DE102008013622A1

DE102008013622A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung des Plasmozytoms

Info

Publication number: DE102008013622A1
Application number: DE102008013622A
Authority: DE
Inventors: Volker A. Prof. Dr. Erdmann
Original assignee: Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2009-09-17
Also published as: WO2009112021A2; WO2009112021A3

Abstract

Die Erfindung betrifft pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzungen, welche an M Antikörper bindende Nukleinsäuren enthalten.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzung, welche zur Diagnose und/oder Behandlung des Plasmozytoms geeignet sind, insbesondere Substanzen, welche an Myeloma IgG1 binden.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
Das Plasmozytom ist eine Knochenmark Krebserkrankung und zählt zu den aggressiven B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen. Der Begriff steht für einen solitären intramedullären oder ein oder mehrere extrameduläre Quellen maligner Plasmazellen. Als Synonym wird der Begriff des Myeloms verwendet. Das multiple Myelom liegt vor, wenn mehrere intramedulläre Herde vorhanden sind.
Das Plasmozym ist gekennzeichnet durch krankhafte Vermehrung der Plasmazellen, welche ihrerseits krankheitsspezifische Antikörper in hohem Maße produzieren. Da alle malignen Plasmazellen von einer gemeinsamen Vorläuferzelle abstammen, sind die produzierten Antikörper monoklonal. Mehr als 50% der Plasmozytome sind IgG Plasmozytome, i. e. betreffen IgG bildende Plasmazellen. Myeloma IgG1 Antikörper unterscheiden sich in den Sequenzen der Bestandteile von „normalen” IgG1 Antikörpern, welche von nicht-malignen Plasmazelle gebildet werden, i. e. Myeloma IgG1 Antikörper sind tumorspezifisch.
Durch das maligne Wachstum der Plasmazellen selbst werden Knochenschmerzen, Auflösung der Knochen, Anstieg des aus dem Knochen gelösten Calciums im Serum und Abnahme der Bildung der roten Blutkörperchen induziert. Die im Übermaß gebildeten Myeloma Antikörper führen zu Funktionsstörungen vieler Organe, insbesondere Nierenversagen, sowie zu einer Beeinträchtigung der Gewebedurchblutung, da sie Ablagerungen in Organen und Geweben bilden.
Derzeit wird das Plasmozytom durch immunologischen Nachweis von Myelom IgG Antikörpern bzw. von Fragmenten solcher Antikörper in Blut und Urin diagnostiziert.
Therapeutische Ansätze umfassen die Chemotherapie mit Melphalan und Prednison, oder mit einer Kombination aus Vincristin, Idarubicin bzw. Agriamycin, sowie Dexamethason. Seit 2001 ist Thalidomid zur Behandlung des multiplen Myeloms zugelassen. Auch wird Lenalidomid, eine immunmodulatorische Substanz, eingesetzt. Dennoch beträgt die Lebenserwartung nach Auftreten von Komplikationen mit Chemotherapie nur ca. 3 Jahre.
Ein Aptamere sind Nukleinsäurestrukturen (RNA oder DNA) welche an ein Targetmolekül beliebiger Art mit hoher Affinität und Selektivität bindet. Erhalten werden Aptamere aus Nukleinsäurebibliotheken mit meist randomisierten Sequenzen durch Kontaktierung der Nukleinsäuren einer solcher Bibliothek mit dem Targetmolekül und Selektion sowie selektive Amplifikation der mit hoher Affinität bindenden Nukleinsäuren.
Aus der Literaturstelle WO 2007/004748 A1 sind Aptamere bekannt, welche an normales humanes IgG binden. Aus der Literaturstelle US 200//0009907 A1 sind Aptamere gegen Immunglobulin E bekannt.
Aus der Literaturstelle Nagel-Wolfrum, K., et al., Mol Cancer Res. 2(3): 170–182 (2004) sind Aptamere gegen STAT3 bekannt, wobei die durch die Bindung an diesen Transkriptionsfaktor Apotose in Krebszellen induziert werden soll. Die Literaturstelle Shangguan, D., et al., Clin Chem. 53(6): 1153–1155 (2007) offenbart Aptamere, welche an die Oberfläche neoplastischer Zellen binden.
In Bezug aus das Plasmozytom wäre es einerseits wünschenswert, eine Diagnose sehr frühzeitig stellen zu können, und andererseits Organschäden durch Myeloma Antikörper zu vermeiden, zumindest aber zu reduzieren bzw. zu verlangsamen.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, mit welchen das Plasmozytom früh und mit hoher Empfindlichkeit diagnostiziert werden kann, sowie mit welchen die Menge an Myeloma Antikörper im Körper reduziert werden kann, und zwar möglichst ohne die normale Immunantwort auf fremde Antigene nennenswert zu stören.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung oder diagnostische Zusammensetzung enthaltend eine isolierte Nukleinsäure oder mehrere verschiedene isolierte Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz
n_a-hwgg-n_b-t-n_c-gggggg-n_d-t-n_e-ggty-n_f,
wobei a = 0–z, b = 0–7, c = 0–2, d = 0 oder 1, e = 0–3 und f = 0–z, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann.
Nukleinsäuren können als Nukleotidsequenz eine RNA, DNA, oder eine LNA enthalten, welche auch derivatisierte nichtnatürliche Nukleotide aufweisen kann. Von der Erfindung mit umfasst sind auch Nukleinsäuren mit zu in den vorliegenden Beschreibung offenbarten Sequenzen homologe Sequenzen, sowie zu solchen Sequenzen bzw. deren Homologe komplementäre Sequenzen. Homologe bezeichnet dabei Nukleinsäuresequenzen, welche mit einer der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Sequenzen eine Homologie von zumindest 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNA LASERGENE, aufweist. Ein Homolog in der Terminologie der Erfindung ist zudem zwingend durch die Fähigkeit zur Bindung als Aptamer an Myeloma IgG Antikörper charakterisiert. Eine Komplementärnukleinsäure ist typischerweise eine Nukleinsäure deren Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz oder der Vollsequenz einer der hier beschriebenen Nukleinsäuren ist und an diese Teilsequenz bzw. Vollsequenz einen Nukleinsäure-Doppelstrang bildend bindet, also hieran hybridisiert.
Neben der Nukleotidsequenz kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure aber auch Moleküle enthalten, beispielsweise endständig der Nukleotidsequenz an das 5'- oder 3'-Ende oder an beide Enden, gebunden, welche keine Nukleotide enthalten. Beispiele hierfür sind Detektorsubstanzen, Antigene, welche vom Immunsystem des Patienten als körperfremd erkannt werden, oder auch Linkermoleküle, über welche eine Kopplung an andere Moleküle, beispielsweise fachübliche Moleküle zur Blockierung eines enzymatischen Abbaus der Nukleinsäure im Körper oder in Körperflüssigkeiten, wie Polyethylenglycol, ein Antigen oder eine Festphase stattfindet. Die Nukleinsäure kann aber natürlich auch direkt mit solchen anderen Molekülen gekoppelt sein, sofern die anderen Moleküle die Bindung an die Myelmoa IgG Antikörper nicht blockieren.
Die Nukleinsäure selbst ist dabei stets ein Aptamer, bezogen auf eine spezifische zu bestimmende Substanz, hier Myeloma IgG Antikörper. In aller Regel wird es sich bei einer Koppelung einer erfindungsgemäßem Nukleinsäure an ein Linkermolekül um eine covalente Bindung handeln. Ein Linkermolekül ist beispielsweise ein organisches Molekül, welches bivalent ist und zur Verbindung der Nukleinsäure unter räumlichem Abstand zur festen Phase dient. Ein Linkermolekül kann dabei eine synthetisches organisches Molekül, beispielsweise Polymer, aber auch ein Biopolymer, beispielsweise ein Protein, Peptid oder eine Nukleinsäure sein. Der Begriff der Linkermoleküle umfasst dabei auch übliche Kopplungsreagenzien, wie die Molekülpaare Biotin/Streptavin bzw. Neutravidin. Dabei wird eines der Moleküle, beispielsweise Biotin, an die zu immobilisierende Substanz gebunden, im Falle der Nukleinsäure beispielsweise an das 5'-Ende, und das andere Molekül an die feste Phase. Zusätzlich zu solchen Kopplungsreagentien können aber auch noch die anderen vorstehend genannten Linkermoleküle zwischengeschaltet sein.
Ein Aptamer ist dabei eine (meist einzelsträngige) Nukleinsäure, welches analog einer Antikörper/Antigenaffinität (”Schlüssel/Schloss”) oder gemäß dem Bindungsmodell des induced fit eine Bindungsaffinität zu bestimmten Zielstrukturen auf molekularer Ebene aufweist. Es handelt sich folglich um nicht-kovalente Bindungen zur Zielstruktur, hier einem Myeloma IgG Antikörper.
Eine Detektorsubstanz ist eine beliebige Substanz, welche sich mittels physikalischer oder chemischer Nachweismethoden bestimmen läßt. Beispiele für physikalisch nachweisbare Detektorsubstanzen sind Stoffe, die Lumineszenz, i. e. Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, nach Exposition durch eine die Lumineszenz anregende Strahlung oder andere Energieform zeigen. Der Nachweis erfolgt durch Messung der Intensität der Lumineszenz bei deren Wellenlänge. Chemische Nachweismethoden umfassen die klassischen Färbemethoden der Biochemie, wozu auch beispielsweise direkte Markierungen einer Nukleinsäure, beispielsweise am 5'-Ende mit einem Farbstoff, zählen.
Als diagnostische Zusammensetzung werden alle üblichen Kombinationen (Mischungen, Koppelungen) einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit weiteren Substanzen, einschließlich Detektorsubstanzen, Linkersubstanzen oder Festphasen, wie im Folgenden beschrieben, bezeichnet, welche zur ex-vivo Bestimmung (qualitativ, halb-quantitativ oder quantitativ) von Myeloma Antikörpern in entnommenen Körperflüssigkeiten, wie entnommen oder fachüblich aufbereitet, geeignet sind.
Mit der Erfindung wird einerseits ein diagnostisches Mittel erreicht, welches mit hoher Empfindlichkeit sowie hoher Selektivität die Erkrankung Plasmozytom durch Analyse eine Blutprobe bzw. Plasmaprobe, aber auch ggf. einer Urinprobe, detektiert werden kann. Falsch-negative ebenso wie falsch-positive Ergebnisse sind mit ungewöhnlich hoher Sicherheit ausgeschlossen, da die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit sehr hoher Selektivität und Affinität ausschließlich an Myeloma IgG Antikörper binden, nicht dagegen an „normale” IgG Antikörper, welche im Rahmen einer normalen Immunantwort auf fremde Antigene erzeugt werden.
Mit der Erfindung wird aber auch ein Mittel zur Verfügung gestellt, mit welchem selektiv Myeloma IgG Antikörper inhibiert bzw. aus dem Plasma bzw. Blut eines Patienten abgetrennt werden können. Dadurch wird zwar die Erkrankung selbst nicht therapiert, jedoch werden die durch die Myeloma IgG Antikörper verursachten Schädigungen an Organen und Knochen reduziert, wenn nicht gar völlig verhindert, insbesondere, wenn die Erkrankung frühzeitig, beispielsweise mit den erfindungsgemäßem diagnostischen Mitteln, detektiert werden kann. Es steht zu erwarten, dass die Lebenserwartung von erkrankten Patienten ganz erheblich verlängert wird, da die kurze Lebenserwartung, selbst bei Therapie der eigentlichen Erkrankung selbst, im Wesentlichen auf den durch die Myeloma IgG Antikörpern verursachten Organschädigungen beruht. Im Rahmen der Erfindung ist dabei von besonderer Bedeutung, dass Myeloma Antikörper typischerweise monoklonale Antikörper sind, so dass diese Antikörper stets gleiche Epitope aufweisen, an welche erfindungsgemäße Nukleinsäuren binden können.
Bevorzugt ist es in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, wenn z = 0–200, insbesondere 10–100, ist. Weiterhin ist vorzugsweise b = 0, 1, 2, 3, 6 oder 7, und/oder e = 1, 2 oder 3. Im Einzelnen kann n_b tt, taa, gt, tg, tc, ta, tgcatc, gcatgtc, a, ct, c, t, ca, oder kein Nukleotid sein. n_c kann tt, t, tc, gc, cc, c, oder kein Nukleotid sein. n_d kann c, g, t, oder kein Nukleotid sein. n_e kann a, ttg, ct, g, atg, tt, oder kein Nukleotid sein. Die Nukleinsäure kann insbesondere eine der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID 1 bis 39 der 1 und 2 enthalten oder hieraus bestehen, wobei t auch durch u ersetzt sein kann.
In der Variante als pharmazeutische Zusammensetzung zur Darreichung an einen erkrankten Patienten können erfindungsgemäß eingesetzte Nukleinsäuren auch mit weiteren Substanzen gekoppelt, insbesondere covalent gekoppelt sein. Die Kopplung wird dabei entweder direkt oder, bevorzugt, über ein Linkermolekül gegeben sein. Als weitere Substanzen kommen dabei beispielsweise körperfremde Antigene in Frage. Diese körperfremden Antigene werden von körpereigenen Immunsystem als körperfremd erkannt und angegriffen mit der Folge, dass das Antigen mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure sowie der daran gebundenen Myeloma IgG Antikörper vom Körper selbst beseitig werden. Folglich können die Myeloma IgG Antikörper keine Schädigungen an den Organen des Patienten mehr hervorrufen.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ggf. in Verbindung mit sonstigen Molekülen, beispielsweise Linkermolekülen, Stabilisatoren gegen enzymatischen Abbau, und/oder körperfremden Antigenen, wird typischerweise in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und zur Darreichung an eine Person hergerichtet. Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäß eingesetzten pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise und grundsätzlich zur beliebigen Darreichung, beispielsweise oral oder zur Injektion, erfolgen. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i. v., i. p., i. m., s. c.), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Saccharide, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, oder Mischungen solcher Lösungsmittel genannt. Eine erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure, ggf. als Salz, in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter und vorgegebener Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Bevorzugt wird in der Regel die i. v. Injektion bzw. Infusion sein.
Die Erfindung lehrt auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Plasmozyms, insbesondere des Plasmozyms mit Myelom IgG.
Des Weiteren lehrt die Erfindung ein Immobilisat enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche an die Oberfläche einer festen Phase gebunden, insbesondere covalent gebunden, ist, oder einen Nukleinsäure/Kopplungsreagenz-Verbund mit einer solchen Nukleinsäure, welche an ein Kopplungsreagenz, insbesondere ein physiologisch verträgliches Kopplungsreagenz, gebunden ist.
In diesem Zusammenhang ist auch Gegenstand der Erfindung eine Dialysevorrichtung mit einem arteriellen Entnahmeteil, mit einer Abtrennkammer, welche mit einem ersten Kammeranschluss mit dem arteriellen Entnahmeteil verbunden ist und ein erfindungsgemäßes Immobilisat enthält, und einem venösen Rückführungsteil, welches mit einem zweiten Kammeranschluss der Abtrennkammer verbunden ist, wobei optional eine Kreislaufpumpe zwischen der Abtrennkammer und dem arteriellen Entnahmeteil und/oder dem venösen Rückführungsteil zwischengeschaltet ist, deren Förderrichtung zum venösen Rückführungsteil weist. Mit Ausnahme des in der Abtrennkammer angeordneten und darin immobilisierten Immobilisats können grundsätzlich alle üblichen Dialysetechnologien eingesetzt sein. Bei Einsatz einer erfindungsgemäßen Dialysevorrichtung wird einem Patienten aus einer Arterie Blut entnommen, welches dann durch die Abtrennkammer geleitet wird. Myeloma IgG Antikörper im Blut werden dann an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gebunden und dadurch immobilisiert und aus dem Blutstrom entfernt. Das insofern gereinigte Blut wird dem Patienten dann wieder über eine Vene zugeführt.
Ein erfindungsgemäßer Nukleinsäure/Kopplungsreagenz-Verbund kann ebenfalls zur Blutreinigung mit einer Dialysevorrichtung eingesetzt werden. Der Nukleinsäure/Kopplungsreagenz-Verbund wird dazu zunächst einem Patienten dargereicht, beispielsweise i. v. injiziert. Die Nukleinsäure bindet dann im Blut bzw. Plasma vorhandene Myeloma IgG Antikörper. Dabei ist im Übrigen vorteilhaft, dass durch die Bindung der Nukleinsäure an ein Kopplungsreagenz auch eine Stabilisierung der Nukleinsäure gegen enzymatischen Abbau, beispielsweise durch Nukleasen, erreicht werden kann, i. e. die biologische in vivo Halbwertzeit wird von wenigen Minuten auf 20 Minuten und mehr, bis zu Tagen, erhöht. Dann erfolgt eine Dialyse, wobei in der Abtrennkammer eine zum Kopplungsreagenz komplementäre Molekülspezies immobilisiert ist. Dann wird das Kopplungsreagent in der Abtrennkammer an diese Molekülspezies gebunden, wodruch letztendlich die Nukleinsäure und der daran gebundene Myeloma IgG Antikörper immobilisiert und dem Blutstrom entzogen wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung bzw. Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure entweder aus einer Nukleinsäurebibliothek isoliert und optional amplifiziert wird, oder wobei die Nukleinsäure synthetisiert und optional amplifiziert wird, und wobei die Nukleinsäure mit Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt oder hieran gebunden wird, welche in der Diagnostik oder der Pharmazie gebräuchlich sind.
In Hinblick auf Länder, in welchen therapeutische und diagnostische verfahren patentierbar sind, betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung des Plasmozyms, wobei einer an Plasmozym erkrankten Person eine physiologisch wirksame Dosis einer erfindungsgmäßen Zusammensetzung dargereicht wird, oder ein Verfahren zur Behandlung des Plasmozyms, wobei eine an Plasmozym erkrankte Person an eine erfindungsgemäße Dialysevorrichtung angeschlossen wird, wobei die Dialysevorrichtung in Betrieb genommen wird, wobei Myelom Antikörper, insbesondere Myelom IgG Antikörper an die Nukleinsäuren in der Abtrennkammer binden und so aus dem Blutstrom entfernt werden. Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung des Plasmozyms, wobei einer an Plasmozym erkrankten Person eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen Nukleinsäure-Kopplungsreagenz-Verbund dargereicht, beispielsweise injiziert, wird, wobei dann der Patient an eine Dialysevorrichtung angeschlossen wird, welche eine Abtrennkammer enthält, in der eine zum Kopplungsreagenz komplementäre Molekülspezies immobilisiert ist, wobei die Dialysevorrichtung in Betrieb genommen wird, und wobei Myelom Antikörper, insbesondere Myelom IgG Antikörper an die Nukleinsäuren im Körper des Patienten binden und der Verbund aus Nukleinsäure/Kopplungsreagenz-Verbund mit daran gebundenen Myelom Antikörper in der Abtrennkammer an die Molekülspezies bindet und so aus dem Blutstrom entfernt wird.
Zu diagnostischen Zwecken lassen sich erfindungsgemäße Nukleinsäuren in den verschiedensten ex-vivo Assay-Formaten zur Detektion von Myeloma Antikörpern einsetzen, wovon einige folgend beispielhaft erläutert werden.
Zunächst ist es möglich, alle fachüblichen direkten Assays einzusetzen. Hierbei ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure typischerweise an einer Festphase immobilisiert. Mit dieser Festphase wird dann eine Probe, potentiell enthaltend Myeloma Antikörper, beispielsweise eine Blut- oder Urinprobe, kontaktiert und inkubiert. Bindungsereignisse der Nukleinsäure mit Myeloma Antikörpern werden dann in fachüblicher Weise detektiert und angezeigt. Solcher verfahren lassen sich qualitativ (ja/nein-Signal), halb-quantitativ, oder quantitativ ausführen.
Möglicherweise genauer, insbesondere, wenn eine quantitative Bestimmung der Myeloma Antikörper gewünscht ist, bzw. empfindlicher sind kompetitive Verfahren, wovon einige Möglichkeiten folgend erläutert werden. Grundsätzlich sind aber auch alle anderen fachüblichen kompetitiven Verfahren einsetzbar.
Ein erstes kompetitives Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte: die Nukleinsäure wird in vorgegebener Menge durch Bindung an eine Festphase immobilisiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure wird mit einer Lösung, welche eine vorgegebene Menge an mit einer Detektorsubstanz verbundenen Myeloma Antikörpern enthält, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundenen Myeloma Antikörpern wird sodann einer Waschverfahrenstufe unterzogen, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundenen Detektorsubstanz-verbundenen Myeloma Antikörpern wird sodann mit einer Lösung, beispielsweise einer Blut- oder Urinprobe eines Patienten, potentiell enthaltend zu bestimmende Myeloma Antikörper für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, wobei die Detektorsubstanzverbundenen Myeloma Antikörper und die zu bestimmenden Myeloma Antikörper kompetitiv an die immobilisierte Nukleinsäure binden, entweder wird der Lösungsüberstand der Festphase mit Detektorsubstanz-verbundenen Myeloma Antikörpern entnommen, und die Myeloma Antikörper in dem Überstand werden qualitativ oder quantitativ bestimmt, oder die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundenen Detektorsubstanz-verbundenen Myeloma Antikörpern wird einer Waschverfahrenstufe unterzogen und die Detektorsubstanz der an die immobilisierte Nukleinsäure gebundenen Myeloma Antikörper wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. Dabei kann die Zunahme der Detektorsubstanz in der Lösung oder die Abnahme der Detektorsubstanz an der Festphase gemessen werden.
Eine nochmals andere Variante eines erfindungsgemäßen Assays umfasst die folgenden Verfahrensschritten: die Nukleinsäure wird in vorgegebener Menge durch Bindung an eine Festphase immobilisiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure wird mit einer Lösung, welche eine vorgegebene Menge an mit einer Detektorsubstanz verbundener Komplementärnukleinsäure enthält, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundener Komplementärnukleinsäure wird sodann einer Waschverfahrenstufe unterzogen, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundener Komplementärnukleinsäure wird sodann mit einer Lösung enthaltend zu bestimmende Myeloma Antikörper für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, wobei die Komplementärnukleinsäure und die zu bestimmenden Myeloma Antikörper kompetitiv an die immobilisierte Nukleinsäure binden, entweder wird der Lösungsüberstand der Festphase mit Komplementärnukleinsäure entnommen, und die Detektorsubstanz der Komplementärnukleinsäure in dem Überstand wird qualitativ oder quantitativ bestimmt, oder die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundener Komplementärnukleinsäure wird einer Waschverfahrenstufe unterzogen und die Detektorsubstanz der gebundenen Komplementärnukleinsäure wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. In dieser Variante erfolgt die kompetitive Bindung zwischen der Nukleinsäure einerseits und den Myeloma Antikörpern sowie der Komplementärnukleinsäure andererseits.
Ein weiteres kompetitives Verfahren zur Detektion von Myeloma Antikörpern umfasst die folgenden Verfahrensschritten: isolierte Myeloma Antikörper werden in vorgegebener Menge durch Bindung an eine Festphase immobilisiert, eine Lösung enthaltend die Nukleinsäure in vorgegebener Menge, welche mit einer Detektorsubstanz verbunden ist, wird mit einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe oder Urinprobe eines Patienten, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, wobei die Nukleinsäure an Myeloma Antikörper bindet, die Festphase mit immobilisierten Myeloma Antikörpern wird sodann mit der Lösung/Probe, kontaktiert, wobei die Nukleinsäure kompetitiv an zu bestimmende Myeloma Antikörper und an immobilisierte Myeloma Antikörper bindet, entweder wird die Festphase mit immobilisierten Myeloma Antikörpern und daran gebundener Nukleinsäure einer Waschverfahrensstufe unterzogen, und die Detektorsubstanz der an die immobilisierten Myeloma Antikörper gebundenen Nukleinsäure wird qualitativ oder quantitativ bestimmt, oder der Lösungsüberstand der Festphase mit Nukleinsäure wird optional entnommen und die Detektorsubstanz in dem Lösungsüberstand wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. Hierbei erfolgt der Nachweis der Myeloma Antikörper entweder durch die Abnahme der Detektorsubstanz in der Lösung oder durch die Zunahme der Detektorsubstanz, die an der Festphase über die Myeloma Antikörper und der daran gebundenen Nukleinsäure gebunden ist. In dieser Variante kann das Assay beispielsweise auch als Filter Assay bzw. Nitrocellulose Assay ausgebildet sein, wobei dann die Bindung der Myeloma Antikörper an die Festphase beispielsweise durch Biotinylierung der Myeloma Antikörper und Bindung an einen Streifen, beispielsweise auf Basis Nitrocellulose, gebundenes Neutravidin erfolgen kann. Dann kann die Detektorsubstanz beispielsweise durch über am 5'-Ende der Nukleinsäure gebundenes Biotin gekoppelte Meerrettichperoxidase (HRP) gebildet sein. Mittels eines Laufpuffers und mit Hilfe der Kapillarkräfte wird dann die Lösung mit der markierten Nukleinsäure in ein Testfeld des Streifens gezogen, in welchem die Myeloma Antikörper immobilisiert sind und wo zugleich 4-Chloro-1-naphthol bei Reaktion mit HRP farbig präzipitiert wird und die Anwesenheit der (an die an der Festphase gebundenen Myeloma Antikörper gebundenen) Detektorsubstanz anzeigt. Dabei wird es sich empfehlen, eine nur sehr geringe Menge an Nukleinsäure in die Lösung mit den zu bestimmenden freien Myeloma Antikörper zu geben, idealerweise eine Menge, die bei Einsatz einer Kontrolllösung ohne Myeloma Antikörper gerade noch eine erkennbare Färbung erzeugt. Dann ist gewährleistet, dass auch sehr kleine Konzentrationen der zu bestimmenden freien Myeloma Antikörper detektiert werden, da diese dann die Nukleinsäure binden, welche dann daher nicht für eine Bindung an die immobilisierten Myeloma Antikörper zur Verfügung steht und folglich keine Färbung erzeugt. Im Ergebnis zeigt eine Färbung die Abwesenheit der zu bestimmenden Myeloma Antikörper an, während eine ausbleibende Färbung die Anwesenheit der zu bestimmenden Myeloma Antikörper in der Probe anzeigt. Die vorstehenden Ausführungen lassen sich analog ohne weiteres auf die folgend erläuterten kompetitiven Verfahren übertragen. Die Zweckmäßigkeit eines Überschusses oder Unterschusses von Nulkeinsäure bzw. markierten Myeloma Antikörper in der Lösung für qualitative Bestimmung ergibt sich aus den jeweiligen Zusammenhängen, ohne dass dies der näheren Erläuterung bedarf. Im Falle quantitativer Bestimmungen ist die jeweils einzusetzende vorgegebene Menge an Nukleinsäure bzw. markierten Myeloma Antikörpern nach Maßgabe der jeweiligen Gleichgewichte für eine Paarung Myeloma Antikörper/Nukleinsäure (Aptamer) zu wählen, was unschwer mit einfachen Experimenten gelingt.
Grundsätzlich kann eine Markierung der Nukleinsäure beliebig erfolgen, sei es mit anderen Farbstoffsubstraten, sei es durch eine direkte Markierung, beispielsweise am 5'-Ende.
Eine Variante der vorstehend beschriebenen allgemeinen kompetitiven Ausführungsform weist die folgenden Verfahrensschritte auf: die Myeloma Antikörper werden in vorgegebener Menge durch Bindung an eine Festphase immobilisiert, die Festphase mit immobilisierten Myeloma Antikörpern wird mit einer Lösung, welche eine vorgegebene Menge an mit einer Detektorsubstanz verbundener Nukleinsäure enthält, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, die Festphase mit immobilisierten Myeloma Antikörpern und daran gebundener Nukleinsäure wird sodann einer Waschverfahrensstufe unterzogen, die Festphase mit immobilisierten Myeloma Antikörpern und daran gebundener Nukleinsäure wird sodann mit einer Lösung enthaltend zu bestimmende Myeloma Antikörper für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, wobei die zu bestimmenden Myeloma Antikörper und die immobilisierten Myeloma Antikörper kompetitiv an die Nukleinsäure binden, entweder wird die Festphase mit immobilisierten Myeloma Antikörpern und daran gebundener Nukleinsäure einer Waschverfahrensstufe unterzogen und die Detektorsubstanz der an die immobilisierten Myeloma Antikörper gebundenen Nukleinsäure wird qualitativ oder quantitativ bestimmt, oder der Lösungsüberstand der Festphase mit Nukleinsäure wird entnommen, und die Detektorsubstanz der Nukleinsäure in dem Überstand wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Variante ist gleichsam das Spiegelbild der vorstehenden Variante.
Die Festphase kann bei vorstehend beschriebenen Varianten ein optischer Leiter sein, wobei die Detektorsubstanz zur spontanen oder angeregten Emission von Licht befähigt ist, wobei die Bestimmung der Detektorsubstanz mittels eines mit einem Ende des optischen Leiters verbundenen optischen Sensor erfolgt. Auf diesem Wege lassen sich auf einfache Weise Sensoren herstellen, welche elektrische Signale nach Maßgabe einer qualitativen oder quantitativen Detektion erzeugen. Mittels solcher Sensoren können Handgeräte zur Anzeige von Myeloma Antikörpern hergestellt werden, wobei lediglich eine Probe in eine Probenöffnung eingegeben werden muss und die Anwesenheit, ggf. quantitativ, der Myeloma Antikörper auf einer Anzeigeeinheit angezeigt wird.
In einer weiteren Variante sind die folgenden Verfahrensschritte vorgesehen: die Nukleinsäure wird an einer negativen Elektrode einer elektrolytischen Zelle immobilisiert, die elektrolytische Zelle wird dann mit einer Lösung enthaltend die zu bestimmenden Myeloma Antikörper versetzt und zugleich wird an die negative Elektrode für eine definierte Dauer ein negatives Potantial, bezogen auf eine Gegenelektrode der elektrolytischen Zelle, gelegt, sodann wird der Gehalt an Wasserstoffperoxid in der Lösung der elektrolytischen Zelle bestimmt. Auf Grund der negativen Ladung an der negativen Elektrode werden bei Bindung zwischen Nukleinsäure und Myeloma Antikörpern kovalente Addukte Antikörper/Nukleinsäure unter der Bildung von Wasserstoffperoxid gebildet. Dies kann wiederum elektrisch/elektronisch detektiert werden, so dass auch in dieser Variante ein Sensor geschaffen ist.
Die Erfindung betrifft daher des Weiteren auch ein Testsystem zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. zur Detektion von Myeloma Antikörpern mit einer Festphase und/oder einer Lösung enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure. Die verschiedenen Varianten und weiteren Komponenten erfindungsgemäßer Testsysteme ergeben sich aus den vorstehenden Erläuterungen zu den erfindungsgemäßen Verfahren.
Schließlich betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1: 18 erfindungsgemäße Sequenzen sowie eine Konsensus-Sequenz,
2: 20 erfindungsgemäße Sequenzen,
3: Bindungskurven für erfindungsgemäße Nukleinsäuren,
4: Bindungskurven bei verschiedenen pH-Werten,
5: Darstellung der Bindungspezifität erfindungsgemäßer Nukleinsäuren,
6: Versuchsergebnisse zur Stabilität von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in humanem Serum,
7: Ergebnisse zur Trennwirkung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren in humanem Serum,
8: Prognostizierte Sekundärstruktur der trunkierten Nukleinsäure aus SEQ.-ID 3,
9: Zwei alternative G-Quadruplexe des Gegenstandes der 8,
10: CD-Spektren des Gegenstandes der 8, und
11: Untersuchungen der thermischen Denaturierung mit UV-Absorption am Gegenstand der 8.
In der 1 erkennt man als erste 18 Sequenzen Seq.-ID 1 bis 18 Sequenzen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, welche mit hoher Affinität und Spezifität an Myeloma Antikörper, speziell Myeloma IgG1 Antikörper binden. In 19. Sequenz (Seq.-ID 19) ist die Konsensus-Sequenz dargestellt. Die mit „N” bezeichneten Teilsequenzen am 5'- sowie 3'-Ende der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 19 sind für die Erfindung weniger relevant, da sie wahrscheinlich keine an Myeloma Antikörper bindenden Teilsequenzen enthalten. Daher sind diese Teilsequenzen mit hoher Wahrscheinlichkeit grundsätzlich beliebig in der Länge sowie in der Konstitution. In der 2 erkennt man weitere Beispiele erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, welche u. a. die vorstehend genannte Konsensus-Sequenz enthalten. Sie sind der der Reihenfolge der Darstellung folgend als Seq.-ID 20–39 bezeichnet.
In der 3 sind auf fachübliche Weise erhaltene Bindungskurven für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure (SEQ.-ID 3), sowie eine trunkierte Variante dieser Nukleinsäure (zur Sequenz siehe auch 8) an Myeloma Antikörper dargestellt. Myeloma Antikörper sind beispielsweise unter der Produktbezeichnung „Human Myeloma IgG1 kappa” und der Katalognummer A50183H von der Firma Biodesign & OEM Concepts of Meridian Life Science, Inc., USA, erhältlich. Es ergeben sich Dissoziationskonstanten von K_d = 172 nM für SEQ.-ID 3 sowie 372 nM für die trunkierte Variante, i. e. die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren binden mit sehr hoher Affinität an Myeloma IgG Antikörper. Dies zeigt aber auch, dass a und f in den Sequenzen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren sehr klein, hier jeweils 5, sein können, ohne dass eine drastische Verschlechterung der Bindungsstärke erfindungsgemäßer Nukleinsäuren eintritt.
In der 4 ist die pH-Abhängigkeit der Dissoziationskonstante für die Nukleinsäure gemäß SEQ.-ID 3 dargestellt. Es ergeben sich als Werte für K_d 172 nM, 290 nM und 602 nM bei pH 6,0, 6,6 und 7,2. Man erkennt, dass die hohe Affinität auch über einen relativ breiten pH Bereich gegeben ist.
In der 5 sind Ergebnisse einer Prüfung auf Spezifität der Nukleinsäure der 4 dargestellt. Es wurde die Bindung mit Myeloma IgG1 einerseits und mit anderen Antikörpern, wie in der Figur angegeben, andererseits untersucht. Man erkennt, dass die Nukleinsäure praktisch ausschließlich an die Target IgG1 Antikörper bindet, nicht jedoch an die anderen angegebenen Antikörper.
In der 6 ist der Zerfall einer Nukleinsäure gemäß 4 in humanem Serum in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt. Dabei bezeichnet „L” eine Standard 10 BP Leiter. Man erkennt, dass nach einer Stunde praktisch noch keine Fragmente der Nukleinsäure zu detektieren ist, während die Fragmentierung erst nach 6 Stunden anfängt signifikant zu werden. Dies bedeutet, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäure selbst ohne stabilisierende Moleküle an einem oder beiden Enden eine physiologische Halbwertszeit aufweist, welche beispielsweise für Dialysezwecke, mit welchen der vorstehend beschriebenen Verfahren auch immer, völlig ausreichend ist. Selbst für ein Therapeutikum mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, welche an ein körperfremdes Antigen gekoppelt ist, ist die in vivo physiologische Halbwertszeit selbst ohne Stabilisatoren ausreichend.
In der 7 ist schließlich gezeigt, dass die Nukleinsäure aus 4 in der Lage ist, Myeloma IgG1 Antikörper aus Serum abzufangen. Hierzu wurde die Nukleinsäure über Biotin an Agarose Beads gekoppelt und mit Serum kontaktiert. Die Spur L zeigt die Säulenbeladung, F ist Flow Through, W ist Waschen und E ist die Elutionsfraktionen. Anhand der vergleichsweise geringen Mengen an Antikörpern in den Spuren 2 und 3 (mit Nukleinsäure) gegenüber einem entsprechenden Experiment ohne Nukleinsäuren (Spuren 5 und 6) erkennt man, dass die Nukleinsäure die Antikörper bindet und aus dem Serum abtrennt. Dies wird auch durch die Spuren 7 (ohne Nukleinsäure) und 4 (mit Nukleinsäure) belegt, da in der Spur 4 höhere Mengen an zuvor gebundenen Antikörpern eluiert werden, als in Spur 7.
Die 8 zeigt eine prognostizierte Sekundärstruktur der trunkierten Nukleinsäure aus SEQ.-ID 3. Hierzu sind in der 9 zwei alternative G-Quadruplexe gezeigt, welche durch diese Nukleinsäure gebildet werden könnten. Die linke Darstellung gehört zur „Chair Type” und die rechte Darstellung zur „Basket Type” Struktur. Die 10 zeigt Circular Dichroism (CD) Spektren der Nukleinsäure der 8 in der Gegenwart von 0,1 M KCl, 0,1 M NaCl, oder ohne Salz. „Basket Type” Qaudruplexe haben eine CD Spektrum, worin ein positives Elliptizitätmaximum bei 295 nm und ein negatives Elliptizitätminimum bei 265 nm liegt. Demgegenüber liegt bei „Chair Type” das Maximum bei 264 nm und das Minimum bei 240 nm. Die beiden Maxima deuten an, dass diese Nukleinsäure in beide Formen gefaltet sein könnte. Die 11 zeigt UV thermische Denaturierungsuntersuchungen an der Nukleinsäure nach 8. Die Nukleinsäure wurde in PBS Puffer erhitzt und die Absorption wurde bei 295 nm (linke y-Achse, Kurve mit Maximum links) sowie 260 nm (rechte y-Achse, monoton ansteigende Kurve) gemessen. Die Abnahme der Absorption bei 295 nm in der Schmelzkurve ist ein Indiz für G-Quadrupex Dissoziation.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 2007/004748 A1 [0008]
- US 200//0009907 A1 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Nagel-Wolfrum, K., et al., Mol Cancer Res. 2(3): 170–182 (2004) [0009]
- Shangguan, D., et al., Clin Chem. 53(6): 1153–1155 (2007) [0009]

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung oder diagnostische Zusammensetzung enthaltend eine isolierte Nukleinsäure oder mehrere verschiedene isolierte Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz n_a-hwgg-n_b-t-n_c-gggggg-n_d-t-n_e-ggty-n_f, wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, b = 0–7, c = 0–2, d = 0 oder 1, e = 0–3 und f = 0–z, wobei z jeweils unabhängig voneinander eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei z = 0–200, insbesondere 10–100, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei b = 0, 1, 2, 3, 6 oder 7, und/oder e = 1, 2 oder 3 ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei n_b tt, taa, gt, tg, tc, ta, tgcatc, gcatgtc, a, ct, c, t, ca, oder kein Nukleotid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei n_c tt, t, tc, gc, cc, c, oder kein Nukleotid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei n_d c, g, t, oder kein Nukleotid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei n_e a, ttg, ct, g, atg, tt, oder kein Nukleotid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleinsäure eine der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID 1 bis 39 enthält oder hieraus besteht, wobei t durch u ersetzt sein kann.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und zur Darreichung an eine Person hergerichtet ist.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Plasmozyms, insbesondere des Plasmozyms mit Myelom IgG.
Immobilisat enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 23, welche an die Oberfläche einer festen Phase gebunden, insbesondere covalent gebunden, ist, oder einen Nukleinsäure/Kopplungsreagenz-Verbund mit einer solchen Nukleinsäure, welche an ein Kopplungsreagenz, insbesondere ein physiologisch verträgliches Kopplungsreagenz, gebunden ist.
Dialysevorrichtung mit einem arteriellen Entnahmeteil, mit einer Abtrennkammer, welche mit einem ersten Kammeranschluss mit dem arteriellen Entnahmeteil verbunden ist und ein Immobilisat nach Anspruch 11 enthält, und einem venösen Rückführungsteil, welches mit einem zweiten Kammeranschluss der Abtrennkammer verbunden ist, wobei optional eine Kreislaufpumpe zwischen der Abtrennkammer und dem arteriellen Entnahmeteil und/oder dem venösen Rückführungsteil zwischengeschaltet ist, deren Förderrichtung zum venösen Rückführungsteil weist.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure entweder aus einer Nukleinsäurebibliothek isoliert und optional amplifiziert wird, oder wobei die Nukleinsäure synthetisiert und optional amplifiziert wird, und wobei die Nukleinsäure mit Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt oder hieran gebunden wird, welche in der Diagnostik oder der Pharmazie gebräuchlich sind.
Verfahren zur Behandlung des Plasmozyms, wobei einer an Plasmozym erkrankten Person eine physiologisch wirksame Dosis einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 dargereicht wird.
Verfahren zur Behandlung des Plasmozyms, wobei eine an Plasmozym erkrankte Person an eine Dialysevorrichtung nach Anspruch 12 angeschlossen wird, wobei die Dialysevorrichtung in Betrieb genommen wird, wobei Myelom Antikörper, insbesondere Myelom IgG Antikörper an die Nukleinsäuren in der Abtrennkammer binden und aus dem Blutstrom entfernt werden.
Isolierte Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz n_a-hwgg-n_b-t-n_c-gggggg-n_d-t-n_e-ggty-n_f, wobei a = 0–z, b = 0–7, c = 0–2, d = 0 oder 1, e = 0–3 und f = 0–z, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann.
Nukleinsäure nach Anspruch 16, wobei z = 0–200, insbesondere 10–100,2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei z = 0–200, insbesondere 10–100, ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 16 oder 17, wobei b = 0, 1, 2, 3, 6 oder 7, und/oder e = 1, 2 oder 3 ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei n_b tt, taa, gt, tg, tc, ta, tgcatc, gcatgtc, a, ct, c, t, ca, oder kein Nukleotid ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei n_c tt, t, tc, gc, cc, c, oder kein Nukleotid ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei n_d c, g, t, oder kein Nukleotid ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei n_e a, ttg, ct, g, atg, tt, oder kein Nukleotid ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei die Nukleinsäure eine der Nukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID 1 bis 38 enthält oder hieraus besteht, wobei t durch u ersetzt sein kann.