DE102012021146A1

DE102012021146A1 - Methode zur spezifischen Isolation von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102012021146A1
Application number: DE102012021146.5A
Authority: DE
Inventors: Dirk Kuhlmeier; Natalia Sandetskaya; Andreas Naumann; Katharina Hennig
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-05-15
Also published as: WO2014064223A1; US20160010144A1; EP2912190A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Affinitätsmaterial, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Affinitätsprotein sowie einen Kit, der ein solches Affinitätsmaterial umfasst. Beschrieben wird ferner ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA sowie die Verwendung des Affinitätsmaterials zum Nachweis pathogener Bakterien oder zum Nachweis einer bakteriellen Kontamination.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Affinitätsmaterial zum Abtrennen und/oder Anreichern prokaryotischer DNA, das einen Träger und ein daran gebundenes Protein umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Anreicherung und/oder Trennung prokaryotischer DNA, der ein solches Affinitätsmaterial umfasst, ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA sowie die Verwendung des Affinitätsmaterials, des Kits und/oder des Verfahrens auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik und der Umwelt- und Lebensmittelanalyse.
Die Isolierung von prokaryotischer DNA ist in vielen Bereichen der Analyse und Diagnostik von großer Bedeutung. So ist z. B. die Isolation pathogener DNA zum Nachweis einer u. U. lebensbedrohlichen Infektion eine wesentliche Herausforderung in der molekularen Diagnostik. Pathogene Bakterien können bereits in niedrigen Konzentrationen unerwünschte Wirkung entfalten, müssen jedoch zum sicheren Nachweis häufig aufwändig kultiviert und anschließend charakterisiert werden. Dabei verstreicht für den betroffenen Patienten wertvolle Zeit, in der keine effektive Therapie ansetzen kann. Die Erfindung zielt auf ein Verfahren zur effektiven Aufreinigung bakterieller Nukleinsäuren aus flüssigen Probenmedien wie z. B. Blut, Sputum oder wässrigen Lösungen, das nicht nur auf medizinische Applikationen zielt.
Auch im Bereich der Lebensmittelanalytik sind Verfahren gefragt, die einen möglichst empfindlichen Nachweis einer bakteriellen Kontamination ermöglichen. Auch hier sind zu einem sicheren Nachweis häufig aufwändige Zwischenschritte zur Kultivierung der Bakterien notwendig, was zu einer langen Zeitdauer des Analyseverfahrens und zu hohen Kosten führt.
Ein besonders empfindlicher Nachweis von Bakterien gelingt durch Amplifizierung bakterieller DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass die Empfindlichkeit und Sicherheit des Nachweises stark vom Verhältnis der bakteriellen Zielnukleinsäure zu der Hintergrund-DNA abhängt.
Dies wird durch die 1 verdeutlicht. 1 zeigt den Nachweis bakterieller DNA in Gegenwart (1) und in Abwesenheit (2) humaner Hintergrund-Nukleinsäure. Letztere Gesamt-DNA wurde aus 1 ml Vollblut gespikt mit 10⁶ Zellen E. coli isoliert, während (2) jeweils nur aus einer wässrigen E. coli-Lösung mit 10⁶ Zellen generiert wurde. 1A zeigt eine Analyse und Detektion mittels der Agaraose-Gelelektrophorese, während 1B eine Realtime-PCR des Lightcyclers^©-Systems (Roche) zeigt. In beiden Fällen generierte die Anwesenheit der humanen Nukleinsäure eine deutliche Störung der Amplifikationsreaktion. Während im Gelbild zumindest eine undeutliche, spezifische Produktbande für die Bakterien-DNA sichtbar war, gelang über das fluoreszenz-optische Verfahren der Realtime-PCR keine klare Analyse: Das Signal der Kurve 1 in 1B basierte auf einer unspezifischen Produktbildung, die keinen Rückschluß auf die baktrielle DNA zuließ.
Eine hohe Konzentration an z. B. humaner DNA („Hintergrund-DNA”) führt zu einer deutlich negativen Beeinflussung der Sensitivität. Es ist daher notwendig, die bakterielle DNA vor Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion möglichst vollständig zu isolieren, um störende Kontaminationen oder Hintergrund-DNA abzutrennen.
Zur Isolierung von bakterieller DNA aus einer Probe stehen im Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Verfügung:
Zur Isolation von Nukleinsäuren aus Proben wird die Affinität von DNA zu Silica-Materialien ausgenutzt. Die Silica-Matrix kann dabei an Partikel (z. B. magnetische) oder als Säulenmaterial appliziert werden. Die Verfahren zur Isolation laufen üblicherweise nach dem folgenden Schema ab:

a) Zelllyse in Gegenwart chaotroper Salze und Proteinase (Abbau von Protein) und nachfolgender Zentrifugation zum Abtrennen der Zellreste
b) Aufbringen auf eine Säule, die Silica-Material enthält, das mit der Nukleinsäure wechselwirkt. Die DNA adsorbiert an der Oberfläche, während andere Zellbestandteile entfernt werden. Die Elution der Nukleinsäure erfolgt nach einem oder mehreren Waschschritten durch Zugabe von Wasser oder Niedrigsalz-Puffer.

Dieses Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus Proben durch Bindung der DNA an Silica-Materialien wird in 2 schematisch gezeigt.
In der Praxis erfordern diese Verfahren recht viele manuelle Handlungsschritte. Um den Verfahrensablauf zu erleichtern werden für diese Verfahren oftmals so genannte Minisäulen eingesetzt. 3 zeigt schematisch den Ablauf eines solchen Verfahrens zur Isolierung von DNA durch Silica-Materialien in einer Minisäule.
Nach Aufreinigung der Gesamt-Nukleinsäure durch diese Silica-Materialien erfolgt typischerweise ein Amplifikationsschritt, mit dessen Hilfe geringe Konzentrationen an bakterieller DNA, wie z. B. bei der Detektion von bakteriellen Kontaminanten im humanen Blut, nachgewiesen werden können. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Vorliegen zahlreicher Kontaminationen insbesondere in Form von Fremd-DNA die Nachweisgrenze bei diesem Verfahren deutlich beeinflusst (Handschur M, Karlic H, Hertel C, Pfeilstöcker M, Haslberger AG. Preanalytic removal of human DNA eliminates false signals in general 16S rDNA PCR monitoring of bacterial pathogens in blood. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009 May; 32 (3): 207–19. Epub 2008 Feb 7; Peters RP, van Agtmael MA, DNAer SA, Savelkoul PH, Vandenbroucke-Grauls CM. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis. 2004 Dec; 4 (12): 751–60).
Somit ist dieses Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus Proben durch Affinität der DNA zu Silica-Materialien mit zahlreichen Nachteilen verbunden. So sind die eingesetzten Säulenmaterialien in der Regel mit hohen Kosten verbunden. Außerdem erfordern diese Verfahren viele manuelle Schritte, die Personal binden und zeitintensiv sind. Darüber hinaus führen diese Verfahren zur Aufreinigung von Gesamt-DNA, die einen Überschuss an nichtrelevanter DNA enthalten kann. So wird beispielsweise bei Gewinnung der Probe aus einer Körperflüssigkeit die isolierte bakterielle DNA in der Regel sehr stark mit humaner DNA kontaminiert sein. Die Sensitivität des Nachweises der bakteriellen DNA durch eine anschließende Polymerase-Kettenreaktion kann dadurch deutlich verringert werden.
Um das Problem der störenden Fremd-DNA zu lösen, werden im Stand der Technik einige Verfahren vorgeschlagen. Dabei werden einerseits Verfahren beschrieben, bei denen eine Reduktion der Fremd-DNA erfolgen soll und andererseits Verfahren, bei denen eine Anreicherung der bakteriellen DNA erfolgen soll.
Ein Beispiel eines Verfahrens zur Reduktion der nichtbakteriellen DNA beinhaltet die selektive Lyse humaner Zellen mit anschließendem gezieltem Abbau der humanen DNA. Ein solches Verfahren ist schematisch in 4 gezeigt.
4 zeigt schematisch den Arbeitsablauf eines Verfahrens zur Isolation bakterieller Nukleinsäuren aus Blutproben durch gezielte Reduktion der humanen DNA. Die Anbieter vertreiben Applikationskits zur gezielten Abreicherung humaner Nukleinsäure durch Lyse der Leukozyten. Die freigesetzte DNA wird gezielt degradiert, wobei die bakteriellen Zellen intakt bleiben. Anschließend erfolgt eine Sedimentierung der Bakterien mit anschließender Lyse der bakteriellen Zellen zur Isolierung der bakteriellen DNA.
Nachteilig an diesem Verfahren ist die Komplexität des Ablaufs, was das Verfahren zeit- und arbeitsaufwändig macht. Darüber hinaus sind diese Verfahren auch mit hohen Kosten verbunden.
In der WO 2005/085440 A1 wird ein Verfahren zur Abtrennung von prokaryotischer DNA mittels eines Proteins beschrieben, das nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA-spezifisch bindet. In dem in der WO 2005/085440 A1 beschriebenen Verfahren wird die Eigenschaft prokaryotischer DNA genutzt, sich durch Vorkommen nicht-methylierter CpG-Motive (Cytidin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotide) (Hartmann G et al., 2001, Deutsches Ärzteblatt Jg. 98/15: A981–A985 (2001) von eukaryotischer DNA zu unterscheiden.
In prokaryotischer DNA sind diese Motive nicht-methyliert, wohingegen sie in eukaryotischen Zellen zum größten Teil methyliert sind. Zur Anreicherung von bakterieller DNA wird bei diesem Verfahren ein Protein eingesetzt, das nicht-methylierte CpG-Motive einer DNA spezifisch bindet. Das Protein hCpGBP (humanes CpG-bindendes Protein) wird dazu an Sepharose oder ähnlichen Matrices immobilisiert und mit dem Lysat aus Blut und potentiellen Pathogenen inkubiert.
Auch dieses Verfahren ist jedoch mit zahlreichen Nachteilen verbunden. So zeigt dieses Verfahren lediglich eine schwache Anreicherung der bakteriellen DNA, da mit dem Protein hCpGBP zwar vermehrt bakterielle DNA gebunden wird, es jedoch auch noch zu einer signifikanten Bindung der stärker methylierten humanen DNA kommt. Somit ist die Spezifität des Trennungsverfahrens recht schwach, was sich negativ auf die Sicherheit und Empfindlichkeit eines anschließenden Nachweises der bakteriellen DNA auswirkt. Darüber hinaus ist das in der WO 2005/085440 A1 beschriebene Verfahren recht kostenintensiv.
Vor dem Hintergrund dieses Standes der Technik lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Material und ein Verfahren bereitzustellen, das die Abtrennung und/oder Anreicherung prokaryotischer DNA aus einer Probe erlaubt. Gegenüber den bisher bekannten Materialien und Verfahren soll dabei ein hoher Anreicherungsgrad mit möglichst wenigen Arbeitsschritten und möglichst geringen Kosten erreicht werden.
Die erwähnte Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Affinitätsmaterial, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Protein, wobei das Protein die DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase umfasst.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass ein solches Affinitätsmaterial eine außerordentlich spezifische Abtrennung von bakterieller DNA in einer Probe insbesondere auch bei Vorliegen großer Mengen von Fremd-DNA ermöglicht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Protein die Untereinheit A der Topoisomerase II.
Die Erfindung macht sich die Eigenschaften des Proteins Topoisomerase II (Gyrase) zu Nutze, das lediglich in Prokaryoten vorkommt.
Die DNA-bindende Domäne der Gyrase A wird verwendet, um gezielt bakterielle Nukleinsäure aus einem Gemisch hochkomplexer DNA zu isolieren. Damit kann ein generelles Prinzip etabliert werden, um ein breites Spektrum verschiedener DNA reversibel zu binden und für weitere Prozesse/Analysen zur Verfügung zu stellen.
Topoisomerasen haben einen wesentlichen Einfluss auf die Struktur des Makromoleküls DNA. Die Topoisomerase II ist ein Enzym aus der Gruppe der Topoisomerasen, das ubiquitär vorkommt und Helix-Windungen von doppelsträngigen DNA-Strängen auflockern und lösen kann (Quelle: Wikipedia). Die bakterielle Gyrase ist das einzige Enzym, das unter Verbrauch von ATP auch negatives Supercoiling eines (ringförmigen) DNA-Moleküls induzieren kann. Das Protein besteht aus zwei Untereinheiten A und B, die verschiedene Funktionalitäten haben: GyrA besitzt eine aktive DNA-Bindungsstelle, während GyrB die eigentliche Reaktion des Strangbruchs und der gezielten Wiederverknüpfung unter ATP-Verbrauch katalysiert.
Besonders bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Untereinheit Gyrase A eingesetzt, die gezielt an verschiedene bakterielle Sequenzen binden kann. Der Einsatz dieses Proteins ermöglicht nach Zelllyse und Freisetzung der Gesamt-DNA eine selektive Bindung der bakteriellen DNA, die somit aufkonzentriert werden kann. Dadurch wird insbesondere humane DNA, die naturgemäß in vielen Körperproben vorliegt, nur in sehr geringem Umfang gebunden.
Grundsätzlich unterliegt der im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Träger keiner Beschränkung. Besonders gute Ergebnisse werden jedoch erzielt, wenn der Träger als magnetische Partikel, Dextran, quervernetzte Polymere wie Agarose und/oder Membran ausgebildet ist. Besonders bevorzugt handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei dem Träger um magnetische Partikel.
Es sind zahlreiche Möglichkeiten bekannt, Proteine an Trägermaterialien zu binden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Protein sowohl durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein-Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen, an den Träger gebunden sein.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn das erfindungsgemäß eingesetzte Protein neben der DNA-bindenden Domäne einer bakteriellen Topoisomerase noch einen weiteren Proteinbestandteil enthält, der beispielsweise die Aufreinigung erleichtern und/oder die Löslichkeit des Proteins verbessern kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäß eingesetzte Protein daher ein Fusions-Protein, das die DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst.
5 zeigt eine prinzipielle Darstellung der Immobilisierungsstrategie. Protein A bindet kovalent über Ausbildung einer Peptidbindung an den Magnetpartikel (MagPrep P-25 carboxy, Merck, Darmstadt). Dieses Protein fixiert hochaffin einen anti-MBP-Antikörper, der über das Fv-Fragment der Antigenbindungsstelle (Fab-Region) spezifisch das Fusionsprotein aus GyrA und MBP immobilisiert. Die GyrA wird damit frei auf der Oberfläche des Magnetpartikels präsentiert, um gezielt bakterielle Nukleinsäure zu fangen. Die direkte Bindung des Fusionsproteins an die Oberfläche des Magnetpartikels ist ebenso prinzipiell möglich, um den Aufwand der Immobilisierungsstrategie zu minimieren.
Es hat sich gezeigt, dass besonders gute Ergebniss erzielt werden, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist:
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials ist das Protein als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Aminosäuresequenzhomologie von ≥ 60%, besonders bevorzugt ≥ 80%, insbesondere ≥ 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Unter Sequenzhomologie soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere der prozentuale Anteil der Identität der Aminosäuresequenzen bei Vergleich von zwei Sequenzen verstanden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials ist das Protein daher als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Sequenzidentität von ≥ 60%, besonders bevorzugt ≥ 80%, insbesondere ≥ 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Um das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial herzustellen, wurde die genetische Information der bakteriellen GyrA DNA-bindenden Untereinheit in kloniert und das Protein in E. coli exprimiert. Das N-terminal fusionierte Maltose-bindende Protein (MBP) wurde zur effektiven Aufreinigung des Fusionproteins benutzt. In modifizierten Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) konnte die prinzipielle Bindung von DNA an das produzierte GyrA-MBP-Konstrukt nachgewiesen werden.
Zum Nachweis der spezifischen Bindung von E. coli (gram negativ) sowie Staphylococcus aureus (gram positiv) Nukleinsäure an das MBP-GyrA-Fusionsprotein wurden magnetische Partikel mit dem Fängerprotein funktionalisiert und mit DNA inkubiert.
Die DNA beider Organismen konnte gezielt, selbst in Gegenwart humaner Nukleinsäure aufgereinigt und anschließend amplifiziert werden.
Es hat sich gezeigt, dass die Expression des erfindungsgemäß eingesetzten Proteins als Fusionsprotein mit dem maltosebindenden Protein die Löslichkeit des exprimierten Proteins verbessert und daher die Aufreinigung des exprimierten Proteins erleichtert.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit Mittel zur Amplifizierung der angereicherten/abgetrennten prokaryotischen DNA, insbesondere in Form von Primern zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion.
Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Kit auch weitere Bestandteile, wie beispielsweise Mittel zur Lyse der Zellen und zur Freisetzung der Gesamt-DNA umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA, umfassend die Schritte:

a) In-Kontakt-Bringen mindestens einer in Lösung befindlichen prokaryotischen DNA mit einem Bindungsmittel, das die DNA-bindende Domäne einer bakteriellen Topoisomerase umfasst,
b) Separieren der an das Bindungsmittel gebundenen prokaryotischen DNA.

Durch ein solches Verfahren gelingt das Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryoter DNA in hoher Selektivität, auch bei Vorliegen hoher Mengen von Fremd-DNA in der Probe.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet, dass das Bindungsmittel in Form eines Affinitätsmaterials vorliegt, umfassend ein Trägermaterial und ein daran gebundenes Protein, das die DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase umfasst.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet, dass das Protein die Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II umfasst.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet ist, dass als Träger magnetische Partikel, Sepharose und/oder Dextran eingesetzt werden. Es hat sich gezeigt, dass besonders gute Ergebnisse erzielt werden, wenn als Träger magnetische Partikel eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so ausgebildet, dass das Protein durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein-Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen an den Träger gebunden ist.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren so ausgebildet, dass das Protein ein Fusions-Protein ist, das eine DNA-bindende Untereinheit einer bakteriellen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst.
Es hat sich gezeigt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders gute Ergebniss erzielt werden, wenn das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der bakteriellen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist:
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Protein als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Aminosäuresequenzhomologie von ≥ 60%, besonders bevorzugt ≥ 80%, insbesondere ≥ 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Unter Sequenzhomologie soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere der prozentuale Anteil der Identität der Aminosäuresequenzen bei Vergleich von zwei Sequenzen verstanden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Protein daher als Fusions-Protein ausgestaltet, das eine Sequenzidentität von ≥ 60%, besonders bevorzugt ≥ 80%, insbesondere ≥ 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Analyse einer großen Vielzahl von Proben, die auf das Vorliegen von Bakterien untersucht werden sollen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Probenflüssigkeit eine Körperflüssigkeit eingesetzt wird, insbesondere in Form von Blut, Serum, Plasma, Zellpräparationen aus Blut und/oder Sputum.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber keineswegs auf alle Anwendungen der medizinischen Diagnostik beschränkt. In einer alternativen Ausführungsform wird das Verfahren so eingesetzt, dass als Probenflüssigkeit eine Flüssigkeit eingesetzt wird, die eine Umwelt- oder Lebensmittelprobe darstellt und/oder eine aus einer daraus abgeleiteten Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Aufreinigung bakterieller DNA aus einer Probe, die stark mit Fremd-DNA genomischen Ursprungs kontaminiert ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt dann nach dem Schritt der Separation der an das Bindungsmaterial gebundenen prokaryotischen DNA ein Schritt c, bei dem die prokaryotische DNA eine Amplifizierung, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, unterworfen wird. Diese Abfolge von Verfahrensschritten ermöglicht einen außerordentlich empfindlichen und sicheren Nachweis auch geringer Mengen von bakterieller DNA in einer Probe.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials bzw. Kits bzw. Verfahrens zum Nachweis pathogener Bakterien zu diagnostischen Zwecken.
In einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Affinitätsmaterials bzw. Kits bzw. Verfahrens zum Nachweis einer bakteriellen Kontamination in einem Lebensmittel.
Das erfindungsgemäße Material und Verfahren weist gegenüber dem Stand der Technik zahlreiche überraschende Vorteile auf.
Insbesondere hat sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial eine außerordentlich hohe Spezifität für bakterielle DNA bei Vorliegen von Fremd-DNA aufweist. Insbesondere ist die Bindung von kontaminierender humaner DNA an das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial sehr gering, so dass in einfacher Weise eine außerordentlich hohe Anreicherung der bakteriellen DNA möglich ist. Die hohe Spezifität erstreckt sich dabei sowohl auf die bakterielle DNA von gram negativen als auch von gram positiven Bakterien. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass eine hohe Flexibilität in Bezug auf das Trägermaterial besteht, wodurch das erfindungsgemäße Material und Verfahren vielseitig und flexibel anwendbar wird. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Affinitätsmaterial leicht und kostengünstig zu produzieren und ermöglicht ein Verfahren zur Abtrennung und/oder Anreicherung prokaryotischer DNA, das schnell und in wenigen Schritten durchführbar ist.
Die beschriebene Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen noch näher erläutert:
Beispiel 1:
Expression und Aufreinigung des Fusions-Proteins GyrA-MBP
Expression des Fusions-proteins GyrA-MBP
Die C-terminale Domäne der Gyrase A-Untereinheit von E. coli (gyrA-CTD) wurde mit dem Primerpaar gyrA BamH I fw/gyrA Stop Hind III rev mittels PCR amplifiziert. Als Matrize für die PCR diente der Vektor pMK90, welcher die komplette Gyrase A-Untereinheit kodiert [Mizuuchi et al., 1984]. Das Amplikon wurde zur Sicherung in den pGEM-T-Vektor kloniert und zur Umklonierung mit BamH I und Hind III herausgeschnitten. Der Zielvektor pMAL-C2× wurde ebenfalls mit den genannten Restriktionsenzymen linearisiert und anschließend dephosphoryliert. Das gyrA-CTD-Fragment wurde zum Abschluss in den Leserahmen des malE-Gens ligiert. Die korrekte Klonierung wurde durch Sequenzierung überprüft.
Aufreinigung des Fusions-Proteins GyrA-MBP
Initial wurden 400 ml LB/Amp/Glucose(0,2%)-Medium mit 5 ml einer Starterkultur des Transformanten angeimpft. Diese Kultur wurde bis zur OD₆₀₀ = 0,6 im Erlenmeyerkolben im Schüttelinkubator angezogen (37°C; 240 U/min). Die Proteinexpression wurde dann durch Zugabe von 450 μl einer 100 mM IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)Lösung induziert. Vier Stunden post Induktion wurde die Kultur auf 4°C herabgekühlt und im 50 ml – Reaktionsgefäß herab zentrifugiert (20 min; 4600 U/min; 4°C). Das Pellet wurde nun in 20 ml Säulenpuffer A (100 mM HEPES (pH 7,5); 90 mM KCl; 1 mM MgCl₂, 1 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)) resuspendiert und dabei ständig auf Eis gekühlt. Der Aufschluss wurde mit kurzen Ultraschallimpulsen (10 s) für 6 min durchgeführt. Die Zellreste wurden durch Zentrifugation (30 min; 4600 U/min; 4°C) abgetrennt und der Überstand in ein 50 ml – Reaktionsgefäß überführt.
In Vorbereitung zur Aufreinigung wurde 1 ml Amylosematrix auf eine Chromatographiesäule geladen und mit 16 ml Säulenpuffer A equilibriert. Der Überstand wurde anschließend auf die Säule gegeben und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min per Gravitation über Amylosematrix geleitet. Im Anschluss wurde die Säule mit Säulenpuffer A + 0,2 M NaCl (4 × 3 ml) gewaschen.
Das Zielprotein wurde zum Abschluss mit 2 × 2 ml Säulenpuffer A + 10 mM Maltose von der Matrix eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden vor der weiteren Verwendung gegen 10 mM HEPES (pH 7,5) für 72 h bei 4°C dialysiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Die Kontrolle der Aufreinigungsschritte und Reinheit wurde mittels SDS-PAGE überprüft.
6 zeigt eine DNA-Protein-Interaktions-Analyse unter Durchführung eines EMSA (5%iges Polyacrylamidgel, angefärbt mit Ethidiumbromid). Untersucht wurden die Proteine GyrA-MBP und MBP mit spezifischen Oligonukleotiden (56 bp, 0,25 pmol). Angegeben sind die Stoffmengen des jeweils eingesetzten Proteins: A-2,5 pmol, B-10 pmol, C-25 pmol.
Wie der 6 klar zu entnehmen ist, kommt es zu einer starken Bindung des Fusionsproteins GyrA-MBP an die eingesetzten spezifischen Oligonukleotide.
Die Proteinsequenz des Konstrukts ist wie folgt:
MBP-gyrA (688 AS; M_w = 75,15 kDa); theoretischer pI 4,87)
Beispiel 2: Herstellung von GyrA-MBP funktionalisierten magnetischen Partikeln
650 μg Protein A-Magnetpartikel (z. B. MyOne^©, 1.05 μm, Invitrogen) wurden magnetisch separiert und der Pufferüberstand verworfen. Die Partikel wurden mit einem monoklonalen anti-MBP-Antikörper (z. B. New England Biolabs) beschichtet, indem sie in 200 μl Lösung ((1:46) in PBS/Tween 20) resuspendiert und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Im Anschluss wurden die Partikel je einmal mit PBS/Tween 20 und gyrA-Bindepuffer (10 mM HEPES (pH 7,5); 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂; 1 mM DTT) gewaschen und nach Abschluss in 40 μl gyrA-Bindepuffer resuspendiert.
Zum prinzipiellen Aufbau des Konstruktes wird nochmals auf die 5 verwiesen.
Beispiel 3: Isolierung von S. Aureus und E. coli DNA aus Pufferproben mit den mit GyrA-MBP funktionalisierten magnetischen Partikeln
200 μl GBBT-Puffer (10 mM HEPES, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,05% Tween 20, pH 7,5) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,00005 ng bis 0,5 ng) bakterieller genomischer DNA gespikt. Modellhaft wurden 20 μg humane DNA zugesetzt, um DNA-Proben zu simulieren, die aus infiziertem biologischem Material extrahiert wurden. 200 μg GyrA-beschichtete Beads wurden zu der Probe gegeben und für 30 min bei 37°C unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Beads wurden drei Mal mit 10 mM Tris-HCl pH 8,5 gewaschen und in 9 μl Wasser resuspendiert. Zur DNA-Isolation wurden die Beads für 10 min auf 95°C erhitzt.
7 zeigt eine Agarosegelelektrophorese (15%iges Gel, angefärbt mit Ethidiumbromid) des PCR-Produkts nach Durchführung des Bindeassays ohne (Kontrolle) und mit pro- (E. coli; S. aureus) und eukaryotischer (Human), genomischer DNA (gDNA).
M: Marker (GeneRuler Low Range DNA Ladder, Fermentas); A: Durchgeführtes Bindeassay mit der jeweiligen gDNA; R: Referenz, PCR der jeweiligen gDNA als Positivkontrolle; +: zugegebene Komponenten; –: Komponente nicht enthalten; Amplifiziert wurden die DNA-Fragmente unter Nutzung der jeweiligen Primer der nachzuweisenden gDNA: E. coli 16S rRNA (353 bp; Gram neg Primer (E. coli), DG74), S. aureus 16S rRNA (215 bp; 16S_Stau_95-110_F, 16S_Stau_284-300_R), hGAPDH (240 bp; hGAPDH_neu_fw, hGAPDH_neu_rev).
8 zeigt eine graphische Auftragung der Effizienz der Isolation von DNA aus Staphylococcus aureus aus gespikten Pufferlösungen mit Hilfe von GyrA-Beads (Magnetische Partikel: MagPrep^®-P25 carboxy, Ø25 nm, Merck, Darmstadt).
9 zeigt Isolation und Nachweis steigender Konzentrationen an DNA aus Staphylococcus aureus. Die Testlösungen 1 bis 3 enthielten jeweils 20 μg humaner DNA und waren gespikt mit: (1) 0,5 ng, (2) 0,05 ng und (3) 0,005 ng S. aureus DNA. (M): DNA-Längenmarker; K+: positive PCR Kontrolle (0,005 ng S. aureus DNA).
Literatur:

Mizuuchi, K., Mizuuchi, M., O'Dea, M. H. und Gellert, M. (1984). Cloning and simplified purification of Escherichia coli DNA gyrase A and B proteins. J. Biol. Chem. 259 (14): 9199–201.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2005/085440 A1 [0016, 0016, 0018]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Handschur M, Karlic H, Hertel C, Pfeilstöcker M, Haslberger AG. Preanalytic removal of human DNA eliminates false signals in general 16S rDNA PCR monitoring of bacterial pathogens in blood. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009 May; 32 (3): 207–19 [0010]
Epub 2008 Feb 7; Peters RP, van Agtmael MA, DNAer SA, Savelkoul PH, Vandenbroucke-Grauls CM. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis. 2004 Dec; 4 (12): 751–60 [0010]
Hartmann G et al., 2001, Deutsches Ärzteblatt Jg. 98/15: A981–A985 (2001) [0016]

Claims

Affinitätsmaterial, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die DNA-bindende Domäne einer prokaryotischen Topoisomerase umfasst.
Affinitätsmaterial gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II umfasst.
Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in Form von magnetischen Partikeln, Membranen, Sepharose und/oder Dextran ausgebildet ist.
Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein-Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen, an den Träger gebunden ist.
Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Fusions-Protein ist, das die DNA-bindende Domäne einer prokaryotischen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II und ein Maltose-bindendes Protein umfasst.
Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Sequenzhomologie von ≥ 60%, insbesondere ≥ 80%, insbesondere ≥ 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist, besonders bevorzugt, dass das Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Kit zur Anreicherung und/oder Trennung prokaryotischer DNA, umfassend ein Affinitätsmaterial gemäß mindestens einem der Ansprüche 1–7.
Kit gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit Mittel zur Amplifizierung der angereicherten/getrennten prokaryotischen DNA, insbesondere in Form von Primern zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, umfasst.
Verfahren zum Abtrennen und/oder Anreichern von prokaryotischer DNA, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen mindestens einer in Lösung befindlichen prokaryotischen DNA mit einem Bindungsmittel, das die DNA-bindende Untereinheit einer prokaryotischen Topoisomerase umfasst, b) Separieren der an das Bindungsmittel gebundenen prokaryotischen DNA.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmittel in Form eines Affinitätsmaterials vorliegt, umfassend einen Träger und ein daran gebundenes Protein, das die DNA-bindende Untereinheit einer prokaryotischen Topoisomerase umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–12, dadurch gekennzeichnet, dass als Träger magnetische Partikel, Membranen, Sepharose und/oder Dextran eingesetzt werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–13, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein durch kovalente Bindung und/oder durch nichtkovalente Wechselwirkung, insbesondere in Form von Protein-Protein-Wechselwirkungen und/oder Protein-Polysaccharid-Wechselwirkungen an den Träger gebunden ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–14, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Fusions-Protein ist, das eine DNA-bindende Untereinheit einer prokaryotischen Topoisomerase und ein Affinitäts-Tag umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–15, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Fusions-Protein aus der Untereinheit A der prokaryotischen Topoisomerase II und einem Maltose-bindenden Protein umfasst.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–16, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenflüssigkeit eine Körperflüssigkeit und/oder eine von einer Körperflüssigkeit abgeleitete Flüssigkeit eingesetzt wird, insbesondere in Form von Blut, Serum, Plasma, Zellpräparationen aus Blut und/oder Sputum.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–16, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenflüssigkeit eine Flüssigkeit eingesetzt wird, die eine Lebensmittel- oder Umweltprobe darstellt und/oder eine daraus abgeleitete Probe.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10–18, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt der Separation der an das Bindungsmaterial gebundenen prokaryotischen DNA ein Schritt c erfolgt, bei dem die prokaryotische DNA eine Amplifizierung, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, unterworfen wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1–19, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Sequenzhomologie von ≥ 60%, insbesondere ≥ 80%, insbesondere ≥ 90% mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist, besonders bevorzugt, dass das Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aufweist.
Verwendung eines Affinitätsmaterials gemäß mindestens einem der Ansprüche 1–6 und/oder eines Kits gemäß mindestens einem der Ansprüche 9–10 und/oder eines Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 11–20 zum Nachweis pathogener Bakterien zu diagnostischen Zwecken.
Verwendung eines Affinitätsmaterials gemäß mindestens einem der Ansprüche 1–6 und/oder eines Kits gemäß mindestens einem der Ansprüche 9–10 und/oder eines Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 11–20 zum Nachweis einer bakteriellen Kontamination in einem Lebensmittel.