CN117405885A - 一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于NTri的三价适配体比色‑荧光双信号检测沙门氏菌的方法，特点是包括将链酶亲和素化纳米磁珠溶液与生物素化适配体溶液混合，加入D‑生物素进行封闭后洗涤再复溶于磷酸盐缓冲液，得到用于捕获沙门氏菌的适配体磁珠溶液的步骤；将四条单链DNA溶液混合，并用TMS缓冲液定容后，将溶液于95℃加热4分钟并迅速降温得到基于NTri的三价适配体的步骤；取适配体磁珠溶液与待测沙门氏菌溶液混合，加入基于NTri的三价适配体溶液制备得到磁珠‑沙门氏菌‑NTri三明治复合物的步骤；最后进行比色法和荧光法检测，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度的步骤，优点是灵敏度高、特异性强且准确性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种沙门氏菌的检测方法，尤其是涉及一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法。
背景技术
食源性疾病已成为全球日益关注的问题。沙门氏菌作为最普遍的食源性细菌病原体，已导致大量食物中毒、疾病和死亡。据报道，全世界每年有超过1亿人被感染沙门氏菌，37万人死于沙门氏菌。据世界卫生组织(WHO)估计，全球每年有超过1600万例沙门氏菌感染。更糟糕的是，如果不及时治疗感染，最终死亡率可能达到10％。对沙门氏菌的灵敏可靠的检测可以有效控制其污染并在食物链中的进一步传播。传统的沙门氏菌检测策略主要基于微生物培养、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。微生物培养作为金标准方法，耗时长(4-7天)且费力，不适合快速筛选和现场应用。PCR核酸分析具有较高的灵敏度和特异性，但操作繁琐，需要技术人员和设备。ELISA检测具有良好的特异性，但灵敏度低，检测限仅为104CFUmL-1。因此，迫切需要开发高灵敏度、简单、快速的沙门氏菌检测方法。
核酸适配体，也称为化学抗体，已成为细菌检测领域非常有前途的识别元件候选者。它们是单链核酸低聚物，可以通过形成独特的二级或三级结构以高特异性结合到靶标上。与抗体相比，核酸适配体具有许多独特的优势，如优异的化学稳定性、经济高效且易于合成和修饰、批次间一致性等，这些优势使核酸适配体在沙门氏菌检测中的应用得以广泛应用。然而，由于食品基质诱导的亲和力降低，适配体单体在实际样品的细菌检测中亲和力和特异性低。
多价适配体是将适配体单体组装到纳米颗粒、脂质体或DNA纳米结构等支架上，以增加局部适配体密度和协同结合，从而显著增强亲和力和特异性。在这些支架中，DNA纳米结构，因其精确控制和可编程性的特点而备受关注。例如，已经报道的编程立方体、五角形结构、DNA纳米三角锥等DNA纳米结构具有比单价适配体高得多的亲和力，并应用于病原体的检测。因此，基于DNA纳米结构的多价适配体在细菌的灵敏检测中显示出巨大的潜力。
比色传感器是最具吸引力的光学检测方法之一，因为它们具有操作简单、分析经济高效、结果快速且无需复杂设备的优点。但是，它们的检测灵敏性差，容易受到操作条件和生物环境变化的干扰。另一方面，荧光检测测定始终具有高灵敏度和强大的抗干扰性。因此，结合多种传感模式在多个领域的独特优势，开发基于荧光和比色的双模式检测方法，以提高检测的灵敏度、稳定性和准确性。例如，Wang的小组基于双模式检测的优势设计了一种比色/荧光双读出传感系统，用于简单灵敏地检测大肠杆菌。遗憾的是，许多双信号检测方法依赖于合成金属纳米材料，功能性金属纳米材料的制备通常涉及苛刻的条件，如需要有毒试剂、强化学试剂、高温高压等对环境有害且难以复制。目前，国内外还没有公开关于基于DNA三角形纳米结构(Nanotriangle，NTri)构建平面三价适配体的荧光/比色双信号检测沙门氏菌的方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强且准确性好的基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，包括以下步骤：
(1)适配体磁珠的制备
将1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠溶液与1μM生物素化适配体溶液(biotin-Apt)混合并在室温反应45分钟，随后加入4μM D-生物素进行封闭后，用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，再复溶于磷酸盐缓冲液，得到用于捕获沙门氏菌的适配体磁珠溶液；所述的链酶亲和素化纳米磁珠、所述的生物素化适配体溶液和所述的磷酸盐缓冲液的体积比为1：1：2：1；
(2)基于NTri的三价适配体的制备
将2.5μL 10μM的四条单链DNA溶液混合，并用TMS缓冲液定容至25μL后，将溶液于95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟，得到基于NTri的三价适配体；所述的四条单链DNA包括一条骨架链L和三条可通过碱基互补结合到骨架链L的沙门氏菌适配体；
(3)磁珠-沙门氏菌-NTri三明治复合物的制备
取10μL步骤(1)中制备的适配体磁珠溶液与200μL待测沙门氏菌溶液混合，于室温反应45分钟，用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤三次后，加入25μL步骤(2)中制备的基于NTri的三价适配体溶液，随后于室温反应45分钟，经三次磁分离洗涤后复溶于10μL磷酸盐缓冲液，得到磁珠-沙门氏菌-NTri三明治复合物；
(4)比色法检测沙门氏菌
取步骤(3)得到的三明治复合物加入10μL链霉亲和素化的辣根过氧化物酶于37℃反应30分钟后洗涤三次，然后加入10μLPBS缓冲液和20μLTMB进行颜色反应后，用20μLH2SO4停止反应后，通过酶标仪(SpectraMax)在450nm处测量所得溶液，根据不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度；
(5)荧光法检测沙门氏菌
取10μL步骤(3)得到的三明治复合物加入10μL 2×Sybr Green I，在室温下反应10分钟后，通过蓝光LED透射仪观察荧光信号，并通过酶标仪(最大激发波长λex为480nm，最大发射波长λem为520nm)测量混合物的荧光强度，根据不同浓度沙门氏菌对应的荧光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。
进一步，步骤(1)中所述的生物素化适配体核苷酸序列如下：biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCTT GGG CGG TTG GTG TGA TGG GCT TTT TTC GTT GGG CCG G。
进一步，所述的骨架链L的序列为：GAT GAC TCG GCT TTC AGT CTAACG CTG ACGTAG GCC CTT CGT AGG ACC TTG CCA TGA TAG GCC CTT GCT CAG TAG ACA CCC，三条所述的沙门氏菌适配体分别如下：沙门氏菌适配体a的序列为Biotin-TCT AGG GCC TAC GTC AGC GTT AGA CTG AAC AAA ACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG(划直线部分为与三角形骨架互补部分，波浪线部分为适配体序列)，沙门氏菌适配体b的序列为Biotin-TAT GCC GAG TCA TCG GGT GTC TAC TGA GCC AAAACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG(划线部分为与三角形骨架互补部分，波浪线部分为适配体序列)，沙门氏菌适配体c的序列为：Biotin-TGTAGG GCC TAT CAT GGCAAG GTC CTACGC AAAACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG(划线部分为与三角形骨架互补部分，波浪线部分为适配体序列)。
发明原理：基于DNA三角形多价适配体的荧光/比色双模式法检测沙门氏菌的机理如图1所示。最初，通过生物素-链霉亲和素相互作用在磁性纳米颗粒表面修饰沙门氏菌特异性适配体，得到适配体磁珠作为识别元件，用于沙门氏菌的捕获。NTri三价适配体是由三条生物素修饰的包含适配体序列的DNA链(a，b和c)和一条长支架链(L)组成。通过生物素-链霉亲和素相互作用同时携带大量辣根过氧化物酶(HRP)，并通过纳米三角形的双链DNA预先加载数百万个SGI(Sybr Green I是全称)。在沙门氏菌存在的情况下，目标细菌被适配体磁珠分离，随后由NTri-Multi-Apt以高亲和力标记，形成“MNPs-细菌-multiApt”三明治复合物。由于HRP催化的无色底物，该复合物产生颜色，并通过SGI产生强烈的荧光信号。因此，本工作设计的双模式检测为食品样品中的沙门氏菌提供了一种简单灵敏的策略。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明中的NTri是一种通过一步法合成的刚性平面纳米结构，并且可以通过调整边长精确控制由此所构建的多价适配体价态，以NTri为骨架构建的纳米三角形三价适配体具有更优的亲和力和特异性。
(2)本发明中基于NTri的三价适配体，在三价结构上同时携带大量的HRP和SGI，作为将细菌信号转化为比色信号和荧光信号的媒介，实现比色和荧光双信号输出对沙门氏菌的检测；比色检测敏感性差，容易受到操作条件和生物环境变化的干扰。但是荧光检测表现出更高的灵敏度和抗外部干扰性。因此，双信号互补来提高检测的灵敏度、稳定性和准确性。
(3)本发明中的通过适配体磁珠对样品的前处理，大大降低了复杂食品基质对体系的干扰，结合基于NTri的三价适配体的双信号检测，最终比色检测实现了14CFU/mL沙门氏菌的检测，荧光检测实现了3CFU/mL沙门氏菌的检测。
综上所述，本发明一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法，结合了适配体磁分离技术、NTri三价适配体系统。通过生物素-链酶亲和素相互作用将适配体固定在纳米磁珠上，得到适配体磁珠用于沙门氏菌的捕获和分离。并通过碱基互补配对将包含适配体序列的DNA链连接到三角形骨架上平面三价适配体，增强了对沙门氏菌的结合亲和力和特异性。此外，三价适配体可以同时携带大量的HRP酶来产生颜色反应，携带大量的SGI来产生荧光信号，从而实现对沙门氏菌的双信号检测，具有灵敏度高、特异性强且准确性好的优点。
附图说明
图1为基于NTri三价适配体比色/荧光双信号检测沙门氏菌的原理图；
图2为具体实施例二中基于NTri的不同价态适配体构建的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为具体实施例二中基于NTri的三价适配体的原子力显微镜图(a)以及三角形高度(b)；
图4为本发明基于NTri的不同价态多价适配体的亲和力值；
图5为本发明基于NTri的不同价态多价适配体和沙门氏菌结合的荧光显微镜图；
图6为本发明基于NTri的三价适配体对比同样价态的线性多价以及单价的比色信号；
图7为本发明NTri三价适配体的比色柱状图(a)和荧光柱状图(b)；
图8为本发明检测不同浓度沙门氏菌的比色信号和荧光强度与沙门氏菌浓度的线性关系；
图9为本发明检测牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度沙门氏菌的比色信号和荧光强度与沙门氏菌浓度线性关系，其中(a)为牛奶、(b)为鸡蛋、(c)为鸡肉；
图10为具体实施例六检测方法分别对105CFU/mL肠炎沙门氏菌、105CFU/mL副溶血性弧菌、105CFU/mL溶藻弧菌、105CFU/mL创伤弧菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌进行检测的比色信号和荧光强度比较图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
适配体磁珠的制备
将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠与100μL 1μM 5’端生物素化适配体(biotin-Apt)混合并在室温反应45分钟，随后加入200μL4μM D-生物素进行封闭，接着用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，最后复溶于100μL磷酸盐缓冲液，得到适配体磁珠用于沙门氏菌的捕获。生物素化适配体的核苷酸序列如下：biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCTT GGG CGG TTG GTG TGA TGG GCT TTT TTC GTT GGG CCG G。
具体实施例二
基于NTri的不同价态多价适配体的合成
将2.5μL 10μM的四条单链DNA(a、b、c、L)混合，并用TMS缓冲液(10mM Tris，80mMMgCl2)定容至25μL，然后将溶液于95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟得到基于NTri的三价适配体。其中四条单链DNA的核苷酸序列如下：骨架链L：GAT GAC TCG GCTTTCAGT CTAACG CTGACG TAG GCC CTT CGTAGGACC TTG CCATGATAG GCC CTT GCT CAGTAGACACCC(三角形骨架)，沙门氏菌适配体a：Biotin-TCT AGG GCC TAC GTC AGC GTT AGA CTG AAC AAA ACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG(划直线部分为与三角形骨架互补部分，波浪线部分为适配体序列)，沙门氏菌适配体b：Biotin-TAT GCC GAG TCATCG GGT GTC TAC TGA GCC AAAACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG(划线部分为与三角形骨架互补部分，波浪线部分为适配体序列)，沙门氏菌适配体c：Biotin-TGTAGG GCC TAT CAT GGC AAG GTC CTACGCAAAACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG(划线部分为与三角形骨架互补部分，波浪线部分为适配体序列)。
单价适配体、二价适配体的合成步骤同三价适配体，仅对其中的DNA进行替换。单价适配体：2.5μL 10μM(L，a，SS26-b，SS26-c)等量混合，并用TMS缓冲液(10mM Tris，80mMMgCl2)定容至25μL于95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟。二价适配体：2.5μL 10μM(L，a，b，SS26-c)等量混合，并用TMS缓冲液(10mM Tris，80mM MgCl2)定容至25μL于95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟。其中SS26-b的核苷酸序列如下：GCC GAG TCATCG GGTGTC TAC TGA GC，SS26-c的核苷酸序列如下：AGG GCC TAT CAT GGCAAG GTC CTACG。
为了直观表征基于NTri的三维多价适配体的形成，根据具体实施例二合成了单价适配体、二价适配体、三价适配体，并将NTri支架L、单价适配体(上述方法制备的单价适配体)、二价适配体(上述方法制备的二价适配体)、三价适配体(上述方法制备的三价适配体)依次加入到1％琼脂糖凝胶电泳上分离(GelRed核酸染料染色，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压30分钟)并在凝胶成像仪上成像观察。如图2所示，随着三维多价适配体价态的增加，条带的迁移速度逐渐降低，这表明不同价态三维多价适配体的成功形成。
然后，合成基于NTri的三价适配体后，置于原子力显微镜下观察。如图3(a)所示，三维四价适配体的平均尺寸约为8.84nm，AFM观察后尺寸增加到16nm。尺寸的增大是由于众所周知的尖端效应，如图3(b)所示，进一步测量了三价适配体的高度接近2nm，与理论上的双链DNA的值一致。因此验证了适配体在NTri上的组装。
具体实施例三
基于NTri的不同价态适配体结合亲和力比较
通过平衡解离常数(Kds，与结合亲和力成反比)评价基于NTri的不同价态适配体的结合亲和力，并采用ELISA法测定。具体步骤如下：首先，在高吸附酶标板上加入50μL沙门氏菌(105CFU/mL)，37℃孵育2小时后，用磷酸盐缓冲液(含0.01％吐温-20)洗板三次。随后，加入150μL 1wt％牛血清白蛋白溶液，37℃孵育30分钟。洗板三次后，加入50μL不同浓度(0.01μM-0.1μM)的基于NTri的不同价态适配体：单价适配体，二价适配体，三价适配体。在37℃下与沙门氏菌结合45分钟后，通过三次洗板洗去未结合的适配体，加入50μL链酶亲和素化辣根过氧化物酶，于室温反应25分钟。然后经三次洗涤后加入TMB(50μL)避光显色15分钟并用50μLH2SO4(2M)终止反应，用酶标仪测450nm处的吸光度。最后，通过公式：Y＝Bmax X/(Kd+X)(X：适配体浓度，Y：吸光度强度，Bmax：实验中最高的Y)。如图4所示，单价适配体、二价适配体、三价适配体、的亲和力Kds分别为440.5nM，334.7nM和292.0nM。
为了进一步证明三价适配体具有更好的结合能力。用荧光显微镜观察沙门氏菌标记的基于NTri的三价适配体、二价适配体和单价适配体。适配体的5’端修饰上荧光基团(FAM)并按照具体实施例二构建基于NTri的三价适配体。将浓度为109CFU/mL(98.5μL)的沙门氏菌与1μM FAM修饰的三价适配体、二价适配体和单价适配体(2.5μL)于37℃孵育2小时。随后，标记适配体的沙门氏菌以6000r/min离心5分钟，去除未结合的适配体，重悬于磷酸盐缓冲液中。最后将该沙门氏菌-适配体复合物稀释至107CFU/mL，通过荧光显微镜成像观察。从图5光镜和荧光图的叠加图中可知，用三价适配体处理的沙门氏菌荧光强度远高于用相同浓度二价适配体和单价适配体处理的沙门氏菌，说明三价适配体具有优越的结合靶标性能。
具体实施例四
基于NTri的三价适配体对比同样价态的线性多价以及单价的比色信号同样采用ELISA法测定。具体步骤如下：首先，在高吸附酶标板上加入50μL沙门氏菌(105CFU/mL)，37℃孵育2小时后，用磷酸盐缓冲液(含0.01％吐温-20)洗板三次。随后，加入150μL 1wt％牛血清白蛋白溶液，37℃孵育30分钟。洗板三次后，加入50μL 0.5μM的基于NTri的平面三价适配体、线性三价适配体和单价适配体。在37℃下与沙门氏菌结合45分钟后，通过三次洗板洗去未结合的适配体，加入50μL链酶亲和素化辣根过氧化物酶，于室温反应25分钟。然后经三次洗涤后加入TMB(50μL)避光显色15分钟并用50μLH2SO4(2M)终止反应，用酶标仪测450nm处的吸光度。其中线性三价适配体的合成步骤如下：制备8个短ssDNA，并将其分为两类：接头DNA(1、2、3)和间隔DNA(A、B)。杂交后，间隔DNA可以通过接头DNA顺序连接，在每个间隔DNA之间留出26bp的间隙，刚好与含有沙门氏菌的适配体的26bp延伸片段连接。通过这种方式，制备了线性三价适配体，使适配体间距与平面三价适配体一致。其中八条单链DNA的核苷酸序列如下：接头DNA 1：GCG TCCAGC TCA GGC TAC GTACAC TTC，接头DNA 2：ATGATGAGG GAGCAG TAG GCG TCG GT，接头DNA 3：CAG GTACGGACAGCG TC，沙门氏菌适配体Apt1：GAAGTGTAC GTA GCC TGATTC TTG GGC GGT TGG TGT GAT GGG CTT TTT TCG TTG GGC CGG(波浪线部分为适配体序列)。沙门氏菌适配体Apt2：TAC TGC TCT TCTTGGGCGGTTGG TGT GAT GGG CTT TTT TCG TTG GGC CGG(波浪线部分为适配体序列)；沙门氏菌适配体Apt3：CGT ACCTGT TCTTGGGCGGTTGGTGTGATGGGCTTTTTTCG TTG GGC CGG(波浪线部分为适配体序列)。间隔DNA-A:GCT GGA CGC ACC GAC GCC。间隔DNA-B:CCTCATCATGACGCTGTC。
从图6中可以看到，平面三价适配体的吸光度值高于线性三价适配体和单价适配体，突出了平面三价适配体的优势。
具体实施例五
基于NTri的三价适配体的双信号检测沙门氏菌
取具体实施例一中制备的适配体磁珠与200μL待测沙门氏菌溶液混合，于室温反应45分钟。用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤三次后，加入25μL步骤实施例二中制备的基于NTri的三价适配体。随后于室温反应45分钟，经三次磁分离洗涤后复溶于10μL磷酸盐缓冲液得到“磁珠-沙门氏菌-NTri”三明治复合物，接着将该三明治复合物加入10μL链霉亲和素化的辣根过氧化物酶于37℃反应30分钟，再次洗涤三次后，加入10μLPBS和20μL TMB进行颜色反应，并使用20μL H2SO4(2M)停止反应。最后，通过SpectraMax在450nm处测量所得溶液。根据不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。如图7(a)所示，在有沙门氏菌存在时，溶液中的吸光度值远远高于没有沙门氏菌存在的情况。然后根据不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。
对于荧光检测，在得到“磁珠-沙门氏菌-NTri”三明治复合物后，加入Sybr GreenI在室温下反应10分钟，最后，可以通过蓝光LED透射仪观察荧光信号，并通过SpectraMax(λex：480nm；λem：520nm)测量混合物的荧光强度。如图7(b)所示，在有沙门氏菌存在时，溶液中的荧光度值远远高于没有沙门氏菌存在的情况。然后根据不同浓度沙门氏菌对应的荧光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。
通过对不同浓度沙门氏菌检测得到相应的吸光度值和荧光强度，绘制吸光度值-沙门氏菌浓度和相对荧光强度-沙门氏菌浓度曲线，从而对待测溶液中的沙门氏菌进行定量分析；当沙门氏菌浓度越高，其特异性结合的三价适配体就越多，携带的辣根过氧化物酶和SG1也越多。
如图8所示，检测PBS中不同浓度沙门氏菌(100-107CFU/mL)的相对吸光度值-沙门氏菌浓度，标准曲线方程为y＝0.160x-0.167，相关系数R2＝0.954，检测限为14CFU/mL；检测PBS中不同浓度沙门氏菌(100-107CFU/mL)的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系，标准曲线方程为y＝0.173×106x-0.0859×106，相关系数R2＝0.990，检测限为3CFU/mL，两者均可用于未知浓度的沙门氏菌检测。
具体实施例六
为验证本发明具体实施例五检测方法在实际应用中的价值，分别在牛奶、鸡蛋、鸡肉中加入沙门氏菌标准溶液作为实际样品，对不同样本中不同浓度的沙门氏菌进行了检测，结果如图9所示，牛奶(a)、鸡蛋(b)、鸡肉(c)中不同浓度(100-107CFU/mL)沙门氏菌的相对吸光度值和相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系图，由图9可知，比色和荧光信号与沙门氏菌浓度(101-107CFU/mL)呈较强线性关系，牛奶、蛋清和鸡肉中比色和荧光检测的检测限分别为130、179、151CFU/mL和6、4、5CFU/mL。
具体实施例七
为验证本发明具体实施例五检测方法的检测特异性，分别对105CFU/mL肠炎沙门氏菌、105CFU/mL副溶血性弧菌、105CFU/mL溶藻弧菌、105CFU/mL创伤弧菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌进行检测的比色信号和荧光强度比较。结果如图10所示，在沙门氏菌存在时，检测的吸光度值和荧光强度远远高于干扰食源性致病菌的吸光度值，表明该检测方法对沙门氏菌具有特异性。
具体实施例八
为验证本发明具体实施例七检测方法的准确度以及稳定性，对牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度的沙门氏菌进行检测，并进行回收率的计算。结果如表1所示，
表1为对牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(1×102-1×104CFU/mL)沙门氏菌的回收率。
由表1可知，牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(1×102-1×104CFU/mL)沙门氏菌的比色检测的平均回收率为92.16％到116.44％，变异系数低于9.71，荧光检测的平均回收率为93.90％到112.83％，变异系数低于9.53，表明该双信号检测方法可应用于食品样品中的沙门氏菌检测。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于包括以下步骤：
(1)适配体磁珠的制备
将1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠溶液与1μM生物素化适配体溶液混合并在室温反应45分钟，随后加入4μM D-生物素进行封闭后，用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，再复溶于磷酸盐缓冲液，得到用于捕获沙门氏菌的适配体磁珠溶液；所述的链酶亲和素化纳米磁珠、所述的生物素化适配体溶液和所述的磷酸盐缓冲液的体积比为1：1：2：1；
(2)基于NTri的三价适配体的制备
将2.5μL 10μM的四条单链DNA溶液混合，并用TMS缓冲液定容至25μL后，将溶液于95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟，得到基于NTri的三价适配体；所述的四条单链DNA包括一条骨架链L和三条可通过碱基互补结合到骨架链L的沙门氏菌适配体；
(3)磁珠-沙门氏菌-NTri三明治复合物的制备
取10μL步骤(1)中制备的适配体磁珠溶液与200μL待测沙门氏菌溶液混合，于室温反应45分钟，用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤三次后，加入25μL步骤(2)中制备的基于NTri的三价适配体溶液，随后于室温反应45分钟，经三次磁分离洗涤后复溶于10μL磷酸盐缓冲液，得到磁珠-沙门氏菌-NTri三明治复合物；
(4)比色法检测沙门氏菌
取步骤(3)得到的三明治复合物加入10μL链霉亲和素化的辣根过氧化物酶于37℃反应30分钟后洗涤三次，然后加入10μL PBS缓冲液和20μL TMB进行颜色反应后，用20μL H2SO4停止反应后，通过酶标仪在450nm处测量所得溶液，根据不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度；
(5)荧光法检测沙门氏菌
取10μL步骤(3)得到的三明治复合物加入10μL 2×Sybr Green I，在室温下反应10分钟后，通过蓝光LED透射仪观察荧光信号，并通过酶标仪测量混合物的荧光强度，根据不同浓度沙门氏菌对应的荧光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(1)中所述的生物素化适配体核苷酸序列如下：biotin-CTT GGG CGG TTG GTG TGA TGG GCT TTT TTC GTT GGG CCG G。
3.根据权利要求1所述的一种基于NTri的三价适配体比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于所述的骨架链L的序列为：GAT GAC TCGGCT TTC AGT CTAACG CTGACG TAG GCC CTT CGTAGGACC TTG CCATGATAG GCC CTT GCT CAGTAGACACCC，三条所述的沙门氏菌适配体分别如下：沙门氏菌适配体a的序列为Biotin-TCTAGG GCC TAC GTC AGC GTTAGA CTG AAC AAAACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTTTTT CGT TGG GCC GG，沙门氏菌适配体b的序列为Biotin-TAT GCC GAG TCATCG GGT GTCTAC TGA GCC AAA ACT TGG GCG GTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG，沙门氏菌适配体c的序列为：Biotin-TGTAGG GCC TAT CAT GGC AAG GTC CTACGC AAAACT TGG GCGGTT GGT GTGATG GGC TTT TTT CGT TGG GCC GG。
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2023
- 2023-09-15 CN CN202311191011.8A patent/CN117405885A/zh active Pending
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