JP2002253259A - 抗ビスフェノールａ抗体をコードする遺伝子、組換えタンパク質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗ビスフェノールＡ抗体をコードするＤＮ
Ａ、前記ＤＮＡを用いて製造された組換えタンパク質及
び前記組換えタンパク質を用いるビスフェノールＡの測
定方法等を提供すること。 【解決手段】 所定のアミノ酸配列からなる抗ビスフェ
ノールＡ抗体の重鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮ
Ａ、所定の塩基配列からなり、抗ビスフェノールＡ抗体
の重鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及びこれ
らのＤＮＡが変異した配列を有するＤＮＡからなる群よ
り選ばれるＤＮＡであって、かつビスフェノールＡと相
互作用する組換えタンパク質を構成可能であるＤＮＡ、
前記ＤＮＡを含むベクター、前記ベクターを導入してな
る形質転換体、前記形質転換体を培養することを特徴と
する組換えタンパク質の製造方法及び製造された組換え
タンパク質、並びに前記組換えタンパク質を用いるビス
フェノールＡの測定キット及び測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、2 ，2 ’- ビス
（4 ’- オキシフェニル）プロパン( 以下、本明細書中
ではビスフェノールＡと記載する) に対する抗体をコー
ドするＤＮＡ、特に抗体の可変領域をコードするＤＮＡ
等に関する。本発明は、さらに、前記ＤＮＡから発現し
た組換えタンパク質およびそれを用いるビスフェノール
Ａの測定方法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビスフェノールＡは、下記式(1):

【化１】 で表される構造を有する化合物であり、ポリカーボネー
トおよびエポキシ樹脂の原料モノマーとして広く用いら
れている。ビスフェノールＡは、工場廃水やプラスチッ
ク製品、または産業廃棄物置き場から水環境中に流出
し、しばしば環境を汚染するが、本化合物が外因性内分
泌撹乱化学物質であると指摘されていることから、その
モニタリングが重要な課題となっている。

【０００３】従来、ビスフェノールＡを始めとする化学
物質の測定には化学分析法が用いられてきた。例えば、
ビスフェノールＡの水中濃度をモニタリングする場合に
は、試料から抽出・精製後、ガスクロマトグラフィーを
用いて測定されてきた。化学分析は、精度の点では問題
はないものの操作が煩雑で測定に時問がかかるため、よ
り迅速、簡便かつ経済的にモニタリングすることのでき
る新しい測定法の開発が求められていた。

【０００４】一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を
利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れてい
るばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法であ
る。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の
病態解析法の一つとして大きな役割を担ってきたが、ビ
スフェノールＡのような環境負荷化学物質の測定へも適
用が進んでいる。ビスフェノールＡにおいてもすでに抗
体が調製され免疫学的測定法の開発が行われた。

【０００５】一般に、抗体を構成する免疫グロブリン
は、分子量５万〜７万の重鎖(H鎖とも言う) と２万〜３
万の軽鎖(L鎖ともいう) とから構成される。免疫グロブ
リンの基本となるペプチド鎖構造は、それぞれ相同な２
本の重鎖および２本の軽鎖が、ジスルフィド結合および
非共有結合することによって構成される。分子量は１５
万〜１９万である。重鎖、軽鎖ともにN 末端に位置する
領域は可変領域と呼ばれ、同一個体から得られた免疫グ
ロブリンであっても、各分子毎にそのアミノ酸配列が異
なる。一方、これよりC 末端側のアミノ酸配列は定常領
域（または「Fc領域」) と呼ばれ、各分子毎でほぼ一定
である。抗体の抗原結合部位は重鎖および軽鎖の可変領
域によって構成され、結合の反応性や特異性はこの部位
のアミノ酸配列で決まる。可変領域のうち特に違いが著
しい部分を超可変領域という。

【０００６】しかし、免疫学的測定法は、その開発に必
須な抗体の調製に時間と労力を必要とする。抗体には一
般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中
に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナ
ル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマ
の分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナ
ル抗体がある。これらの抗体は反応性において十分な性
能を持つが、前者のポリクローナル抗体では調製の都度
動物を用いて長期間免疫しなければならないこと、また
調製ロットごとに反応性が異なる問題点があった。また
後者のモノクローナル抗体ではハイブリドーマの扱いに
習熟しなければならず、抗体の調製に時間とコストがか
かる問題点があった。免疫学的測定法はそれ自体非常に
優れた分析法といえるが、上記のように抗体の調製が煩
雑なためにより安価で安定した抗体の大量調製法が望ま
れてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】これらの問題を解決す
る方法として、近年開発が進んでいる遺伝子工学的な抗
体製造法が考えられる。しかし、ビスフェノールＡに対
する抗体に関しては、これまで遺伝子工学的に製造され
たことがないばかりでなく、ビスフェノールＡとの結合
領域のアミノ酸配列もまったく明らかになっていなかっ
た。

【０００８】そこで、本発明の目的は、抗ビスフェノー
ルＡ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードす
るＤＮＡを提供することにある。

【０００９】また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクタ
ーおよび当該ベクターを導入した形質転換体を提供する
ことにある。

【００１０】また、本発明は、前記形質転換体を用いた
抗ビスフェノールＡの重鎖および／または軽鎖の可変領
域の製造方法および製造された組換えタンパク質を提供
することにある。

【００１１】さらに、本発明は、前記組換えタンパク質
を用いたビスフェノールＡの測定方法および測定キット
を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく、ビスフェノールＡに対する抗体のＤＮＡ
の分離およびその抗原結合領域のアミノ酸配列の解明に
成功し、本発明を完成するに至った。

【００１３】すなわち、本発明は、（ａ） 配列番号：
２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載の
アミノ酸配列からなる抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可
変領域または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、（ｂ）
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４または
１６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸残基が欠失、置換および／または付加された配列
からなるペプチドをコードするＤＮＡ、（ｃ） 配列番
号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載
の塩基配列からなり、抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可
変領域または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、（ｄ）
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１
５に記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠
失、置換および／または付加された配列からなるＤＮ
Ａ、ならびに（ｅ） 配列番号：１、３、５、７、９、
１１、１３または１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ、からなる群より選ばれるＤＮＡであって、
かつビスフェノールＡと相互作用する組換えタンパク質
を構成可能であるＤＮＡに関する。

【００１４】本発明のＤＮＡは、抗ビスフェノールＡ抗
体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするＤＮ
Ａである。前記可変領域とは、ビスフェノールＡに特異
的に結合する部位をいう。抗体の起源としては特に制限
されず、抗体作製に用いられる通常の実験動物が挙げら
れるが、モノクローナル抗体の作製に汎用されているマ
ウスが好ましい。

【００１５】具体的には、配列番号：２、４、６、８、
１０、１２、１４または１６に記載のアミノ酸配列から
なるペプチドをコードするＤＮＡ、より具体的には、配
列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に
記載の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。

【００１６】なお、配列番号：２、４、６、８、１０、
１２、１４または１６に記載のアミノ酸配列において１
もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換および／また
は付加された配列からなるペプチドをコードするＤＮ
Ａ、あるいは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、
１３または１５に記載の塩基配列において１もしくは複
数の塩基が欠失、置換および／または付加された配列か
らなるＤＮＡであっても、ビスフェノールＡと相互作用
する組換えタンパク質を構成可能である限り本発明のＤ
ＮＡに含まれる。

【００１７】ここで、「ビスフェノールＡと相互作用す
る組換えタンパク質を構成可能である」とは、本発明の
ＤＮＡから転写・翻訳される組換えタンパク質がビスフ
ェノールＡに特異的に結合する部位を形成することがで
きることをいう。

【００１８】前記アミノ酸残基および塩基の欠失、置換
または付加を行なう手法は、例えば、部位特異的突然変
異誘発（Methods in Enzymology, 100, 448 (1983)) や
ＰＣＲ(Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, New York,(1989); "PCR A Practical Appro
ach" IRL Press (1989))により、当業者ならば容易に行
なうことができる。

【００１９】さらに、本発明のＤＮＡは、配列番号：
１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の塩
基配列からなるＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつビスフ
ェノールＡと相互作用する組換えタンパク質を構成可能
であるものも包含する。

【００２０】本明細書において、「ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳ
Ｃ（２０×ＳＳＣは、３３３ｍＭクエン酸ナトリウム、
３３３ｍＭＮａＣｌを示す）、0.５％ＳＤＳおよび５０
％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、0.１
×ＳＳＣ、0.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する
条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが
観察されることをいう。

【００２１】本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関
する。含まれるＤＮＡは、１種でも２種でもよく、２種
のＤＮＡの間に介在配列を有していてもよい。介在配列
は、後述するリンカーをコードするＤＮＡが好ましい。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベク
ター、コスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げら
れるが、取り扱いやすさという観点からプラスミドベク
ターが好ましい。

【００２２】前記ベクターとしては、市販品または公知
のものを使用することができ、細菌発現用ベクターとし
ては、pET 、pGEX、pBADなど、酵母発現用ベクターとし
ては、pYES、pYC など、動物細胞発現用ベクターとして
は、pSin、pGene など、昆虫細胞発現用ベクターとして
は、pIZ 、pIB など、植物細胞発現用ベクターとして
は、pBI121などが挙げられる。

【００２３】前記発現用ベクターには、哺乳動物、微生
物、ウイルスまたは昆虫等の遺伝子から誘導された適当
な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列が含まれてい
る。調節配列の例としては、遺伝子発現に調節的役割を
持つ配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー)
、所望であれば転写を制御するためのオペレーター配
列、mRNAリボソーム結合部位をコードする配列、転写や
翻訳の開始および終止を制御する適当な配列ならびにシ
グナルペプチドをコードする配列等が含まれる。

【００２４】これらの調節配列が抗体可変領域のＤＮＡ
の発現に関係する場合は、これらの配列が適当な配置で
連結している。例えば、プロモーターの塩基配列は抗体
可変領域の塩基配列の転写を制御するように、リボソー
ム結合部位は翻訳を促進するようにまた、シグナルペプ
チドをコードする配列は翻訳後の抗体可変領域の分泌を
促進するように配置している。

【００２５】前記ベクターに本発明のＤＮＡを連結する
には、当業者であれば前記モレキュラークローニング
（Molecular Cloning)等に記載された公知の方法で容易
に行うことができる。

【００２６】また、本発明は、前記ベクターを導入した
形質転換体に関する。本発明の形質転換体は、前記ベク
ターを所望の宿主細胞に導入することにより得られるも
のである。宿主細胞としては、抗体の可変領域組換えタ
ンパク質の発現が可能であれば特に制限されず、原核生
物、真菌またはより高度な真核生物細胞が含まれる。原
核生物にはグラム陰性またはグラム陽性の細菌、例え
ば、大腸菌や枯草菌など多くの種が含まれる。真菌に
は、例えばサッカロミセスが含まれる。より高度な真核
生物細胞には、哺乳動物、昆虫、植物などを起源とする
確立された細胞系が含まれる。宿主細胞は、用いるベク
ターに応じて選ばれる。

【００２７】ベクターを導入する方法としては、例え
ば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡ
Ｅデキストラン法、エレクトロポレーション法（F.M.Au
subelらの編纂によるCurrent Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons(1987)）等の公知の方法を
用いればよい。

【００２８】また、本発明は、前記形質転換体を培養
し、当該培養物から抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変
領域および／または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク
質を回収する工程を含む、抗ビスフェノールＡ抗体の重
鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含有する組換
えタンパク質を製造する方法に関する。

【００２９】形質転換体の培養は、宿主細胞およびベク
ターに応じて常法により行うことができる。組換えタン
パク質の回収は、培養細胞もしくは培養液から、タンパ
ク質の抽出、濃縮、精製等の公知の技術を用いて行うこ
とができる。具体的には、抗体可変領域の組換えタンパ
ク質は、凍結融解循環、音波処理、機械的崩壊または細
胞溶解剤を用いて抽出することができる。また、限外ろ
過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフ
ィーなどを用いて濃縮・精製することができる。これら
の濃縮・精製法を適当に組み合わせて組換えタンパク質
を調製する。

【００３０】また、本発明は、前記方法によって製造さ
れた、抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域および／
または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質に関する。
抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域
は、リンカーで連結していることが好ましい。

【００３１】本発明においては、前記重鎖可変領域およ
び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをリンカーをコード
するＤＮＡで繋いでベクターに挿入したものを宿主細胞
内で発現させることにより、抗原結合能を持った一本鎖
の組換え抗体タンパク質(scFv)が得られる。

【００３２】前記リンカーとしては、限定されるわけで
はないが、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser （配列番号：２９）が
タンデムに繰り返された配列が挙げられ、好ましい繰り
返し回数は３回である。リンカーをコードするＤＮＡは
特に限定されないが、６塩基〜６０塩基程度が好まし
い。より具体的には、前記アミノ酸残基の繰り返し配
列、例えばこのようなリンカーをコードするＤＮＡとし
て、Linker Primer Mix （アマシャムファルマシアバイ
オテク）を使用することができる。

【００３３】また、本発明の組換えタンパク質は、可変
領域をコードするＤＮＡを他のタンパク質またはペプチ
ドをコードするＤＮＡと連結させて発現させることによ
り、融合タンパク質としてもよい。このような融合タン
パク質は、可変領域ポリペプチドのＮ末端領域のシグナ
ルまたはリーダーペプチドを含む。シグナルペプチド
は、ポリペプチド鎖の翻訳後にその合成部位から細胞膜
または細胞壁の外側への分泌を促進する。限定されるわ
けではないが、実施例５に記載のpET-27b ベクターには
シグナルペプチドをコードするＤＮＡとして、pelBシグ
ナル配列を含む。

【００３４】本発明の組換えタンパク質は、可変領域を
コードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡとを結
合させて発現させたものであってもよい。定常領域は、
可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、ある
いは異なる抗体に由来するものであってもよい。抗体の
定常領域は、プロテインＡまたはプロテインＧと結合す
ることができ、また、定常領域への特異抗体によって認
識される。この特性は、組換えタンパク質の検出・分離
・精製に有効である。

【００３５】また、本発明は、前記組換えタンパク質を
含むビスフェノールＡの測定キットに関する。本発明の
測定キットは、ビスフェノールＡに特異的に結合する組
換えタンパク質を含むことにより、ビスフェノールＡを
簡便に測定することができ、後述のビスフェノールＡの
測定方法に好適に使用することができる。前記キット
は、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もし
くは標識されたビスフェノールＡ、緩衝液、検出試薬お
よび／またはビスフェノールＡ標準溶液等を含む。

【００３６】さらに、本発明は、前記組換えタンパク質
またはキットを用いることを特徴とするビスフェノール
Ａの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原
−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放
射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イ
ムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol.,
92, 147-523 (1983) ,Antibodies Vol.II IRL Press O
xford (1989)) が挙げられるが、感度や簡便性等の点か
らＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素とし
ては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーアゼ等が挙げられ
る。

【００３７】測定対象であるビスフェノールＡには、前
記式(1) で表される化合物そのものばかりでなく、環境
中で分解されてビスフェノールＡと同様の構造を有する
化合物も含まれる。

【００３８】[ 作用効果 ]本発明により、反応性、安定
性に優れる抗ビスフェノールＡ抗体を遺伝子工学的に大
量かつ安価に調製することができる。本発明により製造
された組換えタンパク質を用いたビスフェノールＡの免
疫学的測定法は、感度、特異性および操作の簡便性にす
ぐれ、かつコストも低く押えられる。

【００３９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を詳細
に説明する。

【００４０】（１）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの作製と抗体の作製 ビスフェノールＡは、単独では免疫原性を有しないた
め、ビスフェノールＡハプテンと牛血清アルブミン（BS
A)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン、ス
カシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫
グロブリン等のタンパク質に結合させたものを免疫原と
して用いる。以下、Antibodies; A Laboratory Manual,
Lane,H,D.ら編,Cold Spring Harber Laboratory Press
出版 New York 1989年などに記載の方法に準じて行い、
Ｂａｌｂ／ｃマウスを例にして説明する。前記のように
調製した免疫原を２ｍｇ／ｍｌ程度になるように生理的
リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した
後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内に投与する。その後、
２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血
清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出
し、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）を入
れたシャーレ内で前記脾臓から細胞を取り出す。培地を
遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させ、脾臓細胞が浮
遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を低速で
遠心分離して細胞を集め、脾臓細胞を調製する。マウス
のミエローマ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を細胞
数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるよ
うに混合し、低速で遠心分離して細胞を集める。沈殿細
胞をほぐした後、３７℃に温めておいた５０％ポリエチ
レングリコール（分子量１，５００）溶液１ｍｌをゆっ
くり加え細胞融合を行う。細胞融合後、ＤＭＥＭ培地９
ｍｌを加え、さらに含牛胎児血清ＤＭＥＭ培地４０ｍｌ
を添加する。遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が
５×１０⁵ 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加えて懸
濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５
０μｌ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガ
ス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週
間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、
１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性を
ＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェ
ルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマの
クローニングを行う。クローニングにより、抗ビスフェ
ノールＡ抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を
得る。これらの株をそれぞれＢＢＡ−２１８７、ＢＢＡ
−２６１７、ＢＢＥ−４２８０、ＢＫＥ−３４３０、Ｂ
ＫＥ−４２６５およびＢＴＥ−３４５６と名付け、この
ハイブリドーマ株をＤＭＥＭに１０％牛胎児血清を含む
培地で培養する。培養液の遠心上清をモノクローナル抗
体溶液とし、それぞれ「モノクローナル抗体ＢＢＡ−２
１８７」（以下単に「抗体ＢＢＡ−２１８７」とい
う）、「モノクローナル抗体ＢＢＡ−２６１７」（以下
単に「抗体ＢＢＡ−２６１７」という）、「モノクロー
ナル抗体ＢＢＥ−４２８０」（以下単に「抗体ＢＢＥ−
４２８０」という）、「モノクローナル抗体ＢＫＥ−３
４３０」（以下単に「 抗体ＢＫＥ−３４３０」 とい
う）、「モノクローナル抗体ＢＫＥ−４２６５」 （以
下単に「 抗体ＢＫＥ−４２６５」という）および「モ
ノクローナル抗体ＢＴＥ−３４５６」（以下単に「 抗
体ＢＴＥ−３４５６」という）とした。

【００４１】（２）本発明のＤＮＡの調製方法 本発明のＤＮＡは、前記のような抗ビスフェノールＡモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得るこ
とができるが、抗ビスフェノールＡ抗体を産生する細胞
であればいずれの細胞を用いてもよく限定されない。例
えば、ハイブリドーマの他に免疫した動物のＢリンパ球
などからも得ることができる。

【００４２】まず、モレキュラークローニング等に記載
の公知の方法に準じてｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素を
用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。その後、ＰＣＲ、ｃ
ＤＮＡライブラリー法等を用いることによって、本発明
のＤＮＡを単離する。次に、単離した抗ビスフェノール
Ａモノクローナル抗体ＤＮＡの重鎖および軽鎖可変領域
をコードする塩基配列を決定する。また、本発明のＤＮ
Ａは、決定された塩基配列に基づき、公知の技術を用い
て化学的に合成してもよい。

【００４３】本発明においては、後述する実施例に記載
のように、前記ハイブリドーマＢＢＡ−２１８７、ＢＢ
Ａ−２６１７、ＢＫＥ−３４３０およびＢＴＥ−３４５
６を培養し、培養細胞から抽出したｍＲＮＡを基に、5
’−ＲＡＣＥ(5’-Rapid Amplification of cDNA End
s)法により抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体をコ
ードするｃＤＮＡを調製する。

【００４４】前記ハイブリドーマから調製できた抗ビス
フェノールＡ抗体ＤＮＡの重鎖可変領域の塩基配列およ
びアミノ酸配列を配列表に示す。配列番号：１および２
は、前記ハイブリドーマＢＢＡ−２１８７由来の重鎖可
変領域をコードするＤＮＡの塩基配列およびそのアミノ
酸配列を記す。配列番号：３および４は、前記ハイブリ
ドーマＢＢＡ−２６１７由来の重鎖可変領域をコードす
るＤＮＡの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記す。配
列番号：５および６は、前記ハイブリドーマＢＫＥ−３
４３０由来の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配
列およびそのアミノ酸配列を記す。配列表の配列番号：
７および８は、前記ハイブリドーマＢＴＥ−３４５６由
来の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列および
そのアミノ酸配列を記す。これら４つの重鎖可変領域の
配列の相同性をアミノ酸レベルで比較すると、ＢＢＡ−
２１８７を基準にしてＢＢＡ−２６１７は９８％、ＢＫ
Ｅ−３４３０は４５％、ＢＴＥ−３４５６は９２％の相
同性を示す。

【００４５】重鎖可変領域にはアミノ酸配列が特に異な
る３個所の超可変領域があり、それぞれＨ１、Ｈ２およ
びＨ３と呼ばれる。ＢＢＡ−２１８７の重鎖（配列番
号：２）においてはアミノ酸残基２６−３６、５１−６
６および９９−１０８、ＢＢＡ−２６１７の重鎖（配列
番号：４）においてはアミノ酸残基２６−３６、５１−
６６および９９−１０８、ＢＫＥ−３４３０の重鎖（配
列番号：６）においてはアミノ酸残基２６−３５、５０
−６６および９９−１１１、ＢＴＥ−３４５６の重鎖
（配列番号：８）においてはアミノ酸残基２６−３６、
５１−６６および９９−１０８が超可変領域に相当す
る。一般に、免疫グロブリンにおいて超可変領域はその
立体構造上で相互に近接して抗原結合部位を構成してお
り、この領域によって抗原に対する反応性が決定され
る。

【００４６】また、上記ハイブリドーマから調製できた
抗ビスフェノールＡ抗体ＤＮＡの軽鎖可変領域の塩基配
列およびそのアミノ酸配列を配列表に示す。配列番号：
９および１０は、前記ハイブリドーマＢＢＡ−２１８７
由来の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列およ
びそのアミノ酸配列を記す。配列番号：１１および１２
は、前記ハイブリドーマＢＢＡ−２６１７由来の軽鎖可
変領域をコードするＤＮＡの塩基配列およびそのアミノ
酸配列を記す。配列番号：１３および１４は、前記ハイ
ブリドーマＢＫＥ−３４３０由来の軽鎖可変領域をコー
ドするＤＮＡの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記
す。配列番号：１５および１６は、前記ハイブリドーマ
ＢＴＥ−３４５６由来の軽鎖可変領域をコードするＤＮ
Ａの塩基配列およびそのアミノ酸配列を記す。これら４
つの軽鎖可変領域の配列の相同性をアミノ酸レベルで比
較すると、ＢＢＡ−２１８７を基準にしてＢＢＡ−２６
１７は９８％、ＢＫＥ−３４３０は６３％、ＢＴＥ−３
４５６は８６％の相同性を示す。上記軽鎖可変領域にお
いてもアミノ酸配列が特に異なる３個所の超可変領域が
あり、それぞれＬ１、Ｌ２およびＬ３と呼ばれる。ＢＢ
Ａ−２１８７の軽鎖（配列番号：１０）においてはアミ
ノ酸残基２４−３８、５３−５９および９２−１００、
ＢＢＡ−２６１７の軽鎖（配列番号：１２）においては
アミノ酸残基２４−３８、５４−６０および９３−１０
１、ＢＫＥ−３４３０の軽鎖（配列番号：１４）におい
てはアミノ酸残基２４−３９、５５−６１および９４−
１０２、ＢＴＥ−３４５６の軽鎖（配列番号：１６）に
おいてはアミノ酸残基２４−３８、５４−６０および９
３−１０１が超可変領域に相当する。

【００４７】本発明のＤＮＡは、前記したように上記塩
基配列を有するＤＮＡに限定されず、様々な塩基配列を
有するが、これらのＤＮＡには、配列表に記載されたア
ミノ酸配列からなる組換えタンパク質よりもビスフェノ
ールＡに対する結合能が高いペプチド、または低いペプ
チドをコードする塩基配列を有するものが含まれる。限
定されるわけではないが、例えば前記抗ビスフェノール
Ａモノクローナル抗体産生細胞ＢＢＥ−４２８０および
ＢＫＥ−４２６５に存在する抗ビスフェノールＡ抗体Ｄ
ＮＡは、これに相当する。これらのＤＮＡは、本明細書
に記載された方法と同様の方法により調製することがで
き、それらも本発明のＤＮＡの範囲に含まれる。

【００４８】また、上記ＤＮＡは、配列表に記載された
塩基配列および／またはアミノ酸配列に基づいて、オリ
ゴヌクレオチドの合成および結合により、または部位特
異的変異誘発技術により調製されたＤＮＡ構築物から合
成してもよい。

【００４９】（３）本発明の組換えタンパク質の製造方
法 前記（２）で得られた本発明のＤＮＡを発現ベクターに
挿入する。このとき、実施例３に記載のように、適当な
プライマーを合成してＰＣＲで鋳型ＤＮＡを増幅するこ
とによりリンカーを介在させた一本鎖の抗体として発現
できるようにＤＮＡを構築することが好ましい。実施例
３は、大腸菌用発現ベクターpET-27b を用いた具体例を
示す。前記発現ベクターを、適当な大腸菌株等の宿主細
胞にトランスフェクトする。発現ベクターが適当な宿主
細胞に形質転換またはトランスフェクトされたことを確
認するために、各種のマーカー遺伝子がベクター中に挿
入されている。例えば、アンピシリン耐性およびテトラ
サイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子や栄養素要求
性の遺伝子などが該当する。実施例３では、pET-27b ベ
クターでの形質転換を確認するために、抗生物質アンピ
シリンを使用する。

【００５０】その後、前記形質転換体を適当な培養条件
下で培養する。例えば，pET-27b ベクターのようにｌａ
ｃＺプロモーターの下流に本発明のＤＮＡを連結したベ
クターが導入されている大腸菌を培養する際には、組換
えタンパク質の合成を誘導するＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド）を添加して培養すること
が好ましい。

【００５１】合成された組換えタンパク質は、宿主細胞
内に蓄積されるかまたは細胞外に分泌される。

【００５２】なお、無細胞翻訳系もまた、本明細書中に
開示された塩基配列に基づいて調製されたＲＮＡを利用
して組換えタンパク質の製造に用いることができる。

【００５３】組換えタンパク質は、前記したような抽
出、濃縮、精製等の公知の技術を用いて単離・精製する
ことができる。

【００５４】以上のようにして得られた抗ビスフェノー
ルＡ抗体可変領域の組換えタンパク質は、公知の免疫学
的測定法を用いて、ビスフェノールＡとの反応性を調べ
ることができる。免疫学的測定法としては、ＲＩＡ、Ｅ
ＬＩＳＡ、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブ
ロット法、イムノクロマト法等の一般に抗原の検出に使
用されている種々の方法(Meth. Enzymol., 92, 147-523
(1983) ,AntibodiesVol.II IRL Press Oxford (1989))
が挙げられる。

【００５５】（４）ビスフェノールＡの測定方法 ビスフェノールＡとの反応性を確認した前記組換えタン
パク質を用いて、ビスフェノールＡを測定する。測定方
法としては、前記（３）に記載された方法が挙げられ、
感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましく、本発明
のキットを用いることがより好ましい。ＥＬＩＳＡによ
る測定法は、実施例６に記載されている。

【００５６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。

【００５７】製造例１ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製と抗体の
製造 ビスフェノールＡのカルボン酸誘導体、４−｛４−［１
−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチルエチル］フ
ェノキシ｝酪酸をビスフェノールＡハプテンとして、BS
A 、KLH 、TGに結合させることにより調製した免疫原を
２ｍｇ／ｍｌになるように生理的リン酸緩衝液に溶解
し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウ
ス腹腔内に１００μｌを投与し、その後２週間毎に追加
免疫した。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価
が高くなったマウスの脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地を入
れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミで傷をつけ、注
射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を追い出した。前記
培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させるために
５分間静置した。脾臓細胞が浮遊している上清を静かに
取り、単細胞の懸濁液を３００×ｇ、５分間遠心分離し
て細胞を集め、脾臓細胞を調製した。マウスのミエロー
マ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の比で
５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように混合
し、３００×ｇ,５分間遠心分離して細胞を集めた。上
清を除去し、遠沈管をはじいて沈殿細胞をほぐした後、
３７℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール
（分子量１，５００）溶液１ｍｌを６０秒かけてゆっく
り加え細胞融合を行った。細胞融合後、ＤＭＥＭ培地９
ｍｌを加え、さらに含牛胎児血清ＤＭＥＭ培地４０ｍｌ
を添加した。遠心分離によって集められた細胞に、細胞
数が５×１０⁵ 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加え
て懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに
２５０μｌ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸
ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養した。１
週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換し
て、１０日から１４日間培養した。培養液中の抗体の活
性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生している
ウェルの細胞を選択した。９６穴のプラスチックプレー
トで、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニング
を行った。その結果、最終的に抗ビスフェノールＡ抗体
を安定に産生する安定なハイブリドーマ６株を得た。こ
れらの株をそれぞれＢＢＡ−２１８７、ＢＢＡ−２６１
７、ＢＢＥ−４２８０、ＢＫＥ−３４３０、ＢＫＥ−４
２６５およびＢＴＥ−３４５６と名付け、このハイブリ
ドーマ株をＤＭＥＭに１０％牛胎児血清を含む培地で培
養した。培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液と
し、それぞれ「抗体ＢＢＡ−２１８７」、「抗体ＢＢＡ
−２６１７」、「抗体ＢＢＥ−４２８０」、「抗体ＢＫ
Ｅ−３４３０」 、「抗体ＢＫＥ−４２６５」および
「抗体ＢＴＥ−３４５６」とした。競合間接ＥＬＩＳＡ
法により，調製した抗体とビスフェノールＡの反応性を
調べた（実施例６）。

【００５８】実施例１ ５’-Rapid Amplification of cDNA Ends （ＲＡＣＥ）
法による抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体の重鎖
および軽鎖をコードするｃＤＮＡのクローニング抗ビス
フェノールＡモノクローナル抗体ＢＢＡ−２１８７、Ｂ
ＢＡ−２６１７、ＢＫＥ−３４３０、ＢＴＥ−３４５６
を産生するマウスハイブリドーマ細胞（ＢＢＡ−２１８
７、ＢＢＡ−２６１７、ＢＫＥ−３４３０、ＢＴＥ−３
４５６）を出発材料とした。まず、10% の牛胎児血清
（JRH 社より購入）を含むＤＭＥＭ培地（ICN 社より購
入）で培養した2x10⁷ 個のＢＢＡ−２１８７、ＢＢＡ−
２６１７、ＢＫＥ−３４３０、ＢＴＥ−３４５６細胞か
ら、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit （Amersh
am Pharmacia Biotech社より購入）を用いて付属の説明
書に従い、約2 μg のｍＲＮＡをそれぞれ抽出した。こ
のうち1 μg のｍＲＮＡを鋳型として、SMART-RACE cDN
A Amplification Kit (Clontech 社より購入)を用いて
付属の説明書に従い、逆転写反応を行って一本鎖ｃＤＮ
Ａをそれぞれ合成した。抗体定常領域の塩基配列情報を
基に重鎖の定常領域に特異的なCgamma1プライマー、お
よび軽鎖の定常領域に特異的なCkappaプライマーを合成
し、これら２種のプライマーとSMART-RACE cDNA Amplif
ication Kitを用いて５’−ＲＡＣＥ法により、抗ビス
フェノールＡモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコ
ードするｃＤＮＡをそれぞれ単離した。

【００５９】 Cgamma1 プライマー： 5'-AGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3' （配列番号：17） Ckappaプライマー： 5'-ACCGATGGGGCTGTTGTTTTGGC-3' （配列番号：18）。

【００６０】ＲＡＣＥ産物増幅のためのＰＣＲ反応液の
組成は、34.5μL の滅菌水、5 μLの10x Advantage 2 P
CR Buffer（SMART-RACE cDNA Amplification Kitに付
属）、1 μL の10 mM dNTP Mix (Clontech社より購入)
、1 μL の50x Advantage 2Polymerase Mix（SMART-RA
CE cDNA Amplification Kitに付属）、2.5 μL のｃＤ
ＮＡサンプル、5 μL のUniversal Primer Mix（SMART-
RACE cDNA Amplification Kitに付属）と1 μL の10μ
M Cgamma1 プライマー、または10μM Ckappaプライマー
で全量を50μL とし、ＰＣＲは94℃で30秒、66℃で30
秒、72℃で3 分の反応を30回繰り返した。反応液を1.5%
アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可変領域をコ
ードする部分を含む約600 bpのｃＤＮＡ断片と、重鎖可
変領域をコードする部分を含む約600 bpのｃＤＮＡ断片
が増幅された。

【００６１】実施例２ 抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体の塩基配列の決
定 実施例１で調製した抗体重鎖および軽鎖可変領域をコー
ドするｃＤＮＡ断片をクローニングベクターpT7Blue T-
vector(Novagen社より購入) に挿入し、大腸菌JM109 株
に導入した。増殖した大腸菌から抗体重鎖、または軽鎖
可変領域をコードするｃＤＮＡ断片が挿入された組換え
pT7Blue T-vectorを抽出し、抗ビスフェノールＡモノク
ローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列をダ
イデオキシ法により決定した。結果をそれぞれ、配列番
号：１、３、５、７、９、１１、１３および１５に示
す。また、前記塩基配列からコードされるアミノ酸配列
をそれぞれ、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、
１４および１６に示す。

【００６２】実施例３ 抗ビスフェノールＡ組換え抗体ＤＮＡBBA-2187 scFv 、
BBA-2617 scFv 、BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv の構
築 実施例２で決定した抗ビスフェノールＡモノクローナル
抗体の重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列情報を基に、
抗ビスフェノールＡ組換え抗体ＤＮＡを構築するための
10種のプライマーを合成した。

【００６３】プライマー01：5'-CCATGGATGATGTACAGCTTC
AGGAGTCAGGAC-3'（配列番号：19） プライマー02：5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGA
GGAGACGGTGACTGAGGTT-3'（配列番号：20） プライマー03：5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAC
ATTGTGCTGACACAGTCTCCT-3'（配列番号：21） プライマー04：5'-GCTAGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGT-3'
（配列番号：22） プライマー05：5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAC
ATTGTGCTGACACAGTTTCCT-3'（配列番号：23） プライマー06：5'-CCATGGATGACGTGAAGTTCGTGGAGTCTG-3'
（配列番号：24） プライマー07：5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGC
AGAGACAGTGACCAGAGTCC-3'（配列番号：25） プライマー08：5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAT
GTTGTGATGACCCAAACTCC-3'（配列番号：26） プライマー09：5'-GCTAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTG-3'（配
列番号：27） プライマー10：5'-GCTAGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCC-3'
（配列番号：28）。

【００６４】プライマー01、02、03、および04はBBA-21
87 scFv ＤＮＡを構築するために、プライマー01、02、
04、および05はBBA-2617 scFv ＤＮＡを構築するため
に、プライマー06、07、08、および09はBKE-3430 scFv
ＤＮＡを構築するために、プライマー01、02、03、およ
び10はBTE-3456 scFv ＤＮＡを構築するためにそれぞれ
使用した。プライマー01、および06は制限酵素NcoIを、
プライマー04、09、および10は制限酵素NheIを認識する
塩基配列を含み、プライマー02、03、05、07、および08
は合成ペプチドリンカーをコードする塩基配列を含んで
おり、それぞれ下線で示している。

【００６５】抗ビスフェノールＡ組換え抗体ＤＮＡは、
ＰＣＲにより構築した。まず、重鎖および軽鎖可変領域
をコードするｃＤＮＡ断片を増幅させるために、4 種の
モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖可変領域をコード
するｃＤＮＡが挿入されたプラスミドと、各々に対応し
たプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応
液の組成は、例えばBBA-2187の重鎖を増幅する場合、1
μL の50x AdvantagecDNA Polymerase Mix(Clontech社
より購入) 、5 μL の10x cDNA PCR ReactionBuffer(Cl
ontech 社より購入) 、1 μL の50x dNTP Mix(Clontech
社より購入)、0.5 μL の組換えプラスミド（この場合
はBBA-2187の重鎖可変領域をコードするcDNA断片が挿入
された組換えpT7Blue T-vector）（100 ng）、0.5 μL
のプライマー01（50 pmol ）、0.5 μL のプライマー02
（50 pmol ）、41.5μL の滅菌水で全量を50μL とし
た。ＰＣＲの条件は94℃で30秒、63℃で1 分、72℃で1.
5分の反応を30回繰り返した。同様にして、4 種の抗ビ
スフェノールＡモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖を
コードするｃＤＮＡをそれぞれ増幅した後、計8 種の反
応液を1.5%アガロースゲルで電気泳動した結果、軽鎖可
変領域をコードする約400bp のｃＤＮＡ断片と重鎖可変
領域をコードする約400bp のｃＤＮＡ断片の増幅をそれ
ぞれ確認した。前記8 種のｃＤＮＡ断片をそれぞれ精製
し、ＰＣＲ反応により重鎖および軽鎖可変領域を連結し
た一本鎖可変領域（scFv）ＤＮＡを構築した。ＰＣＲ反
応液の組成は、例えばBBA-2187 scFv ＤＮＡを構築する
場合、21.5μL のBBA-2187の重鎖をコードするｃＤＮＡ
溶解液、21.5μL のBBA-2187の軽鎖をコードするｃＤＮ
Ａ溶解液、5 μL の10x cDNA PCR Reaction Buffer、1
μL の50x dNTP Mix、1 μL の50x Advantage cDNA Pol
ymerase Mix で全量を50μL とした。ＰＣＲ条件は、94
℃で30秒、55℃で1 分、72℃で1.5 分の反応を7回繰り
返した。その後、以下の反応液を調製し、それぞれの反
応液に加えた。例えばBBA-2187 scFv ＤＮＡを構築する
場合、1 μL の50x Advantage cDNA Polymerase Mix 、
5 μL の10x cDNA PCR Reaction Buffer、1 μL の50x
dNTP Mix、0.5 μL のプライマー01（50 pmol ）、0.5
μL のプライマー04（50 pmol ）、42μL の滅菌水で全
量を50μL とし、ＰＣＲ反応液に加えた。ＰＣＲの条件
は、94℃で30秒、63℃で1 分、72℃で1.5 分の反応を30
回繰り返した。同様に、他のｃＤＮＡについてもＰＣＲ
反応を行い、これらの反応液を1.5%アガロースゲルで電
気泳動し、約750bp のBBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv
、BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv ｃＤＮＡ断片の増
幅を確認し、精製した。

【００６６】実施例４ 抗ビスフェノールＡ組換え抗体発現プラスミドの構築 実施例３で調製したBBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv 、
BKE-3430 scFv 、BTE-3456 scFv ｃＤＮＡ断片をクロー
ニングベクターpT7Blue T-vectorに挿入し、大腸菌JM10
9 株を形質転換した。増殖した大腸菌から導入した組換
えプラスミドを抽出し、抗ビスフェノールＡ組換え抗体
BBA-2187 scFv 、BBA-2617 scFv 、BKE-3430 scFv 、BT
E-3456 scFv の塩基配列を確認した。4 種の組換え抗体
ＤＮＡを挿入した4 種の組換えプラスミドおよび大腸菌
発現ベクターpET-27b を制限酵素NcoIおよびNheIでそれ
ぞれ消化し、組換え抗体をコードするＤＮＡ断片と大腸
菌発現ベクターpET-27b を連結して4 種の抗ビスフェノ
ールＡ組換え抗体発現プラスミドpET-27b/BBA-2187 scF
v 、pET-27b/BBA-2617 scFv 、pET-27b/BKE-3430 scFv
、pET-27b/BTE-3456 scFv を構築した。

【００６７】実施例５ 抗ビスフェノールＡ組換え抗体の調製 実施例４で調製した4 種の抗ビスフェノールＡ組換え抗
体発現プラスミドpET-27b/BBA-2187 scFv 、pET-27b/BB
A-2617 scFv 、pET-27b/BKE-3430 scFv 、pET-27b/BTE-
3456 scFv を大腸菌BL21DE3(pLysS)株に導入した。形質
転換コロニーを50μg/mLのアンピシリン（ナカライテス
クより購入）および33μg/mLのクロラムフェニコール
（ナカライテスクより購入）を含む、5 mLの2xYT培地
（1.7%（w/v）Bacto-trypton （Difco 社より購入）、1
%（w/v ）Bacto-yeast extract （Difco 社より購
入）、0.5%（w/v ）NaCl（ナカライテスクより購入）)
に植菌し、23℃で一晩震盪培養した。この懸濁液を800
mLのSB培地（3.5%（w/v ）Bacto-trypton 、2%（w/v ）
Bacto-yeast extract 、0.5%（w/v ）NaCl）に懸濁し、
23℃で一晩震盪培養した。この懸濁液にIPTG（ナカライ
テスクより購入）を終濃度1mMとなるように添加し、さ
らに23℃で6 時間震盪培養した後、1500g で20分間遠心
分離し、上清を除去した。沈澱した菌体を氷冷した32 m
L の1xTES 緩衝液（0.2 M Tris-HCl（pH8.0 ）、0.5 mM
EDTA 、0.5 M スクロース（それぞれナカライテスク
より購入））に懸濁し、さらに、氷冷した48 mL の0.2x
TES 緩衝液（0.04 M Tris-HCl （pH8.0 ）、0.1 mM EDT
A 、0.1 M スクロース）を加え、十分に撹拌した。こ
の懸濁液を30分間氷冷した後、15000gで10分間遠心分離
し、得られた上清を抗ビスフェノールＡ組換え抗体とし
て使用した。

【００６８】実施例６ ビスフェノールＡ間接競合ＥＬＩＳＡ 96穴マイクロタイタープレートに、0.1 μg/mLのビスフ
ェノールＡハプテンとRSA の結合体（混合酸無水物法を
用いて調製) を100 μL ずつ各ウェルに分注し、4 ℃で
一晩放置した。内溶液を除去した後、蒸留水で4 倍希釈
したブロックエース（大日本製薬より購入）を各ウェル
に300 μL ずつ分注し、4 ℃で一晩放置した。内溶液を
除去した後、リン酸緩衝液（10mM リン酸ナトリウム
（ナカライテスクより購入）、154 mM NaCl、pH7.2 ）
で段階的に希釈したビスフェノールＡ標準溶液を各ウェ
ルに50μL ずつ分注し、実施例５で調製した抗ビスフェ
ノールＡ組換え抗体をリン酸緩衝液で希釈して、各ウェ
ルに50μL ずつ分注した。25℃で1 時間インキュベート
した後、リン酸緩衝液で各ウェルを5 回洗浄した。調製
した組換え抗体にはHSV タグが結合していることから、
次にリン酸緩衝液で0.1 μg/mLに希釈したマウス抗HSV
タグ抗体（Amersham Pharmacia Biotech社より購入）を
各ウェルに100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュ
ベートすることにより、抗HSV タグ抗体をビスフェノー
ルＡハプテンとRSA の結合体と結合した組換え抗体に結
合させた。リン酸緩衝液で各ウェルを5 回洗浄し、リン
酸緩衝液で2,000 倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス抗体・抗体（Pierce社より購入）を各ウェルに
100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュベートし
た。リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗浄した後、発色基
質溶液を各ウェルに100 μL ずつ分注した。室温で10分
間インキュベートした後、1 N 硫酸を100 μL ずつ分注
して酵素反応を停止し、450 nmの吸光度を測定した。

【００６９】対照として、製造例１で調製したハイブリ
ドーマ由来のモノクローナル抗体で間接競合ＥＬＩＳＡ
を行った。リン酸緩衝液で段階的に希釈したビスフェノ
ールＡ標準溶液を各ウェルに50μL ずつ分注し、抗ビス
フェノールＡモノクローナル抗体をリン酸緩衝液で希釈
して、各ウェルに50μL ずつ分注した。25℃で1 時間イ
ンキュベートした後、リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗
浄し、リン酸緩衝液で2,000 倍希釈したペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウス抗体・抗体（Pierce社より購入）を
各ウェルに100 μL ずつ分注し、25℃で1 時間インキュ
ベートした。リン酸緩衝液で各ウェルを3 回洗浄した
後、発色基質溶液を各ウェルに100 μL ずつ分注した。
室温で10分間インキュベートした後、1 N 硫酸を100 μ
L ずつ分注して酵素反応を停止し、450 nmの吸光度を測
定した。

【００７０】結果を図１に示す。図１から明らかなとお
り、4 種の抗ビスフェノールＡ組換え抗体は、いずれも
元のモノクローナル抗体より高い反応性を示した。

【００７１】配列表のフリーテキスト 配列番号：１７〜２８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
は、合成プライマーであり、配列番号：２９に記載のア
ミノ酸配列からなるペプチドは、リンカーである。

【００７２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BIO APPLIED SYSTEMS Inc. <120> A DNA Encoding anti-BisphenolA Antibody, Recombinant Protein and a Method for producing thereof <130> P01088HS <160> 29 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 1 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tatataaggt acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaaattga attctgtgac tcctgaggac acagctacat attactgtgc aagagtattg 300 ggacggggct atggtttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Arg Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 3 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatggcc tacataaggt acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc aagagtattg 300 ggacggggct atggtttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Ala Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Leu Gly Arg Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 366 <212> DNA <213> Mouse <400> 5 gacgtgaagt tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt cactttcaga aactattaca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtt ggtcgcaggc attaatacca atggtggttt cacctactat 180 ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acggccttct actattgtgc aagaccggag 300 tttgatactt cctacgtagc ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Mouse <400> 6 Asp Val Lys Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Thr Asn Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Glu Phe Asp Thr Ser Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 7 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcactc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactgggta ttccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataaact acgacggcag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catcaaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga cttctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc acgagtctat 300 agttactacg atggtctgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser His 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Tyr Ser Tyr Tyr Asp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 333 <212> DNA <213> Mouse <400> 9 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctacct atagttattt acactggtac 120 caacagagac caggacagcc acccaaactc atcaagtatg tatccaacct agaatctggg 180 gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240 gtggaggagg aggatactgc aacatattac tgtcagcaca gttgggagat tcctccgacg 300 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgg 333 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Mouse <400> 10 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Ile Lys Tyr Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 65 70 75 80 Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp Glu 85 90 95 Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Mouse <400> 11 gacattgtgc tgacacagtt tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aactgtcagt acatctaggt ttaattatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 336 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Mouse <400> 12 Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Thr Ser 20 25 30 Arg Phe Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> Mouse <400> 13 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaactttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcat actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 ctgacgttcg gttctgggac caagctggag ctgaaacgg 339 <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Mouse <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> Mouse <400> 15 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtgt ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt atatctggca atagtcatat gcactggtac 120 caacagagac caggacaggc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcaac acagtaggga acttcctccc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgg 336 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Mouse <400> 16 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ile Ser 20 25 30 Gly Asn Ser His Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 agatggatac agttggtgca gcatcagc 28 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 accgatgggg ctgttgtttt ggc 23 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccatggatga tgtacagctt caggagtcag gac 33 <210> 20 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgaggagacg gtgactgagg tt 52 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattgtgc tgacacagtc tcct 54 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gctagcccgt ttgatttcca gcttggt 37 <210> 23 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattgtgc tgacacagtt tcct 54 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccatggatga cgtgaagttc gtggagtctg 30 <210> 25 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgcagagaca gtgaccagag tcc 53 <210> 26 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gatgttgtga tgacccaaac tcc 53 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gctagcccgt ttcagctcca gcttg 25 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gctagcccgt tttatttcca actttgtcc 29 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各種のモノクローナル抗体またはそれ
に対応する組換え抗体（scFv）とビスフェノールＡとの
反応性を、間接競合ＥＬＩＳＡにより測定したグラフで
ある。グラフの横軸は添加したビスフェノールＡの濃度
を示し、縦軸は、[ ビスフェノールＡ添加区の吸光度
（Ｂ）／ビスフェノール未添加区の吸光度（Ｂ０）] ×
１００（％Ｂ／Ｂ０と略す）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者 三宅 司郎 京都府京都市南区吉祥院宮の東町２番地 株式会社バイオ・アプライド・システムズ 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA41 BA53 CA04 DA06 EA04 GA03 GA11 GA19 HA03 HA15 4B064 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA26X AA92X AA99Y AB01 AB05 AC14 AC15 BA02 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA50 FA72 FA73 FA74

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ） 配列番号：２、４、６、８、１
   ０、１２、１４または１６に記載のアミノ酸配列からな
   る抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可
   変領域をコードするＤＮＡ、（ｂ） 配列番号：２、
   ４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載のアミ
   ノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が欠
   失、置換および／または付加された配列からなるペプチ
   ドをコードするＤＮＡ、（ｃ） 配列番号：１、３、
   ５、７、９、１１、１３または１５に記載の塩基配列か
   らなり、抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域または
   軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、（ｄ） 配列番号：
   １、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の塩
   基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換およ
   び／または付加された配列からなるＤＮＡ、ならびに
   （ｅ） 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３ま
   たは１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
   からなる群より選ばれるＤＮＡであって、かつビスフェ
   ノールＡと相互作用する組換えタンパク質を構成可能で
   あるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含んでなるベ
   クター。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のベクターを導入してな
   る形質転換体。
4. 【請求項４】 抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域
   および／または軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質を
   製造する方法であって、請求項４に記載の形質転換体を
   培養し、当該培養物から抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖
   可変領域および／または軽鎖可変領域を含有する組換え
   タンパク質を回収する工程を含む方法。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の方法によって製造され
   た、抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域および／ま
   たは軽鎖可変領域を含む組換えタンパク質。
6. 【請求項６】 抗ビスフェノールＡ抗体の重鎖可変領域
   と軽鎖可変領域がリンカーで連結している、請求項５に
   記載の組換えタンパク質。
7. 【請求項７】 請求項５または６に記載の組換えタンパ
   ク質を含んでなるビスフェノールＡの測定キット。
8. 【請求項８】 請求項５もしくは６に記載の組換えタン
   パク質または請求項７に記載のキットを用いることを特
   徴とするビスフェノールＡの測定方法。