KR20080036595A - 면역글로불린 ｇ에 결합하는 핵산과 그 이용법 - Google Patents

면역글로불린 ｇ에 결합하는 핵산과 그 이용법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IgG에 대한 신규 앱타머 및 그 이용 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 IgG(예, 인간 IgG)의 Fc 부분에 대해 결합하는 앱타머: 앱타머 및 그것에 결합한 기능성 물질(예, 친화성 물질, 표지용 물질, 효소, 약물, 독소, 약물 송달 매체)를 포함하는 복합체: 앱타머 또는 복합체가 고정화된 고상 담체: 고상 담체를 포함하는 의료용 기기: 고상 담체에 IgG 항체를 흡착시키고, 흡착한 IgG 항체를 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함하는 항체 정제 방법: IgG 항체를 제작하여, 제작된 IgG 항체를 고상 담체에 의해 정제하는 것을 포함하는 정제 항체의 제조 방법 등을 제공한다.

Description

면역글로불린 Ｇ에 결합하는 핵산과 그 이용법{NUCLEIC ACID CAPABLE OF BINDING TO IMMUNOGLOBULIN G AND USE THEREOF}
본 발명은 면역글로불린 G(IgG)에 대한 결합 활성을 갖는 핵산에 관한 것이다. 이 핵산에 의해 범용적인 항체의 정제, 표지, 고정화, 수식 등이 가능하게 된다.
IgG는 혈청의 주요한 단백질의 하나로써, 면역계에 있어서 이물을 인식하여 배제하도록 유도하는 중요한 역할을 담당하고 있다. 이 특성을 살려 각종 질환의 치료약이나 진단약, 또한 시약에의 응용 연구가 널리 행해지고 있다. 그 하나가 암에 대한 항체 요법으로, 항체 의존성 세포 개재성 세포 장해 반응(ADCC)이나 보체 의존성 세포 장해 반응(CDC)을 이용한 것이나, 암 세포에 발현하는 수용체 등을 항체에 의해 특이적으로 블록킹하여 군량 공격으로 하는 분자표적 의약, 혹은 암 세포특이적인 항체에 항암제를 결합한 항체를 이용하는 미사일 요법(missile therapy)등의 개발이 진행되고 있다. 그 중에서, 항 HER2 수용체 인간화 단일클론 항체가, 유방암 등의 악성 종양 치료제로써 개발되어 시판되었다(상품명 하셉틴). 또한 IgG는 항원과 특이적으로 결합하는 성질을 이용하여, 면역학적 측정을 비롯하여, 세포나 단백질의 기능 해석, 유전자의 발현 스크리닝 등 각종 생화학 실험의 필수적인 도구로서 사용되고 있다.
IgG는 2개의 H쇄와 2개의 L쇄가 디술피드 결합(S-S 결합)으로 결합한 Y 자형의 구조를 이루고 있다. IgG를 단백질 분해 효소인 파파인으로 분해하면, 정상 부위로 이루어지는 Fc 프라그멘트와 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 프라그멘트로 나눌 수 있다. 또한, IgG에는 서브 클래스가 존재하고, 인간 IgG의 경우는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류가 존재한다.
항체는 혈청이나 하이브리도마 세포 배양 상청액으로부터 항체 정제용 컬럼을 이용하여 정제된다. 일반적으로 제1 단계의 정제에는 리간드로서 단백질 A(Protein A)가 사용된다. 단백질 A는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 생산하는 분자량 42 kDa의 단백질로, IgG의 Fc 영역에 강하게 결합한다. 단백질 A는 고가이고, 또한, 동물종이나 서브 클래스에 의해 고순도의 항체를 얻을 수 없는 경우나, 단백질 A를 이용한 정제 조건에서는 항체가 변성하는 경우가 있어, 단백질 A의 성능을 상회하는 신규의 분리제가 요구되고 있다.
형광 물질 또는 효소에 의해 표지된 항체는, 면역 조직 화학 실험, 조직 염색, ELISA, 웨스턴블로팅, 유세포 측정법(Flow cytometry) 등 각종 실험에 이용되고 있다. 예컨대 조직 염색에서는, FITC 등의 형광 물질이 결합한 항체를 이용함으로써 목적 단백질의 조직 국재를 조사할 수 있다. 또한, ELISA나 웨스턴블로팅 등의 측정에서는, 우선 검출하고 싶은 물질에 대해 일차항체를 반응시키고, 다음으로 그 일차항체와 결합하는 표지된 이차항체를 반응시킴으로써 보다 고감도인 측정이 행해지도록 되어 있다. 예컨대, GE 헬스케어사의 ECL 시스템에서는, 이차항체로서 서양와사비 페록시다아제가 결합한 항체를 이용하여, 그 촉매 작용에 의해 루미놀을 산화·발광시킬 목적 물질을 검출한다. 그러나, 화학 수식에 의해 표지 물질을 항체에 결합시키기 위해서는 번거로우며 시간이 걸리고, 경우에 따라서는 항체가 변성하는 경우가 있어, 신규의 항체 표지 기술의 개발이 요구되고 있다. 또한, 표지화된 이차항체에 대해서도 보다 저렴하고 고감도인 것이 요구되고 있다.
각종 질환에 대한 진단용 칩으로서 항체칩의 개발이 진행되고 있다. 그 하나의 과제는 기판에의 항체의 고정화 방법으로, 항체의 항원 결합 부위를 표면에 고활성 상태로 고밀도로 정렬시키는 방법의 개발이다. 비특이적 흡착을 이용한 고정화법이나 아미노기를 이용한 고정화법에서는 항체가 무질서하게 배열하게 되고, 충분한 감도를 얻을 수 없다.
항체는 암이나 류머티즘 등의 질환에 대한 분자표적 치료약으로서 급속히 개발 연구가 추진되어, 지금까지 약 20종류의 항체 의약이 실용화되고, 또한 세계적으로 약 300 종류의 항체 의약 후보의 임상 시험이 실시되고 있다. 개발 당초에는 항체 의약으로서 마우스 단일 클론 항체가 이용되고 있었지만, 마우스 항체는 인간 면역계에 이물(異物)로 인식되어 인간항 마우스 항체의 생산이 유도되었기 때문에, 충분한 치료 효과를 올릴 수 없었다. 그래서 유전자 재조합 기술을 이용하여, 마우스 항체의 정상 영역을 인간 항체의 정상 영역으로 치환한 키메라 항체나 마우스 항체의 상보성 결정 영역 이외 모두 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 또한, 인간 항체 생산 마우스(KM 마우스)를 이용한 인간 단일 클론 항체의 제작법도 개발되고 있다.
항체 요법에 이용되는 단일 클론 항체 의약의 하나는, 암 세포를 특이적으로 인식하는 항체에 항암제나 독소를 결합시킨 것으로, 이것을 표적 세포에 내재화(internalization)시켜 표적 세포를 사멸시킨다. 항암제 또는 독소는 내재화된 후에 항체로부터 분리되는 것이 필요하다. 그 때문, 항체와 항암제 또는 독소를 결합하는 링커(linker)에 프로테아제 인식 부위를 포함하는 등, 내재화된 후에 항체로부터 항암제 또는 독소가 분리되는 것과 같은 세공이 실시되고 있다. 예컨대, 급성 골수성 백혈병의 치료약으로서 개발된 gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg)은 인간화 항CD33 단일 클론 항체에 칼리케아미신(calicheamicin) 유도체를 결합시킨 것으로, Mylotarg가 CD33에 결합하여 세포 내에 내재화되면, 칼리케아미신 유도체가 유리하여서 세포를 사멸시킨다. 이와 같이, 항체와 항암제 또는 독소를 결합하는 링커의 설계는 중요하고, 보다 높은 약효를 끌어내기 위해, 신규 링커의 개발이 진행되고 있다.
최근, RNA 앱타머의 치료약, 진단약, 시약에의 응용이 주목받고 있고, 몇개의 RNA 앱타머가 임상 단계 혹은 실용화 단계에 들어가 있다. 2004년 12월에는 세계 최초의 RNA 앱타머 의약인 Macugen이 나이 관련 황반 변성증의 치료약으로서 미국에서 승인되었다. RNA 앱타머는 단백질 등의 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA로서, SELEX법(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)을 이용하여 제작할 수 있다[Ellington et al.,(1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al.,(1990) Science, 249, 505-510.] SELEX법은 1014 정도의 상이한 뉴클레오티 드 서열을 갖는 RNA의 풀에서 표적 물질에 특이적으로 결합하는 RNA를 선별해 내는 방법이다. 사용되는 RNA는 40잔기 정도의 랜덤 서열을 프라이머 서열로 끼운 구조를 하고 있다. 이 RNA 풀을 표적 물질과 회합시켜, 필터 등을 이용하여 표적 물질에 결합한 RNA만 회수한다. 회수한 RNA는 RT-PCR에서 증폭하고, 이것을 다음 라운드의 주형으로서 이용한다. 이 작업을 10회 정도 반복함으로써, 표적 물질과 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 취득할 수 있다. 얻어진 RNA 앱타머가 표적 물질의 기능을 촉진하거나 저해하는 경우, 이 RNA 앱타머를 의약품 등에 응용할 수 있다. 실제로는, 인간 번역 개시 인자인 eIF4A[일본 특허 공개 제2002-300885호 공보, 0 guro et al.,(2003) RNA 9, 394-407]나 eIF4E[일본 특허 공개 제2004-344008호 공보, Mochizukietal.,(2005) RNA 11, 77-89), 뼈대사에 관계하는 수용체 RANK(Receptor Activator of NF-κB, Mori et al.,(2004) Nucleic Acids Res.32, 6120-6128] 등에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머가 SELEX법을 이용하여 제작되어 있다. 항 DNA 자기항체의 항원 인식 부위를 통해 결합하는 RNA 앱타머도 또한 보고되어 있다(Kim et al.,(2003) Biochemical and Biophysical Research Communication 300, 516-523).
-본 발명의 개시-
본 발명은 IgG에 대한 앱타머 및 그 이용 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 검토한 결과, IgG에 대해 고도로 설계된 양질인 앱타머를 제작하는 것에 성공하여, 이로써 본 발명을 완성하 는 것에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명 등을 제공하는 것이다.
[1] IgG의 Fc 부분에 대해 결합하는 앱타머.
[2] IgG의 Fc 부분으로서, 인간 IgG의 Fc 부분에 대해 특이적으로 결합하는 상기 [1]의 앱타머.
[3] 앱타머를 구성하는 총 뉴클레오티드수가 40개 이하인 상기 [1] 또는 [2]의 앱타머.
[4] 앱타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 리보스의 2' 위치에 있어서, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 기를 포함하는 뉴클레오티드인 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나의 앱타머.
[5] GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 [3]의 앱타머.
[6] GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 3번째의 U가 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 상기 [5]의 앱타머.
[7] GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 3번째의 U를 제외한다)가 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 상기 [6]의 앱타머.
[8] GGUG(C/A)(U/T)가 GGUGCU 또는 GGUGAU인 상기 [5]의 앱타머.
[9] ANC(N은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 이다)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 상기 [5]의 앱타머.
[10] ANC에 있어서의 각 뉴클레오티드가 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 상기 [9]의 앱타머.
[11] 이하 (i)∼(iii) 중 어느 하나인 상기 [9]의 앱타머:
(i) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGA를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UCC를 포함하는 앱타머;
(ii) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGNx1A를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UNx2CC를 포함하는 앱타머(Nx1, Nx2는 각각 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다.); 혹은
(iii) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGNx3Nx4A를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UNx5Nx6CC를 포함하는 앱타머(Nx3, Nx4, Nx5, Nx6은 각각, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다).
[12] GGA, GGNx1A 또는 GGNx3Nx4A에 포함되는 GG, 및 UCC, UNx2CC 또는 UNx5Nx6CC 에 포함되는 CC는 각각 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 상기 [11]의 앱타머.
[13] 이하 (I)∼(III)로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 상기 [6]의 앱타머:
(I)
Figure 112008008532291-PCT00001
(II)
Figure 112008008532291-PCT00002
(III)
Figure 112008008532291-PCT00003
[식 중, N1, N2, N3, N4, N5는 각각 동일 또는 상이하고, A, G, C , U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이며,
N2 및 N3은 서로 상보적인 뉴클레오티드이고,
N4 및 N5는 서로 상보적인 뉴클레오티드이며,
(i) GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 3번째의 U를 제외한다), (ii) AN1C에 있어서의 각 뉴클레오티드, (iii) N2∼N5의 각 뉴클레오티드가 각각 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보 스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드이다].
[14] 루프 구조에 있어서의 모든 뉴클레오티드는 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 상기 [11]의 앱타머.
[15] (I)∼(III) 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머가 이하 (I')∼(III') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 상기 [13]의 앱타머:
(I')
Figure 112008008532291-PCT00004
(II')
Figure 112008008532291-PCT00005
(III')
Figure 112008008532291-PCT00006
[식 중, N1, N2, N3, N4, N5는 각각, 상기 [13]와 동일한 의미를 나타낸다].
[16] AGGUG(C/A)(U/T)C로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, AGGUG(C/A)(U/T)C에 있어서의 4번째의 U는 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기 가 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드이고, AGGUG(C/A)(U/T)C에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 4번째의 U를 제외한다)가 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 상기 [3]의 앱타머.
[17] GANCU(N은, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고, GANCU에 있어서의 각 뉴클레오티드가 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 상기 [16]의 앱타머.
[18] 이하(Ia)∼(IIIa)로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는, 상기 [6]의 앱타머:
(Ia)
Figure 112008008532291-PCT00007
(IIa)
Figure 112008008532291-PCT00008
(IIIa)
Figure 112008008532291-PCT00009
[식 중, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7은 각각 동일 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이며,
N2 및 N3은 서로 상보적인 뉴클레오티드이고,
N4 및 N5는 서로 상보적인 뉴클레오티드이며,
N6 및 N7은 서로 상보적인 뉴클레오티드이고,
(i) GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 3번째의 U를 제외한다), (ii) ANlC에 있어서의 각 뉴클레오티드, (iii) N2∼N7의 각 뉴클레오티드는 각각 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드이다].
[19] (Ia)∼(IIIa) 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머가 이하 (Ia')∼(IIIa') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 상기 [18]의 앱타머:
(Ia')
Figure 112008008532291-PCT00010
(IIa')
Figure 112008008532291-PCT00011
(IIIa')
[식 중, N1, N2, N3, N4, N5은 각각, 상기 [18]과 동일한 의미를 나타낸다].
[20] N4, N6은 각각 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드이며, N5, N7은 각각 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드인 상기 [19]의 앱타머.
[21] (Ia')∼(IIIa') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머가 이하 (Ia''')∼(IIIa''') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 상기 [19]의 앱타머:
(Ia''')
Figure 112008008532291-PCT00013
(IIa''')
Figure 112008008532291-PCT00014
(IIIa''')
Figure 112008008532291-PCT00015
.
[22] 이하(a)∼(c) 중 어느 하나인 상기 [3]의 앱타머:
(a) 서열 번호 1∼23 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이더라도 좋다)로 이루어지는 앱타머;
(b) 서열 번호 1∼23 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이더라도 좋다)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 앱타머;
(c) 상기(a)의 연결물, 상기(b)의 연결물 및 상기(a) 및(b)의 연결물로 이루어지는 군에서 선택되는 연결물.
[23] 상기 [1]∼[22] 중 어느 하나에 기재한 앱타머 및 그것에 결합한 기능 성 물질을 포함하는 복합체.
[24] 기능성 물질이 친화성 물질, 표지용 물질, 효소, 약물, 독소 또는 약물 송달 매체인 상기 [23]의 복합체.
[25] 상기 [1]∼[22] 중 어느 하나에 기재한 앱타머 혹은 상기 [23] 또는 [24]의 복합체가 고정화된 고상 담체.
[26] 고상 담체가 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼 또는 다공질재인 상기 [25]의 고상 담체.
[27] 상기 [25] 또는 [26]의 고상 담체를 포함하는 의료용 기기.
[28] 의료용 기기가 혈액 정화용 기기인 상기 [27]의 기기.
[29] 상기 [1]∼[22] 중 어느 하나에 기재한 앱타머, 상기 [23] 또는 [24]의 복합체 혹은 상기 [25] 또는 [26]의 고상 담체를 포함하는 진단용 또는 검사용 시약.
[30] 상기 [1]∼[22] 중 어느 하나의 앱타머 혹은 상기 [23] 또는 [24]의 복합체를 포함한 의약.
[31] 상기 [25] 또는 [26]의 고상 담체에 IgG 항체를 흡착시키고, 흡착된 IgG 항체를 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함하는 항체 정제 또는 농축 방법.
[32] 용출액이 중성 용액인 상기 [31]의 방법.
[33] IgG 항체를 제작하고, 제작된 IgG 항체를 상기 [25] 또는 [26]의 고상 담체에 의해 정제하는 것을 포함하는 정제 항체의 제조 방법.
[34] 상기 [1]∼[22] 중 어느 하나에 기재한 앱타머, 상기 [23] 또는 [24]의 복합체 혹은 상기 [25] 또는 [26]의 고상 담체를 이용하고, 시료 중의 IgG 의 유무 및/또는 양을 측정하는 것을 포함하는 IgG의 검출 및/또는 정량 방법.
도 1은 서열 번호 1로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 2는 서열 번호 2로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 3은 서열 번호 3으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 4는 서열 번호 4로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 5는 서열 번호 5로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 6은 서열 번호 6으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 7은 서열 번호 7로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 8은 서열 번호 8로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 9는 서열 번호 9로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 10은 서열 번호 10으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 11은 서열 번호 11로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 12는 서열 번호 12로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 13은 서열 번호 13으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 14는 서열 번호 14로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 15는 서열 번호 15로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 16은 서열 번호 16으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 17은 서열 번호 17로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 18은 서열 번호 18로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 19는 서열 번호 19로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 20은 서열 번호 20으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 21은 서열 번호 21로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 22는 서열 번호 22로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 23은 서열 번호 23으로 표시되는 RNA의 예측되는 이차 구조를 도시한다.
도 24는 서열 번호 1로 표시되는 RNA와 인간 IgG-Fc의 결합 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG-Fc를 주입하여 RNA와의 상호 작용을 관찰했다. 종축의 RU는 Relative Unit를 도시하고, Resp.Diff.는 Response Differences(반응 편차)를 도시한다. 횡축은 시간(초)을 도시한다. 종축, 횡축에 있어서의 이들의 표기는 이하의 도 25∼31, 42에서도 동일하다.
도 25는 서열 번호 3으로 표시되는 RNA와 인간 IgG-Fc의 결합 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG-Fc를 주입하여 RNA와의 상호 작용을 관찰했다.
도 26은 랜덤 서열의 RNA 풀과 인간 IgG-Fc의 결합 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG-Fc를 주입하여 RNA와의 상 호 작용을 관찰했다.
도 27은 서열 번호 1로 표시되는 RNA와 인간 IgG1과 인간 Fcγ RI의 복합체형성 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG1를 주입하여 RNA에 결합시키고, 계속해서 Fcγ RI를 주입하여 IgG1와의 상호 작용을 관찰했다.
도 28은 랜덤 서열을 포함하는 RNA 풀과 인간 IgG1과 인간 Fcγ R의 결합 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG1을 주입하였으며, 계속해서 Fcγ RI를 주입했다.
도 29는 서열 번호 1로 표시되는 RNA와 인간 IgG1과 단백질 A의 복합체 형성 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG1를 주입하여 RNA에 결합시키고, 계속해서 단백질 A를 주입하여 IgG1와의 상호 작용을 관찰했다.
도 30은 서열 번호 1로 표시되는 RNA 앱타머와 단백질 A의 결합 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩으로 고정화하고, 단백질 A를 주입하여 RNA와의 상호 작용을 관찰했다.
도 31은 서열 번호 17-2로 표시되는 RNA 앱타머와 인간 IgG1의 결합 양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly dA를 부가한 RNA를 dA-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, IgG1을 주입하여 RNA와의 상호 작용을 관찰했다.
도 32는 서열 번호 15와 17로 표시되는 RNA를 항체 정제용 분리제의 리간드로서 이용하여 인간 IgG1을 풀다운했을 때의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. Poly(A)가 결합한 RNA를 Poly(dT)가 결합한 비즈에 고정화하여 인간 IgG1의 풀다운을 행하였다. 레인1: 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 리간드로서 이용한 경우. 레인2: 서열 번호 17로 표시되는 RNA를 리간드로서 이용한 경우. 레인3: 단백질 A를 리간드로서 이용한 경우. 레인4: r단백질 A를 리간드로서 이용한 경우.
도 33은 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 항체 정제용 분리제의 리간드로서 이용하여 인간 혈청으로부터 인간 IgG를 정제했을 때의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 비오틴이 결합한 RNA를 스트렙타비딘의 비즈에 고정화하여, 인간 혈청으로부터 IgG를 풀다운했다. RNA에 결합한 IgG는 3종류의 중성 용출액을 이용하여 용출했다. 중성 용출액으로 IgG가 효율적으로 용출되는지의 여부를 확인하기 위해, 용출이 끝난 비즈에 샘플 완충액을 부가하고 가열하여 SDS-PAGE에서 분석했다. 레인1 : 분자량 마커 단백질. 레인2 : RNA를 리간드로서 이용한 비즈로부터 200 mM KCl과 10 mM ED TA로 이루어지는 용출액으로 용출되는 IgG. 레인3 : RNA를 리간드로서 이용한 비즈로부터 200 mM KCl과 10 mM EDTA와 10％ 글리세롤로 이루어지는 용출액으로 용출되는 IgG. 레인4: RNA를 리간드로서 이용한 비즈로부터 600 mM KCl과 10 mM EDTA와 10％ 글리세롤로 이루어지는 용출액으로 용출되는 IgG. 레인5: r단백질 A 세파 로스비즈를 이용하여 IgG를 풀다운한 경우에, pH 3 글리신 완충액으로 용출되는 IgG. 레인6: 레인2의 용출액로 처리한 후의 비즈에 결합하고 있는 IgG. 레인7: 레인3의 용출액으로 처리한 후의 비즈에 결합하고 있는 IgG. 레인8: 레인4의 용출액로 처리한 후의 비즈에 결합하고 있는 IgG. 레인9: RNA를 리간드로서 이용한 비즈에 대해 용출 처리를 하지 않고 직접 비즈에 샘플 완충액을 부가하여 회수한 IgG. 레인10: 레인5의 용출액으로 처리한 후의 비즈에 결합하고 있는 IgG.
도 34는 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 반복하여 항체 정제용 분리제의 리간드로서 사용할 수 있는지의 여부를 시험했을 때의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 한번 항체 정제에 사용한 RNA가 결합한 분리제를 요소로 세정하고, 재차 항체 정제를 행했다. 이것을 두 번 반복했다. 레인1: 분자량 마커 단백질. 레인2: 첫번째의 정제로 얻어지는 IgG. 레인3: 두번째의 정제로 얻어지는 IgG. 레인4: 세번째의 정제로 얻어지는 IgG.
도 35는 서열 번호 16 및 서열 번호 17-2로 표시되는 RNA를 항체 정제용 분리제의 리간드로서 이용하여 인간 혈청으로부터 인간 IgG를 정제했을 때의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 레인1 : 분자량 마커 단백질. 레인2 : 리간드로서 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 이용한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인3: 리간드로서 서열 번호 16으로 표시되는 RNA를 이용한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인4: 리간드로서 서열 번호 17-2로 표시되는 RNA를 이용한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인5: r단백질 A를 리간드로서 이용한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인6: 인간 혈청.
도 36은 티올 커플링에 의해 고정화된 RNA 앱타머를 이용하여 항체 정제를 행한 경우의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 레인1 : 분자량 마커 단백질. 레인2: 리간드에 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 이용하여, 5 ㎕의 인간 혈청을 부가한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인3: 리간드에 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 이용하여, 10 ㎕의 인간 혈청을 부가한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인4: 블랭크(리간드가 결합하지 않는 비즈에 5 ㎕의 인간 혈청을 부가한 경우에 풀다운되는 혈청 단백질). 레인5: r단백질 A 비즈를 이용하여, 5 ㎕의 인간 혈청을 가한 경우에 풀다운되는 IgG. 레인6: 표준 인간 IgG1. 레인7: 인간 혈청.
도 37은 아미노 커플링에 의해 고정화된 RNA 앱타머를 이용하여 항체 정제를 행한 경우의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 회수된 샘플의 반량을 어플라이했다. 레인1: 분자량 마커 단백질. 레인2: 리간드로서 서열 번호 15로 표시되는 RNA(고정화량 25 ㎍)을 이용하여, 10 ㎕의 인간 혈청으로부터 회수한 IgG. 레인3: 리간드로서 서열 번호 15로 표시되는 RNA(고정화량 75 ㎍)를 이용하여, 10 ㎕의 인간 혈청으로부터 회수한 IgG.
도 38은 아미노 커플링에 의해 고정화된 RNA 앱타머를 이용하여 항체 정제한 경우의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 풀다운에는 10 ㎕의 인간 혈청을 이용했다. 레인1: 분자량 마커 단백질. 레인2: 리간드에 서열 번호 17-7로 표시되는 RNA를 이용한 경우. 레인3 : 리간드에 서열 번호 17-8로 표시되는 RNA를 이용한 경우. 레인4 : 리간드에 서열 번호 17-7-107로 표시되는 RNA를 이용한 경우. 레인5: 리간드에 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 이용한 경우. 레인6: r단백질 A 수지를 이용한 경우. 레인7: 표준 인간 IgG1(6 ㎍). 레인8: 인간 혈청(0. 2 ㎕).
도 39는 각종 용출액을 이용하여 용출한 경우의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 레인1: 분자량 마커 단백질. 레인2: 200 mM KCl+ 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris. 레인3: 200 mM KCl+ pH 7.6 10 mM Tris. 레인4: 300 mM NaCl+ 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris. 레인5: 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris.
도 40은 가열 재생된 앱타머 수지의 특성 평가를 위해 행한 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 이미 3회 사용한 앱타머 수지 10 ㎕를 2가지 방법으로 가열 처리하여, 재차 10 ㎕의 인간 혈청을 이용하여 풀다운 실험을 행했다. 중성 용출 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 레인1: 서열 번호 17-18로 표시되는 앱타머 수지, 초순수 중에서 85℃ 5분 가열. 레인2: 서열 번호 17-17로 표시되는 앱타머 수지, 6M 요소 중에서 65℃ 15분 가열.
도 41은 수지 결합형 올리고에 의해 정제된 IgG에 대한 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. 서열 번호 15로 표시되는 RNA가 공유 결합한 수지 결합형 올리고 10 ㎕에 10 ㎕의 인간 혈청을 부가하여, 중성 용출액으로 용출한 분획을 SDS -PAGE에서 분석했다.
도 42는 서열 번호 17-7로 표시되는 RNA와 항체 의약품인 리툭산의 결합양상을 보여주는 표면 플라즈몬 공명 해석으로 얻어진 센서그램을 도시한다. 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-dT 결합으로 센서칩에 고정화하고, 리툭산을 주입하여 RNA와의 상호 작용을 관찰했다.
-발명의 실시를 위한 최량의 형태-
본 발명은 면역글로불린 G(IgG)에 대한 앱타머를 제공한다.
앱타머는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대해 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해하는 작용도 또한 가질 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 IgG의 Fc 부분에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 앱타머가 결합할 수 있는 IgG로서는, 예컨대, 인간 IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 햄스터 IgG, 돼지 IgG를 들 수 있다.
본 발명의 앱타머는 IgG의 Fc 부분의 임의의 부분에 결합할 수 있는 것이다. IgG의 Fc 부분은, 대식 세포나 호중구 등의 면역 담당 세포에 발현하고 있는 수용체 단백질(Fcγ R)에 대해 결합하는 것이 알려져 있지만, 본 발명의 앱타머는 Fcγ R에 대한 결합을 담당하는 Fc 부분과는 상이한 Fc 부분에 결합하는 것이라도 좋다. 또한, 단백질 A가 IgG의 Fc 부분에 결합하는 것이 알려져 있지만, 본 발명의 앱타머는 단백질 A 에 대한 결합을 담당하는 Fc 부분과는 상이한 Fc 부분에 결합하는 것이라도 좋다.
본 발명의 앱타머는 IgG에 대해 결합할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 해리 정수(Kd값)에 기초하여 평가하는 경우, 약 1× 10-6M 이하, 바람직하게는 약 1× 10-7M 이하, 더욱 바람직하게는 약 1× 10-8M 이하의 Kd값을 갖는 것이다. Kd값은 예컨대, 표면 플라즈몬 공명을 이용한 방법에 의해 산출할 수 있다.
본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상, 약 16∼약 200 뉴클레오티드이지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 이하이며, 더욱 바람직하게는 약 40 뉴클레오티드이하이고, 더욱 바람직하게는 약 30 뉴클레오티드 이하이며, 가장 바람직하게는 약 25 뉴클레오티드 이하이다. 또한, 본 발명의 앱타머의 길이는, 예컨대 약 18 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드 이상이더라도 좋다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 메리트도 크다. 또한, 화학 수식도 용이하고, 생체 내안정성도 높고, 독성도 낮다고 여겨진다.
본 발명의 앱타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예, -O-CHO 기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 앱타머는 GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다. GGUG(C/A)(U/T)로서는, 예컨대, GGUGCU, GGUGAU, GGUGCT, GGUGAT를 들 수 있지만, RNA 분자라고 하는 관점에서는, GGUGCU, GGUGAU가 바람직하다. 본 발명의 앱타머가 GGUG(C/A)(U/T)를 포함하는 경우, 핵산에 포함되는 GGUG(C/A)(U/T)의 수는, 1 또는 복수(예, 2 또는 3개)일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 하나의 IgG에 대해 2개 결합할 수 있다.
본 발명의 앱타머는, GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 3번째의 U의 리보스의 2위가 플루오로화된 것(즉 2'-F 수식), 또는 IgG에 대한 본 발명의 앱타머의 결합 활성을 유지할 수 있도록 3번째의 U의 리보스의 2 위치가 플루오로화 이외의 수식을 실시된 것일 수 있다. 이러한 수식으로서는, 예컨대, -O-Me화, 아미노화(NH2)를 들 수 있다.
본 발명의 앱타머는 또한, 화학 합성한 것으로, 5' 말단에 모노포스페이트기를 갖는 점에서, 전사(예, SELEX 법)에 의해 합성된, 5'말단에 트리포스페이트기를 갖는 앱타머와 상이할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 적어도 1종(예, 1, 2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 -0-Me 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머가 GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 그 양단에 있어서, 스템 구조를 가질 수 있다. 스템 구조는, 벌지 구조의 충분한 안정화를 가져오는 것일 수 있다. 예컨대, 스템 구조로서, GGUG(C/A)(U/T)의 5' 말단의 G(첫번째의 뉴클레오티드) 및 5'측에서 그것에 인접하는 1 이상의 뉴클레오티드, 3' 말단의 U/T(6번째의 뉴클레오티드) 및 3'측에서 그것에 인접하는 1 이상의 뉴클레오티드가 각각, 분자내 염기쌍을 형성할 수 있다. 5'측 또는 3'측에서 인접하는 1 이상의 뉴클레오티드는 1 이상인 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2 이상, 바람직하게는 3 이상이다.
본 발명의 앱타머는 또한, 전술한 GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 부가하여, ANC로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. ANC에 있어서의 N은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 뉴클레오티드일 수 있지만, A, G, C 및 U가 바람직하고, A 및 G가 더욱 바람직하며, A가 가장 바람직하다. 본 발명의 앱타머가 GGUG(C/A)(U/T) 및 ANC로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, GGUG(C/A)(U/T)가 5'측, ANC이 3'측에 존재하고 있더라도 좋고, 또한, ANC이 5'측, GGUG(C/A)(U/T)가 3'측에 존재하고 있더라도 좋다. 본 발명의 앱타머는 GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 5'말단의 G가 ANC에 있어서의 C와 분자내 염기쌍을 형성할 수 있는 구조 및/또는 GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 3'말단의 U/T가 ANC에 있어서의 A와 분자내 염기쌍을 형성할 수 있는 구조를 갖는다. 본 발명의 앱타머가 GGUG(C/A)(U/T) 및 ANC의 쌍방을 포함할 수 있는 경우, 앱타머에 포함되는 GGUG(C/A)(U/T) 및 ANC의 수는 각각, 1 또는 복수(예, 2 또는 3개)일 수 있다.
본 발명의 앱타머는 또한, 이하(i)∼(iii) 중 어느 하나일 수 있다: (i) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGA를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UCC를 포함하는 앱타머:
(ii) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGNx1A를 포함하고, 또한 A NC의 3'측에 UNx2CC를 포함하는 앱타머(Nx1, Nx2는 각각, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다); 혹은
(iii) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGNx3Nx4A(예, GGACAG)를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UNx5Nx6CC를 포함하는 앱타머(Nx3, Nx4, Nx5, Nx6은 각각, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다). GGA, GGNx1A 또는 GGNx3Nx4A 및 UCC, UNx2CC 또는 UNx5Nx6CC에 있어서의 모든 뉴클레오티드는, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있지만, 결합 활성의 관점에서, 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 것도 또한, 바람직하다.
본 발명의 앱타머는 또한, AGGUG(C/A)(U/T)C로 표시되는 뉴클레오티드 서열 및/또는 GANCU(N은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 얻을 수 있다. AGGUG(C/A)(U/T)C에 있어서의 4번째의 U는 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드이거나, 또는 IgG에 대한 본 발명의 앱타머의 결합 활성을 유지할 수 있도록 4번째의 U의 리보스의 2' 위치가 플루오로화 이외의 수식이 실시된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 U 이외의 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
상세하게는, 본 발명의 앱타머는, 벌지 구조 및 상기 벌지 구조의 양단에 존재하는 2개의 스템 구조(S1, S2) 및 루프 구조를 포함하는, 잠재적 이차 구조를 갖는다. 본명세서 중에서 이용되는 경우, 「잠재적 이차 구조」란, 생리 조건 하에서 안정하게 존재할 수 있는 이차 구조를 말하며, 예컨대, 잠재적 이차 구조를 갖는지의 여부는, 실시예 기재의 구조 예측 프로그램에 의해 결정할 수 있다. 루프 구조에 있어서의 모든 뉴클레오티드는 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기(예, 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me 기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있으며, 결합 활성의 관점에서, 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 것도 또한 바람직하다.
보다 상세하게는, 본 발명의 앱타머는 이하의 (I)∼(III) :
(I)
Figure 112008008532291-PCT00016
(II)
Figure 112008008532291-PCT00017
(III)
Figure 112008008532291-PCT00018
[식 중, N1, N2, N3, N4, N5는 각각, 동일 또는 상이하고, A, G, C , U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이며, 또한 N2 및 N3은 서로 상보적인 뉴클레오티드이며, N4 및 N5는 서로 상보적인 뉴클레오티드이다] 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 가질 수 있다. 상기(I)∼(III) 중, 실선(가는 선)은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드가 임의의 길이로 연결되어 있는 것을 나타내고, 실선(가는 선)은 상보적인 결합(염기쌍)능을 잠재적으로 갖는 것을 나타낸다. S1, S2는 각각, 스템 구조를 도시한다. S1, S2에 있어서의 스템 구조에 있어서 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드수는 각각 1 이상일 수 있지만, 2 이상, 3 이상 또는 4 이상이더라도 좋다. 곡선부는 루프 구조를 나타낸다. 루프 구조는 바람직하게는 3 이상의 뉴클레오티드로 구성될 수 있지만 4개의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 (I)∼(III)로 표시되는 구조는 상기 (I')∼(III'), 하기 (I'')∼(III'') 또는 (I''')∼(III''')로 표시되는 구조일 수 있다.
(I'')
Figure 112008008532291-PCT00019
(II'')
Figure 112008008532291-PCT00020
(III'')
Figure 112008008532291-PCT00021
(I''')
Figure 112008008532291-PCT00022
(II''')
Figure 112008008532291-PCT00023
(III''')
Figure 112008008532291-PCT00024
또한, GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 3번째의 U가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있고, 본 발명의 앱타머에 포함되는 다른 뉴클레오티드(상기 U를 제외한다)가 각각, 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기(예, 수소 원자, 불소 원자, 또는 -0-Me 기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머는 또한, 이하의 (Ia)∼(IIIa):
(Ia)
Figure 112008008532291-PCT00025
(IIa)
Figure 112008008532291-PCT00026
(IIIa)
Figure 112008008532291-PCT00027
[식 중, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7은 각각, 동일 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이며, 또한 N2 및 N3은 서로 상보적인 뉴클레오티드이고, N4 및 N5는 서로 상보적인 뉴클레오티드이며, N6 및 N7은 서로 상보적인 뉴클레오티드이다] 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 가질 수 있다. 상기(IIa)∼(IIIa) 중, 실선(가는 선)은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드가 임의의 길이로 연결되어 있는 것을 나타내며, 실선(가는 선)은 상보적인 결합(염기쌍)능을 잠재적으로 갖는 것을 나타낸다. S1, S2는 각각, 스템 구조를 도시한다. S1, S2에 있어서의 스템 구조에 있어서 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드수는 각각 1 이상일 수 있지만, 2 이상, 3 이상 또는 4 이상이라도 좋다. 곡선부는 루프 구조를 나타낸다. 루프 구조는 바람직하게는 3 이상의 뉴클레오티드로 구성될 수 있지만, 4개의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기(Ia)∼(IIIa)로 표시되는 구조는 상기 (Ia')∼(IIIa'), 하기 (Ia'')∼(IIIa'') 또는 상기 (Ia''')∼(IIIa ''')로 표시되는 구조일 수 있다.
(Ia'')
Figure 112008008532291-PCT00028
(IIa'')
Figure 112008008532291-PCT00029
(IIIa''')
Figure 112008008532291-PCT00030
또한, GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 3번째의 U가, 리보스의 2' 위치에 있어서, 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있고, 본 발명의 앱타머에 포함되는 다른 뉴클레오티드(상기 U를 제외한다)가 각각, 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기(예, 수소 원자, 불소 원자, 또는 -0-Me 기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 결합 활성의 관점에서는, N4, N6이 각각, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자에 치환되어 있는 뉴클레오티드이고, N5, N7이, 각각, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드인 것도 또한, 바람직하다.
본 발명의 앱타머는 또한, (a) 서열 번호 1∼23 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이더라도 좋다)로 이루어지는 앱타머, (b) 서열 번호 1∼23 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이더라도 좋다)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 앱타머, (c) 상기 (a)의 복수의 연결물, 상기 (b)의 복수의 연결물, 상기 (a) 및 (b)의 복수의 연결물로 이루어지는 군에서 선택되는 연결물일 수 있다. 상기(b)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는, 수개인 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 약 10개 이하, 바람직하게는 약 8개 이하, 더욱 바람직하게는 약 6개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 4개, 3개, 2개 또는 1개일 수 있다. 상기 (c)에 있어서 연결은 랜덤 결합으로써 행해질 수 있다. 또한, 연결에 있어서, 링커를 이용하더라도 좋다. 링커로서는, 뉴클레오티드쇄(예, 1∼약 20 뉴클레오티드), 비 뉴클레오티드쇄[예, -(CH2)n-링커, -(CH2CH2O)n-링커, 헥사에틸렌 글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S- 결합을 포함하는 링커, -CONH- 결합을 포함하는 링커, -OPO3-결합을 포함하는 링커]를 들 수 있다. 상기 복수의 연결물에 있어서의 복수는, 2 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2∼4개일 수 있다. 상기 (a)∼(c)에 있어서의 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 기(예, 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me 기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머는 또한, 가열 처리에 의한 재생, 멸균이 가능할 수 있다. 이러한 가열 처리로서는, 예컨대, 65∼85℃에서의 수분간(예, 5∼15분간)의 처리를 들 수 있다.
본 발명의 앱타머는 IgG에 대한 결합성, 안정성, 약물 송달성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당잔기(예, 리보스)가 수식된 것이라도 좋다. 당잔기에 있어서 수식되는 부위로서는, 예컨대, 당잔기의 2' 위치, 3' 위치 및/또는 4' 위치의 산소 원자를 다른 원자로 대체한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대, 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH2)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 개변은 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대, Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al.,(1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al.,(1973) Biochemistry 12, 5138-5145 참조).
본 발명의 앱타머는 또한, IgG에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 푸린, 피리미딘이 개변(예, 화학적 치환)된 것이라도 좋다. 이러한 개변으로서는, 예컨대, 5 위치 피리미딘 개변, 8 위치 푸린 개변, 환외 아민에서의 개변, 4-티오우리딘에서의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우라실에서의 치환을 들 수 있다. 또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대해 내성이도록, 본 발명의 앱타머에 포함되는 인산기가 개변되어 있더라도 좋다. 예컨대, P(O)O기가, P(O)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있더라도 좋다[여기서, 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다]. 연결기는 -O-, -N- 또는 -S- 연결을 통해 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 개변은 또한 캡핑과 같은 3' 및 5'의 개변을 포함하더라도 좋다. 개변은 또한, 폴리에틸렌글리콜이나 그 밖의 지질을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 개변에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제5,660,985호, 미국 특허 제5,756,703호를 참조한다.
본 발명의 앱타머는 본 명세서 중의 개시 및 상기 기술분야에 있어서의 기술상식에 의해 화학 합성할 수 있다. 본 발명의 앱타머로서는 또한, 예컨대, GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열(및 필요에 따라 ANC로 표시되는 뉴클레오티드 서열)을 포함하는 앱타머를 들 수 있지만, 이러한 앱타머는 SELEX법 및 그 개량법[예컨대, Ellington et al.,(1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al.,(1990) Science, 249, 505-510]을 이용하는 것으로 고도로 설계 가능하다. 예컨대, 하기:
프라이머용 서열(i) - (N)a-GGUG(C/A)(U/T)-(N)b - 프라이머용 서열(ii)
[상기에 있어서, (N)a는 a개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드쇄를 나타내고, (N)b는 b개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드쇄를 나타내며, N은 각각, 동일 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T(바람직하게는, A, G, C 및 U)로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이다. a, b는 각각, 동일 또는 상이하고, 임의의 수일 수 있으며, 예컨대 1∼약 100개, 바람직하게는 1∼약 50개, 더욱 바람직하게는 1∼약 30개, 또한 더욱 바람직하게는 1∼약 20개 또는 1∼약 10개일 수 있다.]로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단일종의 핵산 분자 또는 복수종의 핵산 분자(예, a, b의 수 등이 다른 핵산 분자의 라이브러리) 및 프라이머용 서열 (i), (ii)에 각각 대응하는 프라이머쌍을 이용함으로써, GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 앱타머가 고도로 설계 가능하다. 본 발명은 또한, 이러한 고도한 설계를 가능하게 하는 앱타머 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 앱타머는, 예컨대, 항체 정제용 분리제로서의 리간드, 항체와 표지 물질을 결합하는 링커, 항체의 고정화제, 항체와 수식 물질을 결합하는 링커로서 유용할 수 있다. 항체 정제용 분리제의 리간드로서의 구체적인 이용법은 단백질 A를 이용한 항체 정제 방법과 거의 동일하지만, 항체를 중성 용액으로 용출할 수 있는 점에서, 항체를 산성 용액으로 용출하는 것이 필요한 단백질 A를 이용한 방법보다도, 항체의 변성을 방지하는 것이 가능하다는 이점을 갖는다. 본 발명의 앱타머를 항체와 표지 물질을 결합하는 링커로서 이용하는 경우는, 본 발명의 앱타머가 항체로부터 해리하지 않을 정도로 높은 결합 활성이 필요하다. 한편, 항체 정제용 분리제로서 이용하는 경우는, 한번 흡착한 항체를 용출해야만 하므로, 반드시 결합 활성이 높다고 좋은 것은 아니다. 본 발명에서는 상이한 서열 및 상이한 길이 및 다른 수식 방법을 이용하는 것으로 IgG에 대해 상이한 결합력이나 안정성을 가지고, 저렴한 가격 등의 이점을 갖는 앱타머를 제공한다. 본 발명의 앱타머는 또한, 후술하는 여러 가지의 유용성을 갖는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 앱타머 및 그것에 결합한 기능성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에 있어서의 앱타머와 기능성 물질의 사이의 결합은 공유 결합, 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 복합체는 본 발명의 앱타머와 1 이상(예, 2 또는 3개)의 동종 또는 이종의 기능성 물질이 결합한 것일 수 있다. 기능성 물질로서는, 예컨대, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당질, 단당, 폴리 뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 들 수 있다. 기능성 물질로서는 또한, 예컨대, 친화성 물질, 표지용 물질, 효소, 약물, 독소, 약물 송달 매체를 들 수 있다.
친화성 물질로서는, 예컨대, 비오틴, 스트렙타비딘(streptavidin), 표적상보 서열에 대해 친화성을 갖는 폴리 뉴클레오티드, 항체, 글루타치온 세파로스, 히스티딘(histidine)을 들 수 있다.
표지용 물질로서는, 예컨대, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위체를 들 수 있다. 형광 물질로서는, 예컨대, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR Gold, SYPRO Ruby, SYPRO Orange, SYPRO Tangerine, FITC, FAM, EGFP, ECFP, AttoPhos, SYPRO Red, Cy3, TAMRA, ROX, HEX, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Deep Purple, Pro-Q Diamond, Rhodamine Red, BODIPY 576/589, NED, R-phycoerythrin, RFP, HNPP, Alexa Flour 633, Alexa Flour 635, Alexa Flour 647, Cy5, BODIPY 650/665, DiD, TOTO-3, DDAO 포스페이트, 브롬화에티늄, SYPRO Rose, Cy7, 플루오레세인 등을 들 수 있다. 발광 물질로서는, 예컨대, 루미놀, 루시페린, 루시게닌을 들 수 있다. 방사성 동위체로서는, 예컨대, 3H, 14C, 32P,35S, 90Y, 123I, 125I, 131I 등을 들 수 있다.
효소로서는, 예컨대, 서양와사비 페록시다아제나 알칼리 포스파타아제를 들 수 있다.
약물로서는, 예컨대, 항암제를 들 수 있다. 항암제로서는, 예컨대, 칼리케아미신이나 듀오칼마이신 등 미사일 요법에 사용되고 있는 것, 시클로포스파미드, 멜파란, 이포스파미드 또는 트로포스파미드 등의 니트로겐 머스타드 유사체, 티오테파 등의 에틸렌이미드류, 칼무스틴 등의 니트로소 요소, 테모졸로미드 또는 다카르바진 등의 리스트제, 메토트렉사트 또는 랄티트렉세이드 등의 엽산 유사 대사 대항제, 티오구아닌, 클라드리빈 또는 플루다라빈 등의 푸린 유사체, 플루오로우라실, 테가풀 또는 젬시타빈 등의 피리미딘 유사체, 빈브라스틴, 빈크리스틴 또는 빈오렐빈 등의 빈카알카로이드 및 그 유사체, 에토포시드, 탁산, 도세탁셀 또는 파클리탁셀 등의 포드필로톡신 유도체, 도키솔루비신, 에피루비신, 이달비신 및 미톡산트론 등의 안트라사이클린(anthracycline)류 및 유사체, 블레오마이신 및 미토마이신 등의 다른 세포 독성 항생 물질, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴 등의 백금 화합물, 펜토스타틴, 밀테포신, 에스트라머스틴, 토포테칸, 이리노테칸 및 비칼루타미드 등의 다른 항종양제를 들 수 있다.
독소로서는, 예컨대, 리신 독소, 리어 독소를 들 수 있다.
약물 송달 매체로서는, 예컨대, 리포좀, 마이크로스피어, 폴리에틸렌글리콜, 콜레스테롤, 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 앱타머 및/또는 본 발명의 복합체는 예컨대, 의약 또는 시약[예, 진단약, 검사약(실험용 시약을 포함한다)]으로 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 의약 또는 진단약은, 예컨대, 이상 IgG 및/또는 IgG의 과잉 발현이 원인인 질환(예, 류머티즘, 신장염, 캐슬먼 병, 베게너 육아종증, 실구체 경화증, 실구체질환, 다발성 동맥염, 자반병, 에리테마토데스, 장기 이식에 있어서의 거절 반응), IgG 생산에 관련된 질환(예, B 세포 임파종) 등의, 자기 면역 질환을 포함하는 IgG 관련 질환, 혹은 암의 치료 또는 진단(예, 병의 용태 파악, 치료 효과의 모니터링)에 유용하다. 또한, 암의 치료에서는, 본 발명의 복합체(예, 항암제나 독소에 결합한 본 발명의 앱타머를 항체 의약에 결합시킨 것)을 이용함으로써 암 세포를 사멸시키는 것이 가능하다.
본 발명의 시약은 항체를 대신해서 본 발명의 앱타머를 이용하는 것 이외는, 면역학적 방법과 동일한 방법에 의해 사용될 수 있다. 따라서, 항체를 대신해서 본 발명의 앱타머를 이용함으로써, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA, 간접경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 면역 크로마토법, 루미네센스 면역 측정법, 스핀 면역 측정법, 웨스턴블로팅법(예, 웨스턴블로팅 법에 있어서의 이차항체 대신으로서의 사용), 면역 조직 화학적 염색법, 세포 솔팅법 등의 방법과 동일한 방법에 의해, 전술한 질환의 진단이나 후술하는 IgG의 검출 정량을 행할 수 있다. 본 발명의 진단용 시약을 사용하는 방법도 또 본 발명에 의해 제공되지만, 이 경우, 본 발명의 고상 담체를 이용할 수도 있다.
본 발명의 의약은, 의약상 허용되는 담체가 배합된 것일 수 있다. 의약상 허용되는 담체로서는, 예컨대, 단당, 전분, 만니톨, 소르비트, 젖당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 단당, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복실메틸셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 나트륨-글리콜-스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 시트르산칼슘 등의 붕해제, 스테아린산마그네슘, 에어로질, 탈크, 라우릴황산나트륨 등의 윤활제, 시트르산, 멘톨, 글리실리신·암모늄염, 글리신, 오렌지 분말 등의 방향제, 안식향산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 초산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아린산 알루미늄 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오지, 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
경구 투여에 적합한 제제는 물, 생리식염수, 오렌지 쥬스같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 샤세제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 유효 성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효 성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.
비경구적인 투여(예컨대, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입, 복강내 투여 등)에 적합한 제제로서는, 수성 및 비수성의 등장성인 무균의 주사액제가 있고, 여기에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있더라도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있고, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있더라도 좋다. 상기 제제는, 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 혹은 복수회 투여량씩 용기에 봉인할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 의약상 허용되는 담체를 동결 건조하여, 사용 직전에 적당한 무균의 운반체(vehicle)에 용해 또는 현탁하면 좋은 상태로 보존할 수도 있다.
본 발명의 의약의 투여량은 유효 성분의 종류·활성, 병의 중증도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 의해 상이하지만, 통상, 성인 하루 당 유효 성분량으로서 약 0.0001∼약 2.0 g/kg, 예컨대 약 0.0001∼약 0.1 g/kg, 바람직하게는 약 0.005∼약 0.05 g/kg일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 앱타머 및/또는 본 발명의 복합체가 고정화된 고상 담체를 제공한다. 고상 담체로서는, 예컨대, 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티 웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은, DNA 칩이나 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대, 니켈PTFE(polytetrafluoroethylene) 기판이나 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 한 것을 들 수 있다. 수지로서는, 예컨대, 항체 정제 크로마토그래피나 항체를 리간드로 한 친화력 크로마토그래피에 사용되는 컬럼에 충전하는 수지 및 뱃치법으로 항체를 정제 혹은 고정화하기 위한 수지를 들 수 있고, 또한, 여러 가지의 농도의 아가로스 입자나 고도 가교된 아가로스 입자, 실리카 입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌가교디비닐벤젠 입자, 덱스트란을 에피택셜클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스 화이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교 폴리머, 단분산계 합성 폴리머, 단분산계 친수성 폴리머, 세파로스, 토요 펄(Toyopearl) 등을 포함하고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지를 포함한다.
본 발명의 앱타머 및/또는 본 발명의 복합체는 자체 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질(예, 전술한 것)이나 소정의 관능기를 본 발명의 앱타머 및/또는 본 발명의 복합체에 도입하고, 계속해서 상기 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 방법을 제공한다. 소정의 관능기는 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대, 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 관능기가 도입된 앱타머를 제공한다.
본 발명의 고상 담체는, 예컨대, IgG의 정제 및 IgG의 검출, 정량에 유용할 수 있다. 본 발명의 고상 담체는 또한, 전술한 이상 IgG 또는 IgG의 과잉 발현이 원인인 질환의 치료에 이용할 수 있다. 송액 펌프를 이용하여 환자의 혈관으로부터 혈액을 본 발명의 고상 담체(예, 카트리지)에 유입시켜, 소정의 양의 IgG를 흡착 제거한 후, 정화된 혈액을 환자에게 되돌린다. 이 경우, 항혈액 응고제를 첨가하여 혈액이 굳어지지 않도록 하는 것도 유익하다. IgG의 제거량은 투과 혈액량 및 본 발명의 고상 담체의 흡착 용량에 의해 조절할 수 있다. 본 발명의 고상 담체는 중성 용출액을 이용하여 세정하고, 가열 또는 자외선 조사 등에 의해 멸균하는 것으로, 재생할 수 있다. 본 발명의 고상 담체를 혈액의 정화에 이용하는 경우, 사용 방법의 상세한 내용이나 치료 효과에 대해서는, 투석 요법이나 단백질 A를 이용한 IgG 제거제인 Prosorba(Fresenius사 제조) 및 Immunosorba(Fresenius사 제조)를 이용한 혈액 정화법을 참고로 행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 이러한 혈액의 정화를 가능하게 하는, 본 발명의 고상 담체를 포함하는 의료용 기기를 제공한다.
본 발명은 항체의 정제 및/또는 농축 방법을 제공한다. 본 발명의 정제 및/또는 농축 방법은 본 발명의 고상 담체에 IgG 항체를 흡착시켜, 흡착한 IgG 항체를 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 정제 및/또는 농축 방법은 또한, 용기(예, 플라스크, 시험관, 튜브)에 본 발명의 고상 담체를 충전하여 정제 또는 농축을 하는 정적 방법 및 본 발명의 고상 담체(예, 컬럼)에 IgG를 포함하는 용액을 송액하여 정제 또는 농축을 행하는 동적 방법일 수 있다.
본 발명의 고상 담체에의 IgG 항체의 흡착은 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, IgG를 함유하는 시료(예, 혈액, 혈장, 혈청, 복수, 세포 배양 상청, 조직 추출액)을 본 발명의 고상 담체 또는 그것을 충전한 용기 또는 지지체에 도입한다. 정적 방법의 경우는 교반하면서 1∼60분 정도 실온 방치하는 것으로 IgG가 본 발명의 고상 담체에 결합한다. 동적 방법의 경우는 유속 0.1∼20 mL/분 정도로 시료를 도입하는 것으로서 IgG가 본 발명의 고상 담체에 결합한다. IgG를 함유하는 시료는 본 발명의 고상 담체에 도입되기 전에 희석하더라도 좋다. 희석은 NaCl 및 MgCl2를 포함하는 용액을 이용하는 것이 바람직하다. IgG가 본 발명의 고상 담체에 결합한 후, 불순물을 제거하기 위해 세정액으로 본 발명의 고상 담체를 세정한다. 세정액은 NaCl 및 MgCl2를 함유하는 용액인 것이 바람직하다.
IgG 항체의 용출은 중성 용액을 이용하여 행할 수 있다. IgG 항체의 정제에 있어서 단백질 A를 이용하는 종래의 방법에서는, 용출을 산성 용액으로 행할 필요가 있고, 따라서, 항체가 변성되기 쉽다는 불이익이 있었다. 한편, 본 발명의 앱타머는 용출을 중성 용액으로 행하는 것이 가능하고, 따라서, 종래법과는 상이하게, 항체의 변성을 방지할 수 있는 이점을 갖는다.
중성 용출액은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 pH 약 6∼약 9, 바람직하게는 약 6.5∼약 8.5, 더욱 바람직하게는 약 7∼약 8일 수 있다. 또한, 중성 용액은 칼륨염[예, 염화칼륨(KCl), 초산칼륨, 포름산칼륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산삼칼륨, 질산칼륨, 황산칼륨, 아황산칼륨, 과염소산칼륨, 시트르산칼륨, 말산칼륨, 옥살산칼륨, 시안화칼륨), 마그네슘염(예, 염화마그네슘, 초산마그네슘, 포름산마그네슘, 황산마그네슘, 옥살산마그네슘), 칼슘염(예, 염화칼슘, 초산칼슘, 포름산칼슘, 황산칼슘, 옥살산칼슘), 암모늄염(예, 염화암모늄, 초산암모늄, 포름산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 황산암모늄, 아황산암모늄, 과염소산암모늄, 시트르산암모늄, 시안화암모늄, 옥살산암모늄), 킬레이트제(예, 에틸렌디아민사초산(EDTA), 시트르산나트륨 등의 시트르산염, 말산나트륨 등의 말산염, 옥살산나트륨등의 옥살산염, 에틸렌디아민, 아세틸아세트나트륨, EGTA), 변성제 또는 표면활성제(구아니딘, SDS, Tween20, NP-40, Triton X-100)를 포함할 수 있지만, 비용 면에서는 KCl을 포함하는 것이 바람직하다. KCl 용액의 농도는 100∼1000 mM, 바람직하게는 200∼800 mM, 더욱 바람직하게는 300∼600 mM이다. EDTA 용액의 농도는 1∼100 mM, 바람직하게는 5∼50 mM, 더욱 바람직하게는 10∼20 mM이다.
본 발명의 정제 방법은 또한, IgG 항체의 흡착 후, 고상 담체를 세정하는 것을 포함할 수 있다. 세정액으로서는, 예컨대, 요소, 강염기(예, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 약염기(예, 암모니아), 강산(예, 염산, 질산, 황산, 트리플루오로초산), 약산(예, 초산, 포름산)을 포함하는 용액을 들 수 있다. 요소는, 예컨대, 1∼10 M일 수 있다. 강염기 및 약염기는 0.01∼10 N이 바람직하지만, 0.01∼1 N이 더욱 바람직하고, 0.01∼0.1 N이 더욱 바람직하다. 강산 및 약염기는 0.01∼10 N이 바람직하지만, 0.01∼1 N이 더욱 바람직하고, 0.01∼0.1 N이 더욱 바람직하다.
본 발명의 정제 방법은 또한, 고상 담체를 가열 처리하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 공정에 의해, 고상 담체의 재생, 멸균이 가능하다. 이러한 가열 처리로서는, 예컨대 약 50∼약 100℃, 바람직하게는 약 60∼약 90℃, 더욱 바람직하게는 약 65∼약 85℃에서의, 수분간, 예컨대 1∼30분간, 바람직하게는 1∼20분간, 더욱 바람직하게는 5∼15분간의 처리를 들 수 있다. 가열 처리는 요소(예, 1∼10 M) 중에서 행하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한, 정제 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은 IgG 항체를 제작하여, 제작된 IgG 항체를 본 발명의 앱타머 및 복합체를 이용하여(예, 본 발명의 고상 담체의 사용에 의해) 정제하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서 제작되는 항체는 IgG일 수 있다. 항체는 또한, 다클론 항체 또는 단일 클론 항체일 수 있다. 다클론 항체 또는 단일 클론 항체는 자체 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 항체는 또한, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있지만, 인간화 항체 또는 인간 항체가 바람직하다. 인간화 항체는 예컨대 일본 특허 공표 평 제4-506458호 공보, 일본 특허 공개 소 제62-296890호 공보 등을, 인간 항체는, 예컨대 「Nature Genetics, Vol. 15, p.146-156, 1997」, 「Nature Genetics, Vol. 7, p.13-21, 1994」, 일본 특허 공표 평 제4-504365호 공보, 국제 출원 공개 W094/25585호 공보, 「일경 사이언스, 6월호, 제40∼제50 페이지, 1995년」, 「Nature, Vol. 368, p.856-859, 1994」, 일본 특허 공표 평 제6-500233호 공보 등을 참고로 각각 제작할 수 있다.
계속해서, 제작된 항체는 앱타머를 이용하여 정제될 수 있다. 정제의 상세 설명은 본 발명의 정제 방법과 동일할 수 있다.
본 발명은 또한, IgG의 검출 및/또는 정량 방법을 제공한다. 본 발명의 검출 및/또는 정량 방법은 본 발명의 앱타머를 이용하여(예, 본 발명의 복합체 및/또는 고상 담체의 사용에 의해) IgG를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법에서는, 본 발명의 진단용 시약에 있어서 전술한 바와 같이, 항체를 대신해서 본 발명의 앱타머를 이용하는 것 외에는, 면역학적 방법과 동일한 방법에 의해, 검출 및/또는 정량을 행할 수 있다.
본 발명은 또한, 항체의 수식 방법을 제공한다. 본 발명의 수식 방법은 본 발명의 앱타머를 통해, 기능성 물질을 항체에 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 이러한 수식 방법에 의해 제작된 수식 항체도 또한 제공한다.
본 명세서 중에 예를 든 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 모두가 명시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 삽입되는 것이다.
이하에 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 자세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예 등에 제한되는 것이 아니다.
〔실시예 1〕IgG에 특이적으로 결합하는 핵산의 제작
IgG에 특이적으로 결합하는 핵산은 SELEX 법을 이용하여 제작했다. SELEX는 Ellington 등의 방법(Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) 및 Tuerk 등의 방법(Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990)을 개량하여 행했다. 표적 물질로서 히스티딘 태그가 붙은 인간 IgG1의 Fc 부분(Pro100∼Lys330)과 RANK(Receptor activator of NF-κB)의 키메라체(IgG1-Fc, R&D Systems사 제조)를 이용했다. 이 키메라체는 마우스 골수종 세포를 이용하여 발현시킨 것이다. 최초의 라운드에서 이용한 RNA는, 화학 합성에 의해 얻어진 DNA를 DuraScribetm T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용하여 전사하여 얻었다. 이 방법에 의해 얻어지는 RNA는 피리미딘 염기 함유 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 플루오로화된 것이다. DNA 주형으로서 40잔기의 랜덤 서열의 양측에 프라이머 서열을 갖는 길이 90 잔기의 DNA를 이용했다. DNA 주형과 프라이머는 화학 합성에 의해 작성했다(Operon사 제조). DNA 주형의 서열과 프라이머 서열을 이하에 나타낸다.
DNA 주형: 5'-ctctcatgtcggccgtta-40N-cgtccattgtgtccctatagtgagtcgtatta -3'(서열 번호 24)
프라이머 A: 5'-taatacgactcactatagggacacaatggacg-3'(서열 번호 25)
프라이머 B: 5'-ctctcatgtcggccgtta-3'(서열 번호 26)
프라이머 A는 T7 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 포함하고 있다. 최초의 라운드에서 이용한 RNA 풀의 변화량(variation)은 이론상 1014였다.
표적 물질인 IgG1-Fc는 Ni-NTA 친화성 수지(Qiagen사 제조) 또는 BD TalonTM 친화성 수지(BD Biosciences사 제조)에 흡착시켜 고정했다. 이것에 RNA 풀을 부가하여, 30분간 실온에서 유지한 후, IgGl-Fc에 결합하지 않은 RNA를 용액 A에서 씻어 내었다. 여기서 용액 A는 145 mM 염화나트륨, 5.4 mM 염화칼륨, 1.8 mM 염화칼슘, 0.8 mM 염화마그네슘, 20 mM pH 7.6 트리스의 혼합 용액이다. IgG1-Fc에 결합한 RNA는 용출액을 부가하여 회수하고, RT-PCR로 증폭한 후, DuraScribeTM T7 Transcription Kit에서 전사하여 다음 라운드에 이용했다. 용출액으로서 용액 A에 250 mM의 이미다졸을 부가한 것을 이용했다. 7 라운드 및 10 라운드 종료 후, PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega사 제조)에 클로닝하여, 대장균주 DH5α(Toyobo사 제조)로 트렌스포메이션했다. 싱글 콜로니로부터 플라스미드를 추출 후, DNA 시퀀스(ABI PRISM 3100, ABI사 제조)로 뉴클레오티드 서열을 결정했다. 서열 번호 1로 표시되는 서열을 갖는 클론은 48클론 중 10클론이었다. 또한, 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8로 표시되는 서열을 갖는 클론은 48 클론 중 각각 2, 7, 14, 2, 5, 4, 4 클론 존재했다.
서열 번호 1∼8로 표시되는 RNA의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 사용하여 예측했다[M. Zuker, Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-15,(2003)]. 그 구조를 도 1∼8에 도시한다. 도에 도시한 바와 같이, 이들의 RNA는 GGUGCU라는 공통 서열을 포함하고, 이 공통 서열이 벌지(bulge)를 형성하고 있었다.
프라이머 셋트를 바꾸어, 상기와 동일한 방법으로 재차 SELEX를 행했다. 프 라이머 서열을 하기에 기재한다.
프라이머 C: 5'-taatacgactcactatagggccacagcgag-3'(서열 번호 27)
프라이머 D: 5'-ccgaccacacgcg-3'(서열 번호 28)
8 라운드 종료 후, 서열 번호 9로 표시되는 RNA가 서열을 조사한 48 클론 중 1클론 존재하고 있었다. 이 RNA는 인간 IgG1에 특이적으로 결합하고, GGUGCU의 서열이 존재했다. 그러나, 이 RNA의 이차 구조를 MFOLD 프로그램을 사용하여 예측한 바, GGUGCU의 벌지 구조가 존재하지 않았다. 그래서, 서열 번호 9로 표시되는 RNA의 이차 구조를 vsfold 4 프로그램(http://www. rna.itchiba.ac.jp/vsfold4/)dmf 이용하여 예측한 바, GGUGCU의 벌지 구조가 나타났다(도 9). 한편, 다른 47 클론은 IgG1와는 결합하지 않았다.
다음으로, 아미노 커플링에 의해 IgG의 Fc 프라그멘트(IgG-Fc)를 고정화한 SELEX를 행했다. 100 ㎍의 인간 IgG-Fc(Athens Research & Technology사 제조)를 30 ㎕의 NHS-activated Sepharose 비즈(Amersham Bioscience사 제조)에 고정화했다. 구입한 IgG-Fc 용액에는 Tris 완충액이 포함되어 있었기 때문에, 20 mM HEPES 완충액(Sigma사 제조)으로 치환하고 나서 커플링을 행했다. 커플링은 사양서에 따라 행했다. 고정화량은 고정화 전의 IgG-Fc 용액과 고정화 직후의 상청액을 SDS-PAGE에 의해 조사함으로써 확인했다. 상청액에서는 IgG-Fc의 밴드는 검출되지 않았으며, 사용한 IgG-Fc의 거의 모두가 커플링되었다고 생각된다. RNA는 상기 동일 피리미딘 염기 함유 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 플루오로화된 것을 이용했다. RNA의 초기 풀을 작성하기 위한 DNA 주형으로서, 40잔기의 랜덤 서열을 이하의 프라이머 서열에 끼운 것을 이용했다.
프라이머 E: 5'-taatacgactcactatagggtacgagtctggacttgcaa-3'(서열 번호 29)
프라이머 F: 5'-gcctgttgtgagcctca-3'(서열 번호 30)
7 라운드 종료 후, 서열 번호 19, 20, 21로 표시되는 RNA가 서열을 조사한 48 클론 중 각각 13, 9, 6클론 존재하고 있었다. 이들의 RNA는 GGUGCU의 공통 서열을 포함하고 있었다. MFOLD 프로그램을 사용하여 이차 구조를 예측한 바, 서열 번호 20과 21의 RNA는 서열 번호 1의 RNA와 동일한 벌지 구조를 포함하고 있었지만, 서열 번호 19의 RNA는 포함하고 있지 않았다(도 19∼21). 다음으로, 48 클론 중 1 클론만 존재한 RNA의 서열을 자세히 조사한 바, 서열 번호 22와 23으로 표시되는 RNA가 GGUGCU의 공통 서열을 포함하고 있었다. MFOLD 프로그램을 사용하여 이차 구조를 예측한 바, 서열 번호 22의 RNA는 공통의 벌지 구조를 포함하고 있었지만, 서열 번호 23의 RNA는 포함하고 있지 않았다. 이 외에 1 클론의 것이 15 서열 있었다. 이들은 전부 GGUGCU는 포함하고 있지 않았다. 이들의 서열 중 8 서열의 결합 활성을 조사했지만, 어느 것이나 결합 활성이 없었다.
리보스의 2' 위치가 플루오로화된 피리미딘 염기 함유 뉴클레오티드와 천연형의 푸린 염기 함유 뉴클레오티드로 만들어진 RNA를 이용하여 3회의 상이한 SELEX를 행했지만, 그 어떤 것에서도 GGUGCU의 공통 서열을 포함하는 RNA가 선택되었다. 이 공통 서열의 양측의 서열에 특별한 특징은 없고, IgG와의 결합에 GGUGCU가 중요한 것으로 예상되었다. MFOLD 프로그램을 사용하여 이차 구조를 예측한 바, 선택된 RNA의 거의가 GGUGCU의 벌지 구조를 포함하고 있고, 공통 서열을 갖는 모든 RNA에 서 GGUGCU의 벌지 구조를 취하고 있다고 예측되었다.
[실시예 2] 결합 활성의 평가
서열 번호 1∼9로 표시되는 RNA의 인간 IgG-Fc에 대한 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법에 의해 조사했다. 측정에는 BIAcore사 제조의 BIAcore 2000을 이용했다. 센서칩에는 스트렙타비딘이 고정화되어 있는 SA 칩을 이용했다. 이것에, 5'말단에 비오틴이 결합하고 있는 16잔기의 Poly dT를 1000 RU 정도 결합시켰다. 리간드가 되는 RNA는 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가하여, dT와 A의 결합에 의해 SA 칩에 고정했다. 그 고정화량은 0.01 ㎍/㎕의 농도의 것을 60 ㎕ 주입하는 것으로 1000 RU정도로 했다. 분석용의 IgG-Fc(Athens Research & Technology사 제조)는 0.6 ㎛로 조정한 것을 70 ㎕ 주입했다. 런닝 완충액은 SELEX에서 이용한 용액 A와 동일한 성분의 것을 이용했다.
서열 번호 1 또는 3으로 표시되는 RNA를 고정하여 IgG-Fc를 주입한 경우의 센서그램을 각각 도 24 또는 25에 도시한다. RNA와 IgG-Fc가 결합하고 있는 양상을 보여주고 있다. 컨트롤로서 랜덤 서열을 포함하는 RNA 풀을 고정화하여 측행을 수행했지만, IgG-Fc는 결합하지 않았다(도 26). 서열 번호 2∼9로 표시되는 RNA에 대해 동일한 측정을 행했지만, 그 모두가 IgG-Fc와 결합했다.
다음으로, 전체 길이의 인간 IgG1과의 결합 활성을 동일한 방법으로 조사했다. 서열 번호 1∼9로 표시되는 RNA는 모두 IgG1와 결합했다. 또한, 랜덤 서열을 포함하는 RNA 풀은 결합 활성을 나타내지 않았다.
다음으로, 농도가 상이한 IgG(0.6 uM∼0.05 uM)를 이용하여 속도 이론적 해 석을 행하고, 각 RNA 앱타머의 해리 정수(Kd)를 구했다. 해리 정수는 3' 말단에 16잔기의 PolyA를 부가한 RNA를 A-dT 결합을 이용하여 센서칩에 고상화하고, 농도가 상이한 IgG(0.6 uM∼0.05 uM)를 주입하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 해리 정수를 구했다. 결과를 표 1에 나타냈다.
Figure 112008008532291-PCT00031
서열 번호 19∼23으로 표시되는 RNA와 인간 IgG1의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사했다. 그 결과, 그 모든 RNA가 IgG1에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것을 알 수 있었다. MFOLD 프로그램을 이용하여 예측되는, 서열 번호 19와 23으로 표시되는 RNA의 이차 구조는 공통의 벌지 구조를 포함하고 있지 않지만, IgG1에 대해 결합 활성을 갖고 있었다.
앱타머의 결합 활성은 Biacore2000(Biacore사 제조)를 이용하여 측정되었다. Biacore2000에는 속도 이론적 해석 소프트가 삽입되어 있고, 얻어진 센서그램의 형상에 이론식을 피팅시키는 것으로 해리 정수를 구할 수 있다. 서열 번호 1∼9 및 19∼23으로 표시되는 긴 앱타머는 1 : 1 결합 모델의 이론식이 잘 피팅되어 있지만, 서열 번호 17 등 짧은 앱타머에 대해서는 1 : 2 결합 모델인 Bivalent 모델의 이론식이 보다 적합했다. 항체는 대칭적인 구조을 하고있기 때문에, 하나의 항체에 대해 두개의 앱타머가 결합하고 있는 것은 지극히 평범하게 받아들여지는 사고 방식이다.
이상으로, SELEX법에 의해 제작된 서열 번호 1∼9 및 19∼23으로 표시되는 RNA는 인간 IgG에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다. 이것은 공통 서열인 GGUGCU가 IgG와의 결합에 중요하다는 것을 나타내고 있다.
[실시예 3] RNA 앱타머의 소형화
서열 번호 1∼9 및 19∼23으로 표시되는 RNA의 길이는 70잔기 정도이지만, 40잔기 정도 이하의 길이까지 짧게 할 수 있으면, RNA 앱타머를 화학 합성에 의해 제작할 수 있게 된다. 그래서, 서열 번호 1∼9 및 19∼23으로 표시되는 RNA의 소형화를 시도했다. 여기서, 서열 번호 1∼9 및 19∼23으로 표시되는 RNA는 피리미딘 염기 함유 뉴클레오티드(U, C)의 리보스의 2' 위치가 플루오로화되어 있고, 푸린 염기 함유 뉴클레오티드(A, G)는 천연의 RNA 타입의 것이다. 또한, 본 실시예로 새롭게 제작하는 짧은 RNA는 전부 피리미딘 염기의 리보스의 2' 위치가 플루오로화되어 있다.
처음에 서열 번호 1로 표시되는 RNA를 기본으로서 소형화를 시도했다. 서열 번호 10으로 표시되는 RNA는 서열 번호 1로 표시되는 RNA의 5'말단의 GGGACAC를, 또한, 3'말단의 GAGAG를 절단한 것으로, 전사용의 5'말단에 GG를 부가한 것이다. 서열 번호 11로 표시되는 RNA는 서열 번호 10으로 표시되는 RNA의 5'말단의 GGAAU를, 또한, 3'말단의 ACAU를 절단한 것이다. 서열 번호 12로 표시되는 RNA는 서열 번호 11로 표시되는 RNA의 5'말단의 GGACGAGUU를, 또한, 3'말단의 AACGGCCG를 절단한 것으로, 5'말단에 GG를, 또한, 3'말단에 CC를 부가한 것이다. 서열 번호 13으로 표시되는 RNA는 서열 번호 12로 표시되는 RNA의 GGUGCU의 벌지의 후에 있는 스템 루프 구조를 서열 번호 2로 표시되는 RNA의 스템 루프 구조로 치환한 것이다. 서열 번호 14로 표시되는 RNA는 서열 번호 13으로 표시되는 RNA의 루프 부분을 GAAA 테트라 루프로 치환한 것이다. 서열 번호 15로 표시되는 RNA는 서열 번호 13으로 표시되는 RNA의 최초의 스템으로부터 두개의 염기쌍을 제거하여 스템을 짧게 한 것이다. 서열 번호 16으로 표시되는 RNA는 서열 번호 13으로 표시되는 RNA의 두번째의 스템으로부터 3가지 염기쌍을 제거하여 스템을 짧게 한 것이다. 서열 번호 17로 표시되는 RNA는 서열 번호 16으로 표시되는 RNA의 최초의 스템으로부터 두개의 염기쌍을 제거하여 스템을 짧게 한 것이다. 서열 번호 18로 표시되는 RNA는 서열 번호 17로 표시되는 RNA의 두번째의 스템으로부터 일염기쌍을 제거하여 스템을 짧게 한 것이다.
소형화된 RNA의 결합 활성은 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 확인했다. 측정은 실시예 1과 동일하게, 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA를 A-pT 결합을 이용하여 고정화하고, 거기에 IgG를 주입하는 것으로 행해졌다. 그 결과, GGUGCU의 콘센서스(consensus) 서열을 포함하는 서열 번호 10∼18로 표시되는 RNA가 인간 IgG1에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것을 알았다. 이 중, 서열 번호 18로 표시되는 RNA는 21잔기로 이루어지는 것이었다. 각각의 해리 정수를 표 1에 나타낸다.
서열 번호 17로 표시되는 RNA의 8번째의 뉴클레오티드의 C를 U에 치환한 변이체를 제작했다. 이 C는 공통 서열 GGUGCU의 C이다. 표면 플라즈몬 공명 해석의 결과, 이 변치체는 인간 IgG1에 대해 결합 활성을 갖고 있지 않은 것을 알았다. 이 사실은 공통 서열인 GGUGCU가 IgG와의 결합에 중요하다는 것을 나타내고 있다.
이상으로, 서열 번호 1로 표시되는 RNA를 소형화하는 것으로, 화학 합성할 수 있는 길이의 RNA 앱타머를 제작할 수 있었다. 또한, 공통 서열인 GGUGCU의 벌지 구조가 존재하면 IgG와의 결합 활성이 유지되는 것으로 나타났다.
[실시예 4] 종특이성의 평가
제작된 RNA 앱타머가 인간 IgG1 이외의 서브클래스의 IgG 또는 인간 이외의 동물종의 IgG에 대해서도 결합 활성을 갖고 있는지의 여부를 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사했다. 측정은 실시예 1와 동일하게, 16잔기의 Poly A를 부가한 핵산을 A-pT 결합을 이용하여 고정화하고, 거기에 IgG를 주입하는 것으로 행해졌다. RNA 앱타머에는 서열 번호 1과 17로 표시되는 핵산을 이용했다. 항체에는 인간 IgG1(Calbiochem사 제조), 인간 IgG2(Calbiochem사 제조), 인간 IgG3(Calbiochem사 제조), 인간 IgG4(Calbiochem사 제조), 마우스 IgGl(Chemicon International사 제조), 마우스 IgG2a(Chemicon International사 제조), 마우스 IgG2b(Zymed Laboratories사 제조), 마우스 IgG3(Bethyl Laboratories사 제조), 래트 IgG1(R & D Systems사 제조), 래트 IgG2a(Zymed Laboratories사 제조), 래트 IgG2b(Zymed Laboratories사 제조), 래트 IgG2c(UK-Serotec사 제조), 토끼 IgG(Zymed Laboratories사 제조), 소 IgG1(Bethyl Laboratories사 제조), 소 IgG2(Bethyl Laboratories사 제조), 닭 IgG(Rockland사 제조), 개 IgG(Rockland사 제조), 고양이 IgG(Bethyl Laboratories사 제조), 기니피그 IgG(Biogenesis사 제조), 햄스터 IgG(Rockland사 제조), 돼지 IgG(Rockland사 제조)를 이용했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112008008532291-PCT00032
* 단백질 A의 데이터는 Amersham Biosciences 사의 카탈로그에서 인용했다. +는 결합의 강함을 나타내고, +가 많은 쪽이 결합이 강하다. -는 결합하지 않는 것을 의미한다. nd는 측정하지 않는 것을 의미한다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1과 17로 표시되는 RNA는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 햄스터 IgG, 돼지 IgG에 대해서는 결합 활성을 갖고 있지만, 다른 동물종의 IgG에 대해서는 결합 활성을 갖고있지 않은 것을 알았다. 또한, 서열 번호 1과 17로 표시되는 핵산은 인간 IgD(Biogenesis사 제조) 및 인간 IgE(Calbiochem사 제조)에 대해서도 결합 활성을 갖고 있지 않았다. 또한, 서열 번호 17로 표시되는 핵산은 인간 IgA(Bethyl Laboratories사 제조)에 대해 결합 활성을 갖고 있지 않지만, 인간 IgM(Chemicon International 사 제조)에 대해서는 매우 약하지만 결합 활성을 나타냈다.
이상으로, 본 발명에서 제공되는 RNA 앱타머는 인간, 햄스터, 돼지의 IgG에 특이적으로 결합하는 RNA인 것을 알았다. 또한, 인간 IgG에 관해서는 서브 클래스에 관계없이, IgG1∼4의 모두에 결합하는 것을 알았다. 이것은 현재 항체 정제용 수지의 리간드로서 사용되고 있는 단백질 A와 상이한 특성이다.
[실시예 5] RNA 앱타머의 결합 부위의 검토1(Fcγ R)
IgG의 Fc 부분은 대식 세포나 호중구 등의 면역 담당 세포에 발현하고 있는 수용체 단백질(Fcγ R)에 결합하여, 세포의 활성화 혹은 억제를 촉진한다. 그래서, 본 발명에서 제공되는 RNA가 IgG의 Fcγ R 결합 부위에 결합하고 있는지의 여부를 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사했다. 우선, 16잔기의 Poly A를 부가한 RNA 앱타머를 실시예 1과 동일한 방법으로 고정화하여, 거기에 인간 IgG1를 주입하여 RNA 앱타머에 결합시킨 후, Fcγ R를 주입했다. 만약 IgG의 RNA 앱타머 결합 부위가 Fcγ R의 결합 부위와 전체적으로 혹은 주요한 일부분이 중복하고 있다면, Fcγ R는 RNA 앱타머에 결합하고 있는 IgG에는 결합할 수 없다고 생각된다. 또한, IgG과 Fcγ R의 결합력이 IgG와 RNA 앱타머의 결합력보다 강하고, RNA 앱타머와 Fcγ R의 치환 반응이 발생한 경우는 IgG은 고정되어 있는 RNA 앱타머로부터 해리하고, Fcγ R와 복합체를 형성하여 흘러 나오는 것으로 예상된다.
RNA 앱타머로서 서열 번호 1로 표시되는 RNA를, IgG로서 인간 IgG-Fc(Athens Research & Technology사 제조)를, Fcγ R로서 인간 Fcγ RI(R&D Systems사 제조)를 이용하여 측정을 행했다. 그 결과, IgG-Fc 결합 후에 Fcγ RI의 결합에 의한 시그널의 상승이 관찰되었기 때문에(도 27), RNA 앱타머, IgG-Fc, Fcγ RI의 삼자 복합체가 형성되는 것을 알았다. 또한, 콘트롤로서 랜덤 서열을 포함하는 RNA 풀을 이용한 경우, IgG-Fc와 Fcγ RI는 함께 결합하지 않았다(도 28).
이상으로, RNA 앱타머는 IgG의 Fcγ RI 결합 부위와는 상이한 부분에 결합하고 있는 것을 알았다.
[실시예 6] RNA 앱타머의 결합 부위의 검토 2(단백질 A)
IgG-Fc에 결합하는 다른 물질로서는 단백질 A가 잘 알려져 있다. 단백질 A는 IgG의 Fc 부분에 특이적으로 결합함으로써, 항체 정제용 분리제의 리간드로서 사용되고 있다. 그래서, 실시예 5와 동일한 방법으로, 본 발명으로 제공되는 RNA가 IgG의 단백질 A 결합 부위에 결합하고 있는지의 여부를 조사했다. 우선, 3'말단에 16잔기의 Poly A를 부가한 서열 번호 1로 표시되는 RNA 앱타머를 실시예 1과 동일한 방법으로 고정하여, 거기에 인간 IgG1(Calbiochem사 제조)를 흘려 RNA 앱타머에 결합시킨 후, 단백질 A(MP Biomedicals사 제조)를 주입했다. 그 결과, IgG1 결합후에 단백질 A의 결합에 의한 시그널의 상승이 관찰되었으므로(도 29), RNA 앱타머, IgG1, 단백질 A의 삼자 복합체가 형성되는 것을 알았다. 또한, 컨트롤로서 서열 번호 1로 표시되는 RNA 앱타머를 고정한 후 단백질 A를 주입하는 측정을 행했지만, 단백질 A의 결합은 보이지 않았다(도 30).
이상으로, RNA 앱타머는 IgG-Fc의 단백질 A 결합 부위와는 상이한 부분에 결합하고 있는 것을 알았다.
[실시예 7] RNA 앱타머의 2'수식 방법과 IgG에 대한 결합 활성
실시예 1에서 제작된 RNA 앱타머는 피리미딘 염기 함유 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 플루오로화된 것이었다. 본 실시예에서는, 리보스의 2' 위치의 수식 방법이 상이한 RNA를 제작하고, IgG에 대한 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사했다.
처음에, 서열 번호 11과 13으로 표시되는 천연형의 RNA를 제작하여, IgG에 대한 결합 활성을 조사했다. 천연형 RNA는 주형 DNA를 화학 합성(오페론사 제조)하여, T7 RNA 폴리머라아제(Takara사 제조)를 이용하여 전사하는 것으로 제작했다. 결합 활성은 실시예 1과 동일하게, 표면 플라즈몬 공명법에 의해 측정되었다. IgG로서 인간 IgG1(Calbiochem사 제조)을 이용했다. 그 결과, IgG1의 결합량은 저하했지만, 서열 번호 11과 13으로 표시되는 천연형의 RNA는 IgG에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것을 알았다.
다음으로, 서열 번호 17을 바탕으로 하여 이하에 기재한 것과 같은 수식이 상이한 서열 번호 17-1∼17-14로 표시되는 RNA를 제작했다.
서열 번호 17
G(OH)G(OH)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)G(OH)A(OH)A(OH)A(OH)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-1(23F1)
G(OH)G(OH)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)G(OH)A(OH)A(OH)A(OH)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)T(H)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-2(23F2)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-3(23F3)
G(H)G(H)A(H)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)G(H)A(H)A(H)A(H)G(H)G(H)A(OH)A(OH)C(F)T(H)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-4(23F10)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(H)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-5(23F11)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)G(H)A(H)A(H)A(H)G(H)G(H)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-6(23F12)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(H)C(F)U(F)C(F)C(F)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-7(23F23)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(F)C(H)C(H)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OH)G(OH)A(H)A(H)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-8(23F25)
G(OMe)G(OMe)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(OMe)C(OMe)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-9(23F32)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(F)C(H)C(H)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OMe)G(OH)A(H)A(H)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-10(23F33)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(F)C(H)C(H)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OH)G(OMe)A(H)A(H)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-11(23F41)
G(OMe)G(OMe)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(OMe)C(F)C(F)G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(OMe)C(OMe)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-12(23F42)
G(OMe)G(OMe)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(OMe)C(F)G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(OMe)C(OMe)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-13(23F43)
G(OMe)G(OMe)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(OMe)G(OMe)A(OMe)A(OMe)A(OMe)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(OMe)C(OMe)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
서열 번호 17-14(23F31)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(OMe)C(H)C(H)G(H)A(H)A(H)A(H)G(OH)G(OH)A(H)A(H)C(F)U(F)C(H)C(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)A(H)
RNA는 화학 합성에 의해 제작했다(유전자 디자인사 제조). 결합 활성은 실시예 1과 동일하게, 표면 플라즈몬 공명법에 의해 측정되었다. IgG로서 인간 IgGI(Calbiochem사 제조)를 이용했다. 측정의 결과, 서열 번호 17-1로 표시되는 RNA는 서열 번호 17로 표시되는 RNA와 동일한 정도의 결합 활성을 나타냈다. 또한, 서열 번호 17-2, 17-4∼17-14로 표시되는 RNA는 서열 번호 17로 표시되는 RNA보다 결합 활성이 높았다. 한편, 서열 번호 17-3으로 표시되는 RNA는 서열 번호 17로 표시되는 RNA보다 결합 활성이 낮았다.
서열 번호 15로 표시되는 핵산을 바탕으로 하여 동일하게 수식 개변체를 제작하여, 그 인간 IgG에 대한 결합 활성을 조사했다.
서열 번호 15
G(OH)G(OH)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)U(F)G(OH)C(F)G(OH)A(OH)G(OH)C(F)C(F)A(OH)C(F)G(OH)C(F)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)
서열 번호 15-1(30F-1)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)U(F)G(OH)C(F)G(OH)A(H)G(H)C(H)C(H)A(H)C(F)G(OH)C(F)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)
서열 번호 15-2(30F-2)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)U(H)G(OH)C(F)G(OH)A(H)G(H)C(H)C(H)A(H)C(H)G(OH)C(H)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)
서열 번호 15-3(30F-3)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(H)G(OH)C(H)G(OH)A(H)G(H)C(H)C(H)A(H)C(H)G(OH)C(H)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)
서열 번호 15-4(30F-4)
G(H)G(H)A(OH)G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)C(F)C(F)G(OH)C(H)G(OH)G(H)A(H)A(H)A(H)C(H)G(OH)C(H)G(OH)G(OH)A(OH)A(OH)C(F)U(F)C(H)C(H)
표면 플라즈몬 공명법을 이용한 측정의 결과, 서열 번호 15-1∼15-3으로 표시되는 핵산은 서열 번호 15로 표시되는 핵산과 동등한 결합 활성을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과를 정리한 것을 표 3-1 및 표 3-2에 나타낸다. 표 3 중, 결합 활성의 높이를 +로 나타내고, +의 수가 많을수록 활성이 높은 것을 의미한다. 또한, 서열 번호 17-2로 표시되는 RNA와 IgG의 결합의 모습을 도 31에 도시한다.
[표 3-1]
Figure 112008008532291-PCT00033
[표 3-2]
Figure 112008008532291-PCT00034
[실시예 8] GGUGCU의 벌지 구조
GGUGCU 이외의 서열로 IgG와 친화성이 있는 서열이 없는지를 조사하기 위해 최적화 SELEX를 행했다. 최초의 풀로서 GGUGCU의 부분을 랜덤 서열로 한 RNA를 이용했다. 이 RNA 풀은 하기에 도시하는 화학 합성으로 제작한 DNA를 주형으로 하여, DuraScribeTM T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용하여 전사하는 것으로 제작했다.
DNA 주형: 5'-tgtcggccgttacagttccggtttcccgg-6N-tgtaactcgtccattgtccc-3'(서열 번호 31)
프라이머 G: 5'-taatacgactcactatagggacaatggacgagttac-3'(서열 번호 32)
프라이머 H: 5'-tgtcggccgttacagttc-3'(서열 번호 33)
RNA 풀이 이론적인 변화량은 4096이다. 사양서에 기초하여, 40 ㎍의 인간 IgG(Zymed Laboratories)를 40 ㎕의 NHS-activated sepharose resin(Amasham Bioscience사 제조)에 고정화했다. SELEX는 실시예 1과 동일하게 행했다.
3 라운드 종료 후 서열을 조사한 바, 48 서열 중 36 서열이 GGUGCU를 포함하고 있었다. MFOLD 프로그램을 이용하여 이차 구조를 조사한 바, GGUGCU와 상이한 서열로 GGUGCU와 동일한 벌지 구조를 형성하는 것은 존재하지 않았다. 또한, 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 결합 활성을 조사한 바, GGUGCU와 상이한 서열의 것으로 인간 IgG에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것은 존재하지 않았다.
다음으로, 2라운드 종료 후의 서열을 48 서열 조사했다. GGUGCU를 포함하는 서열은 1 서열이 존재했다. MFOLD 프로그램을 이용하여 모든 서열의 2차 구조를 예측한 바, GGUGAU를 포함하는 서열이 GGUGCU와 동일한 벌지 구조를 형성했다. 그래서, 이 클론과 IgG의 친화성을 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사한 바, 이 클론이 IgG에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것을 알았다. 또한, ACCGAC이라는 서열이 2클론 발견되었지만, 이 서열은 IgG에 결합하지 않았다. MF0LD 프로그램을 이용하면 GGUGCU 및 GGUGAU 이외에도 GGUGCU와 동일한 벌지 구조를 형성하는 서열이 발견된다. 그래서, 서열 번호 17-7로 표시되는 핵산의 GGUGCU를 대신해서 그와 같은 서열을 포함한 핵산을 화학 합성하여, 인간 IgG1과의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 측정했다. GGUGCU를 대신해서 이용한 서열은 이하와 같다.
서열 번호 17-7의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-1의 벌지 부분의 서열: G(OH)A(OH)U(F)G(OH)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-2의 벌지 부분의 서열: G(OH)C(F)U(F)G(OH)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-3의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)C(F)G(OH)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-4의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)A(OH)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-5의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)U(F)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-1∼17-7-5중 인간 IgG1에 대해 결합 활성을 갖는 것은 존재하지 않았다.
서열 번호 17-7로 표시되는 핵산의 GGUGCU는 G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(F)U(F)와 같이 피리미딘 염기 함유 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치가 플루오로화되어 있다. 다른 수식 방법으로 인간 IgG에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것이 존재하는지의 여부를 조사했다. 실험으로 사용한 핵산은 하기한 바와 같이, 화학 합성에 의해 제작했다. 인간 IgG1에 대한 결합 활성은 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 조사했다.
서열 번호 17-7의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(F)
서열 번호 17-7-101의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(F)U(F)G(OH)C(H)U(F)
서열 번호 17-7-102의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(OH)G(OH)C(H)U(F)
서열 번호 17-7-103의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(H)G(OH)C(H)U(F)
서열 번호 17-7-104의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)G(F)C(H)U(F)
서열 번호 17-7-105의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(OH)U(F)
서열 번호 17-7-106의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(OH)
서열 번호 17-7-107의 벌지 부분의 서열: G(OH)G(OH)U(F)G(OH)C(H)U(OMe)
결합 활성 측정의 결과, 17-7-101, 17-7-104∼107는 17-7과 동등한 결합 활성을 갖고 있는 것을 알았다. 또한, 17-7-102 및 17-7-103은 결합 활성을 갖고 있지 않았다.
이상을 표 4에 정리했다. 표 4 중, 결합 활성의 높이를 +로 나타내고, +의 수가 많을수록 활성이 높은 것을 의미한다.
Figure 112008008532291-PCT00035
이상으로, GGUGCU 및 GGUGAU의 벌지 구조는 IgG와의 결합에 중요한 것을 알았다. 또한, GGUGCU의 3번째의 U가 천연의 리보스 뉴클레오티드(리보스의 2' 위치가 OH인 것) 또는 디옥시 리보스 뉴클레오티드(리보스의 2' 위치가 H인 것)인 경우는 결합 활성이 없어지는 것을 알았다.
[실시예 9] RNA 앱타머를 이용한 IgG 정제법에 관한 실험
서열 번호 15와 17로 표시되는 RNA를 비즈에 고정화하여 인간 IgG1의 풀다운실험을 행했다. Oligo(dT)-Cellulose 비즈(Amersham Biosciences사 제조)를 10 ㎕ 씩 200 ㎕의 튜브(Axygen사 제조)에 넣어, 소 혈청 알부민(Boehringer Mannheim사 제조)으로 코팅했다. 거기에 3'말단에 16개 A를 부가한 RNA를 약 10 ㎍ 부가하여 고정화했다. RNA는 DNA 주형과 프라이머를 화학 합성하고(Operon사 제조), 이것을 DuraScribeTM T7 Transcription Kit(Epicentre사 제조)를 이용하여 전사하는 것으로 제작했다. 결합하지 않은 RNA를 용액 A를 이용하여 세정하는 것으로 제거한 후, 20 ㎍의 인간 IgG1(Calbiochem)을 부가하여, 30분간 실온으로 유지했다. RNA에 결합하지 않은 인간 IgG1은 용액 A를 이용하여 세정 제거했다. 다음으로, 비즈에 샘플 완충액을 부가하고, 65℃로 15분 가열하여, SDS-PAGE에서 분석했다. 6x 샘플 완충액은 1.3 g 도데실황산나트륨(SDS), 3 mL 2-머캅토에탄올, 4.2 mL 글리세린, 1.5 mg 브로모페놀블루를 혼합하여 조정했다. SDS-PAGE의 결과를 도 32에 도시한다. 레인1은 리간드에 서열 번호 15의 앱타머를 이용한 경우, 레인2는 서열 번호 17의 앱타머를 이용한 경우이다. 위의 밴드가 IgG의 중쇄(H쇄)의 밴드이고 아래가 경쇄(L쇄)의 밴드이다. 서열 번호 15 또는 17로 표시되는 RNA를 항체 정제용 분리제의 리간드로서 이용하는 것으로 IgG를 풀다운할 수 있는 것을 알았다.
단백질 A가 결합한 비즈(Amersham Biosciences사 제조)와 유전자 재편성에 의해 알부민 결합 영역을 제거한 단백질 A(r단백질 A)가 결합한 비즈(Amersham Biosciences사 제조)를 10 ㎕ 취하여, 20 ㎍의 인간 IgG1을 부가하여 동일하게 IgG의 정제를 행했다. 용출액으로서 pH 3 글리신 완충액을 이용했다. 용출액을 SDS-PAGE에서 분석한 결과를 도 32에 도시한다. 레인3이 단백질 A를 리간드로 한 경우, 레인2가 r단백질 A를 리간드로 한 경우이다. 앱타머가 단백질 A와 동등한 성능으로 IgG를 풀다운 할 수 있는 것을 알았다.
서열 번호 15로 표시되는 RNA를 이용하여 인간 혈청으로부터 인간 IgG가 정제할 수 있는지의 여부를 조사했다. 또한, 중성 용출액으로 IgG를 용출할 수 있는지의 여부를 검토했다. 스트렙타비딘이 결합한 세파로스 비즈(Amersham Biosciences사 제조)를 10 ㎕ 씩 200 ㎕의 튜브(Axygen사 제조)에 넣어, 소혈청 알부민으로 코팅했다. 거기에 5'말단에 비오틴을 결합한 RNA(유전자 디자인사 제조)를 약 10 ㎍ 부가하여 고정화했다. 결합하지 않은 RNA를 제거한 후, 20 ㎕의 인간 혈청(Chemicon International사 제조)을 부가하여, 30분간 실온으로 유지했다. RNA에 결합하지 않은 인간 혈청 성분은 NaCl-MgCl2 완충액을 이용하여 세정 제거했다. NaCl-MgCl2-완충액은 150 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, pH 7.6 20 mM Tris 완충액이다. RNA에 결합한 IgG는 중성의 용출액을 이용하여 용출했다.
중성 용출액으로서(1) 200 mM KCl+ 10 mM EDTA의 혼합 용액,(2) 200 mM KCl+ 10 mM EDTA+ 10％ 글리세롤의 혼합 용액,(3) 600 mM KCl+ 10 mM EDTA+ 10％ 글리세롤의 혼합 용액을 이용했다. 회수된 IgG의 양을 조사하기 위해, 용출액을 SDS-PAGE에서 분석했다. 또한, 용출되지 않고 비즈에 결합하고 있는 IgG의 양을 조사하기 위해, 용출액을 제거한 후의 비즈에 샘플 완충액을 부가하여, 65℃로 15분 가열하여, SDS-PAGE에서 분석했다. SDS-PAGE의 결과를 도 33에 도시한다. 레인2∼4에서, 앱타머 수지를 이용하여 혈청으로부터 인간 IgG을 고순도로 풀다운할 수 있는 것을 알았다. 또한, 레인6∼8에서 IgG가 거의 검출되고 있지 않은 점에서, 중성 용출액을 이용하는 것으로 인간 IgG이 용출할 수 있는 것을 알았다.
r단백질 A가 결합한 비즈를 10 ㎕ 취하여, 20 ㎕의 인간 혈청을 부가하여 동일하게 IgG의 정제를 행했다. 용출액으로서 pH 3 글리신 완충액을 이용했다. 용출액과 비즈를 SDS-PAGE에서 분석한 결과를 도 33에 도시한다. IgG의 흡착 용량에 차이가 있지만, 앱타머 수지가 r단백질 A 수지와 동일한 정도의 순도로 IgG를 정제할 수 있는 것을 알 수 있었다. 앱타머 수지를 이용한 경우는 IgG을 중성으로 용출할 수 있는 점에서, 앱타머 수지는 r단백질 A 수지보다 우수하다고 말할 수 있다.
동일한 실험을 마우스 혈청(Chemicon International사 제조)을 이용하여 행했다. r단백질 A를 이용한 경우는 IgG은 풀다운되었지만, 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 이용한 경우는 풀다운되지 않았다. 본 발명의 항체 정제용 RNA 리간드는 인간 항체만을 고순도로 정제할 수 있는 것을 알 수 있었다.
서열 번호 15로 표시되는 RNA가 반복 항체 정제용 분리제의 리간드로서 사용할 수 있는지의 여부를 시험했다. 상기와 같이, 비오틴이 결합한 약 10 ㎍의 RNA를 10 ㎕의 스트렙타비딘의 비즈에 고정화하여, 인간 혈청을 부가하고, 중성 용액으로 IgG를 용출했다. 그 후, 50 ㎕ 6M 요소로 3회 비즈를 세정하여, 요소를 제거하기 위해 NaCl-M9C12 완충액으로 3회 비즈를 더 세정한 후에, 재차 인간 혈청을 20 ㎕ 부가하여, 중성 용액으로 IgG를 용출했다. 이것을 재차 행하여, 3회의 항체 정제에 있어서의 IgG의 회수량을 SDS-PAGE에서 확인했다(도 34). 그 결과, 풀다운된 IgG의 양은 3회의 항체 정제에 있어서 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다. 이것은, 항체 정제용의 RNA 리간드는 요소로 세정하여, 재생할 수 있는 것을 나타내고 있다. 동일하게 0.1 M의 NaOH로 세정을 행했다. 3회 반복 정제했지만, 크게 IgG의 회수량이 감소하는 것은 없었다.
다음으로, 서열 번호 16으로 표시되는 RNA와 서열 번호 17-2로 표시되는 RNA의 5'말단에 비오틴을 결합하여, 전술한 바와 같이 인간 혈청으로부터 IgG를 정제했다. 그 결과, 이들의 RNA 리간드를 이용하는 것으로 IgG를 고순도로 정제할 수 있는 것을 알았다(도 35).
이상으로, RNA 앱타머를 리간드로서 이용하는 것으로 중성 조건으로 인간 혈청으로부터 인간 IgG를 효율적이고 또한 고순도로 정제할 수 있는 것을 알았다.
[실시예 10] 티올 커플링에 의해 고정화된 RNA 앱타머를 이용한 IgG 정제법에 관한 실험
서열 번호 15로 표시되는 RNA를 티올커플링으로 비즈에 고정화하여 실시예 9와 동일한 풀다운 실험을 행했다. 서열 번호 15로 표시되는 RNA의 5'말단에 C18의 링커를 사이에 두고 티올기를 결합시켰다(유전자 디자인사 제조). 이 RNA 약 20 ㎍을 Activated Thiol Sepharose 비즈(Amersham Bioscience사 제조) 10 ㎕로 고정화했다. 고정화는 사양서에 따라 행했다. 고정화량은 고정하기 전의 RNA의 양과 고정화 직후의 상청 중의 RNA의 양을 흡광도계로 측정하는 것으로 어림했다. 그 결과, 커플링에 이용한 RNA의 90％ 이상의 RNA가 고정화되는 것을 알았다. 이 RNA 압타마비즈를 이용하여 실시예 9와 동일하게 풀다운 실험을 행했다. 비즈 10 ㎍에 대해 인간 혈청을 5 ㎕ 및 10 ㎕ 부가하여, 세정, 중성 용출액에 의한 용출을 행하여, SDS-PAGE에서 분석했다(도 36). 그 결과, IgG가 고순도로 풀다운되는 것이 나타났다(도 36 레인 2, 3).
실시예 9와 동일하게 r단백질 A 비즈를 이용한 풀다운 실험도 행했다. r단백질 A 비즈 10 ㎕에 대해 인간 혈청을 5 ㎕ 부가하여, 세정 후, SDS-PAGE용 샘플 완충액을 부가하여 65℃ 15분 가열하여, SDS-PAGE에서 분석했다(도 36 레인 5).
본 풀다운 실험의 결과로, 티올 커플링에 의해 고정화한 RNA 앱타머 비즈를 이용함으로써 중성 조건에서 인간 혈청으로부터 인간 IgG을 효율적이고 또한 고순도로 정제할 수 있는 것을 알았다.
[실시예 11] 아미노커플링에 의해 고정화된 RNA 앱타머를 이용한 IgG 정제법에 관한 실험
RNA의 5'말단에 C12의 링커를 사이에 두고 아미노기를 결합시켜, RNA를 아미노 커플링에 의해 수지 상에 고정화했다. 아미노기를 결합한 RNA는 화학 합성에 의해 제작했다(유전자 디자인사 제조). RNA의 고정화에는 Tresy1-TOYOPEARL 수지(도소사 제조)를 이용했다. 수지 1 mL 당 10 mg의 RNA를 사용하는 것으로, 약 8 mg의 RNA를 고정화했다. 고정화량은 커플링 전후의 상청 중의 RNA의 양을 흡광도계로 측정함으로써 구했다. 이 앱타머 수지를 이용하여 실시예 9와 동일하게 인간 혈청으로부터 IgG의 풀다운 실험을 행했다. 리간드로서, 서열 번호 15(도 37) 및 서열 번호 17-7, 17-8, 17-7-107, 15로 표시되는 RNA(도 38)를 이용했다. 그 결과, 이들의 어떠하 앱타머 수지로부터도 r단백질 A 수지와 동등한 순도로 IgG가 풀다운되는 것이 나타난다(도 37, 도 38).
실시예 9에서 앱타머 수지를 이용한 경우, 200 mM KCl+ 10 mM EDTA의 중성 용출액으로 IgG를 용출할 수 있는 것을 나타냈다. 여기서는 아미노 커플링에 의해 고정화된 서열 번호 17-7로 표시되는 앱타머 수지를 이용하여, 상이한 성분의 중성 용출액에 의한 IgG 용출 실험을 행했다. 용출액으로서 (1) 200 mM KCl+ 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris, (2) 200 mM KCl+ pH 7.6 10 mM Tris, (3) 300 mM NaCl+ 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris, (4) 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris를 이용했다. 실시예 9와 동일하게 인간 혈청으로부터 IgG를 풀다운하여, 상기 용출액으로 용출한 것을 SDS-PAGE를 이용하여 분석했다. 그 결과, KCl 또는 EDTA만으로 IgG를 용출할 수 있는 것을 알았다(도 39).
1MNaCl 용액으로 IgG를 용출할 수 있는지를 검토했다. 핵산은 음전하를 띠고 있기 때문에, 단백질과의 결합에는 이온 결합이 중요하다고 일반적으로 생각되어지고 있다. 따라서, 단백질과의 결합을 절단하기 위해서는 고염농도의 용액을 이용하면 좋다. 1M NaCl 용액을 용출액으로서 전술과 동일한 실험을 행했지만, 용출액 중에 IgG는 검출되지 않았고, 그 대부분이 앱타머 수지에 흡착된 상태였다. 고농도의 NaCl 존재화로 앱타머와 IgG가 결합하고 있는 것을 확인하기 위해 표면 플라즈몬 공명법을 이용한 실험을 행했다. 런닝 완충액에 500 mM NaCl + 2 mM MgCl2 + 10 mM pH 7.6 Tris 혼합액을 이용했다. 그 결과, 500 mM의 NaCl이 존재하더라도 완전히 결합 활성이 저하되지 않는 것을 알았다.
이상으로, 앱타머 수지에 결합한 IgG는 200 mM KCl 용액에서는 용출할 수 있지만, 1 M NaCl 용액에서는 용출 가능하지 않은 것을 알았다.
다음으로, 앱타머 수지의 가열에 의한 재생 및 멸균에 관한 실험을 행했다. 이미 3회 사용이 끝난 서열 번호 17-17 또는 17-18로 표시되는 앱타머 수지를(1) 초순수를 부가하여 85℃로 5분간 가열 또는(2) 6 M 요소를 부가하여 65℃로 15분간 가열하여, 재차 풀다운 실험을 행했다. 인간 혈청은 10 ㎕ 사용하고, 용출액으로서 200 mM KCl+ 10 mM EDTA+ pH 7.6 10 mM Tris 용액을 이용했다. 용출액을 SDS-PAGE에서 분석한 바,(1) 및 (2)에 의한 가열 처리에 의해 앱타머 수지가 거의 열화하지 않는 것을 알았다(도 40).
IgG를 동적 상태로 정제할 수 있는지의 여부를 조사했다. 앱타머 수지 100 ㎕을 소형 컬럼(MoBiTec/mobicols)에 충전하여, 인간 혈청 100 ㎕를 부가했다. 그 후 곧 용액 A를 시린지를 이용하여 부가하고, 수지를 세정했다(용액 A: 4 mL, 유속 약 1 mL/min). 다음으로, 중성 용출액을 이용하여 앱타머 리간드에 결합한 IgG를 용출했다(중성 용출액: 2 mL, 유속 약 1 mL/min). 용출된 획분을 SDS-PAGE를 이용하여 조사한 바, IgG가 용출되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 각 분획의 흡광도를 측정하여 IgG의 동적 정제량을 구한 바, 일회의 정제로 수지 1 mL 당 3.5 mg의 IgG를 정제할 수 있는 것을 알았다.
[실시예 12] 수지 결합형 올리고를 이용한 IgG의 풀다운 실험
전술까지는 화학 합성에 의해 제작한 앱타머를 polyA-polydT 결합, 비오틴-스트렙타비딘 결합, 티올 커플링, 아미노 커플링에 의해 수지 상에 고정화하여 사용하였다. 그러나, 핵산은 수지에 고정화한 상태로 합성하여, 합성 후에 수지로부터 분리하여 사용하였다. 그래서, 수지부터의 분리와 수지에의 재결합 과정을 단축할 목적으로, 합성 종료 후에 핵산을 수지로부터 분리하지 않고 그대로 풀다운 실험에 사용했다(수지 결합형 올리고). 수지 결합형 올리고는 서열 번호 15로 표시되는 RNA를 Oligo affinity support(Glen Research사 제조) 상에서 합성한 것을 사용했다(진 디자인사 제조). 수지 10 ㎕에 인간 혈청 10 ㎕을 부가하여 IgG를 풀다운하고, 중성 용출액으로 용출한 바, IgG가 고순도로 정제되었다(도 41).
[실시예 13] 키메라 항체에 대한 결합 활성의 평가
유전자 재조합 기술을 이용하여 제작된 의약품용의 항체에 대해 본 앱타머가 결합 활성을 갖고 있는지의 여부에 대해, 표면 플라즈몬 공명법을 이용하여 확인했다. 항체에는 의약품으로서 사용되고 있는 리툭산(로쉬사 제조)을 리간드에 서열 번호 17-7로 표시되는 핵산을 이용했다. 측정의 결과, 서열 번호 17-7로 표시되는 핵산은 리툭산에 대해 결합 활성을 갖고 있는 것을 알았다(도 42).
본 발명에 의해 IgG에 대해 결합능을 갖는 핵산 리간드가 제공된다. 본 발명에 의해 제공되는 핵산 리간드는 IgG에 대해 높은 결합 활성과 특이성을 유지하고 있다. 또한, 화학 합성할 수 있는 점에서 용이하게 뉴클레오티드 서열을 바꾸거나 수식을 부가하거나 할 수 있다. 그 때문에, 항체를 의약·시약·진단약에 이용하는 경우에, 각각의 요구에 맞추어 결합 활성이나 안정성을 변화시키거나, 형광 물질이나 항암제 등을 결합시켜 새로운 기능을 부가하는 것이 용이하다. 또한, 최근 인간화한 단일 클론 항체가 분자 표적 의약으로서 실용화되어 세계적으로 항체 제제의 개발이 진행되고 있다. 그 때문에, 현재 항체 정제에 사용되고 있는 단백질 A 수지 분리제를 대신하여 고기능성 분리제의 개발이 기대되고, 그 분리제 시장도 500억 엔 정도에 달할 거라고 예상된다. 본 발명에 의해 제공되는 핵산 리간드는 항체 정제용 분리제의 리간드로서 사용하는 것이 가능하고, 원하는 항체를 중성 조건으로 간편하게 고순도로 정제할 수 있다. 이것은, 종래의 단백질 A를 이용한 산성 조건에서의 정제와 크게 상이하고, 정제 중에 항체가 활성을 소실할 가능성이 적다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 리간드는 항체와 형광 물질이나 효소를 결합하기 위한 신규의 링커, 기판이나 수지에 항체를 고정하기 위한 신규의 고정화제, 또한 항체와 항암제나 독소를 결합하기 위한 신규의 링커로서 범용적으로 이용이 가능하다. 본 발명은 항체에 관한 신규 분리제, 시약, 의약의 산업화와 연구용 도구로서 범용적으로 이용할 수 있을 것이라 기대할 수 있고, 그 경제 효과도 크다.
본 출원은, 2005년 7월 5일에 일본에서 출원된 특허 출원 제2005-195717호 및 2005년 12월 12일에 미국에서 출원된 미국 가출원 US60/749,026을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서 중에 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> RIBOMIC Inc. <120> Nucleic acid capable of binding to immunoglobulin G and use thereof <130> 09944 <150> JP 2005-195717 <151> 2005-07-05 <150> US 60/749,026 <151> 2005-12-12 <160> 33 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 1 gggacacaau ggacgaguua caggugcucc aucaacaaaa uguuacaugg aacuguaacg 60 gccgacauga gag 73 <210> 2 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 2 gggacacaau ggacgucaaa gaagaggugc ucugcgagcc acgcggaacu cuauaacggc 60 cgacaugaga g 71 <210> 3 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 3 gggacacaau ggacggcgua aaauggaacc uggguuagaa uaucgggggu gcuccguaac 60 ggccgacaug agag 74 <210> 4 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 4 gggacacaau ggacggccaa cguuaacugg aacuguaaau caggugcucg agauaacggc 60 cgacaugaga g 71 <210> 5 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 5 gggacacaau ggacgacuac aaggugcucc uugaaauguu aaaugaggaa cuuguaacgg 60 ccgacaugag ag 72 <210> 6 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 6 gggacacaau ggacggcugg uaaggugcuc ggaauggaac ucgucauucg gaacuuaacg 60 gccgacauga gag 73 <210> 7 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 7 gggacacaau ggacgggugu uacaggugcu ugauaaaggu agaaaaucaa acuguaacgg 60 ccgacaugag ag 72 <210> 8 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 8 gggacacaau ggacgaaagg ugcuccaacu aaauuuggaa cuuuccaccc auaauaacgg 60 ccgacaugag ag 72 <210> 9 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 9 gggccacagc gaggugcucc accauucacg uggaacucgu gggcagcccg uccccgcgug 60 uggucgg 67 <210> 10 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 10 ggaauggacg aguuacaggu gcuccaucaa caaaauguua cauggaacug uaacggccga 60 cau 63 <210> 11 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 11 ggacgaguua caggugcucc aucaacaaaa uguuacaugg aacuguaacg gccg 54 <210> 12 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 12 ggacaggugc uccaucaaca aaauguuaca uggaacuguc c 41 <210> 13 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 13 ggacaggugc ucugcgagcc acgcggaacu gucc 34 <210> 14 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 14 ggacaggugc ucugcggaaa cgcggaacug ucc 33 <210> 15 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 15 ggaggugcuc ugcgagccac gcggaacucc 30 <210> 16 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 16 ggacaggugc uccgaaagga acugucc 27 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 17 ggaggugcuc cgaaaggaac ucc 23 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 18 ggaggugcuc gaaagaacuc c 21 <210> 19 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 19 ggguacgagu cuggacuugc aacaaggugc uccaccuacc uaguggaacu ugcugaugag 60 gcucacaaca ggc 73 <210> 20 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 20 ggguacgagu cuggacuugc aaggugcucc guuagcauug cggaacuugc aauauauccu 60 auugaggcuc acaacaggc 79 <210> 21 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 21 ggguacgagu cuggacuugc aacggauaca ggugcuccga ucuucggaac uggcguuggc 60 ggugaggcuc acaacaggc 79 <210> 22 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 22 ggguacgagu cuggacuugc aauacgaggu gcuccaagga aucgcccugg aacucgacga 60 cgugaggcuc acaacaggc 79 <210> 23 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic RNA <400> 23 ggguacgagu cuggacuugc aaccuaaugc ggugcuccuc uggaaccauu agcuguugca 60 aaugaggcuc acaacaggc 79 <210> 24 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (19)..(58) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 ctctcatgtc ggccgttann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnncg 60 tccattgtgt ccctatagtg agtcgtatta 90 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 25 taatacgact cactataggg acacaatgga cg 32 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 26 ctctcatgtc ggccgtta 18 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 27 taatacgact cactataggg ccacagcgag 30 <210> 28 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 28 ccgaccacac gcg 13 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 29 taatacgact cactataggg tacgagtctg gacttgcaa 39 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 gcctgttgtg agcctca 17 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 tgtcggccgt tacagttccg gtttcccggn tgtaactcgt ccattgtccc 50 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 taatacgact cactataggg acaatggacg agttac 36 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 tgtcggccgt tacagttc 18

Claims (34)

  1. IgG의 Fc 부분에 대해 결합하는 앱타머.
  2. 제1항에 있어서, IgG의 Fc 부분으로서, 인간 IgG의 Fc 부분에 대해 특이적으로 결합하는 앱타머.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 앱타머를 구성하는 총 뉴클레오티드수가 40개 이하인 앱타머.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 앱타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드는 리보스의 2' 위치에 있어서, 수소 원자, 불소 원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 기를 포함하는 뉴클레오티드인 앱타머.
  5. 제3항에 있어서, GGUG(C/A)(U/T)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머.
  6. 제5항에 있어서, GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 3번째의 U는 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 앱타머.
  7. 제6항에 있어서, GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 3번째의 U를 제외함)는 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 앱타머.
  8. 제5항에 있어서, GGUG(C/A)(U/T)가 GGUGCU 또는 GGUGAU인 앱타머.
  9. 제5항에 있어서, ANC(N은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드임)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 앱타머.
  10. 제9항에 있어서, ANC에 있어서의 각 뉴클레오티드는 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 앱타머.
  11. 제9항에 있어서, 이하 (i)∼(iii) 중 어느 하나인 앱타머:
    (i) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGA를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UCC를 포함하는 앱타머;
    (ii) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGNx1A를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UNx2CC를 포함하는(Nx1, Nx2는 각각, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드임) 앱타머; 또는
    (iii) GGUG(C/A)(U/T)의 5'측에 GGNx3Nx4A를 포함하고, 또한 ANC의 3'측에 UNx5Nx6CC를 포함하는(Nx3, Nx4, Nx5, Nx6은 각각, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드임) 앱타머.
  12. 제11항에 있어서, GGA, GGNx1A 또는 GGNx3Nx4A에 포함되는 GG, 및 UCC, UNx2CC 또는 UNx5Nx6CC에 포함되는 CC는 각각 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 앱타머.
  13. 제6항에 있어서, 이하 (I)∼(III)으로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머:
    (I)
    Figure 112008008532291-PCT00036
    (II)
    Figure 112008008532291-PCT00037
    (III)
    Figure 112008008532291-PCT00038
    [식 중, N1, N2, N3, N4, N5는 각각 동일 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이고,
    N2 및 N3은 서로 상보적인 뉴클레오티드이며,
    N4 및 N5는 서로 상보적인 뉴클레오티드이고,
    (i) GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 3번째의 U를 제외함), (ii) AN1C에 있어서의 각 뉴클레오티드, (iii) N2∼N5의 각 뉴클레오티드는 각각 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드이다].
  14. 제11항에 있어서, 루프 구조에 있어서의 모든 뉴클레오티드는 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 앱타머.
  15. 제13항에 있어서, (I)∼(IIl) 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머가 이하 (I')∼(III') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머:
    (I')
    Figure 112008008532291-PCT00039
    (II')
    Figure 112008008532291-PCT00040
    (III')
    Figure 112008008532291-PCT00041
    [식 중, N1, N2, N3, N4, N5는 각각 청구항 13에서와 동일한 의미를 나타낸다]
  16. 제3항에 있어서, AGGUG(C/A)(U/T)C로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, AGGUG(C/A)(U/T)C에 있어서의 4번째의 U는 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 불소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드이고, AGGUG(C/A)(U/T)C에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 4번째의 U를 제외함)는 각각 동일 또는 상이하고, 리보스 의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 앱타머.
  17. 제16항에 있어서, GANCU(N은 A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드임)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고, GANCU에 있어서의 각 뉴클레오티드가 각각 동일 또는 상이하고, 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드인 앱타머.
  18. 제6항에 있어서, 이하 (Ia)∼(IIIa)로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머:
    (Ia)
    Figure 112008008532291-PCT00042
    (IIa)
    Figure 112008008532291-PCT00043
    (IIIa)
    Figure 112008008532291-PCT00044
    [식 중, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7은 각각 동일 또는 상이하고, A, G, C, U 및 T로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드이며,
    N2 및 N3은 서로 상보적인 뉴클레오티드이고,
    N4 및 N5는 서로 상보적인 뉴클레오티드이며,
    N6 및 N7은 서로 상보적인 뉴클레오티드이고,
    (i) GGUG(C/A)(U/T)에 있어서의 각 뉴클레오티드(단, 3번째의 U를 제외함), (ii) AN1C에 있어서의 각 뉴클레오티드, (iii) N2∼N7의 각 뉴클레오티드는 각각 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 혹은 리보스의 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자, 불소 원자 또는 -0-Me기로 치환되어 있는 뉴클레오티드이다]
  19. 제18항에 있어서, (Ia)∼(IIIa) 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머가 이하 (Ia')∼(IIIa') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머:
    (Ia')
    Figure 112008008532291-PCT00045
    (IIa')
    Figure 112008008532291-PCT00046
    (IIIa')
    Figure 112008008532291-PCT00047
    [식 중, N1, N2, N3, N4, N5는 각각 청구항 18에서와 동일한 의미를 나타낸다]
  20. 제19항에 있어서, N4, N6은 각각 2' 위치에 있어서 히드록실기가 수소 원자로 치환되어 있는 뉴클레오티드이고, N5, N7은 각각 2' 위치에 있어서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드인 앱타머.
  21. 제19항에 있어서, (Ia')∼(IIIa') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머가 이하 (Ia''')∼(IIIa''') 중 어느 하나로 표시되는 잠재적 이차 구조를 갖는 앱타머:
    (Ia''')
    Figure 112008008532291-PCT00048
    (IIa''')
    Figure 112008008532291-PCT00049
    (IIIa''')
    Figure 112008008532291-PCT00050
  22. 제3항에 있어서, 이하 (a)∼(c) 중 어느 하나인 앱타머:
    (a) 서열 번호 1∼23 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이더라도 좋음)로 이루어지는 앱타머;
    (b) 서열 번호 1∼23 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열(단, 우라실은 티민이더라도 좋음)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 있어서 하나 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 앱타머;
    (c) 상기 (a)의 연결물, 상기 (b)의 연결물 및 상기 (a) 및 (b)의 연결물로 이루어지는 군에서 선택되는 연결물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 및 그것에 결합한 기능성 물질을 포함하는 복합체.
  24. 제23항에 있어서, 기능성 물질이 친화성 물질, 표지용 물질, 효소, 약물, 독소 또는 약물 송달 매체인 복합체.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 혹은 제23항 또는 제24항에 기재한 복합체가 고정화된 고상 담체.
  26. 제25항에 있어서, 고상 담체가 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼 또는 다공질재인 고상 담체.
  27. 제25항 또는 제26항에 기재한 고상 담체를 포함하는 의료용 기기.
  28. 제27항에 있어서, 의료용 기기가 혈액 정화용 기기인 기기.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머, 제23항 또는 제24항에 기재한 복합체 혹은 제25항 또는 제26항에 기재한 고상 담체를 포함하는 진단용 또는 검사용 시약.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머 혹은 제23항 또는 제24항에 기재한 복합체를 포함하는 의약.
  31. 제25항 또는 제26항에 기재한 고상 담체에 IgG 항체를 흡착시키고, 흡착된 IgG 항체를 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함하는 항체 정제 또는 농축 방법.
  32. 제31항에 있어서, 용출액이 중성 용액인 방법.
  33. IgG 항체를 제작하고, 제작된 IgG 항체를 제25항 또는 제26항에 기재한 고상 담체에 의해 정제하는 것을 포함하는 정제 항체의 제조 방법.
  34. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재한 앱타머, 제23항 또는 제24항에 기재한 복합체 혹은 제25항 또는 제26항에 기재한 고상 담체를 이용하여, 시료 중의 IgG의 유무 및/또는 양을 측정하는 것을 포함하는 IgG의 검출 및/또는 정량 방법.
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