
記式(1) で表される化合物そのものばかりでなく、環境
中で分解されてビスフェノールAと同様の構造を有する
化合物も含まれる。
記式(1) で表される化合物そのものばかりでなく、環境
中で分解されてビスフェノールAと同様の構造を有する
化合物も含まれる。
【0038】[ 作用効果 ]本発明により、反応性、安定
性に優れる抗ビスフェノールA抗体を遺伝子工学的に大
量かつ安価に調製することができる。本発明により製造
された組換えタンパク質を用いたビスフェノールAの免
疫学的測定法は、感度、特異性および操作の簡便性にす
ぐれ、かつコストも低く押えられる。
性に優れる抗ビスフェノールA抗体を遺伝子工学的に大
量かつ安価に調製することができる。本発明により製造
された組換えタンパク質を用いたビスフェノールAの免
疫学的測定法は、感度、特異性および操作の簡便性にす
ぐれ、かつコストも低く押えられる。
【0039】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を詳細
に説明する。
に説明する。
【0040】(1)モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの作製と抗体の作製 ビスフェノールAは、単独では免疫原性を有しないた
め、ビスフェノールAハプテンと牛血清アルブミン(BS
A)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン、ス
カシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫
グロブリン等のタンパク質に結合させたものを免疫原と
して用いる。以下、Antibodies; A Laboratory Manual,
Lane,H,D.ら編,Cold Spring Harber Laboratory Press
出版 New York 1989年などに記載の方法に準じて行い、
Balb/cマウスを例にして説明する。前記のように
調製した免疫原を2mg/ml程度になるように生理的
リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した
後、Balb/cマウスに腹腔内に投与する。その後、
2週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血
清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出
し、DMEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地)を入
れたシャーレ内で前記脾臓から細胞を取り出す。培地を
遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させ、脾臓細胞が浮
遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を低速で
遠心分離して細胞を集め、脾臓細胞を調製する。マウス
のミエローマ細胞(P3×63Ag8.653)を細胞
数の比で5:1(ミエローマ細胞:脾臓細胞)になるよ
うに混合し、低速で遠心分離して細胞を集める。沈殿細
胞をほぐした後、37℃に温めておいた50%ポリエチ
レングリコール(分子量1,500)溶液1mlをゆっ
くり加え細胞融合を行う。細胞融合後、DMEM培地9
mlを加え、さらに含牛胎児血清DMEM培地40ml
を添加する。遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が
5×105 個/mlになるようにHAT培地を加えて懸
濁し、細胞懸濁液を96穴プラスチックプレートに25
0μl/ウェルの量で分注して、37℃、5%炭酸ガ
ス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。1週
間後、ウェル中の培地の半量をHAT培地で置換して、
10日から14日間培養する。培養液中の抗体の活性を
ELISAで調べ、目的とする抗体を産生しているウェ
ルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマの
クローニングを行う。クローニングにより、抗ビスフェ
ノールA抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を
得る。これらの株をそれぞれBBA−2187、BBA
−2617、BBE−4280、BKE−3430、B
KE−4265およびBTE−3456と名付け、この
ハイブリドーマ株をDMEMに10%牛胎児血清を含む
培地で培養する。培養液の遠心上清をモノクローナル抗
体溶液とし、それぞれ「モノクローナル抗体BBA−2
187」(以下単に「抗体BBA−2187」とい
う)、「モノクローナル抗体BBA−2617」(以下
単に「抗体BBA−2617」という)、「モノクロー
ナル抗体BBE−4280」(以下単に「抗体BBE−
4280」という)、「モノクローナル抗体BKE−3
430」(以下単に「 抗体BKE−3430」 とい
う)、「モノクローナル抗体BKE−4265」 (以
下単に「 抗体BKE−4265」という)および「モ
ノクローナル抗体BTE−3456」(以下単に「 抗
体BTE−3456」という)とした。
ーマの作製と抗体の作製 ビスフェノールAは、単独では免疫原性を有しないた
め、ビスフェノールAハプテンと牛血清アルブミン(BS
A)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン、ス
カシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫
グロブリン等のタンパク質に結合させたものを免疫原と
して用いる。以下、Antibodies; A Laboratory Manual,
Lane,H,D.ら編,Cold Spring Harber Laboratory Press
出版 New York 1989年などに記載の方法に準じて行い、
Balb/cマウスを例にして説明する。前記のように
調製した免疫原を2mg/ml程度になるように生理的
リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した
後、Balb/cマウスに腹腔内に投与する。その後、
2週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血
清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出
し、DMEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地)を入
れたシャーレ内で前記脾臓から細胞を取り出す。培地を
遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させ、脾臓細胞が浮
遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を低速で
遠心分離して細胞を集め、脾臓細胞を調製する。マウス
のミエローマ細胞(P3×63Ag8.653)を細胞
数の比で5:1(ミエローマ細胞:脾臓細胞)になるよ
うに混合し、低速で遠心分離して細胞を集める。沈殿細
胞をほぐした後、37℃に温めておいた50%ポリエチ
レングリコール(分子量1,500)溶液1mlをゆっ
くり加え細胞融合を行う。細胞融合後、DMEM培地9
mlを加え、さらに含牛胎児血清DMEM培地40ml
を添加する。遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が
5×105 個/mlになるようにHAT培地を加えて懸
濁し、細胞懸濁液を96穴プラスチックプレートに25
0μl/ウェルの量で分注して、37℃、5%炭酸ガ
ス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。1週
間後、ウェル中の培地の半量をHAT培地で置換して、
10日から14日間培養する。培養液中の抗体の活性を
ELISAで調べ、目的とする抗体を産生しているウェ
ルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマの
クローニングを行う。クローニングにより、抗ビスフェ
ノールA抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を
得る。これらの株をそれぞれBBA−2187、BBA
−2617、BBE−4280、BKE−3430、B
KE−4265およびBTE−3456と名付け、この
ハイブリドーマ株をDMEMに10%牛胎児血清を含む
培地で培養する。培養液の遠心上清をモノクローナル抗
体溶液とし、それぞれ「モノクローナル抗体BBA−2
187」(以下単に「抗体BBA−2187」とい
う)、「モノクローナル抗体BBA−2617」(以下
単に「抗体BBA−2617」という)、「モノクロー
ナル抗体BBE−4280」(以下単に「抗体BBE−
4280」という)、「モノクローナル抗体BKE−3
430」(以下単に「 抗体BKE−3430」 とい
う)、「モノクローナル抗体BKE−4265」 (以
下単に「 抗体BKE−4265」という)および「モ
ノクローナル抗体BTE−3456」(以下単に「 抗
体BTE−3456」という)とした。
【0041】(2)本発明のDNAの調製方法 本発明のDNAは、前記のような抗ビスフェノールAモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得るこ
とができるが、抗ビスフェノールA抗体を産生する細胞
であればいずれの細胞を用いてもよく限定されない。例
えば、ハイブリドーマの他に免疫した動物のBリンパ球
などからも得ることができる。
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得るこ
とができるが、抗ビスフェノールA抗体を産生する細胞
であればいずれの細胞を用いてもよく限定されない。例
えば、ハイブリドーマの他に免疫した動物のBリンパ球
などからも得ることができる。
【0042】まず、モレキュラークローニング等に記載
の公知の方法に準じてmRNAを調製し、逆転写酵素を
用いて一本鎖cDNAを合成する。その後、PCR、c
DNAライブラリー法等を用いることによって、本発明
のDNAを単離する。次に、単離した抗ビスフェノール
Aモノクローナル抗体DNAの重鎖および軽鎖可変領域
をコードする塩基配列を決定する。また、本発明のDN
Aは、決定された塩基配列に基づき、公知の技術を用い
て化学的に合成してもよい。
の公知の方法に準じてmRNAを調製し、逆転写酵素を
用いて一本鎖cDNAを合成する。その後、PCR、c
DNAライブラリー法等を用いることによって、本発明
のDNAを単離する。次に、単離した抗ビスフェノール
Aモノクローナル抗体DNAの重鎖および軽鎖可変領域
をコードする塩基配列を決定する。また、本発明のDN
Aは、決定された塩基配列に基づき、公知の技術を用い
て化学的に合成してもよい。
【0043】本発明においては、後述する実施例に記載
のように、前記ハイブリドーマBBA−2187、BB
A−2617、BKE−3430およびBTE−345
6を培養し、培養細胞から抽出したmRNAを基に、5
’−RACE(5’-Rapid Amplification of cDNA End
s)法により抗ビスフェノールAモノクローナル抗体をコ
ードするcDNAを調製する。
のように、前記ハイブリドーマBBA−2187、BB
A−2617、BKE−3430およびBTE−345
6を培養し、培養細胞から抽出したmRNAを基に、5
’−RACE(5’-Rapid Amplification of cDNA End
s)法により抗ビスフェノールAモノクローナル抗体をコ
ードするcDNAを調製する。
【0044】前記ハイブリドーマから調製できた抗ビス
フェノールA抗体DNAの重鎖可変領域の塩基配列およ
びアミノ酸配列を配列表に示す。配列番号:1および2
は、前記ハイブリドーマBBA−2187由来の重鎖可
変領域をコードするDNAの塩基配列およびそのアミノ
酸配列を記す。配列番号:3および4は、前記ハイブリ
ドーマBBA−2617由来の重鎖可変領域をコードす
るDNAの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記す。配
列番号:5および6は、前記ハイブリドーマBKE−3
430由来の重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配
列およびそのアミノ酸配列を記す。配列表の配列番号:
7および8は、前記ハイブリドーマBTE−3456由
来の重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列および
そのアミノ酸配列を記す。これら4つの重鎖可変領域の
配列の相同性をアミノ酸レベルで比較すると、BBA−
2187を基準にしてBBA−2617は98%、BK
E−3430は45%、BTE−3456は92%の相
同性を示す。
フェノールA抗体DNAの重鎖可変領域の塩基配列およ
びアミノ酸配列を配列表に示す。配列番号:1および2
は、前記ハイブリドーマBBA−2187由来の重鎖可
変領域をコードするDNAの塩基配列およびそのアミノ
酸配列を記す。配列番号:3および4は、前記ハイブリ
ドーマBBA−2617由来の重鎖可変領域をコードす
るDNAの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記す。配
列番号:5および6は、前記ハイブリドーマBKE−3
430由来の重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配
列およびそのアミノ酸配列を記す。配列表の配列番号:
7および8は、前記ハイブリドーマBTE−3456由
来の重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列および
そのアミノ酸配列を記す。これら4つの重鎖可変領域の
配列の相同性をアミノ酸レベルで比較すると、BBA−
2187を基準にしてBBA−2617は98%、BK
E−3430は45%、BTE−3456は92%の相
同性を示す。
【0045】重鎖可変領域にはアミノ酸配列が特に異な
る3個所の超可変領域があり、それぞれH1、H2およ
びH3と呼ばれる。BBA−2187の重鎖(配列番
号:2)においてはアミノ酸残基26−36、51−6
6および99−108、BBA−2617の重鎖(配列
番号:4)においてはアミノ酸残基26−36、51−
66および99−108、BKE−3430の重鎖(配
列番号:6)においてはアミノ酸残基26−35、50
−66および99−111、BTE−3456の重鎖
(配列番号:8)においてはアミノ酸残基26−36、
51−66および99−108が超可変領域に相当す
る。一般に、免疫グロブリンにおいて超可変領域はその
立体構造上で相互に近接して抗原結合部位を構成してお
り、この領域によって抗原に対する反応性が決定され
る。
る3個所の超可変領域があり、それぞれH1、H2およ
びH3と呼ばれる。BBA−2187の重鎖(配列番
号:2)においてはアミノ酸残基26−36、51−6
6および99−108、BBA−2617の重鎖(配列
番号:4)においてはアミノ酸残基26−36、51−
66および99−108、BKE−3430の重鎖(配
列番号:6)においてはアミノ酸残基26−35、50
−66および99−111、BTE−3456の重鎖
(配列番号:8)においてはアミノ酸残基26−36、
51−66および99−108が超可変領域に相当す
る。一般に、免疫グロブリンにおいて超可変領域はその
立体構造上で相互に近接して抗原結合部位を構成してお
り、この領域によって抗原に対する反応性が決定され
る。
【0046】また、上記ハイブリドーマから調製できた
抗ビスフェノールA抗体DNAの軽鎖可変領域の塩基配
列およびそのアミノ酸配列を配列表に示す。配列番号:
9および10は、前記ハイブリドーマBBA−2187
由来の軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列およ
びそのアミノ酸配列を記す。配列番号:11および12
は、前記ハイブリドーマBBA−2617由来の軽鎖可
変領域をコードするDNAの塩基配列およびそのアミノ
酸配列を記す。配列番号:13および14は、前記ハイ
ブリドーマBKE−3430由来の軽鎖可変領域をコー
ドするDNAの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記
す。配列番号:15および16は、前記ハイブリドーマ
BTE−3456由来の軽鎖可変領域をコードするDN
Aの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記す。これら4
つの軽鎖可変領域の配列の相同性をアミノ酸レベルで比
較すると、BBA−2187を基準にしてBBA−26
17は98%、BKE−3430は63%、BTE−3
456は86%の相同性を示す。上記軽鎖可変領域にお
いてもアミノ酸配列が特に異なる3個所の超可変領域が
あり、それぞれL1、L2およびL3と呼ばれる。BB
A−2187の軽鎖(配列番号:10)においてはアミ
ノ酸残基24−38、53−59および92−100、
BBA−2617の軽鎖(配列番号:12)においては
アミノ酸残基24−38、54−60および93−10
1、BKE−3430の軽鎖(配列番号:14)におい
てはアミノ酸残基24−39、55−61および94−
102、BTE−3456の軽鎖(配列番号:16)に
おいてはアミノ酸残基24−38、54−60および9
3−101が超可変領域に相当する。
抗ビスフェノールA抗体DNAの軽鎖可変領域の塩基配
列およびそのアミノ酸配列を配列表に示す。配列番号:
9および10は、前記ハイブリドーマBBA−2187
由来の軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列およ
びそのアミノ酸配列を記す。配列番号:11および12
は、前記ハイブリドーマBBA−2617由来の軽鎖可
変領域をコードするDNAの塩基配列およびそのアミノ
酸配列を記す。配列番号:13および14は、前記ハイ
ブリドーマBKE−3430由来の軽鎖可変領域をコー
ドするDNAの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記
す。配列番号:15および16は、前記ハイブリドーマ
BTE−3456由来の軽鎖可変領域をコードするDN
Aの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記す。これら4
つの軽鎖可変領域の配列の相同性をアミノ酸レベルで比
較すると、BBA−2187を基準にしてBBA−26
17は98%、BKE−3430は63%、BTE−3
456は86%の相同性を示す。上記軽鎖可変領域にお
いてもアミノ酸配列が特に異なる3個所の超可変領域が
あり、それぞれL1、L2およびL3と呼ばれる。BB
A−2187の軽鎖(配列番号:10)においてはアミ
ノ酸残基24−38、53−59および92−100、
BBA−2617の軽鎖(配列番号:12)においては
アミノ酸残基24−38、54−60および93−10
1、BKE−3430の軽鎖(配列番号:14)におい
てはアミノ酸残基24−39、55−61および94−
102、BTE−3456の軽鎖(配列番号:16)に
おいてはアミノ酸残基24−38、54−60および9
3−101が超可変領域に相当する。
【0047】本発明のDNAは、前記したように上記塩
基配列を有するDNAに限定されず、様々な塩基配列を
有するが、これらのDNAには、配列表に記載されたア
ミノ酸配列からなる組換えタンパク質よりもビスフェノ
ールAに対する結合能が高いペプチド、または低いペプ
チドをコードする塩基配列を有するものが含まれる。限
定されるわけではないが、例えば前記抗ビスフェノール
Aモノクローナル抗体産生細胞BBE−4280および
BKE−4265に存在する抗ビスフェノールA抗体D
NAは、これに相当する。これらのDNAは、本明細書
に記載された方法と同様の方法により調製することがで
き、それらも本発明のDNAの範囲に含まれる。
基配列を有するDNAに限定されず、様々な塩基配列を
有するが、これらのDNAには、配列表に記載されたア
ミノ酸配列からなる組換えタンパク質よりもビスフェノ
ールAに対する結合能が高いペプチド、または低いペプ
チドをコードする塩基配列を有するものが含まれる。限
定されるわけではないが、例えば前記抗ビスフェノール
Aモノクローナル抗体産生細胞BBE−4280および
BKE−4265に存在する抗ビスフェノールA抗体D
NAは、これに相当する。これらのDNAは、本明細書
に記載された方法と同様の方法により調製することがで
き、それらも本発明のDNAの範囲に含まれる。
【0048】また、上記DNAは、配列表に記載された
塩基配列および/またはアミノ酸配列に基づいて、オリ
ゴヌクレオチドの合成および結合により、または部位特
異的変異誘発技術により調製されたDNA構築物から合
成してもよい。
塩基配列および/またはアミノ酸配列に基づいて、オリ
ゴヌクレオチドの合成および結合により、または部位特
異的変異誘発技術により調製されたDNA構築物から合
成してもよい。
【0049】(3)本発明の組換えタンパク質の製造方
法 前記(2)で得られた本発明のDNAを発現ベクターに
挿入する。このとき、実施例3に記載のように、適当な
プライマーを合成してPCRで鋳型DNAを増幅するこ
とによりリンカーを介在させた一本鎖の抗体として発現
できるようにDNAを構築することが好ましい。実施例
3は、大腸菌用発現ベクターpET-27b を用いた具体例を
示す。前記発現ベクターを、適当な大腸菌株等の宿主細
胞にトランスフェクトする。発現ベクターが適当な宿主
細胞に形質転換またはトランスフェクトされたことを確
認するために、各種のマーカー遺伝子がベクター中に挿
入されている。例えば、アンピシリン耐性およびテトラ
サイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子や栄養素要求
性の遺伝子などが該当する。実施例3では、pET-27b ベ
クターでの形質転換を確認するために、抗生物質アンピ
シリンを使用する。
法 前記(2)で得られた本発明のDNAを発現ベクターに
挿入する。このとき、実施例3に記載のように、適当な
プライマーを合成してPCRで鋳型DNAを増幅するこ
とによりリンカーを介在させた一本鎖の抗体として発現
できるようにDNAを構築することが好ましい。実施例
3は、大腸菌用発現ベクターpET-27b を用いた具体例を
示す。前記発現ベクターを、適当な大腸菌株等の宿主細
胞にトランスフェクトする。発現ベクターが適当な宿主
細胞に形質転換またはトランスフェクトされたことを確
認するために、各種のマーカー遺伝子がベクター中に挿
入されている。例えば、アンピシリン耐性およびテトラ
サイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子や栄養素要求
性の遺伝子などが該当する。実施例3では、pET-27b ベ
クターでの形質転換を確認するために、抗生物質アンピ
シリンを使用する。
【0050】その後、前記形質転換体を適当な培養条件
下で培養する。例えば,pET-27b ベクターのようにla
cZプロモーターの下流に本発明のDNAを連結したベ
クターが導入されている大腸菌を培養する際には、組換
えタンパク質の合成を誘導するIPTG(イソプロピル
−β−D−チオガラクトシド)を添加して培養すること
が好ましい。
下で培養する。例えば,pET-27b ベクターのようにla
cZプロモーターの下流に本発明のDNAを連結したベ
クターが導入されている大腸菌を培養する際には、組換
えタンパク質の合成を誘導するIPTG(イソプロピル
−β−D−チオガラクトシド)を添加して培養すること
が好ましい。
【0051】合成された組換えタンパク質は、宿主細胞
内に蓄積されるかまたは細胞外に分泌される。
内に蓄積されるかまたは細胞外に分泌される。
【0052】なお、無細胞翻訳系もまた、本明細書中に
開示された塩基配列に基づいて調製されたRNAを利用
して組換えタンパク質の製造に用いることができる。
開示された塩基配列に基づいて調製されたRNAを利用
して組換えタンパク質の製造に用いることができる。
【0053】組換えタンパク質は、前記したような抽
出、濃縮、精製等の公知の技術を用いて単離・精製する
ことができる。
出、濃縮、精製等の公知の技術を用いて単離・精製する
ことができる。
【0054】以上のようにして得られた抗ビスフェノー
ルA抗体可変領域の組換えタンパク質は、公知の免疫学
的測定法を用いて、ビスフェノールAとの反応性を調べ
ることができる。免疫学的測定法としては、RIA、E
LISA、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブ
ロット法、イムノクロマト法等の一般に抗原の検出に使
用されている種々の方法(Meth. Enzymol., 92, 147-523
(1983) ,AntibodiesVol.II IRL Press Oxford (1989))
が挙げられる。
ルA抗体可変領域の組換えタンパク質は、公知の免疫学
的測定法を用いて、ビスフェノールAとの反応性を調べ
ることができる。免疫学的測定法としては、RIA、E
LISA、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブ
ロット法、イムノクロマト法等の一般に抗原の検出に使
用されている種々の方法(Meth. Enzymol., 92, 147-523
(1983) ,AntibodiesVol.II IRL Press Oxford (1989))
が挙げられる。
【0055】(4)ビスフェノールAの測定方法 ビスフェノールAとの反応性を確認した前記組換えタン
パク質を用いて、ビスフェノールAを測定する。測定方
法としては、前記(3)に記載された方法が挙げられ、
感度や簡便性等の点からELISAが好ましく、本発明
のキットを用いることがより好ましい。ELISAによ
る測定法は、実施例6に記載されている。
パク質を用いて、ビスフェノールAを測定する。測定方
法としては、前記(3)に記載された方法が挙げられ、
感度や簡便性等の点からELISAが好ましく、本発明
のキットを用いることがより好ましい。ELISAによ
る測定法は、実施例6に記載されている。
【0056】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。
するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。
【0057】製造例1 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製と抗体の
製造 ビスフェノールAのカルボン酸誘導体、4−{4−[1
−(4−ヒドロキシフェニル)−1−メチルエチル]フ
ェノキシ}酪酸をビスフェノールAハプテンとして、BS
A 、KLH 、TGに結合させることにより調製した免疫原を
2mg/mlになるように生理的リン酸緩衝液に溶解
し、アジュバントと等量混合した後、Balb/cマウ
ス腹腔内に100μlを投与し、その後2週間毎に追加
免疫した。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価
が高くなったマウスの脾臓を摘出し、DMEM培地を入
れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミで傷をつけ、注
射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を追い出した。前記
培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させるために
5分間静置した。脾臓細胞が浮遊している上清を静かに
取り、単細胞の懸濁液を300×g、5分間遠心分離し
て細胞を集め、脾臓細胞を調製した。マウスのミエロー
マ細胞(P3×63Ag8.653)を細胞数の比で
5:1(ミエローマ細胞:脾臓細胞)になるように混合
し、300×g,5分間遠心分離して細胞を集めた。上
清を除去し、遠沈管をはじいて沈殿細胞をほぐした後、
37℃に温めておいた50%ポリエチレングリコール
(分子量1,500)溶液1mlを60秒かけてゆっく
り加え細胞融合を行った。細胞融合後、DMEM培地9
mlを加え、さらに含牛胎児血清DMEM培地40ml
を添加した。遠心分離によって集められた細胞に、細胞
数が5×105 個/mlになるようにHAT培地を加え
て懸濁し、細胞懸濁液を96穴プラスチックプレートに
250μl/ウェルの量で分注して、37℃、5%炭酸
ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養した。1
週間後、ウェル中の培地の半量をHAT培地で置換し
て、10日から14日間培養した。培養液中の抗体の活
性をELISAで調べ、目的とする抗体を産生している
ウェルの細胞を選択した。96穴のプラスチックプレー
トで、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニング
を行った。その結果、最終的に抗ビスフェノールA抗体
を安定に産生する安定なハイブリドーマ6株を得た。こ
れらの株をそれぞれBBA−2187、BBA−261
7、BBE−4280、BKE−3430、BKE−4
265およびBTE−3456と名付け、このハイブリ
ドーマ株をDMEMに10%牛胎児血清を含む培地で培
養した。培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液と
し、それぞれ「抗体BBA−2187」、「抗体BBA
−2617」、「抗体BBE−4280」、「抗体BK
E−3430」 、「抗体BKE−4265」および
「抗体BTE−3456」とした。競合間接ELISA
法により,調製した抗体とビスフェノールAの反応性を
調べた(実施例6)。
製造 ビスフェノールAのカルボン酸誘導体、4−{4−[1
−(4−ヒドロキシフェニル)−1−メチルエチル]フ
ェノキシ}酪酸をビスフェノールAハプテンとして、BS
A 、KLH 、TGに結合させることにより調製した免疫原を
2mg/mlになるように生理的リン酸緩衝液に溶解
し、アジュバントと等量混合した後、Balb/cマウ
ス腹腔内に100μlを投与し、その後2週間毎に追加
免疫した。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価
が高くなったマウスの脾臓を摘出し、DMEM培地を入
れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミで傷をつけ、注
射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を追い出した。前記
培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させるために
5分間静置した。脾臓細胞が浮遊している上清を静かに
取り、単細胞の懸濁液を300×g、5分間遠心分離し
て細胞を集め、脾臓細胞を調製した。マウスのミエロー
マ細胞(P3×63Ag8.653)を細胞数の比で
5:1(ミエローマ細胞:脾臓細胞)になるように混合
し、300×g,5分間遠心分離して細胞を集めた。上
清を除去し、遠沈管をはじいて沈殿細胞をほぐした後、
37℃に温めておいた50%ポリエチレングリコール
(分子量1,500)溶液1mlを60秒かけてゆっく
り加え細胞融合を行った。細胞融合後、DMEM培地9
mlを加え、さらに含牛胎児血清DMEM培地40ml
を添加した。遠心分離によって集められた細胞に、細胞
数が5×105 個/mlになるようにHAT培地を加え
て懸濁し、細胞懸濁液を96穴プラスチックプレートに
250μl/ウェルの量で分注して、37℃、5%炭酸
ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養した。1
週間後、ウェル中の培地の半量をHAT培地で置換し
て、10日から14日間培養した。培養液中の抗体の活
性をELISAで調べ、目的とする抗体を産生している
ウェルの細胞を選択した。96穴のプラスチックプレー
トで、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニング
を行った。その結果、最終的に抗ビスフェノールA抗体
を安定に産生する安定なハイブリドーマ6株を得た。こ
れらの株をそれぞれBBA−2187、BBA−261
7、BBE−4280、BKE−3430、BKE−4
265およびBTE−3456と名付け、このハイブリ
ドーマ株をDMEMに10%牛胎児血清を含む培地で培
養した。培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液と
し、それぞれ「抗体BBA−2187」、「抗体BBA
−2617」、「抗体BBE−4280」、「抗体BK
E−3430」 、「抗体BKE−4265」および
「抗体BTE−3456」とした。競合間接ELISA
法により,調製した抗体とビスフェノールAの反応性を
調べた(実施例6)。
【0058】実施例1 5’-Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)
法による抗ビスフェノールAモノクローナル抗体の重鎖
および軽鎖をコードするcDNAのクローニング抗ビス
フェノールAモノクローナル抗体BBA−2187、B
BA−2617、BKE−3430、BTE−3456
を産生するマウスハイブリドーマ細胞(BBA−218
7、BBA−2617、BKE−3430、BTE−3
456)を出発材料とした。まず、10% の牛胎児血清
(JRH 社より購入)を含むDMEM培地(ICN 社より購
入)で培養した2x107 個のBBA−2187、BBA−
2617、BKE−3430、BTE−3456細胞か
ら、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Amersh
am Pharmacia Biotech社より購入)を用いて付属の説明
書に従い、約2 μg のmRNAをそれぞれ抽出した。こ
のうち1 μg のmRNAを鋳型として、SMART-RACE cDN
A Amplification Kit (Clontech 社より購入)を用いて
付属の説明書に従い、逆転写反応を行って一本鎖cDN
Aをそれぞれ合成した。抗体定常領域の塩基配列情報を
基に重鎖の定常領域に特異的なCgamma1プライマー、お
よび軽鎖の定常領域に特異的なCkappaプライマーを合成
し、これら2種のプライマーとSMART-RACE cDNA Amplif
ication Kitを用いて5’−RACE法により、抗ビス
フェノールAモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコ
ードするcDNAをそれぞれ単離した。
法による抗ビスフェノールAモノクローナル抗体の重鎖
および軽鎖をコードするcDNAのクローニング抗ビス
フェノールAモノクローナル抗体BBA−2187、B
BA−2617、BKE−3430、BTE−3456
を産生するマウスハイブリドーマ細胞(BBA−218
7、BBA−2617、BKE−3430、BTE−3
456)を出発材料とした。まず、10% の牛胎児血清
(JRH 社より購入)を含むDMEM培地(ICN 社より購
入)で培養した2x107 個のBBA−2187、BBA−
2617、BKE−3430、BTE−3456細胞か
ら、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Amersh
am Pharmacia Biotech社より購入)を用いて付属の説明
書に従い、約2 μg のmRNAをそれぞれ抽出した。こ
のうち1 μg のmRNAを鋳型として、SMART-RACE cDN
A Amplification Kit (Clontech 社より購入)を用いて
付属の説明書に従い、逆転写反応を行って一本鎖cDN
Aをそれぞれ合成した。抗体定常領域の塩基配列情報を
基に重鎖の定常領域に特異的なCgamma1プライマー、お
よび軽鎖の定常領域に特異的なCkappaプライマーを合成
し、これら2種のプライマーとSMART-RACE cDNA Amplif
ication Kitを用いて5’−RACE法により、抗ビス
フェノールAモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコ
ードするcDNAをそれぞれ単離した。
【0059】 Cgamma1 プライマー: 5'-AGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3' (配列番号:17) Ckappaプライマー: 5'-ACCGATGGGGCTGTTGTTTTGGC-3' (配列番号:18)。
【0060】RACE産物増幅のためのPCR反応液の
組成は、34.5μL の滅菌水、5 μLの10x Advantage 2 P
CR Buffer(SMART-RACE cDNA Amplification Kitに付
属)、1 μL の10 mM dNTP Mix (Clontech社より購入)
、1 μL の50x Advantage 2Polymerase Mix(SMART-RA
CE cDNA Amplification Kitに付属)、2.5 μL のcD
NAサンプル、5 μL のUniversal Primer Mix(SMART-
RACE cDNA Amplification Kitに付属)と1 μL の10μ
M Cgamma1 プライマー、または10μM Ckappaプライマー
で全量を50μL とし、PCRは94℃で30秒、66℃で30
秒、72℃で3 分の反応を30回繰り返した。反応液を1.5%
アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可変領域をコ
ードする部分を含む約600 bpのcDNA断片と、重鎖可
変領域をコードする部分を含む約600 bpのcDNA断片
が増幅された。
組成は、34.5μL の滅菌水、5 μLの10x Advantage 2 P
CR Buffer(SMART-RACE cDNA Amplification Kitに付
属)、1 μL の10 mM dNTP Mix (Clontech社より購入)
、1 μL の50x Advantage 2Polymerase Mix(SMART-RA
CE cDNA Amplification Kitに付属)、2.5 μL のcD
NAサンプル、5 μL のUniversal Primer Mix(SMART-
RACE cDNA Amplification Kitに付属)と1 μL の10μ
M Cgamma1 プライマー、または10μM Ckappaプライマー
で全量を50μL とし、PCRは94℃で30秒、66℃で30
秒、72℃で3 分の反応を30回繰り返した。反応液を1.5%
アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可変領域をコ
ードする部分を含む約600 bpのcDNA断片と、重鎖可
変領域をコードする部分を含む約600 bpのcDNA断片
が増幅された。
【0061】実施例2 抗ビスフェノールAモノクローナル抗体の塩基配列の決
定 実施例1で調製した抗体重鎖および軽鎖可変領域をコー
ドするcDNA断片をクローニングベクターpT7Blue T-
vector(Novagen社より購入) に挿入し、大腸菌JM109 株
に導入した。増殖した大腸菌から抗体重鎖、または軽鎖
可変領域をコードするcDNA断片が挿入された組換え
pT7Blue T-vectorを抽出し、抗ビスフェノールAモノク
ローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列をダ
イデオキシ法により決定した。結果をそれぞれ、配列番
号:1、3、5、7、9、11、13および15に示
す。また、前記塩基配列からコードされるアミノ酸配列
をそれぞれ、配列番号:2、4、6、8、10、12、
14および16に示す。
定 実施例1で調製した抗体重鎖および軽鎖可変領域をコー
ドするcDNA断片をクローニングベクターpT7Blue T-
vector(Novagen社より購入) に挿入し、大腸菌JM109 株
に導入した。増殖した大腸菌から抗体重鎖、または軽鎖
可変領域をコードするcDNA断片が挿入された組換え
pT7Blue T-vectorを抽出し、抗ビスフェノールAモノク
ローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列をダ
イデオキシ法により決定した。結果をそれぞれ、配列番
号:1、3、5、7、9、11、13および15に示
す。また、前記塩基配列からコードされるアミノ酸配列
をそれぞれ、配列番号:2、4、6、8、10、12、
14および16に示す。
【0062】実施例3 抗ビスフェノールA組換え抗体DNABBA-2187 scFv 、
BBA-2617 scFv 、BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv の構
築 実施例2で決定した抗ビスフェノールAモノクローナル
抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列情報を基に、
抗ビスフェノールA組換え抗体DNAを構築するための
10種のプライマーを合成した。
BBA-2617 scFv 、BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv の構
築 実施例2で決定した抗ビスフェノールAモノクローナル
抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列情報を基に、
抗ビスフェノールA組換え抗体DNAを構築するための
10種のプライマーを合成した。
【0063】プライマー01:5'-CCATGGATGATGTACAGCTTC
AGGAGTCAGGAC-3'(配列番号:19) プライマー02:5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGA
GGAGACGGTGACTGAGGTT-3'(配列番号:20) プライマー03:5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAC
ATTGTGCTGACACAGTCTCCT-3'(配列番号:21) プライマー04:5'-GCTAGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGT-3'
(配列番号:22) プライマー05:5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAC
ATTGTGCTGACACAGTTTCCT-3'(配列番号:23) プライマー06:5'-CCATGGATGACGTGAAGTTCGTGGAGTCTG-3'
(配列番号:24) プライマー07:5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGC
AGAGACAGTGACCAGAGTCC-3'(配列番号:25) プライマー08:5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAT
GTTGTGATGACCCAAACTCC-3'(配列番号:26) プライマー09:5'-GCTAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTG-3'(配
列番号:27) プライマー10:5'-GCTAGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCC-3'
(配列番号:28)。
AGGAGTCAGGAC-3'(配列番号:19) プライマー02:5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGA
GGAGACGGTGACTGAGGTT-3'(配列番号:20) プライマー03:5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAC
ATTGTGCTGACACAGTCTCCT-3'(配列番号:21) プライマー04:5'-GCTAGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGT-3'
(配列番号:22) プライマー05:5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAC
ATTGTGCTGACACAGTTTCCT-3'(配列番号:23) プライマー06:5'-CCATGGATGACGTGAAGTTCGTGGAGTCTG-3'
(配列番号:24) プライマー07:5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGC
AGAGACAGTGACCAGAGTCC-3'(配列番号:25) プライマー08:5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAT
GTTGTGATGACCCAAACTCC-3'(配列番号:26) プライマー09:5'-GCTAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTG-3'(配
列番号:27) プライマー10:5'-GCTAGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCC-3'
(配列番号:28)。
【0064】プライマー01、02、03、および04はBBA-21
87 scFv DNAを構築するために、プライマー01、02、
04、および05はBBA-2617 scFv DNAを構築するため
に、プライマー06、07、08、および09はBKE-3430 scFv
DNAを構築するために、プライマー01、02、03、およ
び10はBTE-3456 scFv DNAを構築するためにそれぞれ
使用した。プライマー01、および06は制限酵素NcoIを、
プライマー04、09、および10は制限酵素NheIを認識する
塩基配列を含み、プライマー02、03、05、07、および08
は合成ペプチドリンカーをコードする塩基配列を含んで
おり、それぞれ下線で示している。
87 scFv DNAを構築するために、プライマー01、02、
04、および05はBBA-2617 scFv DNAを構築するため
に、プライマー06、07、08、および09はBKE-3430 scFv
DNAを構築するために、プライマー01、02、03、およ
び10はBTE-3456 scFv DNAを構築するためにそれぞれ
使用した。プライマー01、および06は制限酵素NcoIを、
プライマー04、09、および10は制限酵素NheIを認識する
塩基配列を含み、プライマー02、03、05、07、および08
は合成ペプチドリンカーをコードする塩基配列を含んで
おり、それぞれ下線で示している。
【0065】抗ビスフェノールA組換え抗体DNAは、
PCRにより構築した。まず、重鎖および軽鎖可変領域
をコードするcDNA断片を増幅させるために、4 種の
モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖可変領域をコード
するcDNAが挿入されたプラスミドと、各々に対応し
たプライマーを用いてPCR反応を行った。PCR反応
液の組成は、例えばBBA-2187の重鎖を増幅する場合、1
μL の50x AdvantagecDNA Polymerase Mix(Clontech社
より購入) 、5 μL の10x cDNA PCR ReactionBuffer(Cl
ontech 社より購入) 、1 μL の50x dNTP Mix(Clontech
社より購入)、0.5 μL の組換えプラスミド(この場合
はBBA-2187の重鎖可変領域をコードするcDNA断片が挿入
された組換えpT7Blue T-vector)(100 ng)、0.5 μL
のプライマー01(50 pmol )、0.5 μL のプライマー02
(50 pmol )、41.5μL の滅菌水で全量を50μL とし
た。PCRの条件は94℃で30秒、63℃で1 分、72℃で1.
5分の反応を30回繰り返した。同様にして、4 種の抗ビ
スフェノールAモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖を
コードするcDNAをそれぞれ増幅した後、計8 種の反
応液を1.5%アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可
変領域をコードする約400bp のcDNA断片と重鎖可変
領域をコードする約400bp のcDNA断片の増幅をそれ
ぞれ確認した。前記8 種のcDNA断片をそれぞれ精製
し、PCR反応により重鎖および軽鎖可変領域を連結し
た一本鎖可変領域(scFv)DNAを構築した。PCR反
応液の組成は、例えばBBA-2187 scFv DNAを構築する
場合、21.5μL のBBA-2187の重鎖をコードするcDNA
溶解液、21.5μL のBBA-2187の軽鎖をコードするcDN
A溶解液、5 μL の10x cDNA PCR Reaction Buffer、1
μL の50x dNTP Mix、1 μL の50x Advantage cDNA Pol
ymerase Mix で全量を50μL とした。PCR条件は、94
℃で30秒、55℃で1 分、72℃で1.5 分の反応を7回繰り
返した。その後、以下の反応液を調製し、それぞれの反
応液に加えた。例えばBBA-2187 scFv DNAを構築する
場合、1 μL の50x Advantage cDNA Polymerase Mix 、
5 μL の10x cDNA PCR Reaction Buffer、1 μL の50x
dNTP Mix、0.5 μL のプライマー01(50 pmol )、0.5
μL のプライマー04(50 pmol )、42μL の滅菌水で全
量を50μL とし、PCR反応液に加えた。PCRの条件
は、94℃で30秒、63℃で1 分、72℃で1.5 分の反応を30
回繰り返した。同様に、他のcDNAについてもPCR
反応を行い、これらの反応液を1.5%アガロースゲルで電
気泳動し、約750bp のBBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv
、BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv cDNA断片の増
幅を確認し、精製した。
PCRにより構築した。まず、重鎖および軽鎖可変領域
をコードするcDNA断片を増幅させるために、4 種の
モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖可変領域をコード
するcDNAが挿入されたプラスミドと、各々に対応し
たプライマーを用いてPCR反応を行った。PCR反応
液の組成は、例えばBBA-2187の重鎖を増幅する場合、1
μL の50x AdvantagecDNA Polymerase Mix(Clontech社
より購入) 、5 μL の10x cDNA PCR ReactionBuffer(Cl
ontech 社より購入) 、1 μL の50x dNTP Mix(Clontech
社より購入)、0.5 μL の組換えプラスミド(この場合
はBBA-2187の重鎖可変領域をコードするcDNA断片が挿入
された組換えpT7Blue T-vector)(100 ng)、0.5 μL
のプライマー01(50 pmol )、0.5 μL のプライマー02
(50 pmol )、41.5μL の滅菌水で全量を50μL とし
た。PCRの条件は94℃で30秒、63℃で1 分、72℃で1.
5分の反応を30回繰り返した。同様にして、4 種の抗ビ
スフェノールAモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖を
コードするcDNAをそれぞれ増幅した後、計8 種の反
応液を1.5%アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可
変領域をコードする約400bp のcDNA断片と重鎖可変
領域をコードする約400bp のcDNA断片の増幅をそれ
ぞれ確認した。前記8 種のcDNA断片をそれぞれ精製
し、PCR反応により重鎖および軽鎖可変領域を連結し
た一本鎖可変領域(scFv)DNAを構築した。PCR反
応液の組成は、例えばBBA-2187 scFv DNAを構築する
場合、21.5μL のBBA-2187の重鎖をコードするcDNA
溶解液、21.5μL のBBA-2187の軽鎖をコードするcDN
A溶解液、5 μL の10x cDNA PCR Reaction Buffer、1
μL の50x dNTP Mix、1 μL の50x Advantage cDNA Pol
ymerase Mix で全量を50μL とした。PCR条件は、94
℃で30秒、55℃で1 分、72℃で1.5 分の反応を7回繰り
返した。その後、以下の反応液を調製し、それぞれの反
応液に加えた。例えばBBA-2187 scFv DNAを構築する
場合、1 μL の50x Advantage cDNA Polymerase Mix 、
5 μL の10x cDNA PCR Reaction Buffer、1 μL の50x
dNTP Mix、0.5 μL のプライマー01(50 pmol )、0.5
μL のプライマー04(50 pmol )、42μL の滅菌水で全
量を50μL とし、PCR反応液に加えた。PCRの条件
は、94℃で30秒、63℃で1 分、72℃で1.5 分の反応を30
回繰り返した。同様に、他のcDNAについてもPCR
反応を行い、これらの反応液を1.5%アガロースゲルで電
気泳動し、約750bp のBBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv
、BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv cDNA断片の増
幅を確認し、精製した。
【0066】実施例4 抗ビスフェノールA組換え抗体発現プラスミドの構築 実施例3で調製したBBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv 、
BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv cDNA断片をクロー
ニングベクターpT7Blue T-vectorに挿入し、大腸菌JM10
9 株を形質転換した。増殖した大腸菌から導入した組換
えプラスミドを抽出し、抗ビスフェノールA組換え抗体
BBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv 、BKE-3430 scFv 、BT
E-3456 scFv の塩基配列を確認した。4 種の組換え抗体
DNAを挿入した4 種の組換えプラスミドおよび大腸菌
発現ベクターpET-27b を制限酵素NcoIおよびNheIでそれ
ぞれ消化し、組換え抗体をコードするDNA断片と大腸
菌発現ベクターpET-27b を連結して4 種の抗ビスフェノ
ールA組換え抗体発現プラスミドpET-27b/BBA-2187 scF
v 、pET-27b/BBA-2617 scFv 、pET-27b/BKE-3430 scFv
、pET-27b/BTE-3456 scFv を構築した。
BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv cDNA断片をクロー
ニングベクターpT7Blue T-vectorに挿入し、大腸菌JM10
9 株を形質転換した。増殖した大腸菌から導入した組換
えプラスミドを抽出し、抗ビスフェノールA組換え抗体
BBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv 、BKE-3430 scFv 、BT
E-3456 scFv の塩基配列を確認した。4 種の組換え抗体
DNAを挿入した4 種の組換えプラスミドおよび大腸菌
発現ベクターpET-27b を制限酵素NcoIおよびNheIでそれ
ぞれ消化し、組換え抗体をコードするDNA断片と大腸
菌発現ベクターpET-27b を連結して4 種の抗ビスフェノ
ールA組換え抗体発現プラスミドpET-27b/BBA-2187 scF
v 、pET-27b/BBA-2617 scFv 、pET-27b/BKE-3430 scFv
、pET-27b/BTE-3456 scFv を構築した。
【0067】実施例5 抗ビスフェノールA組換え抗体の調製 実施例4で調製した4 種の抗ビスフェノールA組換え抗
体発現プラスミドpET-27b/BBA-2187 scFv 、pET-27b/BB
A-2617 scFv 、pET-27b/BKE-3430 scFv 、pET-27b/BTE-
3456 scFv を大腸菌BL21DE3(pLysS)株に導入した。形質
転換コロニーを50μg/mLのアンピシリン(ナカライテス
クより購入)および33μg/mLのクロラムフェニコール
(ナカライテスクより購入)を含む、5 mLの2xYT培地
(1.7%(w/v)Bacto-trypton (Difco 社より購入)、1
%(w/v )Bacto-yeast extract (Difco 社より購
入)、0.5%(w/v )NaCl(ナカライテスクより購入))
に植菌し、23℃で一晩震盪培養した。この懸濁液を800
mLのSB培地(3.5%(w/v )Bacto-trypton 、2%(w/v )
Bacto-yeast extract 、0.5%(w/v )NaCl)に懸濁し、
23℃で一晩震盪培養した。この懸濁液にIPTG(ナカライ
テスクより購入)を終濃度1mMとなるように添加し、さ
らに23℃で6 時間震盪培養した後、1500g で20分間遠心
分離し、上清を除去した。沈澱した菌体を氷冷した32 m
L の1xTES 緩衝液(0.2 M Tris-HCl(pH8.0 )、0.5 mM
EDTA 、0.5 M スクロース(それぞれナカライテスク
より購入))に懸濁し、さらに、氷冷した48 mL の0.2x
TES 緩衝液(0.04 M Tris-HCl (pH8.0 )、0.1 mM EDT
A 、0.1 M スクロース)を加え、十分に撹拌した。こ
の懸濁液を30分間氷冷した後、15000gで10分間遠心分離
し、得られた上清を抗ビスフェノールA組換え抗体とし
て使用した。
体発現プラスミドpET-27b/BBA-2187 scFv 、pET-27b/BB
A-2617 scFv 、pET-27b/BKE-3430 scFv 、pET-27b/BTE-
3456 scFv を大腸菌BL21DE3(pLysS)株に導入した。形質
転換コロニーを50μg/mLのアンピシリン(ナカライテス
クより購入)および33μg/mLのクロラムフェニコール
(ナカライテスクより購入)を含む、5 mLの2xYT培地
(1.7%(w/v)Bacto-trypton (Difco 社より購入)、1
%(w/v )Bacto-yeast extract (Difco 社より購
入)、0.5%(w/v )NaCl(ナカライテスクより購入))
に植菌し、23℃で一晩震盪培養した。この懸濁液を800
mLのSB培地(3.5%(w/v )Bacto-trypton 、2%(w/v )
Bacto-yeast extract 、0.5%(w/v )NaCl)に懸濁し、
23℃で一晩震盪培養した。この懸濁液にIPTG(ナカライ
テスクより購入)を終濃度1mMとなるように添加し、さ
らに23℃で6 時間震盪培養した後、1500g で20分間遠心
分離し、上清を除去した。沈澱した菌体を氷冷した32 m
L の1xTES 緩衝液(0.2 M Tris-HCl(pH8.0 )、0.5 mM
EDTA 、0.5 M スクロース(それぞれナカライテスク
より購入))に懸濁し、さらに、氷冷した48 mL の0.2x
TES 緩衝液(0.04 M Tris-HCl (pH8.0 )、0.1 mM EDT
A 、0.1 M スクロース)を加え、十分に撹拌した。こ
の懸濁液を30分間氷冷した後、15000gで10分間遠心分離
し、得られた上清を抗ビスフェノールA組換え抗体とし
て使用した。
【0068】実施例6 ビスフェノールA間接競合ELISA 96穴マイクロタイタープレートに、0.1 μg/mLのビスフ
ェノールAハプテンとRSA の結合体(混合酸無水物法を
用いて調製) を100 μL ずつ各ウェルに分注し、4 ℃で
一晩放置した。内溶液を除去した後、蒸留水で4 倍希釈
したブロックエース(大日本製薬より購入)を各ウェル
に300 μL ずつ分注し、4 ℃で一晩放置した。内溶液を
除去した後、リン酸緩衝液(10mM リン酸ナトリウム
(ナカライテスクより購入)、154 mM NaCl、pH7.2 )
で段階的に希釈したビスフェノールA標準溶液を各ウェ
ルに50μL ずつ分注し、実施例5で調製した抗ビスフェ
ノールA組換え抗体をリン酸緩衝液で希釈して、各ウェ
ルに50μL ずつ分注した。25℃で1 時間インキュベート
した後、リン酸緩衝液で各ウェルを5 回洗浄した。調製
した組換え抗体にはHSV タグが結合していることから、
次にリン酸緩衝液で0.1 μg/mLに希釈したマウス抗HSV
タグ抗体(Amersham Pharmacia Biotech社より購入)を
各ウェルに100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュ
ベートすることにより、抗HSV タグ抗体をビスフェノー
ルAハプテンとRSA の結合体と結合した組換え抗体に結
合させた。リン酸緩衝液で各ウェルを5 回洗浄し、リン
酸緩衝液で2,000 倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス抗体・抗体(Pierce社より購入)を各ウェルに
100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュベートし
た。リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗浄した後、発色基
質溶液を各ウェルに100 μL ずつ分注した。室温で10分
間インキュベートした後、1 N 硫酸を100 μL ずつ分注
して酵素反応を停止し、450 nmの吸光度を測定した。
ェノールAハプテンとRSA の結合体(混合酸無水物法を
用いて調製) を100 μL ずつ各ウェルに分注し、4 ℃で
一晩放置した。内溶液を除去した後、蒸留水で4 倍希釈
したブロックエース(大日本製薬より購入)を各ウェル
に300 μL ずつ分注し、4 ℃で一晩放置した。内溶液を
除去した後、リン酸緩衝液(10mM リン酸ナトリウム
(ナカライテスクより購入)、154 mM NaCl、pH7.2 )
で段階的に希釈したビスフェノールA標準溶液を各ウェ
ルに50μL ずつ分注し、実施例5で調製した抗ビスフェ
ノールA組換え抗体をリン酸緩衝液で希釈して、各ウェ
ルに50μL ずつ分注した。25℃で1 時間インキュベート
した後、リン酸緩衝液で各ウェルを5 回洗浄した。調製
した組換え抗体にはHSV タグが結合していることから、
次にリン酸緩衝液で0.1 μg/mLに希釈したマウス抗HSV
タグ抗体(Amersham Pharmacia Biotech社より購入)を
各ウェルに100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュ
ベートすることにより、抗HSV タグ抗体をビスフェノー
ルAハプテンとRSA の結合体と結合した組換え抗体に結
合させた。リン酸緩衝液で各ウェルを5 回洗浄し、リン
酸緩衝液で2,000 倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス抗体・抗体(Pierce社より購入)を各ウェルに
100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュベートし
た。リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗浄した後、発色基
質溶液を各ウェルに100 μL ずつ分注した。室温で10分
間インキュベートした後、1 N 硫酸を100 μL ずつ分注
して酵素反応を停止し、450 nmの吸光度を測定した。
【0069】対照として、製造例1で調製したハイブリ
ドーマ由来のモノクローナル抗体で間接競合ELISA
を行った。リン酸緩衝液で段階的に希釈したビスフェノ
ールA標準溶液を各ウェルに50μL ずつ分注し、抗ビス
フェノールAモノクローナル抗体をリン酸緩衝液で希釈
して、各ウェルに50μL ずつ分注した。25℃で1 時間イ
ンキュベートした後、リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗
浄し、リン酸緩衝液で2,000 倍希釈したペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウス抗体・抗体(Pierce社より購入)を
各ウェルに100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュ
ベートした。リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗浄した
後、発色基質溶液を各ウェルに100 μL ずつ分注した。
室温で10分間インキュベートした後、1 N 硫酸を100 μ
L ずつ分注して酵素反応を停止し、450 nmの吸光度を測
定した。
ドーマ由来のモノクローナル抗体で間接競合ELISA
を行った。リン酸緩衝液で段階的に希釈したビスフェノ
ールA標準溶液を各ウェルに50μL ずつ分注し、抗ビス
フェノールAモノクローナル抗体をリン酸緩衝液で希釈
して、各ウェルに50μL ずつ分注した。25℃で1 時間イ
ンキュベートした後、リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗
浄し、リン酸緩衝液で2,000 倍希釈したペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウス抗体・抗体(Pierce社より購入)を
各ウェルに100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュ
ベートした。リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗浄した
後、発色基質溶液を各ウェルに100 μL ずつ分注した。
室温で10分間インキュベートした後、1 N 硫酸を100 μ
L ずつ分注して酵素反応を停止し、450 nmの吸光度を測
定した。
【0070】結果を図1に示す。図1から明らかなとお
り、4 種の抗ビスフェノールA組換え抗体は、いずれも
元のモノクローナル抗体より高い反応性を示した。
り、4 種の抗ビスフェノールA組換え抗体は、いずれも
元のモノクローナル抗体より高い反応性を示した。
【0071】配列表のフリーテキスト 配列番号:17〜28に記載の塩基配列からなるDNA
は、合成プライマーであり、配列番号:29に記載のア
ミノ酸配列からなるペプチドは、リンカーである。
は、合成プライマーであり、配列番号:29に記載のア
ミノ酸配列からなるペプチドは、リンカーである。
【0072】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BIO APPLIED SYSTEMS Inc. <120> A DNA Encoding anti-BisphenolA Antibody, Recombinant Protein and a Method for producing thereof <130> P01088HS <160> 29 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 1 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tatataaggt acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaaattga attctgtgac tcctgaggac acagctacat attactgtgc aagagtattg 300 ggacggggct atggtttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Arg Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 3 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatggcc tacataaggt acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc aagagtattg 300 ggacggggct atggtttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Ala Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Arg Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 366 <212> DNA <213> Mouse <400> 5 gacgtgaagt tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt cactttcaga aactattaca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtt ggtcgcaggc attaatacca atggtggttt cacctactat 180 ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acggccttct actattgtgc aagaccggag 300 tttgatactt cctacgtagc ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Mouse <400> 6 Asp Val Lys Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Thr Asn Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Glu Phe Asp Thr Ser Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 7 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcactc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactgggta ttccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataaact acgacggcag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catcaaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga cttctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc acgagtctat 300 agttactacg atggtctgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser His 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Tyr Ser Tyr Tyr Asp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 333 <212> DNA <213> Mouse <400> 9 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctacct atagttattt acactggtac 120 caacagagac caggacagcc acccaaactc atcaagtatg tatccaacct agaatctggg 180 gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240 gtggaggagg aggatactgc aacatattac tgtcagcaca gttgggagat tcctccgacg 300 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgg 333 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Mouse <400> 10 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Ile Lys Tyr Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 65 70 75 80 Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp Glu 85 90 95 Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Mouse <400> 11 gacattgtgc tgacacagtt tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aactgtcagt acatctaggt ttaattatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 336 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Mouse <400> 12 Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Thr Ser 20 25 30 Arg Phe Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> Mouse <400> 13 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaactttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcat actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 ctgacgttcg gttctgggac caagctggag ctgaaacgg 339 <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Mouse <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> Mouse <400> 15 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtgt ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt atatctggca atagtcatat gcactggtac 120 caacagagac caggacaggc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcaac acagtaggga acttcctccc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgg 336 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Mouse <400> 16 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ile Ser 20 25 30 Gly Asn Ser His Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 agatggatac agttggtgca gcatcagc 28 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 accgatgggg ctgttgtttt ggc 23 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccatggatga tgtacagctt caggagtcag gac 33 <210> 20 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgaggagacg gtgactgagg tt 52 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattgtgc tgacacagtc tcct 54 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gctagcccgt ttgatttcca gcttggt 37 <210> 23 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattgtgc tgacacagtt tcct 54 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccatggatga cgtgaagttc gtggagtctg 30 <210> 25 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgcagagaca gtgaccagag tcc 53 <210> 26 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gatgttgtga tgacccaaac tcc 53 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gctagcccgt ttcagctcca gcttg 25 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gctagcccgt tttatttcca actttgtcc 29 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
【図1】図1は、各種のモノクローナル抗体またはそれ
に対応する組換え抗体(scFv)とビスフェノールAとの
反応性を、間接競合ELISAにより測定したグラフで
ある。グラフの横軸は添加したビスフェノールAの濃度
を示し、縦軸は、[ ビスフェノールA添加区の吸光度
(B)/ビスフェノール未添加区の吸光度(B0)] ×
100(%B/B0と略す)を示す。
に対応する組換え抗体(scFv)とビスフェノールAとの
反応性を、間接競合ELISAにより測定したグラフで
ある。グラフの横軸は添加したビスフェノールAの濃度
を示し、縦軸は、[ ビスフェノールA添加区の吸光度
(B)/ビスフェノール未添加区の吸光度(B0)] ×
100(%B/B0と略す)を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/21 C12P 21/02 C 5/10 21/08 C12P 21/02 G01N 33/53 S 21/08 (C12P 21/02 C G01N 33/53 C12R 1:19) //(C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:19) 5/00 A (72)発明者 三宅 司郎 京都府京都市南区吉祥院宮の東町2番地 株式会社バイオ・アプライド・システムズ 内 Fターム(参考) 4B024 AA11 BA41 BA53 CA04 DA06 EA04 GA03 GA11 GA19 HA03 HA15 4B064 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA26X AA92X AA99Y AB01 AB05 AC14 AC15 BA02 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA50 FA72 FA73 FA74
Claims (8)
- 【請求項1】 (a) 配列番号:2、4、6、8、1
0、12、14または16に記載のアミノ酸配列からな
る抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域または軽鎖可
変領域をコードするDNA、(b) 配列番号:2、
4、6、8、10、12、14または16に記載のアミ
ノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸残基が欠
失、置換および/または付加された配列からなるペプチ
ドをコードするDNA、(c) 配列番号:1、3、
5、7、9、11、13または15に記載の塩基配列か
らなり、抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域または
軽鎖可変領域をコードするDNA、(d) 配列番号:
1、3、5、7、9、11、13または15に記載の塩
基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換およ
び/または付加された配列からなるDNA、ならびに
(e) 配列番号:1、3、5、7、9、11、13ま
たは15に記載の塩基配列からなるDNAの相補鎖とス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
からなる群より選ばれるDNAであって、かつビスフェ
ノールAと相互作用する組換えタンパク質を構成可能で
あるDNA。 - 【請求項2】 請求項1に記載のDNAを含んでなるベ
クター。 - 【請求項3】 請求項2に記載のベクターを導入してな
る形質転換体。 - 【請求項4】 抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域
および/または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質を
製造する方法であって、請求項4に記載の形質転換体を
培養し、当該培養物から抗ビスフェノールA抗体の重鎖
可変領域および/または軽鎖可変領域を含有する組換え
タンパク質を回収する工程を含む方法。 - 【請求項5】 請求項4に記載の方法によって製造され
た、抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域および/ま
たは軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質。 - 【請求項6】 抗ビスフェノールA抗体の重鎖可変領域
と軽鎖可変領域がリンカーで連結している、請求項5に
記載の組換えタンパク質。 - 【請求項7】 請求項5または6に記載の組換えタンパ
ク質を含んでなるビスフェノールAの測定キット。 - 【請求項8】 請求項5もしくは6に記載の組換えタン
パク質または請求項7に記載のキットを用いることを特
徴とするビスフェノールAの測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001058673A JP2002253259A (ja) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | 抗ビスフェノールa抗体をコードする遺伝子、組換えタンパク質およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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JP2001058673A JP2002253259A (ja) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | 抗ビスフェノールa抗体をコードする遺伝子、組換えタンパク質およびその製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002253259A true JP2002253259A (ja) | 2002-09-10 |
Family
ID=18918357
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001058673A Pending JP2002253259A (ja) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | 抗ビスフェノールa抗体をコードする遺伝子、組換えタンパク質およびその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2002253259A (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021029185A (ja) * | 2019-08-27 | 2021-03-01 | 株式会社イーダブルニュートリション・ジャパン | 貝類の受動免疫方法 |
US11759525B1 (en) | 2021-07-09 | 2023-09-19 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
US11771776B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-10-03 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
US11833217B2 (en) | 2018-08-02 | 2023-12-05 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
US11911484B2 (en) | 2018-08-02 | 2024-02-27 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy |
US11931421B2 (en) | 2022-04-15 | 2024-03-19 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy |
US11969475B2 (en) | 2021-07-09 | 2024-04-30 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
US12018087B2 (en) | 2018-08-02 | 2024-06-25 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject |
-
2001
- 2001-03-02 JP JP2001058673A patent/JP2002253259A/ja active Pending
Cited By (10)
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US12005124B2 (en) | 2018-08-02 | 2024-06-11 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
US12018087B2 (en) | 2018-08-02 | 2024-06-25 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject |
JP2021029185A (ja) * | 2019-08-27 | 2021-03-01 | 株式会社イーダブルニュートリション・ジャパン | 貝類の受動免疫方法 |
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