JP4698559B2

JP4698559B2 - ウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子

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Publication number: JP4698559B2
Application number: JP2006317113A
Authority: JP
Inventors: 嘉仁吉田; 真木雄古市; 巌和賀; 洋水野
Original assignee: NEC Solutions Innovators Ltd
Current assignee: NEC Solutions Innovators Ltd
Priority date: 2006-11-24
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2026-11-24
Also published as: AU2007322660B2; WO2008062882A1; US20100222559A1; EP2098594A4; US8283457B2; JP2008125484A; NZ577837A; ATE531799T1; EP2098594A1; EP2098594B1; AU2007322660A1

Description

本発明は、ウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子に関する。

ＤＮＡやＲＮＡ等のオリゴヌクレオチドは、主としてタンパク質の合成に関与する分子種としての機能を主として有するものと考えられてきたが、リボザイムやＲＮＡｉといった、遺伝子がタンパク質や高分子等の分子種と直接相互作用することにより、分子種の有する機能を制御し得る現象が見出され、注目されている。なかでも、アプタマーは、近年、タンパク質などの分子種に結合して、その機能を改変し得る核酸として注目されており、医薬品等への応用を目的として、新規のアプタマーが多く取得されている。

一方、マウス、ラット、ウサギなどの実験動物に由来するＩｇＧなどの各クラスに属する抗体は、タンパク質などの抗原や、抗原−抗体複合体を形成し得る抗体など、高分子化合物に水素結合などの結合様式で結合し得るタンパク性の物質を総称する。抗体は、例えば抗原−抗体複合体における抗体に特異的に結合する抗体として、診断薬など医療分野等において広く用いられている。

しかしながら、抗体は、抗原と特異的な活性を有する点で、有用であるものの、抗体の調製には、種々の問題が指摘されている。例えば、抗体は、マウス、ラット、ウサギ等の被免疫動物に抗原を反復的に注入して免疫反応を惹起した後、血清等から、所望する、抗原との結合性を有する画分を調製する必要があり、作業の面でも、コストの面でも、非常に不利である。また、抗体は、この抗体が特異的に結合する抗原以外にも、種々のタンパク質や、ＰＰ、ＰＥといった容器等にも非特異的に結合する性質を有しており、ハンドリングの面でも不利である。さらに、抗体の調製には、上述の通り、被免疫動物を用いる必要があり、動物愛護の面からも、好ましいものではない。

また、抗体は、上述の診断薬などに二次抗体として用いる場合、抗原−抗体複合体への結合の程度を分光光度的に検出するため、ペルオキシダーゼ等の標識化合物とのコンジュゲート体として用いられる必要があるが、このようなコンジュゲート体の調製は、二次抗体の調製に加えて、さらに煩雑となる。

従って、抗体に代わって、抗原と特異的に結合し得る分子種が所望されていた。
Ｍ．Ｚｕｋｅｒ著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２４４巻、ｐ．４８〜５２

本発明は、上述の問題点に鑑みてなされたものであり、抗体よりも簡便に調製可能で、且つ抗体と比べて同等以上の結合性を有する、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子を提供することを目的とする。

本発明による核酸分子は、ウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有することを特徴とする。

本発明による核酸分子は、ウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合し得る物質として、有用である。

本発明において、核酸分子とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）など種々の核酸を有するヌクレオチドであれば、特に制約はなく、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど、鎖の本数や、核酸が修飾されているか否か等に制約はない。

本発明において、「ウサギ由来のＩｇＧ抗体」とは、任意の抗原でウサギに免疫反応を惹起させて得た血清のＩｇＧ画分に存在する抗体を総称するものをいう。

本発明による核酸分子において、ウサギ由来のＩｇＧ抗体に対する結合定数（Ｋ_Ｄ）は、１．１８×１０^−７（Ｍ）以下であることが好ましい。

本発明による核酸分子は、ウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸であって、この核酸の配列と実質的に相同性を有するものが好ましい。本発明において、「実質的に相同性を有する」とは、７０％より高い、最も好ましくは８０％より高い、及びさらにより好ましくは９０％、９５％又は９９％より高い一次配列の相同性を有することを意味する。

本発明による核酸分子は、ウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸であって、実質的に同一な推定構造又は構造モチーフを有することが好ましい。本発明において、「実質的に同一な推定構造又は構造モチーフを有する」とは、核酸の配列の二次構造及びこの構造のモチーフを予測するプログラムを用い、複数の配列からなる配列群に見出される一定の同一性を有することを意味する。この一定の同一性としては、比較対照とする配列間の相同性が、７０％以上であることが好ましい。実質的に同一性を有することにより、ウサギ由来のＩｇＧ抗体への結合性が向上する。このようなプログラムの例としては、非特許文献１に記載のＺｕｋｅｒｆｏｌｄプログラムが挙げられる。

＜本発明による核酸分子の製造方法＞
本発明による核酸分子は、いわゆるＲＮＡプールと、標的物質としてウサギ由来のＩｇＧ抗体とを用いて、ＳＥＬＥＸ法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）に従って、製造することが可能である。以下、ＳＥＬＥＸ法に準じた本発明による核酸分子の調製方法について、説明する。

（ＳＥＬＥＸ法に準じた本発明による核酸分子の製造方法）
本発明による核酸分子は、ＳＥＬＥＸ法に準じた方法で、ＲＮＡプールと、標的物質とを反応させて得られるＲＮＡプール−標的物質複合体を回収した後、この複合体から、この複合体の形成に関与したＲＮＡプールのみを回収して、製造することが可能である。

ＲＮＡプールとは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵからなる群から選択された塩基を２０〜１２０個程度連結した領域（この領域を、以下、「ランダム領域」と称する。）を有する遺伝子配列を総称する遺伝子の混合物をいう。従って、ＲＮＡプールは、４^２０〜４^１２０（１０^１２〜１０^７２）種類の複数の遺伝子が含まれ、４^３０〜４^６０（１０^１８〜１０^３６）種類の遺伝子が含まれることが好ましい。

ＲＮＡプールは、ランダム領域を有する限り、その他の構造に制約はないが、本発明による核酸分子をＳＥＬＥＸ法に準じて製造する場合、ランダム領域の５’末端及び／又は３’末端には、後述のＰＣＲ等で利用するプライマー領域や、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域を有することが好ましい。例えば、ＲＮＡプールは、５’末端側からＴ７プロモーターなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、この領域を「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」と称する。）と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を「５’末端側プライマー領域」と称する。）とを連結し、この５’末端側プライマー領域の３’末端にランダム領域を連結し、さらにこのランダム領域の３’末端側にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を、「３’末端側プライマー領域」と称する。）を連結した構造を有してもよい。また、ＲＮＡプールは、これらの領域の他に、標的物質への結合を補助する公知の領域を有してもよい。さらに、ＲＮＡプールは、ランダム領域の一部が各ＲＮＡプールにおいて同じ配列を有するものであってもよい。

ＲＮＡプールは、ＲＮＡプールのランダム領域のＵをＴに置き換えた初期プールを鋳型として、ＰＣＲ法に基づいて、遺伝子増幅した後、得た遺伝子産物と、Ｔ７ポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを反応させて、調製されてもよい。また、初期プールに相補的な遺伝子を合成し、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、５’末端側プライマー領域に相補的な配列とからなるプライマーを、初期プールにおいてこのプライマーと相補的な遺伝子にアニーリングさせて、ＰＣＲ法に基づいて、調製されてもよい。

次に、このようにして合成したＲＮＡプールと、標的物質であるウサギ由来抗体とを水素結合などの分子間力を介して結合させる。この結合方法としては、ＲＮＡプールと標的物質とを、標的物質の結合などの機能が保たれる緩衝液中で一定時間インキュベートする方法が挙げられる。このようにして、緩衝液中でＲＮＡプール−標的物質複合体が形成される。

次に、このように形成されたＲＮＡプール−標的物質複合体を回収する。緩衝液中には、この複合体の他、複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールや標的物質が含まれるが、この複合体の回収方法としては、標的物質に結合性を有する核酸分子を回収することを目的として、緩衝液中に存在する複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールを除去する方法により行えばよい。この方法としては、標的物質及びＲＮＡプールの吸着性の違いや、複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用する方法が挙げられる。

標的物質とＲＮＡプールとの吸着性の違いを利用した方法としては、例えば、ニトロセルロース等の標的物質に吸着性を有する膜を用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を有する緩衝液を濾過し、この膜上にＲＮＡプール−標的物質複合体を吸着させ、その後、この膜上に残存したＲＮＡプール−標的物質複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを、例えばこの複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合を解除した後にＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。

また、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用した方法としては、アガロースゲルなど、ＲＮＡプールを通過させ得るがＲＮＡプール−標的物質複合体を通過させ得ない程度のポアを有する担体を利用して、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとを電気的に分離し、この複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。

次に、このようにして得たＲＮＡプール−標的物質複合体から回収した複合体の形成に関与したＲＮＡプールを用いて、遺伝子増幅を行う。この遺伝子増幅の方法としては、ＲＮＡプールに含まれる５’末端側プライマー領域、３’末端側プライマー領域、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用する方法が挙げられる。例えば、複合体の形成に関与したＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な遺伝子断片をプライマーとして用いて、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応に従ってｃＤＮＡを調製した後、このｃＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域及び３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行い、得た遺伝子産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応を行って、ＲＮＡプールの遺伝子増幅を行ってもよい。

このように遺伝子増幅された複合体の形成に関与したＲＮＡプールと、標的物質とを用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を形成する方法以下の各方法を繰り返し行い、最終的に、標的物質としてのウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子を得ることができる。

（その他の方法に準じた本発明による核酸分子の製造方法）
従来公知の種々の方法で合成することが可能である。本発明による核酸分子は、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて、ｄＮＴＰを材料として、末端塩基から化学合成されたものであってもよい。

（実施例１）
配列番号６に示す初期プールを、ＤＮＡ合成装置（３３４ＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））で合成した。この初期プール（５００ｎＭ）と、プライマー１（配列番号８）と、プライマー２（配列番号９）と、２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ社製）とを用いて、初期プールと、初期プールに相補的な遺伝子鎖とからなるｃＤＮＡを得た。次に、このようにして得たｃＤＮＡと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製））とを用いて、転写反応を行い、ＲＮＡプール（配列番号７）を得た。

２０μＭのＲＮＡプールと、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（１μＭ、ケミコン社製、以下、標的物質と称する。）とを、結合バッファ（５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２）中で、室温、２０分間インキュベートした。得た混合物を、ポップトップホルダーに固定したニトロセルロース膜に導入してろ過し、膜を１ｍＬの結合バッファで洗浄した。その後、この膜を３００μＬの溶離液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、７Ｍ尿素）に浸漬して、９０℃、５分間加温した。得た液にエタノール沈殿を施し、オリゴヌクレオチドを得た。

その後、このオリゴヌクレオチド全量と、プライマー３（配列番号１０）と、ＡＭＶトランスクリプターゼ（１０Ｕ、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）とを用いて、４２℃で、１時間、逆転写反応を行った。

この反応産物全量と、２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ社製）と、３０ｎＭのプライマー１（配列番号８）と、プライマー２（配列番号９）とを用いて、９０℃×５０秒、５３℃×７０秒及び７４℃×５０秒の順で行うサイクルを１サイクルとして、１２サイクルでＰＣＲ反応を行った。得た液にエタノール沈殿を施し、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。

この二本鎖ＤＮＡ産物を８μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解し、そのうち４μＬと、２μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製））とを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写を行い、ｉｎｖｉｔｒｏ転写物を得た。なお、ここまでの工程を１サイクルと称する。

その後、このｉｎｖｉｔｒｏ転写物を上述のＲＮＡプールとして、上述の工程を１０サイクル行った。その結果、配列番号１乃至５に示すＲＮＡを得た。

（実施例２）
配列番号１乃至５に示すＲＮＡ（各２０ｎＭ）と、１００ｎＭの標的物質とを、結合バッファ中で、室温、２０分間インキュベートした。得た混合物を、以下の［結合実験］の方法に従って、結合強度を測定した。結果を表１に示す。なお、表１中の数値は、［結合実験］前の放射標識ｉｎｖｉｔｒｏ転写物の放射強度を１００％としたときの百分率を示す。

（実施例３）
標的物質に対する配列番号１乃至５に示すＲＮＡの結合活性を、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて、以下の通り測定した。

まず、リガンドとして、配列番号１乃至５に示す各ＲＮＡの５’末端側にアデニン２４塩基を連結したものを、定法に従い調製した。５’末端側にビオチンを標識した２４塩基のデオキシチミンをセンサーチップＳＡ（ビアコア社製）に固定化し、つぎに、調製したＲＮＡをデオキシチミンと結合させた。これに、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭの標的物質を、流速２０μＬ／分で２分間添加し、測定物の結合を観察した後、３分間にわたって解離を観察した。反応は２５℃で行った。この観察で得た標的物質の各濃度における結合反応曲線から、結合定数（ｋａ（Ｍｓ^−１）、ｋｄ（ｓ^−１）及びＫＤ（Ｍ））をそれぞれ算出した。また、これらの結合定数の値について、χ（カイ）２乗検定を行った。その結果を表２に示す。

（実施例４−１）
実施例３において、配列番号１乃至５に示す各ＲＮＡの代わりに、配列番号５に示すＲＮＡと、このＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡとを用い、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭの標的物質の代わりに、１００００ＲＵ（１ＲＵは、単位平方ミリメートル当たり１ｐｇの質量変化を起こす量に相当する単位）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用い、２分間の結合時間を２分３０秒とした以外は、実施例３と同様に行って、表面プラズモン共鳴を利用して得たセンサグラムを得た。結果を図１−１に示す。

（実施例４−２）
実施例４−１において、１００００ＲUのＧＳＴの代わりに、１００００ＲUのＧＳＴと１００００ＲUの抗ＧＳＴ抗体（ＩｇＧ、ウサギ由来、ケミコン社製）との混合物を用いた以外は、実施例４−１と同様に行って、表面プラズモン共鳴を利用して得たセンサグラムを得た。結果を図１−２に示す。

（実施例４−３）
実施例４−１において、１００００ＲUのＧＳＴの代わりに、１００００ＲUの抗ＧＳＴ抗体（ＩｇＧ、ウサギ由来、ケミコン社製）を用いた以外は、実施例４−１と同様に行って、表面プラズモン共鳴を利用して得たセンサグラムを得た。結果を図１−３に示す。

（実施例５）
配列番号１乃至５に示すＲＮＡ（２０ｎＭ）と、以下に示す物質（各１００ｎＭ）とを、結合バッファ中でインキュベートした後、以下の［放射標識］及び［結合実験］の方法に従って、結合強度を測定した。結果を表３に示す。

［物質一覧］
（１）結合バッファのみ
（２）ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）
（３）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来、ＧＥ社製ベクターより同社プロトコールに従い実験室内で調製した。以下、ＧＳＴと称する。）
（４）抗ＧＳＴ抗体（ＩｇＧ、ウサギ由来、ケミコン社製）
（５）ＧＳＴ（１００ｎＭ）と抗ＧＳＴ抗体（１００ｎＭ）との混合物
（６）マウスＩｇＧ（ケミコン社製）
（７）ヤギＩｇＧ（ケミコン社製）

［放射標識］
上述のｉｎｖｉｔｒｏ転写の方法に準じて、上記の二本鎖ＤＮＡ産物を用いて、α−^３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）存在下で、放射標識ｉｎｖｉｔｒｏ転写物を得た。

［結合実験］
放射標識ｉｎｖｉｔｒｏ転写物と、標的物質とを、結合バッファ中、室温で２０分間インキュベーションを行った。

得た混合物を、サッカーを用いて吸引したフィルター（商品名：ＭＦ−メンブレンフィルター（ミリポア社製））上に導入し、その後、混合物の２０倍量の結合バッファで、このフィルターを洗浄した。このようにして得たフィルターの放射強度を、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製バイオ・イメージングアナライザー（ＢＡＳ−２５００（イメージングプレートとして、富士フィルム社、ＢＡＳ−ＭＳ２０４０を使用））を用いて、測定した。なお、放射強度は、ＩｍａｇｅＲｅａｄｅｒ（同前）で可視化し、得たデータをＩｍａｇｅＧａｕｇｅｖｅｒ．４．０（同前）を用いて数値化した。

（実施例６）
実施例５において、配列番号１乃至５に示すＲＮＡの代わりに、配列番号５に示すＲＮＡを用い、実施例５に示す物質として、３３３ｎＭ及び３３ｎＭのウサギ由来の抗Ｆｌａｇ−抗体（ＩｇＧ画分）、並びにウサギにＭＢＰ（マルトース結合タンパク質；ｍａｌｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）で免疫して得た血清画分（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社製）、結合バッファで１００倍、１０００倍、及び１００００倍に希釈したもの）を用いた以外は、実施例５と同様に行って、結合強度を測定した。結果を図２に示す。なお、図２の縦軸は、［結合実験］前の放射標識ｉｎｖｉｔｒｏ転写物の放射強度を１００％としたときの百分率を示す。

（実施例７）
実施例５において、配列番号１乃至５に示すＲＮＡの代わりに、配列番号５に示すＲＮＡを用い、実施例５に示す物質として、ウサギにＧＳＴで免疫して得た血清のＩｇＧ画分（ケミコン社製）、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭＮａＣｌからなる緩衝液で、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ及び２５ｎＭに調製したもの）を用いた以外は、実施例５と同様に行って、結合強度を測定した。結果を図３に示す。なお、図３の縦軸は、［結合実験］前の放射標識ｉｎｖｉｔｒｏ転写物の放射強度を１００％としたときの百分率を示し、横軸は、ＩｇＧ画分を調製したロット番号及び抗体濃度を示す。

実施例４−１で得たセンサグラムを示す。実施例４−２で得たセンサグラムを示す。実施例４−３で得たセンサグラムを示す。実施例６で得た結合強度を示す。実施例７で得た結合強度を示す。

Claims

ウサギ由来のＩｇＧ抗体に対する結合定数（Ｋ_Ｄ）が、１．１８×１０^−７（Ｍ）以下であり、かつ、配列番号１から５のいずれかに記載のＲＮＡ配列または前記ＲＮＡ配列と９０％より高い相同性を示すＲＮＡ配列を有することを特徴とするウサギ由来のＩｇＧ抗体に結合性を有するＲＮＡ核酸分子。
当該ＲＮＡ核酸分子は、ＳＥＬＥＸ法により取得されたものであることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ核酸分子。
前記ウサギ由来のＩｇＧ抗体は、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載のＲＮＡ核酸分子。