JP7318865B2 - 貝類の受動免疫方法 - Google Patents

Description

本発明は、貝類に起因するヒト食中毒を防止するために、貝類の体内に取り込まれている大腸菌，腸炎ビブリオ菌及びノロウイルス等の不活化方法に関する。

貝類に起因する食中毒を防止するには、貝類の体内に取り込まれている細菌やウイルス等の人工浄化が必要である。
例えば、ノロウイルスは牡蠣の中腸腺に取り込まれており、これをヒトが食すると腸粘膜細胞にて感染及び増殖することで、食中毒症状が発現する。
これまで、貝類の出荷にあっては、滅菌された海水にて人工的に浄化することが行われているが、ノロウイルス等は感染力が強く、ヒトが１０～１００個程度摂取したのみでも発症する場合があり、本出願人は先に多くの種類の遺伝子型を有するノロウイルスに対しても、不活化が可能な免疫グロブリンを提案している（特許文献１）。
本発明は、これまで行われている貝類の人工浄化システムに免疫グロブリンによるウイルス等の不活化技術を適用すべく研究を重ねた結果、本発明に至った。

特願２０１８－０３９４１０号

本発明は、貝類の人工浄化システムに一体化するのに有効な貝類の受動免疫方法の提供を目的とする。

本発明に係る貝類の受動免疫方法は、貝類が畜養されている水槽に所定の濃度になるように免疫グロブリンを添加することで前記貝類の体内に前記免疫グロブリンを取り込ませることを特徴とする。

貝類が畜養されている水槽においては、貝類が海水を体内に取り込み、海水中の酸素や栄養源を得るための生理活動を行っている。
人工浄化は、この生理活性を利用して貝類の体内から細菌やウイルス等を除去する方法である。
しかし、水槽に単に免疫グロブリンを添加しただけでは貝類が生理的な拒否反応を示し、体内に取り込まないことが研究により明らかになった。
そこで本発明は、貝類が取り込みやすい条件が得られた点に特徴がある。
例えば牡蠣の場合には、免疫グロブリンは鳥類由来の免疫グロブリンであり、前記水槽に終濃度２５～５００ｎｇ／ｍｌの範囲になるように添加し、２時間以上畜養するのが好ましい。

貝類の人工浄化には、これまでに紫外線照射や、オゾン，残留濃度０．２ｐｐｍ程度の次亜塩素酸ナトリウム等の薬剤が使用されている。
本発明は、これらの人工浄化システムに受動免疫方法を組み込むことに成功したものである。
例えば、浄化を目的に貝類が畜養されている水槽は紫外線照射された海水が循環されており、前記紫外線照射をＯＦＦの状態にし、あるいはＯＮの状態で浄化水の循環を維持しながら前記免疫グロブリンを前記水槽に添加することができる。
また、水槽に薬剤にて滅菌された海水がかけ流されている場合には、前記かけ流しを停止した後に前記免疫グロブリンを前記水槽に添加するのが好ましい。

貝類は、海水を体内に取り込み海水中の酸素を吸収するための繊毛運動とともにプランクトンを濾し取り栄養源としている。
本発明は、この生理活性を利用して人工浄化水槽内の滅菌海水に抗ヒト食中毒病原体免疫グロブリンを所定の濃度となるように添加することで、貝類が体内に免疫グロブリンを取り込み受動免疫が成立する。
この受動免疫により、貝類の体内に取り込まれている大腸菌，腸炎ビブリオ菌及びノロウイルス等のヒト食中毒病原体の感染性が不活化される。
加えて、人工浄化水槽内にて貝類が新たに取り込む上記病原体に対しては、体内に滞留する免疫グロブリンによって感染性が不活化される。
従来の人工浄化方法である紫外線照射滅菌海水のろ過循環方法、清浄海水または次亜塩素酸ナトリウム添加による滅菌海水の規定時間以上のかけ流し方法では食中毒を発症させない程度の十分な浄化効果が実現できなかったが、鳥類由来の免疫グロブリンを活用した受動免疫法と既存の人工浄化システムと組み合わせて一体化したことにより、生食用としてより安全な貝類を提供することができる。

免疫グロブリンを人工浄化水槽に添加するにあたり、貝類生産現場で用いられている既存の人工浄化システムに、所定の濃度になるように人工浄化水槽の浄化海水に直接投入するのみであり、新たな装置や改装が不要であることから貝類生産現場での設備投資はなく極めて簡易的な方法で効果が得られる。

抗ヒト食中毒病原体免疫グロブリンを鳥類に産生させて産卵する卵を原料とすることで、貝類の人工浄化に用いる大量の清浄海水への抗ヒト食中毒病原体免疫グロブリンの所定濃度の添加に対応できる。
本発明では、精製免疫グロブリンではなく卵黄水溶性蛋白質の抽出液とすることで、安価に大量製造を可能として低コストで効果が得られる。

紫外線照射滅菌方式浄化システムの全体構成例を模式的に示す。 薬剤滅菌方式の浄化システムの全体構成例を模式的に示す。

本発明に用いる免疫グロブリンは、前述した特許文献１の内容を取り込むことができるが、その概要は次のとおりである。
貝類由来の食中毒病原体を病原体ごとに作製し抗原としてオイルアジュバンドと混和する。
それを鳥類の筋肉内に接種し一定間隔ごとに追加接種することで、接種抗原に対する高抗体力価の特異抗体を産生させる。

上記の接種鳥類が産卵した卵に含まれる抗ヒト食中毒病原体免疫グロブリンの抗体力価を確認し、卵黄水溶性蛋白質を分画して抽出液を製造する。
この抽出液をフィルターろ過滅菌し、冷蔵もしくは冷凍させたものを用いる。

本発明は、貝類が畜養されている水槽に上記免疫グロブリンが含まれている抽出液を添加することになるが、その一実施態様として、紫外線照射滅菌海水のろ過循環式人工浄化システムでは、紫外線照射をＯＦＦの状態にし、あるいはＯＮの状態にて浄化水の循環を維持しながら、所定の数量の貝類を畜養した人工浄化水槽の浄化海水に免疫グロブリンが終濃度２５～５００ｎｇ／ｍｌの範囲になるように添加する。
免疫グロブリン添加後２時間以上畜養して受動免疫を成立させる。
次に紫外線照射ＯＮの状態で所定の換水又は循環水量にて規定時間以上人工浄化して水揚げする。

また、他の実施態様として、次亜塩素酸ナトリウム等の薬剤添加滅菌海水または、紫外線照射、オゾン使用による滅菌海水のかけ流し式人工浄化システムでは、所定の数量の貝類を畜養した人工浄化水槽で規定の注入量及び時間のかけ流しを行った後に、かけ流し注入を停止し満水状態の水槽に免疫グロブリンが終濃度２５～５００ｎｇ／ｍｌの範囲になるように添加して、貝類が海水取り込みや呼吸などの生理活性を維持した状態で２時間以上畜養して受動免疫を成立させて水揚げする。

以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、一例を説明するためのものであり、本発明はこれに限定されるものではない。

＜抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液の作製＞
遺伝子組換え技術で発現させたノロウイルス様中空粒子（ＶＬＰ：Virus like particle）とオイルアジュバントの混和物を産卵鶏の胸筋内に接種し、接種鶏が産卵した卵の卵黄より抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液を製造した。

＜抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液の抗ノロウイルス活性評価試験＞
抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液の抗ノロウイルス活性評価試験を実施した。
リン酸緩衝液にノロウイルスＶＬＰをウイルス粒子数相当として、１×１０^９／ｍＬ、１×１０^８／ｍＬ、１×１０^７／ｍＬ、１×１０^６／ｍＬの各濃度になるように調製した。抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液中の免疫グロブリン濃度が２２,５００ｎｇ／ｍＬ、２,２５０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液で希釈調製した。各濃度ノロウイルスＶＬＰ溶液と各濃度免疫グロブリン溶液を１：１で混合し混合溶液１００μＬを体外診断用医薬品ノロウイルス抗原キット「イムノキャッチ－ノロ」にアプライして、ノロウイルス抗原の有無の判定を行った。

その結果を表１に示す。
抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液中の免疫グロブリン濃度が２２,５００ｎｇ／ｍＬでノロウイルスＶＬＰ １×１０^８／ｍＬ濃度溶液まで陰性反応を示した。
同様に２,２５０ｎｇ／ｍＬでは１×１０^７／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬでは１×１０^６／ｍＬ濃度まで陰性反応を示した。
抗ノロウイルスＶＬＰ抗体の特異的結合反応によって、ノロウイルス抗原性をなくしたことからノロウイルスの感染性を不活化したことになる。
また、免疫グロブリン濃度に比例してノロウイルス抗原性をなくすことのできるノロウイルスＶＬＰ量の比例関係が確認された。

＜浄化海水に添加するする鶏卵黄由来免疫グロブリンの最適濃度確認試験＞
浄化海水中の免疫グロブリン濃度が２,５００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように、抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液を水槽に添加した。
卵黄水溶性蛋白質抽出液を添加後均一になるよう混ぜた後、浄化海水をサンプリングした。
各免疫グロブリン濃度浄化海水の水槽に牡蠣を入れて一晩畜養後、牡蠣中腸腺をサンプリングして、下記ＥＬＩＳＡ法を用いて中腸腺内の免疫グロブリン濃度を定量した。
抗ニワトリＩｇＧヤギＩｇＧをＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに一晩吸着固相化させた後、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔを分注して１時間ブロッキングし、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。
中腸腺乳剤または、卵黄水溶性蛋白質抽出液添加浄化海水及び、検量線用の既知ニワトリＩｇＧを適性濃度に希釈して１００μＬをウエルに分注して１時間反応させた後、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄した。
抗ニワトリＩｇＧヤギＩｇＧ標識抗体を各ウエルに分注し１時間反応後、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して３０分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させＯＤ値を測定し、検量線より総ニワトリＩｇＧ抗体濃度を算出した。

その結果を表２，３に示す。
表２の結果から、浄化海水に卵黄水溶性蛋白質抽出液を添加して混合した後の浄化海水中の免疫グロブリン濃度は、理論値に近い濃度が確認された。
表３に示すように一晩畜養後の牡蠣中腸腺乳剤中の免疫グロブリン濃度は、２,５００ｎｇ／ｍＬ濃度区では１０検体のうち３検体が検出限界以下であった。
これに対して２５０ｎｇ／ｍＬの濃度区では、１０検体のすべてにて免疫グロブリンの体内への取り込みが確認された。
この事実は、人工浄化水槽に単に免疫グロブリンを添加するだけでは受動免疫を成立させることができないことを意味している。
これは、浄化海水中に２，５００ｎｇ／ｍＬのような高濃度の免疫グロブリンを添加した場合に、牡蠣がこれまでとは違う環境に変化したと判断し、海水を体内に取り込まなくなったものと推定される。
また、５０ｎｇ／ｍＬ濃度では検出限界以下が１検体存在したが、平均して中腸腺１ｇあたり１１ｎｇの免疫グロブリンが検出された。
これらの試験結果から、添加する免疫グロブリンの濃度は２，５００ｎｇ／ｍＬ以下である必要があり、２５～５００ｎｇ／ｍＬの範囲がよい。
より好ましくは、５０～５００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

＜牡蠣の免疫グロブリン取込み量の経時推移確認試験＞
浄化海水中の免疫グロブリン濃度が１２５ｎｇ／ｍＬとなるように、抗ノロウイルスＶＬＰ抗体を含有する卵黄水溶性蛋白質抽出液を水槽に添加した。
卵黄水溶性蛋白質抽出液を添加後均一になるよう混ぜた後、各免疫グロブリン濃度浄化海水の水槽に牡蠣を入れて、１、２、３、６時間ごとに牡蠣を水揚げして牡蠣中腸腺をサンプリングした。
ＥＬＩＳＡ法を用いて中腸腺内の免疫グロブリン濃度を定量した。

その結果を表４に示す。
畜養１時間では５検体中２検体が検出限界以下であったが、２時間以降では全検体より免疫グロブリンが検出された。
免疫グロブリン１２５ｎｇ／ｍＬ濃度の浄化海水の畜養において、２時間時点で中腸腺１ｇあたり２２ｎｇの免疫グロブリンが検出されたことから、受動免疫の成立は２時間以上の畜養で十分であることが確認された。

＜紫外線照射滅菌海水のろ過循環式人工浄化システムにおける牡蠣の免疫グロブリン取込み確認試験＞
養殖牡蠣の一般生産者で使用されている紫外線照射滅菌海水のろ過循環式人工浄化システムにおける牡蠣の免疫グロブリン取込み確認試験を実施した。
図１に、紫外線照射滅菌方式の人工浄化システムの構成例を模式的に示す。
貝類が畜養される浄化水槽４を有し、浄化水槽４には自然海水を給水ポンプ１ａにてポンプアップし、ろ過装置２を経由して給水される。
浄化水槽４に所定量の海水が貯えられると、循環ポンプ１ｂにてろ過装置２を経由して浄化水が循環するが、その途中に紫外線照射装置３にて海水が滅菌され、浄化水槽４に循環供給される。
水槽容量に対する規定の数量の牡蠣を浸漬して人工浄化システム装置の紫外線照射のみOFFにしてろ過循環及びエアレーションは稼働した状態にて浄化海水に卵黄水溶性蛋白質抽出液を添加した。
１日畜養後に人工浄化水槽の各場所より牡蠣をサンプリングした。継続して紫外線照射をONにしてろ過循環及びエアレーションも稼働した状態で１日畜養して、計２日畜養した牡蠣を人工浄化水槽の中央部の水深中段より牡蠣をサンプリングした。
ＥＬＩＳＡ法を用いて中腸腺内の免疫グロブリン濃度を定量した。

その結果を表５，６に示す。
一般生産者で使用されている紫外線照射滅菌海水のろ過循環式人工浄化システムにおいても牡蠣の免疫グロブリンの取り込みが確認された。
人工浄化水槽で牡蠣の浸漬させた場所、水深部による免疫グロブリンの取込みに大きな差は認められず、免疫グロブリン濃度が均一な浄化海水が人工浄化水槽全体を流水していることが確認された。
また、牡蠣の取り込まれた免疫グロブリンは人工浄化システムの紫外線照射に関係なく中腸腺内を滞留していることが確認された。
上記人工浄化システムにおいて人工浄化前に貝類の体内に取り込まれた病原体の感染性の不活化と人工浄化水槽内にて貝類が新たに取り込む病原体に対しても同様に感染性の不活化のための受動免疫の成立が確認された。

＜残留塩素濃度０．２ｐｐｍ浄化海水における免疫グロブリン安定性確認試験＞
貝類の人工浄化方法として、残留塩素濃度が０．２ｐｐｍになるように次亜塩素酸ナトリウムを添加した滅菌海水を規定の注入量及び時間のかけ流しが一般的に普及している。
その薬剤滅菌方式の浄化システムの構成例を図２に模式的に示す。
図１の方式と相違する点を説明すると、薬液タンク６と薬液添加装置５を有し、所定の濃度になるように次亜塩素酸ナトリウムの薬液が浄化水槽４にかけ流される。
かけ流し人工浄化システムと受動免疫法と低コストで組み合わせるためには、かけ流しを行った後に、かけ流し注入を停止し満水状態の人工浄化水槽に免疫グロブリンを所定の濃度になるように添加して、貝類が海水の取り込みや呼吸などの生理活性を維持した状態で２時間以上畜養を必要とする。
よって、人工浄化水槽内の残留塩素濃度０．２ｐｐｍの滅菌海水においる免疫グロブリンの安定性確認試験を実施した。
残留塩素濃度測定キットを用いて、自然海水に次亜塩素酸ナトリウムを添加して０．２ｐｐｍであることを確認した後、理論上免疫グロブリン濃度が１２５ｎｇ／ｍＬになるように卵黄水溶性蛋白質抽出液を添加した。
良く撹拌して１０分後に海水をサンプリングした。
ＥＬＩＳＡ法を用いて海水中の免疫グロブリン濃度を定量した。

理論上免疫グロブリン濃度が１２５ｎｇ／ｍＬに対して、測定結果は１０５ｎｇ／ｍＬであり、残留塩素濃度０．２ｐｐｍ海水において免疫グロブリンは安定であることが確認された。
参考として残留塩素濃度０．６ｐｐｍでは免疫グロブリン濃度が６５％減少した。
残留塩素濃度０．２ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウムを添加した滅菌海水かけ流し人工浄化方法では、かけ流し滅菌海水の全てに免疫グロブリンを添加することは非効率でコスト的に現実的でない。
しかし、かけ流し終了後の人工浄化水槽内の残留塩素濃度０．２ｐｐｍの滅菌海水に卵黄水溶性蛋白質抽出液を添加しても免疫グロブリンが安定であることから、貝類が海水の取り込みや呼吸などの生理活性を維持した状態で２時間以上畜養することで受動免疫を成立することが示唆された。

本発明は、例えば鳥類が持つ生体の免疫防御システムで重要な役割を担う免疫グロブリンを貝類の体内に取り込ませて受動免疫を活用することで、有機物が存在する貝類の消化器官内でターゲットとするヒト食中毒病原体と瞬時に特異的抗原抗体反応で結合し感染性を不活化できる。
鳥類由来の免疫グロブリンを活用した受動免疫法と既存の人工浄化システムと組み合わせた一体化は、生食用としてより安全な貝類を提供することが可能である。
免疫グロブリンは、このような特性を持ちながら貝類の組織に作用しないこと及び免疫グロブリンを含む卵黄水溶性蛋白質抽出液も無味無臭であり貝類の品質を低下させないこと、鶏卵そのものがヒトに食されても安全であることから本来の貝類の風味を維持しつつ安心安全な食材の提供はできることは産業上の有効性は極めて大きい。
既存の人工浄化システムをそのまま使用でき、卵黄水溶性蛋白質抽出液を人工浄化水槽に直接投入するのみと極めて簡易的な方法で効果が得られるため汎用性が高く迅速な普及が期待される。

１ａ 給水ポンプ
１ｂ 循環ポンプ
２ ろ過装置
３ 紫外線照射装置
４ 浄化水槽
５ 薬液添加装置
６ 薬液タンク

Claims (3)

1. 貝類が畜養されている浄化水槽に所定の濃度になるように免疫グロブリンを添加することで前記貝類の体内に前記免疫グロブリンを取り込ませるものであり、
   前記免疫グロブリンは鳥類由来の免疫グロブリンであり、前記浄化水槽に終濃度２５～５００ｎｇ／ｍｌの範囲になるように添加し、２時間以上畜養することを特徴とする貝類の受動免疫方法。
2. 前記浄化水槽は紫外線照射された海水が循環されており、前記紫外線照射をＯＦＦの状態にし、あるいはＯＮの状態を維持しながら前記免疫グロブリンを前記浄化水槽に添加することを特徴とする請求項１記載の貝類の受動免疫方法。
3. 前記浄化水槽には薬剤にて滅菌された海水がかけ流されており、前記かけ流しを停止した後に前記免疫グロブリンを前記浄化水槽に添加することを特徴とする請求項１記載の貝類の受動免疫方法。

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