KR20020048426A

KR20020048426A - ＴＧＦ-βⅡ형 수용체에 대한 인간 모노클로날항체 및그의 의약용도

Info

Publication number: KR20020048426A
Application number: KR1020027005900A
Authority: KR
Inventors: 사카모토신지; 가마다마사후미
Original assignee: 미즈노 마사루; 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2002-06-22
Also published as: ES2313908T3; US7579186B1; JP2001206899A; AU1415801A; EP1245676B1; AU2005200044B2; EP1245676A1; AU2005200044A1; EP1245676A4; DE60040301D1; ATE408628T1; AU779871B2; CA2389862A1; WO2001036642A1; KR100548761B1

Abstract

유전자 공학기술을 사용하여 제작한 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스에 가용성 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 면역함으로써, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여, 인간 TGF-β 시그날의 세포내로의 전달을 저해하는 여러 인간 모노클로날항체를 얻었다. 더욱이, 인간 모노클로날항체가, 인간 TGF-β의 작용에 의해 야기되는 여러 장기에서의 조직 섬유증 등의 여러 질환의 예방 및 치료에 유효한 것을 발견했다.

Description

ＴＧＦ-βⅡ형 수용체에 대한 인간 모노클로날항체 및 그의 의약용도{Human monoclonal antibodies against TGF-βⅡ receptor and medicinal use thereof}

기술분야

본 발명은, 인간 트랜스포밍 성장인자-β(Transforming Growth Factor-β;TGF-β)의 Ⅱ형 수용체(이하 「TGF-βⅡ형 수용체」 또는 「TβRⅡ」라고 부르는 경우도 있다.)에 결합하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부, 상기 인간 모노클로날항체를 생산하는 세포, 상기 인간 모노클로날항체를 포함하여 된 의약조성물, 상기 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 시그날전달을 억제 또는 저해하는 물질(예를 들면, 상기 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 항체 또는 화학합성 저분자화합물 등)을 포함하여 된 의약조성물에 관한 것이다.

배경기술

정상 래트의 섬유아세포(fibroblast cells)의 증식인자의 탐색에 있어서, 정상세포의 형질전환을 촉진하는 분자로서 발견된 2개의 증식인자는, 트랜스포밍 성장인자-α(Transforming Growth Factor-α;TGF-α)와 트랜스포밍 성장인자-β(Transforming Growh Factor-β;TGF-β)라고 명명되었다. 그 후의 연구에 의해, TGF-α는 상피 증식인자(Epidermal Growth Factor; EGF) 패밀리에 속하는분자이고, 한편, TGF-β는 대부분의 종류의 세포에서 생산되고, 그 수용체도 각 장기 및 세포에서 널리 발현되고 있다(Biol. Signals., Vol.5, p,232, 1996 및 Pulmonary Fibrosis, Vol.80 of Lung Biology in Health and Disease Series, ed. by Phan et al, p.627, Dekker, New York, 1995).

TGF-β는 세포의 분화 및 증식을 제어하는 활성을 갖는다. TGF-β의 세포증식활성은, 세포의 종류에 따라 크게 다르다(Roberts et al, The transforming growth factor-βs, In Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p.419-472). 예를 들면, 섬유아세포나 혈관평활근세포 등의 간엽계 세포에 대해서는 세포증식을 촉진하는 활성을 갖는 한편으로, 상피세포, 혈관내피세포 및 혈구계 세포 등의 다종 세포에 대해서는 증식촉진 보다도 오히려 증식을 억제하는 인자로서 작용하는 것이 명백해졌다. 더욱이, TGF-β는 세포증식의 제어 뿐 아니라, 면역계의 제어나 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 및 테나신(tenascin) 등의 세포외 매트릭스(ECM; Extracellular Matrix)의 축적촉진 등의 다채로운 기능을 갖는 것이 명백해졌다(Adv. Immunol., Vol.55, p.181, 1994 및 Seminars in Cell Biol., Vol.5, p.389, 1994).

최근 들어, TGF-β의 이러한 다채로운 기능의 메커니즘이, TGF-β수용체의 구조와 시그날전달의 특유성에 유래하는 것이 명백해지고 있다.

TGF-β는, 분자량 약 25 kD의 단백질로, 2가닥의 펩티드로 다이머를 구성한다. TGF-β에는 5개의 아이소폼(isoform)이 존재하고, 포유동물에서는 TGF-β1,TGF-β2 및 TGF-β3이 있으며, 닭에서는 TGF-β4가, 또 개구리에서는 TGF-β5가 존재한다. 이들 아이소폼은 서로 약 70%의 상동성을 갖는다.

TGF-β 중 TGF-β1에 대해서는, 특히 그 기능이 해석되어 있다. TGF-β1은, 생체조직에 있어서의 창상의 치유과정에 있어서 지극히 중요한 역할을 한다(New Engl. J. Med., Vol.331, p.1286, 1994 및 J. Cell. Biol., Vol.119, p.1017, 1992). 조직의 창상부위에서는, 염증세포나 섬유아세포의 침윤, ECM의 증생과 혈관신생 및 조직재생을 위한 세포증식 등의 신속하고 또는 다이나믹한 생체반응이 일어나 상처가 수복된다.

창상시에는 먼저 출혈이 일어나고, 이어서 혈소판으로부터 TGF-β나 PDGF(platelet-derived growth factor)가 생산되는 동시에, 창상부위의 ECM에 결합하고 있는 불활성형 TGF-β를 활성화시킨다. 유주해 온 세포나 창상부위의 세포는, 그와 같이 생산된 고농도 TGF-β에 노출시킴으로써, FGF(fibroblast growth factor), TNF(Tumor necrosis factor) 및 IL-1(Interleukin-1) 등의 증식인자나 사이토카인을 분비하고, 또한 섬유아세포에서는 ECM의 합성 및 분비가 일어난다.

더욱이, 예를 들면, 섬유아세포나 간엽세포에서는, 혈소판 유래 증식인자(Platelet-derived Growth Factor (PDGF))나 결합조직 성장인자(Connective Tissue Growth Factor (CTGF);Hcs24라고도 부른다. J. Cell Biology, Vol.114, No.6, p.1285-1294, 1991;Int. J. Biochem. Cell Biol., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997;Circulation, Vol.95, No.4, p.831-839, 1997; Cell Growth Differ., Vol.7, No.4, p.469-480, 1996;J. Invest. Dermatol.,Vol.106, No.4, p.729-733, 1996;J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.2, p.280-284, 1995;J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.1, p.128-132, 1995; 및 국제특허출원공개 WO96/38172호 공보)나 피브로넥틴(fibronectin) 생산의 증가가 관찰된다.

TGF-β1은 더욱이 단백질 분해효소의 생산을 억제하는 한편으로, 그 효소저해제를 증가시키는 동시에, ECM의 세포로의 접착에 관여하는 인테그린(integrin)의 합성을 촉진하여 ECM의 증생과 침착을 조장하여, 창상의 수복을 행하는 것으로 생각되고 있다. 이 밖에, TGF-β는, T 림프구 및 B 림프구의 기능을 억제하여, TNF나 IL-1의 합성을 저해하는 것에 의한 면역억제작용도 갖는다.

TGF-β 발현제어의 메커니즘은 아직 해명되지 않은 부분도 있지만, TGF-β가 ECM인 프로테오글리칸에 결합함으로써 그 발현이 제어되는 것으로 생각되고 있다(Nature, Vol.346, p.281, 1990 및 Nature, Vol.360, p.361, 1992). 즉, TGF-β가 TGF-β자신이 생산 촉진한 ECM에 의해 음성 제어를 받아, 창상의 치유와 함께 TGF-β의 과잉발현이 억제되는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 이 음성 제어에 이상이 생기면 TGF-β의 과잉발현이 일어나 조직의 섬유화(섬유증) (fibrosing(fibrosis)) 등의 병적 상태가 일어나는 것으로 생각되고 있다.

한편, 폐섬유증(pulmonary fibrosis)이나 신장경화증(nephrosclerosis)에 있어서는, ECM의 침착이 충분히 일어나고 있음에도 불구하고, TGF-β는 고농도로 유지되고 있어, 그러한 섬유증 등의 병적 상태가 더욱이 진행된다(Kidney Int., Vol.45, p.916, 1994 및 J. Clin. Invest., Vol.92, p.632, 1993). 폐섬유증이나 신장경화증에서는, 조직의 상해가 끊임없이 일어남으로써 TGF-β의 발현의 시그날이 항상 ON의 상태이거나, 상술한 바와 같은 TGF-β발현의 음성 제어 시그날이 들어가지 않거나, 또는 그 양자가 상승적으로 작용하는 것으로 추찰되고 있다.

신장경화증은, 만성 사구체신염(chronic glomerulonephritis)이나 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy) 등의 많은 신장질환의 최종상(terminal state)으로, 메산기움세포의 증식과 ECM의 증생에 의해 특징지어진다. 신장경화증의 신장에 있어서는, TGF-β의 이상발현이 인정되어 왔다(J. Clin. Invest., Vol.90, p.1, 1992 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.86, p.1056, 1989). 또 항Thy-1 항체에 의해 유발되는 실험적 신장염모델에 있어서는, 항TGF-β항체의 투여에 의해 신장염의 진행이 억제되는 것이 나타내어져 TGF-β가 신장경화증의 병태형성에 관여하는 것이 시사되어 오고 있다(Nature, Vol.346, p.371, 1990).

한편, 폐에 대해서는, 블레오마이신(bleomycin) 투여에 의해 유도되는 폐섬유증이나 돌발성 폐섬유증에서는, TGF-β가 고농도로 발현하고 있어, TGF-β의 폐섬유증의 형성에 관여하는 것이 시사되어 오고 있다.

또한, 만성 간염이나 간경변 환자의 생검조직에 있어서는, 콜라겐의 침착부위에 TGF-β의 발현이 인정되고 있다. 이 밖에, 혈관재협착, 류머치즘성관절염(rheumatoid arthritis) 등의 관절염 및 피부의 켈로이드(keloid) 등에 있어서도 ECM의 침착과 TGF-β의 발현이 보고되어 오고 있다.

이러한 사실로부터, TGF-β가 여러 조직의 섬유화(섬유증)의 병태형성에 관여할 가능성이 시사되어 오고 있어, 안티센스의약이나 유전자치료 등에 의해 TGF-β의 기능을 억제함으로써 조직섬유증 치료의 시도가 계속해서 실험적으로 이루어지고 있다(Kidney Int., Vol.50, p.148, 1996).

상술한 TGF-β의 여러 기능발현 및 TGF-β에 의한 조직섬유증 등의 여러 병태의 형성은, TGF-β가 TGF-β수용체에 결합함으로써 세포내에 시그날이 전달됨으로써 개시된다.

인간 및 래트 등의 포유동물에 있어서의 TGF-β의 수용체로서는, 지금까지 I형 수용체(분자량 약 53 kD; GenBank Accession No:L11695; Cell, Vol.75, No.4, p.681, 1993; 이하 「TGF-βⅠ형 수용체」(TGF-βType Ⅰ recptor) 또는 「TβRⅠ」라고 부르는 경우도 있다.), Ⅱ형 수용체(분자량 약 70 kD; GenBank Accession No:M85079; Cell, Vol.68, No.4, p.775, 1992; 이하 「TGF-βⅡ형 수용체」(TGF-βType Ⅱ recptor) 또는 「TβRⅡ」라고 부르는 경우도 있다.) 및 Ⅲ형 수용체(분자량 약 200-300 kD; GenBank Accession No:L07594; Cell, Vol.67, No.4, p.785, 1991; Cell, Vol.67, No.4, p.797, 1991; 및 Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.189, Nol.1, p.356, 1992; 이하 「TGF-βⅢ형 수용체」(TGF-βType Ⅲ recptor) 또는 「TβRⅢ」라고 부르는 경우도 있다.)의 3개의 수용체가 동정되어 구조가 명백해져 있다(Adv. Imm., Vol.55, p.181, 1994).

그들 수용체의 역할에 대해서는, 인위적으로 수립된 TGF-β에 저항성인 밍크폐 상피세포주 Mv1Lu의 변이주를 사용하여 그들 수용체의 기능해석에 의해, 그들 3개의 수용체 중 TGF-βⅠ형 수용체와 TGF-βⅡ형 수용체가 TGF-β의 시그날전달에 중요하고 필수인 것이 명백해져 있다(J. Biol. Chem., Vol.265, p.18518, 1990 및 J. Biol. Chem., Vol.266, p.9108, 1991). 한편, TGF-βⅢ형 수용체는, TGF-β의시그날전달에는 필수가 아니라, 간접적인 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다.

TGF-βⅢ형 수용체는, 849개의 아미노산으로 된 세포막관통 단백질로, 세포외영역(761개의 아미노산), 세포막관통영역(24개의 아미노산) 및 세포내영역(43개의 아미노산)으로 구성된다. TGF-βⅢ형 수용체의 세포내영역은, 세린(Ser)/트레오닌(Thr)잔기가 풍부하고, 40% 이상을 점유한다.

TGF-βⅠ형 수용체는, 503개의 아미노산으로 된 세포막관통 단백질로, 세포외영역(101개의 아미노산), 세포막관통영역(22개의 아미노산) 및 세포내영역(356개의 아미노산)으로 구성된다.

TGF-βⅡ형 수용체는, 마찬가지로 567개의 아미노산으로 된 세포막관통 단백질로, 시그날서열(23개의 아미노산), 세포외영역(136개의 아미노산), 세포막관통영역(30개의 아미노산) 및 세포내영역(378개의 아미노산)으로 구성된다.

TGF-βⅠ형 수용체 및 TGF-βⅡ형 수용체는, 세포외영역이 비교적 짧고, 두군데의 키나아제 삽입부위를 갖는 세린/트레오닌 키나아제 구조를 갖는 1회 막관통형 단백질이다. 또한, 세포내영역에는 아스파라긴산(Asp) 결합형 당쇄가 결합하여, 시스테인(Cys)잔기가 TGF-βⅠ형 수용체에는 10개 및 TGF-βⅡ형 수용체에는 12개 보여, 특징적인 단백질 3차구조를 취하고 있다.

TGF-βⅠ형 수용체의 세포내영역에는, 키나아제영역에 인접하여 GS영역이라 불리는 글리신(Gly), 세린(Ser) 및 트레오닌(Thr)이 풍부한 영역이 보인다. TGF-βⅡ형 수용체도 TGF-βⅠ형 수용체와 닮은 구조이지만, GS영역은 갖지 않는다.

TGF-βⅠ형 수용체 및 TGF-βⅡ형 수용체의 키나아제영역은, 약 43%의 상동성을 가지고, 동시에 세린/트레오닌에 특이적인 프로틴 키나아제인 것이 나타내어져 있지만, TGF-β의 시그날이 세포내에 전달되기 위해서는, 양자의 세린/트레오닌 키나아제영역이 작용하는 것이 필요하다는 것이 명백해져 있다(J. Biol. Chem., Vol.269, p.30753, 1994).

TGF-β의 시그날 세포내로의 전달에는, TGF-βⅠ형 수용체와 TGF-βⅡ형 수용체가 필수이다. TGF-βⅡ형 수용체는 단독으로 TGF-β와 결합하지만, TGF-βⅠ형 수용체 단독으로는 TGF-β에 결합하지 않는다. TGF-β의 시그날의 세포내로의 전달에는, TGF-βⅠ형 수용체 및 TGF-βⅡ형 수용체의 양자가 세포표면에서 복합체를 형성하는 것이 중요하다.

TGF-β가 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하면, TGF-βⅡ형 수용체는 TGF-βⅠ형 수용체와 세포표면에서 헤테로 4량체의 복합체를 형성하는 것이 나타내어져 있다(J. Biol. Chem., Vol.269, p.20172, 1994). 즉, TGF-βⅠ형 수용체는, TGF-βⅡ형 수용체의 기질로서 작용하고, TGF-β의 존재하에 양자가 복합체를 형성하면, TGF-βⅡ형 수용체가 TGF-βⅠ형 수용체의 GS영역을 인산화함으로써 TGF-βⅠ형 수용체가 활성화되어, 그 결과 세포내의 다른 기질을 인산화함으로써 TGF-β의 시그날이 더욱이 하류로 전달되는 것으로 생각되고 있다(Nature, Vol.370, p.341, 1994).

TGF-β의 시그날의 TGF-βⅠ형 수용체로부터 하류로의 전달 경로의 상세에 대해서는 아직 불명확한 점도 남아 있지만, 최근 들어 TGF-βⅠ형 수용체로부터 하류에 위치하여 TGF-β의 시그날전달을 매개하는 8개의 아이소폼으로 되어 Smad(SMothers against Dpp)로 총칭되는 시그날전달분자(Nature, Vol.381, p.620, 1996; Cell, Vol.86, p.543, p.1996; Nature, 383, p.168, 1996; 및 Nature, Vol.383, p.832, 1996), 및 TAK1(TGF-β activated kinase-1)로 불리는 시그날전달분자(Science, Vol.270, p.2008, 1995)가 동정되어 있다. Smad 및 Smad3은, TGF-βⅡ형 수용체와 복합체를 형성함으로써 활성화된 TGF-βⅠ형 수용체에 결합하여, TGF-βⅡ형 수용체의 키나아제로 인산화된 후, TGF-βⅡ형 수용체로부터 떨어져, Smad4(DPC4)와 복합체를 형성한 후 핵내에 이행하는 것이 명백해져 있다(Cell, Vol.87, p.1215, 1996 및 EMBO J., Vol.16, No.17, 1997). 핵내에 이행한 Smad2/Smad4 또는 Smad3/Smad4 복합체는, DNA 결합단백질(전사인자)과 결합하여 전사활성인자로서 작용하여 유전자의 발현을 제어하는 것으로 생각되고 있다(Nature, Vol.383, p.832, 1996 및 Nature, Vol.390, p.465, 1997).

TAK1은, MAP 키나아제 캐스케이드상에서 MAPKKK로서 작용함으로써 TGF-β의 시그날전달에 관여하는 것이 나타내어져 있다.

상술한 바와 같이, TGF-β는, 신장경화증, 폐섬유증이나 간경변 등의 여러 조직섬유증, 더욱이 만성 간염, 류머치즘성관절염, 혈관재협착 및 피부의 켈로이드 등의 여러 병태의 형성에 깊게 관여하고 있어, 이들 병태의 형성은, TGF-β의 시그날이 TGF-β수용체를 매개로 하여 세포내에 전달됨으로써 일어나는 것으로 생각된다.

따라서, TGF-β 시그날의 세포내로의 전달을 제어, 특히 억제함으로써, 그들의 병태를 치료 또는 예방할 수 있을 가능성이 시사된다.

TGF-β의 시그날전달의 억제에 의한 그들 병태의 치료의 시도에 대해서는, TGF-β를 타겟으로 하여, TGF-β에 대한 항체 또는 TGF-β유전자에 대한 안티센스를 사용하여 TGF-β의 기능을 억제함으로써 신장염 등의 병태를 억제하려고 하는 시도가 행해지고 있다.

그러나, TGF-β결합의 상대쪽인 TGF-β수용체, 특히 TGF-βⅡ형 수용체의 기능의 억제, 환언하면 TGF-βⅡ형 수용체를 타겟으로 하여, TGF-βⅡ형 수용체를 매개로 한 TGF-β의 세포내로의 시그날전달을 저해하는 것에 의한 질환의 치료에 대해서는, 아직 전혀 보고되어 있지 않다.

더욱이, TGF-βⅡ형 수용체에 대한 항체에 의해 TGF-βⅡ형 수용체를 매개로 한 TGF-β의 시그날전달을 저해하는 질환치료의 어프로치에 대해서는 전혀 보고되어 있지 않다.

인간 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 항체에 대해서는, 토끼나 염소 등의 비인간 포유동물 유래의 폴리클로날항체가 보고되어 있는 것에 지나지 않아, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 모노클로날항체는 물론, 인간 유래의 모노클로날항체의 제작 및 상기 인간 모노클로날항체를 사용한 여러 질환의 치료의 시도에 대해서는, 아직 전혀 보고되어 있지 않다.

발명의 개시

TGF-β는, 여러 질환증상, 예를 들면, 신장경화증, 폐섬유증이나 간경변 등의 여러 조직섬유증, 더욱이 만성간염, 류머치즘성관절염, 혈관재협착 및 피부의켈로이드 등의 발증에 깊게 관여할 가능성이 시사되고 있다.

TGF-β의 기능의 발현은, TGF-β가 TGF-βⅡ형 수용체에 결합함으로써 TGF-β의 시그날이 세포내에 전달됨으로써 달성되는 것으로부터, TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 물질, 예를 들면 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 항체 등을 사용하여 TGF-βⅡ형 수용체를 매개로 한 TGF-β의 시그날전달을 억제함으로써, 그들의 병태를 치료 또는 예방할 수 있는 것으로 생각할 수 있다.

즉, 본 발명은, 상술한 바와 같은 조직섬유증 등의 여러 질환의 치료에 지극히 유용한 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 모노클로날항체, 특히 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 인간 모노클로날항체 및 상기 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질(예를 들면, 상기의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 모노클로날항체나 화학합성 저분자화합물 등)을 사용하는 여러 질환(예를 들면, 여러 신장질환(예를 들면, 신장염, 신장섬유증, 신장경화증 등), 신장섬유증이나 폐섬유증 등의 여러 조직섬유증, 간경변, 류머치즘성관절염, 피부켈로이드 등)을 치료하기 위한 의약조성물 및 그 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자 등은, 상술한 목적을 달성하기 위해, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 대한 인간 모노클로날항체에 관하여 예의 연구한 결과, 유전자 재조합기술을 사용하여 인간의 항체를 생산하기 위해 제작한 트랜스제닉 마우스를 가용성 재조합 인간 TGF-βⅡ형 수용체에서 면역함으로써, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 여러 인간 모노클로날항체, 특히는 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여, 인간 TGF-β의세포내로의 시그날전달을 저해하는 여러 모노클로날항체를 제작하는 것에 세계에 앞서 처음으로 성공했다.

더욱이, 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체에 대표되는 상기 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 물질(다른 예로서는, 화학합성 저분자화합물이나 안티센스핵산 등)이, 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 매개로 하는 인간 TGF-β의 세포내로의 시그날전달을 유의하게 저해할 뿐 아니라, 여러 질환(예를 들면, 신장질환(예를 들면, 신장염, 신장섬유증, 신장경화증 등), 신장섬유증 및 폐섬유증 등의 여러 조직섬유증, 간경변, 류머치즘성관절염, 피부켈로이드 등)의 치료효과를 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 모노클로날항체는, 인간에 유래하는 항체인 것으로부터, 마우스 유래의 항체 등의 비인간 포유동물 유래의 항체로 된 항체의약품 치료상의 커다란 문제점(부작용)이었던 인간에 대한 항원성, 즉 HAMA(Human anti-mouse antigenicity)에 기인하는 숙주의 중독한 면역거절반응을 전혀 야기하지 않는 것으로부터, 항체의 의약품으로서의 가치를 극적으로 증대시키는 것이다.

더욱이, 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체에 대표되는 상기 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 물질(다른 예로서는, 화학합성 저분자화합물이나 동식물, 세균, 미생물 등으로부터 단리되는 화합물 등) 및 상기 물질을 포함하여 된 의약조성물은, TGF-β의 작용에 기인하는 여러 질환, 예를 들면, 신장질환(신장섬유증, 신장염, 신부전, 신장경화증 등), 폐질환(예를 들면, 폐섬유증,폐렴 등), 간장질환(예를 들면, 간장조직섬유증, 간경변, 간염 등), 피부질환(예를 들면, 창상, 강피증(scleroderma), 건선, 켈로이드 등), 관절염(예를 들면, 만성 류머치즘성관절염, 변형성 관절증 등), 혈관질환(예를 들면, 혈관재협착, 류마치성 혈관염 등), 여러 장기에서의 조직섬유증(여러 암에서 병발하는 조직섬유증을 포함한다) 및 동맥경화증(병발하는 조직섬유증을 포함한다) 등의 발증 및/또는 진행을 억제, 저지하여, 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약품으로서 유용하다.

즉, 본 발명의 하기 (1) 내지 (24)에 기재되는 바와 같은 발명이다.

(1) 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 인간 TGF-β가 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합함으로써 생기는 시그날의 세포내로의 전달을 저해하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(3) 상기 (1)에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 하기의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부:

(a) 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427)의 세포증식을 억제한다;

(b) 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 폐암세포주 A549(ATCC CCL-185)의 세포증식억제를 억제한다; 또는

(c) 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427)에 의한 피브로넥틴 또는 결합조직 성장인자의 생산을 억제한다.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 인간항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 비인간 포유동물에 유래하는 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(5) 상기 (4)에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 발현하는 세포 또는 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 전부 또는 일부를, 인간항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 비인간 포유동물에 면역함으로써 얻어지는 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(6) 상기 (4) 또는 (5)에 있어서, 상기 트랜스제닉 비인간 포유동물이, 트랜스제닉 마우스인 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄가변영역(heavy chain variable region)을 코드하는 V영역의 DNA가, DP-54(3-07), DP-73(5-51) 및 DP-77(3-21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(8) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 경쇄가변영역(light chain variable region)을 코드하는 V영역의 DNA가, A30, DPK-15(A19), DPK-24(B-3) 및 DPK-28(A18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄가변영역을 코드하는 V영역의 DNA가, DP-54(3-07), DP-73(5-51) 및 DP-77(3-21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하고, 또한 상기 인간 모노클로날항체의 경쇄가변영역을 코드하는 V영역의 DNA가, A30, DPK-15(A19), DPK-24(B-3) 및 DPK-28(A18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.

(10) 상기 (1)에 있어서, 상기 인간 모노클로날의 중쇄가변영역이, 하기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나의 아미노산서열을 포함하는 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부:

(a) 서열번호 4에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열;

(b) 서열번호 4에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(c) 서열번호 6에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 2 내지 98번째의 아미노산서열;

(d) 서열번호 6에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 2 내지 98번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(e) 서열번호 8에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열;

(f) 서열번호 8에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(g) 서열번호 10에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열; 또는

(h) 서열번호 10에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열.

(11) 상기 (1)에 있어서, 상기 인간모노클로날의 경쇄가변영역이, 하기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나의 아미노산서열을 포함하는 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부:

(a) 서열번호 12에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 23 내지 117번째의 아미노산서열;

(b) 서열번호 12에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 23 내지 117번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(c) 서열번호 14에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열;

(d) 서열번호 14에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(e) 서열번호 16에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 22 내지 120번째의 아미노산서열;

(f) 서열번호 16에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 22 내지 120번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(g) 서열번호 18에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 18 내지 113번째의 아미노산서열; 또는

(h) 서열번호 18에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 18 내지 113번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열.

(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 모노클로날항체를 생산하는 세포.

(13) 상기 (12)에 있어서, 상기 세포가, 상기 인간 모노클로날항체를 생산하는 능력을 포유동물 유래의 B세포와 포유동물 유래의 미엘로마세포를 융합하여 얻어지는 융합세포인 것을 특징으로 하는 세포.

(14) 상기 (12)에 있어서, 상기 세포가, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄를 코드하는 DNA 또는 그의 경쇄를 코드하는 DNA 중 어느 한쪽의 DNA, 또는 양쪽의DNA가 세포내에 도입됨으로써 형질전환된 유전자 재조합 세포인 것을 특징으로 하는 세포.

(15) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물.

(16) 상기 (15)에 있어서, 상기 의약조성물이, 인간 TGF-β가 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합함으로써 생기는 시그날의 세포내로의 전달을 저해하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(17) 조직의 섬유화를 억제하기 위한 의약조성물로서, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(18) 상기 (17)에 있어서, 상기 물질이, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부인 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(19) 상기 (17) 또는 (18)에 있어서, 상기 조직의 섬유화가, 폐, 간장, 신장 또는 피부에 있어서의 섬유화인 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(20) 상기 (19)에 있어서, 상기 조직의 섬유화가, 신장에 있어서의 섬유화인 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(21) 신장질환의 치료 또는 예방에 사용되는 의약조성물로서, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여된 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(22) 상기 (17)에 있어서, 상기 물질이, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부인 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(23) 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물로서, 상기 의약조성물이, 신장경화증, 폐섬유증, 간경변, 혈관재협착, 동맥경화증, 건선, 강피증, 아토피, 켈로이드 또는 관절염을 억제 또는 치료하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.

(24) 상기 (17)에 있어서, 상기 물질이, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부인 것을 특징으로 하는 의약조성물.

이하, 본 발명에서 사용하는 어구의 의미를 명확하게 함으로써, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서의 「포유동물」로서는, 인간, 소, 염소, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터 및 모르모트 등을 의미하고, 바람직하게는 인간, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마우스이고, 특히 바람직하게는 인간, 래트, 햄스터 또는 마우스이다.

본 발명에서 사용되는 「인간 이외의 포유동물」 및 「비인간 포유동물」이라는 용어는 각각 동일한 뜻으로, 앞에서 정의한 포유동물에 있어서의 인간 이외의 모든 포유동물을 의미한다.

본 발명에 있어서 사용되는 「아미노산」이란, 자연계에 존재하는 모든 아미노산을 의미하고, 바람직하게는, 아미노산을 표기하기 위해 사용되는 알파벳의 3문자 표기법 또는 1문자 표기법에 따라 각각 아래와 같이 표시되는 아미노산을 의미한다.

글리신(Gly/G), 알라닌(Ala/A), 발린(Val/V), 류신(Leu/L), 이소류신(Ile/I), 세린(Ser/S), 트레오닌(Thr/T), 아스파라긴산(Asp/D), 글루타민산(Glu/E), 아스파라긴(Asn/N), 글루타민(Gln/Q), 리신(Lys/K), 아르기닌(Arg/R), 시스테인(Cys/C), 메티오닌(Met/M), 페닐알라닌(Phe/F), 티로신(Tyr/Y), 트립토판 (Trp/W), 히스티딘(His/H), 프롤린(Pro/P).

본 발명에서 말하는 「인간 TGF-βⅡ형 수용체」(「TβRⅡ」라고 칭하는 경우도 있다.)란, 앞서 기술한 바와 같은 기보에 보고되는 구조 및 기능을 갖는 인간의 TGF-βⅡ형 수용체(human TGF-βtype Ⅱ receptor)를 의미한다(예를 들면, Cell, Vol.68, No.4, p.775-785, 1992; Adv. Immunol., Vol.55, p.181-220, 1994; GenBank Accession No.:M85079).

상기 천연형 인간 TGF-βⅡ형 수용체는, 아래와 같은 구조적 특징 및 성질을 갖는다.

인간 TGF-βⅡ형 수용체는, 567개의 아미노산으로 된 세포막관통 단백질로서, 세포외영역(136개의 아미노산), 세포막관통영역(30개의 아미노산) 및 세포내영역(378개의 아미노산)으로 구성된다. 또한, TGF-βⅡ형 수용체는, 세포외영역이 비교적 짧아, 두군데의 키나아제 삽입부위를 갖는 세린/트레오닌 키나아제구조를 갖는 1회 막관통형 단백질이다. 또한, 세포내영역에는 아스파라긴산(Asp)결합형 당쇄가 결합하는 동시에, 시스테인(Cys)잔기가 12개 보여, 특징적인 단백질 3차 구조를취하고 있다.

TGF-βⅡ형 수용체의 키나아제영역은, 세린/트레오닌에 특이적인 프로틴키나아제로서, TGF-βⅠ형 수용체의 키나아제영역과 약 43%의 상동성을 갖는다. 이 키나아제영역은, TGF-β의 시그날이 세포내에 전달되기 위해 필수이다(J. Biol. Chem., Vol.269, p.30753, 1994).

TGF-βⅡ형 수용체는, TGF-βⅠ형 수용체와 공동으로 TGF-β의 시그날의 세포내로 전달하는 지극히 중요한 분자이다. TGF-βⅡ형 수용체는 단독으로 TGF-β와 결합한다. TGF-β가 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하면, TGF-βⅡ형 수용체는 TGF-βⅠ형 수용체와 세포표면에서 헤테로 4량체의 복합체를 형성하는 것이 나타내어져 있다(J. Biol. Chem., Vol.269, p.20172, 1994). TGF-β의 존재하에 양자의 상기 복합체가 형성되면, TGF-βⅡ형 수용체는, TGF-βⅠ형 수용체의 GS영역(상술)을 인산화하여 TGF-βⅠ형 수용체가 활성화한다. 그 결과 세포내의 다른 기질을 인산화함으로써 TGF-β의 시그날이 더욱 하류로 전달되는 것으로 생각되고 있다(Nature, Vol.370, p.341, 1994).

또한, 본 발명에서 말하는 「인간 TGF-βⅡ형 수용체」(「TβRⅡ」라고도 부른다.)에는, 상술한 기보에 기재되는 천연형 단백질 1차구조(아미노산서열)의 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 천연형 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 변이체도 포함한다.

여기에서 「실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 천연형 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 변이체」란 아래 변이단백질을 의미한다.

즉, 천연형의 인간 TGF-βⅡ형 수용체와 실질적으로 동등한 생물학적 성질을 갖는 한, 상기 아미노산서열 중의 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 수식되어 있는 아미노산서열을 갖는 변이단백질 및 천연형 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 아미노산서열 중에, 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 부가된 아미노산서열을 갖는 변이단백질이다.

더욱이, 그러한 치환, 결실, 수식 및 부가의 복수를 갖는 변이체이더라도 좋다.

본 발명에 있어서의 인간 TGF-βⅡ형 수용체는, 유전자 재조합 기술 외에, 화학적 합성법, 세포배양방법 등과 같은 해당 기술적 분야에 있어서 알려지는 공지의 방법 또는 그의 수식방법을 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 「인간 TGF-βⅡ형 수용체」(「TβRⅡ」라고도 부른다.)에는, 상기 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 「일부」도 포함된다. 여기에서 「일부」란, 상기에 정의한 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 아미노산서열 중의 임의의 부분서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.

바람직하게는, 상기에 정의한 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 세포외영역 또는 그의 임의의 일부를 의미한다.

인간 TGF-βⅡ형 수용체의 「일부」(바람직하게는 TGF-βⅡ형 수용체의 세포외영역 또는 그의 임의의 일부)는, 후술하는 해당 기술적 분야에 있어서 알려지는공지의 방법 또는 그의 수식방법에 따라, 유전자 재조합 기술 또는 화학적 합성법에 의해 제조하는 것도 가능하고, 또 세포배양방법에 의해 단리한 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 단백질분해효소 등을 사용하여 적절히 절단함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 「인간 모노클로날항체」란, 상기에 정의한 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체이다.

더욱이 상세하게는, 이뮤노 글로불린을 구성하는 중쇄(H사슬)의 가변영역(Variable region) 및 H사슬의 정상영역(Constant Region) 및 경쇄(L사슬)의 가변영역 및 L사슬의 정상영역을 포함하는 모든 영역이 인간 이뮤노 글로불린을 코드하는 유전자에 유래하는 인간 이뮤노 글로불린이다. L사슬로서는, 인간 κ사슬 또는 인간 λ사슬을 들 수 있다.

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체는, 상기와 같은 본 발명의 (1) 내지 (11) 중 어느 하나의 특징을 갖는 모노클로날항체이다.

더욱 구체적으로는, 후술하는 실시예 및 도면에 기재되는 바와 같은 여러 특성 및 산업상 유용성을 갖는 각종 모노클로날항체이다.

본 발명의 인간 모노클로날항체에 있어서의 바람직한 태양으로서는, 상기 본 발명의 (2) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체이다.

더욱 바람직한 태양으로서는, 상기 본 발명의 (7) 내지 (11) 중 어느 하나의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체이다.

특히 바람직한 태양으로서는, 상기 본 발명의 (10) 또는 (11)의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체이다.

본 발명의 「인간 모노클로날항체」는, 아래의 어느 하나의 면역원(항원)을 아래에 기술하는 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물에 면역함으로써 제작할 수 있다.

(가) 상기에 정의한 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 세포표면에 발현하는 천연세포 또는 인공적으로 수립한 세포주;

(나) 상기에 정의한 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 세포표면에 발현하도록 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작된 유전자 재조합 세포;

(다) 상기 (가) 또는 (나)의 세포를 가용화하여 얻은 세포 가용화물(cell lysate), 또는 상기 cell lysate로부터 정제한 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 폴리펩티드단편;

(라) 상기에 정의한 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 일부(특히 바람직하게는, 그 세포외영역 또는 그의 임의의 펩티드)를 가용성 폴리펩티드로서 발현하도록 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작된 유전자 재조합 세포;

(마) 상기 (라)의 유전자 재조합 세포를 배양하여 얻은 배양상청 또는 상기 배양상청으로부터 정제된 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 세포외영역 폴리펩티드(가용성 인간 TGF-βⅡ형 수용체); 또는

(바) 화학적으로 합성된 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 일부(특히 바람직하게는, 그 세포외영역 또는 그의 임의의 펩티드).

더 나아가서는, 본 발명의 인간 모노클로날항체는, 유전자 재조합 기술을 사용하여, 그러한 본 발명의 인간 모노클로날항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코드하는 cDNA에 의해 숙주세포를 형질전환하여 얻어지는 유전자 재조합 세포로서, 유전자 재조합 인간 모노클로날항체를 생산하는 본 발명의 「유전자 재조합 세포」를 배양함으로써 배양상청 속으로부터 얻을 수도 있다.

또한, 본 발명 인간 모노클로날항체는, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE 중 어느 하나의 아이소타입을 갖는 인간 모노클로날항체이더라도 좋다. 바람직하게는, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)이고, 더욱 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4이며, 특히 바람직하게는 IgG4이다.

본 발명의 인간 모노클로날항체는, 후술하는 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스와 같은 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물에 상술의 (가) 내지 (바) 중 어느 하나의 면역원(항원)을 면역하여, 모노클로날항체의 기존의 일반적인 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

즉, 예를 들면, 상기 항원을, 필요에 따라 프로인드 아쥬반트(Freund's Adjuvant)와 함께, 상기 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물에 면역한다. 폴리클로날항체는, 상기 면역감작동물(immunized animal)로부터 얻은 혈청으로부터 취득할 수 있다. 또 모노클로날항체는, 상기 면역감작동물로부터 얻은 상기 항체생산세포와 자기항체생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마세포)로부터 융합세포(하이브리도마)를 조제하고, 상기 하이브리도마를 클론화하여, 포유동물의 면역에 사용한 항원에 대해 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 제조된다.

더욱 구체적으로는 아래와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, 상술한 (가) 내지 (다) 중 어느 하나의 면역원을, 필요에 따라 프로인드 아쥬반트(Freund's Adjuvant)와 함께, 상기 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물(특히 바람직하게는 후술하는 「인간 항체생산 트랜스제닉 마우스」)의 피하내, 근육내, 정맥내, 풋패드(footpad)내 또는 복강내에 1 내지 수회 주사하거나 또는 이식함으로써 면역감작을 행한다. 통상, 초회면역으로부터 약 1 내지 14일 마다 1 내지 4회 면역을 행하여, 최종면역으로부터 약 1 내지 5일 후에 면역감작된 상기 포유동물로부터 항체생산세포가 취득된다. 면역을 시행하는 횟수 및 시간적 간격은, 사용하는 면역원의 성질 등에 의해, 적절히 변경할 수 있다.

인간 모노클로날항체를 분비하는 융합세포(하이브리도마)의 조제는, 쾰러 및 밀스테인 등의 방법(Nature, Vol.256, p.495-497, 1975) 및 그것에 준하는 수식방법에 따라 행할 수 있다. 즉, 상술과 같이 면역감작된 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도 등, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체생산세포와, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 특히 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간 유래의 자기항체생산능이 없는 미엘로마세포와의 세포융합시킴으로써 조제된다.

세포융합에 사용되는 미엘로마세포로서는, 예를 들면 마우스 유래 미엘로마 P3/X63-AG8.653(ATCC No. CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/0,Sp2), PAI, FO 또는 BW5147, 래트 유래 미엘로마 210RCY3-Ag.2.3., 인간 유래 미엘로마 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2; UC729-6, CEM-AGR, D1R11 또는 CEM-T15를 사용할 수 있다.

모노클로날항체를 생산하는 세포(예를 들면, 하이브리도마)의 스크리닝은, 상기 세포를 예를 들면 마이크로 타이터 플레이트 중에서 배양하여, 증식이 보인 웰의 배양상청의 상술한 면역감작에서 사용한 면역항원에 대한 반응성을, 예를 들면 RIA(radio immunoassay)나 ELISA(enzyme-linked immuno-solvent assay) 등의 효소면역측정법에 의해 측정함으로써 행할 수 있다.

하이브리도마로부터의 모노클로날항체의 제조는, 하이브리도마를 인 비트로, 또는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등, 바람직하게는 마우스 또는 래트, 보다 바람직하게는 마우스의 복수속 등에서의 인 비보에서 행해, 얻어진 배양상청, 또는 포유동물의 복수로부터 단리함으로써 행할 수 있다.

또한, 상기 하이브리도마 또는 후술하는 유전자 재조합 인간 모노클로날항체를 생산하는 본 발명의 「유전자 재조합 세포」로부터 모노클로날항체를 코드하는 유전자를 클로닝하여, 트랜스제닉 동물 제작기술을 사용하여 해당 유전자가 내재성 유전자에 삽입된 트랜스제닉 소, 염소, 양 또는 돼지를 제작하여, 해당 트랜스제닉 동물의 밀크중에서 해당 인간 모노클로날항체 유전자에 유래하는 모노클로날항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다(닛케이사이언스, 1997년 4월호, 제78페이지 내지 84페이지).

상기 모노클로날 항체생산세포를 인 비트로에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험연구의 목적 및 배양방법 등의 여러 조건에 맞춰, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜, 배양상청중에 모노클로날항체를 생산시키기 위해 사용되는 기지의 영양배지 또는 기지의 기본배지로부터 유도조제되는 모든 영양배지를 사용하여 실시하는 것이 가능하다.

기본배지로서는, 예를 들면, Ham'F12배지, MCDB153배지 또는 저칼슘MEM배지 등의 저칼슘배지 및 MCDB104배지, MEM배지, D-MEM배지, RPMI1640배지, ASF104배지 또는 RD 배지 등의 고칼슘배지 등을 들 수 있고, 상기 기본배지는, 목적에 따라, 예를 들면 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 여러 무기 또는 유기물질 등을 함유할 수 있다.

모노클로날항체의 단리, 정제는, 상술하는 배양상청 또는 복수를, 포화황산암모늄, 유글로불린침전법(euglobulin precipitation method), 카프로인산법(caproic acid method), 카프릴산법(caprylic acid method), 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography)(DEAE 또는 DE52 등), 항이뮤노 글로불린컬럼(anti-immunoglobulin column) 또는 프로틴A컬럼 등의 어피니티컬럼크로마토그래피에 사용하는 것 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날항체에는, 상기 항체를 구성하는 중쇄 및/또는 경쇄의 각각의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산서열을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄로 된 인간 모노클로날항체도 포함된다.

여기에서, 「여러 개의 아미노산」이란, 복수개의 아미노산을 의미하고, 구체적으로는 1 내지 10개의 아미노산이고, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이다.

본 발명의 인간 모노클로날항체의 아미노산서열 중에, 상기와 같은 아미노산의 부분적 개변(결실, 치환, 삽입, 부가)은, 상기 아미노산서열을 코드하는 염기서열을 부분적으로 개변함으로써 도입할 수 있다. 이 염기서열의 부분적 개변은, 기지의 부위특이적 변이도입법(Site specific mutagenesis)을 사용하여 일반적인 방법에 의해 도입할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p.5662-5666, 1984).

본 발명에 있어서의 「인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물」, 특히 바람직한 태양인 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스는, 기보에 따라 제작할 수 있다(Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 일본국 특표평4-504365호 공보; 일본국 특표평7-509137호 공보; 닛케이사이언스, 6월호, 제40~제50페이지, 1995년; 국제출원공개 WO94/25585호 공보; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 및 일본국 특표평6-500233호 공보 등).

상기 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스는, 구체적으로는 예를 들면 아래의 공정으로 된 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 다른 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물도 동일하게 하여 제조할 수 있다.

(1) 마우스 내재성 이뮤노 글로불린 중쇄유전자좌(heavy chain gene locus)의 적어도 일부를 상동재조합에 의해 약제내성 마커유전자(네오마이신 내성 유전자 등)로 치환함으로써 상기 마우스 내재성 이뮤노 글로불린 중쇄유전자가 기능적으로 불활성화된 녹아웃 마우스를 제작하는 공정.

(2) 마우스 내재성 이뮤노 글로불린 경쇄유전자좌(light chain gene locus)의 적어도 일부를 상동재조합에 의해 약제내성 마커유전자(네오마이신 내성 유전자 등)로 치환함으로써 상기 마우스 내재성 이뮤노 글로불린 경쇄유전자(특히 κ사슬 유전자)가 기능적으로 불활성화된 녹아웃 마우스를 제작하는 공정.

(3) 효모 인공염색체(Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등으로 대표되는 거대유전자를 운반 가능한 벡터를 사용하여, 인간 면역 글로불린 중쇄유전자좌가 목적으로 하는 영역이 마우스염색체 중에 삽입된 트랜스제닉 마우스를 제작하는 공정.

(4) YAC 등으로 대표되는 거대유전자를 운반 가능한 벡터를 사용하여, 인간 면역 글로불린 경쇄(특히 κ사슬)유전자좌가 목적으로 하는 영역이 마우스 염색체중에 삽입된 트랜스제닉 마우스를 제작하는 공정.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 녹아웃 마우스 및 트랜스제닉 마우스를 임의의 순서로 교배함으로써, 마우스 내재성 면역 글로불린 중쇄유전자좌 및 마우스 내재성 면역 글로불린 경쇄유전자좌가 함께 기능적으로 불활성화되고, 또한 인간 면역 글로불린 중쇄유전자좌가 목적으로 하는 영역 및 인간 면역 글로불린 경쇄유전자좌가 목적으로 하는 영역이 함께 마우스 염색체상에 삽입된 트랜스제닉 마우스를 제작하는 공정.

상기 녹아웃 마우스는, 마우스 내재성 이뮤노 글로불린 유전자좌의 적당한 영역을 외래성 마커유전자(네오마이신 내성 유전자 등)로 상동 재조합에 의해 치환함으로써 상기 유전자좌가 재구성(rearrangement)할 수 없도록 불활성화함으로써제작할 수 있다. 상기 상동 재조합을 사용한 불활성화에는, 예를 들면, 포지티브 ·네거티브 ·셀렉션(Positive Negative Selection; PNS)이라 호칭되는 방법을 사용할 수 있다(닛케이사이언스, 5월호, p.52-62, 1994).

이뮤노 글로불린 중쇄유전자좌의 기능적 불활성화에는, 예를 들면, J영역 또는 C영역(예를 들면 Cμ영역)의 일부에 장애(lesion)를 도입함으로써 달성할 수 있다. 또한 이뮤노 글로불린 경쇄(예를 들면 κ사슬)의 기능적 불활성화는, 예를 들면, J영역 또는 C영역의 일부, 또는 J영역 및 C영역에 걸친 영역을 포함하는 영역에 장애를 도입함으로써 달성 가능하다.

트랜스제닉 마우스는, 트랜스제닉 동물의 제조에 있어서 통상 사용되는 일반적인 방법(예를 들면, 최신 동물세포 실험매뉴얼, LIC발행, 제7장, 제361~제408페이지, 1990년을 참조)에 따라 제작하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면, 정상 마우스 배반포(blastcyst)에 유래하는 HPRT 음성(히포크산틴구아닌 ·포스포리보실 트랜스페라아제(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 유전자가 결실되어 있다)ES세포(embryonic stem cell)를, 상기 인간 이뮤노 글로불린 중쇄유전자좌 또는 경쇄유전자좌를 코드하는 유전자 또는 그의 일부 및 HPRT 유전자가 삽입된 YAC 벡터를 포함하는 효모와 스페로플라스트 융합법(spheroplast fusion method)에 의해 융합한다. 상기 외래성 유전자가 마우스 내재성 유전자상에 인테그레이트된 ES세포를 HAT셀렉션법에 의해 선별한다. 이어서, 선별한 ES세포를, 별도의 정상 마우스로부터 취득한 수정란(배반포)에 마이크로 인젝션한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980; 미국특허 제4,873,191호 공보). 상기 배반포를 가친(foster mother)으로서 별도의 정상 마우스의 자궁에 이식한다. 그렇게 하여 상기 가친 마우스로부터, 키메라 트랜스제닉 마우스가 태어난다. 상기 키메라 트랜스제닉 마우스를 정상 마우스와 교배시킴으로써 헤테로 트랜스제닉 마우스를 얻는다. 상기 헤테로(heterogeneic) 트랜스제닉 마우스끼리를 교배시킴으로써, 멘델의 법칙에 따라, 호모(homogeneic) 트랜스제닉 마우스가 얻어진다.

본 발명에 있어서의 「모노클로날항체의 일부」란, 상술의 본 발명의 인간 모노클로날항체의 일부분의 영역을 의미하여, 구체적으로는 F(ab')₂, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), sFv, dsFv(disulphide stabilised Fv) 또는 dAb(single domain antibody) 등을 들 수 있다(엑스퍼트 ·오피니온 ·온 ·테라퓨틱 ·파텐츠(Exp. Opin. Ther. Patents), 제6권, 제5호, 제441~456페이지, 1996년).

여기에서, 「F(ab')₂」 및 「Fab'」란, 이뮤노 글로불린(모노클로날항체)을, 단백질분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리함으로써 제조되어, 힌지영역(hinge region)중의 2가닥의 H사슬 사이에 존재하는 디술피드결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들면 IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지영역중의 두 가닥의 H사슬 사이에 존재하는 디술피드결합의 상류에서 절단되어 V_L(L사슬 가변영역)과 C_L(L사슬 정상영역)로 된 L사슬 및 V_H(H사슬 가변영역)와 C_Hγ1(H사슬 정상영역중의 γ1영역)로 된 H사슬 프래그먼트가 C말단영역에서 디술피드결합에 의해 결합한 상동한 2개의 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이들 2개의 상동한 항체 프래그먼트를 각각 Fab'라고 한다. 또한 IgG를 펩신으로 처리하면, 힌지영역중의 두 가닥의 H사슬 사이에 존재하는 디술피드결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab'가 힌지영역에서 이어진 것 보다 조금 큰 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이 항체 프래그먼트를 F(ab')₂라고 한다.

본 발명의 「모노클로날항체를 생산하는 세포」 또는 유전자 재조합 인간 모노클로날항체를 생산하는 본 발명의 「유전자 재조합 세포」란, 상술한 본 발명의 인간 모노클로날항체를 생산하는 임의의 세포를 의미한다.

구체적으로는, 예를 들면, 아래 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 세포를 들 수 있지만 이것에 한정되는 것은 아니다.

(1) 상기에서 정의한 면역원(항원)을 상술한 인간 항체생산 트랜스제닉 비인간 포유동물에 면역함으로써 얻어지고, 상기 피면역 동물로부터 채취될 수 있는 인간 모노클로날 항체생산 B세포.

(2) 그와 같이 하여 얻어진 인간 모노클로날 항체생산 B세포를 포유동물 유래의 미엘로마세포와 세포융합하여 얻어지는 상술의 융합세포(하이브리도마).

(3) 상기 인간 모노클로날 항체생산 B세포 또는 인간 모노클로날 항체생산 융합세포(하이브리도마)로부터 단리되는 상기 인간 모노클로날항체를 코드하는 유전자(중쇄를 코드하는 유전자 또는 경쇄를 코드하는 유전자 중 어느 한쪽, 또는 양쪽 유전자)이고, 상기 B세포 및 하이브리도마 이외의 세포(예를 들면, CHO(Chinesehamster ovarian)세포), BHK(Baby hamster kidney)세포 등)를 형질전환하여 얻어지는 유전자 재조합 인간 모노클로날항체를 생산하는 유전자 재조합 세포.

여기에서, 상기 (3)의 유전자 재조합 인간 모노클로날항체를 생산하는 유전자 재조합 세포는, 즉, 상기 (1)의 B세포 또는 (2)의 하이브리도마가 생산하는 인간 모노클로날항체의 유전자 재조합체를 생산하는 유전자 재조합 세포를 의미한다.

본 발명을 구성하는 「물질」, 구체적으로는 「인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질」에는, 자연계에 존재하는 천연 물질 또는 인공적으로 조제되는 임의의 물질을 의미한다.

또한, 상기 물질에는, 인간 TGF-βⅡ형 수용체로의 결합에 있어서, 상기 수용체의 생체내 리간드인 TGF-β와 경합하는 임의의 물질이 포함된다.

상기 물질은, 「단백질성 물질」과 「비단백질성 물질」로 크게 나눌 수 있다.

상기 「단백질성 물질」로서는, 폴리펩티드, 폴리클로날항체, 모노클로날항체, 또는 상기 모노클로날항체의 일부를 들 수 있다.

상기 물질이 항체인 경우에는, 바람직하게는 모노클로날항체이다. 상기 물질이 모노클로날항체인 경우에는, 비인간 포유동물 유래의 모노클로날항체 뿐 아니라, 재조합 키메라 모노클로날항체, 재조합 인간형 모노클로날항체 및 상술한 「인간 모노클로날항체」가 포함된다.

상기 물질이, 항체 이외의 폴리펩티드인 경우에는, 임의의 폴리펩티드, 상기폴리펩티드의 단편(올리고펩티드), 융합폴리펩티드 및 그들 중 어느 하나의 화학수식체가 포함된다. 올리고펩티드로서는, 5 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 20개의 아미노산으로 된 펩티드를 들 수 있다. 상기 화학수식은, 생체에 투여된 경우의 혈중 반감기의 증대 또는 경구투여시에 있어서의 소화관에서의 분해에 대한 내성 또는 흡수성의 증대 목적 등의 여러 목적에 따라 설계할 수 있다.

「비단백질성 물질」로서는, 화학적으로 합성된 임의의 화합물 또는 동식물(예를 들면, 식물, 미생물, 세균, 곤충, 어류, 갑곡류 등)로부터 단리되는 임의의 화학물질을 들 수 있다. 구체적으로는, 분자량 약 100 내지 약 1000 이하의 화합물, 바람직하게는 분자량 약 100 내지 약 800의 화합물이고, 보다 바람직하게는 분자량 약 100 내지 약 600의 화합물을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 「의약조성물」은, 유효성분으로서의 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부, 또는 상술한 「인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질」과 「약학적으로 허용될 수 있는 담체」로 된 의약품으로서 유용한 조성물을 의미한다.

여기에서 「약학적으로 허용될 수 있는 담체」란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해보조제 또는 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다.

그러한 담체의 하나 이상을 사용함으로써, 정제, 환제, 산제, 과립제, 주사제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 엘릭서제, 현탁제, 유제 또는 시럽제 등의 형태의 의약조성물을 조제할 수 있다.

이들 의약조성물은, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구투여를 위한 그 밖의 형태로서는, 하나 또는 그 이상의 활성물질을 포함하고, 일반적인 방법에 의해 처방되는 외용액제, 장용내 투여를 위한 좌제 및 페서리(pessary) 등이 포함된다.

투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간, 또는 상기 의약조성물에 함유되는 활성성분(상기 단백질이나 항체 등)의 종류 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1인당, 1회 마다 10 ㎍~1000 mg(또는 10 ㎍~500 mg)의 범위에서 투여할 수 있다. 그러나, 투여량은 여러 조건에 따라 변동되기 때문에, 상기 투여량 보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또 상기 범위를 초과하는 투여량이 필요한 경우도 있다.

특히 주사제의 경우에는, 예를 들면 생리식염수 또는 시판의 주사용 증류수 등의 비독성의 약학적으로 허용될 수 있는 담체중에 0.1 ㎍항체/ml담체~10 mg항체/ml 담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다.

이렇게 하여 제조된 주사제는, 처치를 필요로 하는 인간 환자에 대해, 1회의 투여에 있어서 1 kg 체중당, 1 ㎍~100 mg의 비율로, 바람직하게는 50 ㎍~50 mg의 비율로, 1일당 1회~수회 투여할 수 있다. 투여의 형태로서는, 정맥내주사, 피하주사, 피내주사, 근육내주사 또는 복강내주사와 같은 의료상 적당한 투여형태를 예시할 수 있다. 바람직하게는 정맥내주사이다.

또한, 주사제는 경우에 따라, 비수성 희석제(예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류 등), 현탁제 또는 유탁제로서 조제할 수도 있다.

그러한 주사제의 무균화는, 박테리아 보류 필터를 통과하는 여과멸균, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 행할 수 있다. 주사제는, 용시조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결건조법 등에 의해 무균의 고체조성물로 하여, 사용전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

본 발명의 의약조성물은, 여러 병태 및 질환의 발증에 관여하는 TGF-β의 시그날의 TGF-βⅡ형 수용체를 매개로 하는 세포내로의 전달을 저해하기 때문에 유용하다.

더 나아가서는, 본 발명의 의약조성물은, TGF-β의 작용에 기인하는 여러 질환, 예를 들면, 신장질환(신장섬유증, 신장염, 신부전, 신장경화증 등), 폐질환(예를 들면, 폐섬유증, 폐렴 등), 간장질환(예를 들면, 간장조직섬유증, 간경변, 간염 등), 피부질환(예를 들면, 창상, 강피증, 건선, 켈로이드 등), 관절염(예를 들면, 만성 류머치즘성관절염, 변형성 관절증 등), 혈관질환(예를 들면, 혈관재협착, 류마치성 혈관염 등), 여러 장기에서의 조직섬유증(여러 암에서 병발하는 조직 섬유증을 포함한다) 및 동맥경화증(병발하는 조직섬유증을 포함한다) 등의 발증 및/또는 진행을 억제, 저해하여, 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약품으로서 유용하다.

특히, 본 발명의 인간 모노클로날항체 또는 그의 의약조성물은, 인간 유래의 모노클로날항체로 된 것으로부터, HAMA(human anti-mouse antibody)에 기인하는 숙주의 면역거절반응을 야기하지 않아, 항체의약품으로서 지극히 유용하다.

또한, 본 발명의 의약조성물의 여러 질환증상의 치료효과에 대해서는, 일반적인 방법에 따라, 기지의 질환 모델동물에 투여함으로써 시험, 검토할 수 있다.

예를 들면, 조직섬유증의 하나이고, 또 신장질환의 하나이기도 한 신장섬유증 치료효과를 검토하는 경우에는, 마우스의 한쪽 뇨관을 결찰하여 신장의 혈액 등의 여과기능을 정지시킴으로써 신기능부전을 야기시킨 모델마우스(UUO모델, Unilateral ureteral obstruction)에, 본 발명의 의약조성물을 투여하여, 상기 신기능부전에 의해 야기되는 신장염 및 신장섬유증 발증의 지표인 히드록시프롤린 생성의 상승을 억제하는 정도를 측정하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 히드록시프롤린 농도의 감소는, 상기 의약조성물이 상기 신장질환의 치료에 유효한 것을 나타내는 것이다.

더욱이 별도의 방법으로서는, 래트에 세포표면 마커인 Thy-1에 대한 항체를 투여함으로써 유발한 신장염 모델 래트에, 본 발명의 의약조성물을 투여하고, 상기 신기능부전에 의해 야기되는 신장염 및 신장섬유증 발증의 지표인 뇨중에 배설되는 단백질량, 혈청중의 크레아티닌량, 세포외 매트릭스(피브로넥틴, I 형 콜라겐 등) 생산의 감소정도를 측정하는 방법을 사용할 수 있다(Nephron, Vol.78, p.453-463, 1998; Kidney Blood Press Res., Vol.22, p.5-12, 1999). 상기 뇨단백질량, 혈청 크레아티닌량, 피브로넥틴 또는 I형 콜라겐의 감소는, 상기 의약조성물이 상기 신장질환의 치료에 유효하다는 것을 나타내는 것이다.

신장질환, 예를 들면, 미소사구체이상(예를 들면, 네프로제형미소변화군(Minimal Change Nephrotic Syndrome;MCNS)), 둥지상 사구체경화증(Focal Glomerular Sclerosis;FGS), 막성 사구체신장염(막성 신증, MN), IgA신증, 메산기움 증식성 신장염, 용련균감염후 급성 사구체신장염(APSGN), 반월체 형성성(관외성)신장염, 간질성 신장염, 또는 급성 신부전 등에 대해서는, 기보에 상술되는 모델동물을 사용할 수 있다(「질환별 모델 동물의 제작과 신약개발을 위한 시험 ·실험법」, p.34-46, 1993, 기술정보협회(발행)).

피부질환, 예를 들면, 창상, 켈로이드, 아토피, 피부염, 강피증 또는 건선 등에 대해서는, 기보에 상세하게 기술되는 모델 동물을 사용할 수 있다(「질환별 모델 동물의 제작과 신약개발을 위한 시험 ·실험법」, p.229-235, 1993, 기술정보협회(발행)).

간장질환, 예를 들면, 간염(예를 들면, 바이러스성 간염(A형, B형, C형, E형 등) 등), 간경변 또는 약물간장애 등에 대해서는, 기보에 상술되는 모델 동물을 사용할 수 있다(「질환별 모델 동물의 제작과 신약개발을 위한 시험 ·실험법」, p.119-129 및 p.349-358, 1993, 기술정보협회(발행)).

예를 들면, 동맥경화증 및 혈관재협착으로의 효과를 검토하는 경우에는, 래트 대동맥에 벌룬 카테테르(balloon catheter)를 삽입하여 PTCA를 행하여 유사적으로 작성한 재협착 모델을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 DNA는, 일반적인 방법에 따라, 상기 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 mRNA로부터 cDNA를 클론화하는 방법, 게놈 DNA를 단리하여 스프라이싱처리하는 방법, 상기 cDNA 서열 또는 mRNA 서열을 주형으로 하여 PCR에 의해 조제하는 방법, 또는 화학합성하는 방법 등에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 DNA는, 그렇게 하여 조제한 상기 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 각각의 DNA를 적절한 제한효소에 의한 절단(소화)하여, 얻어진 DNA 단편을, 필요에 따라 링커 DNA 또는 태그(Tag)와 함께, 적절한 DNA 폴리머라아제 등을 사용하여 연결함으로써 조제할 수 있다.

상기 인간 TGF-βⅡ형 수용체(이하, 목적단백질이라고 한다)를 코드하는 cDNA를 mRNA로부터 클론화하는 방법으로서는, 아래의 방법을 예시할 수 있다.

먼저, 목적단백질을 발현 ·생산하는 조직 또는 세포로부터 목적단백질을 코드하는 mRNA를 조제한다. mRNA의 조제는, 예를 들면 구아니딘티오시아네이트법(guanidine-thiocyanate method)(Biochemistry, Vol.18, p.5294, 1979), 열페놀법(hot phenol method) 또는 AGPC법 등의 공지의 방법을 사용하여 조제한 전 RNA를 올리고(dT)셀룰로오스나 폴리 U-세파로오스(U-Sepharose) 등에 의한 어피니티 크로마토그래피에 걸음으로써 행할 수 있다.

이어서 얻어진 mRNA를 주형으로 하여, 예를 들면 역전사효소를 사용하는 등의 공지의 방법, 예를 들면 오카야마 등의 방법(Mol. Cell. Biol., Vol.2, p.161, 1982 및 동지 Vol.3, p.280, 1983)이나 호프만(Hoffman) 등의 방법(Gene, Vol.25, p.263, 1983) 등에 의해 cDNA사슬을 합성하여, cDNA의 두가닥 사슬 cDNA로의 변환을 행한다. 이 cDNA를 플라스미드 벡터(plasmid vector), 파지 벡터(phage vector) 또는 코스미드 벡터(cosmid vector)에 삽입하여, 대장균을 형질전환(transforming)하고, 또는 인 비트로 팩키징 후, 대장균에 형질이입(transfecting)함으로써 cDNA 라이브러리를 제작한다.

여기에서 사용되는 플라스미드 벡터로서는, 숙주내에서 복제유지되는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 또 사용되는 파지 벡터로서도 숙주내에서 증식할 수 있는 것이라면 좋다. 일반적인 방법에 사용되는 클로닝용 벡터로서 pUC19, λgt10, λgt11 등을 예시할 수 있다. 단, 후술하는 면역학적 스크리닝에 사용하는 경우는, 숙주내에서 목적단백질을 코드하는 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 갖는 벡터인 것이 바람직하다.

플라스미드에 cDNA를 삽입하는 방법으로서는, 예를 들면 마니아티스(Maniatis) 등의 방법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.53, 1989)에 기재의 방법 등을 들 수 있다. 또한, 파지 벡터에 cDNA를 삽입하는 방법으로서는, 흉(Hyunh) 등의 방법(DNA Cloning, a practical approach, Vol.1, p.49, 1985) 등을 들 수 있다. 간편하게는, 시판의 클로닝 키트(예를 들면, 다까라주조사제 등)를 사용하는 것도 가능하다. 이와 같이 하여 얻어지는 재조합 플라스미드나 파지 벡터는, 원핵세포(예를 들면, E.coli:HB101, DH5α, Y1090, DH10B 또는 MC1061/P3 등) 등의 적당한 숙주에 도입한다.

플라스미드를 숙주에 도입하는 방법으로서는, (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.74, 1989)에 기재의 염화칼슘법 또는 염화칼슘/염화루비듐법,일렉트로포레이션법(electroporation method) 등을 들 수 있다. 또한, 파지 벡터를 숙주에 도입하는 방법으로서는 파지 DNA를 인 비트로 팩키징한 후, 증식시킨 숙주에 도입하는 방법 등을 예시할 수 있다. 인 비트로 팩키징은, 시판의 인 비트로 팩키징 키트(예를 들면, STRATAGENE사제 또는 AMERSHAM사제)를 사용함으로써 간편하게 행할 수 있다.

상기의 방법에 의해 제작된 cDNA 라이브러리로부터, 목적단백질을 코드하는 cDNA를 단리하는 방법은, 일반적인 cDNA 스크리닝법을 조합시킴으로써 행할 수 있다.

예를 들면, 별개로 목적단백질의 아미노산서열에 대응하는 것으로 생각되는 올리고뉴클레오티드를 화학합성한 후, 이것을³²P로 라벨하여 프로브로 하고, 공지의 콜로니 하이브리다이제이션법(크랜슈타인(Crustein) 등, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, Vol.72, p.3961, 1975) 또는 플라크 하이브리다이제이션법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.2.108, 1989)에 의해, 목적의 cDNA를 함유하는 클론을 스크리닝하는 방법, PCR프라이머를 제작하여 목적단백질의 특정영역을 PCR법에 의해 증폭하여, 상기 영역을 코드하는 DNA 단편을 갖는 클론을 선택하는 방법 등을 들 수 있다.

또한, cDNA를 발현할 수 있는 벡터(예를 들면, λgt11 등의 파지 벡터)를 사용하여 제작한 cDNA 라이브러리를 사용하는 경우에는, 목적단백질에 반응성을 갖는 항체를 사용하는 항원항체반응을 이용하여, 목적의 클론을 선택할 수 있다. 대량으로 클론을 처리하는 경우에는, PCR법을 이용한 스크리닝법을 사용하는 것이 바람직하다.

이렇게 하여 얻어진 DNA의 염기서열은 막삼 ·길버트법(막삼(Maxam) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74, p.560, 1977) 또는 파지 M13을 사용한 디데옥시뉴클레오티드 합성사슬 정지의 방법(dideoxynucleotide synthetic chain termination method)(생거(Sanger) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74, p.5463-5467, 1977)에 의해 결정할 수 있다. 목적단백질을 코드하는 유전자는, 그 전부 또는 일부를 상기와 같이 하여 얻어지는 클론으로부터 제한효소 등에 의해 잘라냄으로써 취득할 수 있다.

또한, 상술한 바와 같은 목적단백질을 발현하는 세포에 유래하는 게놈 DNA로부터 목적단백질을 코드하는 DNA를 단리하는 것에 의한 조제방법으로서는, 예를 들면 아래의 방법을 예시할 수 있다.

상기 세포를 바람직하게는 SDS 또는 프로테이나아제 K(proteinase K) 등을 사용하여 용해하고, 페놀에 의한 추출을 반복하여 DNA의 탈단백질을 행한다. RNA를 바람직하게는 리보뉴클레아제에 의해 소화한다. 얻어지는 DNA를 적당한 제한효소에 의해 부분소화하고, 얻어지는 DNA 단편을 적당한 파지 또는 코스미드로 증폭하여 라이브러리를 작성한다. 그리고 목적의 서열을 갖는 클론을, 예를 들면 방사성 표지된 DNA 프로브를 사용하는 방법 등에 의해 검출하고, 상기 클론으로부터 목적단백질을 코드하는 유전자의 전부 또는 일부를 제한효소 등에 의해 잘라내 취득한다.

목적단백질을 코드하는 DNA의 PCR에 의한 조제는, 상기 목적단백질의 기지의mRNA 또는 cDNA 등을 주형으로 하여 일반적인 방법에 의해 조제할 수 있다(「유전자증폭 PCR법 ·기초와 새로운 전개」, 교리츠출판주식회사 발행, 1992년 등).

또, 화학적 합성에 의한 목적단백질을 코드하는 DNA의 제조는, 목적단백질의 염기서열을 토대로 하여, 일반적인 방법에 따라 행할 수 있다.

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체 또는 그의 일부(바람직하게는 세포외영역)는, 상술에 예시한 방법을 사용하여 조제한 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 DNA(cDNA 또는 인트론을 포함하는 게노믹 DNA)를, 각각 적절한 제한효소로 절단함으로써, 상기 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 DNA 단편을 얻어, 그들 단편을 필요에 따라 링커 DNA 또는 태그(Tag)와 함께, 적절한 DNA 폴리머라아제 등을 사용하여 연결시켜 얻은 DNA를 사용하여, 관용되는 유전자 재조합 기술을 사용하여, 일반적인 방법에 의해 재조합 단백질로서 조제할 수 있다.

구체적으로는 아래에 예시되는 바와 같다. 즉, 앞서 기술한 바와 같이 하여 조제한 DNA를, 아래에 상세하게 기술하는 벡터에 삽입하여 발현벡터를 작성하고, 상기 발현벡터로 후술하는 바와 같은 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 얻는다. 상기 형질전환체를 배양함으로써, 배양상청중에 상기 목적단백질을 생산시킨다. 배양상청중의 상기 목적단백질은, 컬럼 크로마토그래피 등을 사용하여 용이하게 정제할 수 있다.

재조합 인간 TGF-βⅡ형 수용체(또는 그의 세포외영역)를 조제하기 위해 사용되는 발현벡터, 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종 숙주내에서 복제유지 또는 자기증식할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 벡터 및 파지 벡터가 포함된다(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985년).

해당 발현벡터는, 간편하게는 당업계에 있어서 입수 가능한 재조합용 벡터(플라스미드 DNA 및 박테리오파지 DNA)에 인간 TGF-βⅡ형 수용체(또는 그의 세포외영역)를 코드하는 DNA를 일반적인 방법에 의해 연결함으로써 조제할 수 있다. 사용되는 재조합용 벡터로서 구체적으로는, 대장균 유래의 플라스미드로서 예를 들면 pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC19 등, 효모 유래 플라스미드로서 예를 들면 pSH19, pSH15 등, 고초균 유래 플라스미드로서 예를 들면 pUB110, pTP5, pC194 등을 예시할 수 있다. 또한, 파지로서는, λ파지 등의 박테리오파지가, 더욱이 레트로바이러스(retrovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 핵다각체 바이러스(nuclear polyhedrosis virus) 등의 동물이나 곤충의 바이러스(pVL1393, Invitrogen사제)를 예시할 수 있다.

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체 또는 그의 가용성 세포외영역을 코드하는 DNA를 발현시켜 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 숙주세포 표면에 발현시키고, 또는 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 가용성 세포외영역을 생산시키는 목적에 있어서는, 플라스미드 벡터가 유용하다. 플라스미드 벡터로서는, 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종 숙주세포중에서 상기 인간 TGF-βⅡ형 수용체 또는 그의 가용성 세포외영역을 코드하는 유전자를 발현하여, 이들 폴리펩티드를 생산하는 기능을 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, pMAL C2, pcDNA3.1(-), pEF-BOS(Nucleic Acid Research, Vol.18, p.5322, 1990 등) 또는 pME18S(실험의학별책「유전자공학 핸드북」, 1992년 등) 등을 들 수 있다.

숙주세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 일반적으로 발현벡터는 적어도 프로모터 오퍼레이터영역, 개시코돈, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA, 종지코돈, 터미네이터영역 및 복제 가능단위로 구성된다.

숙주로서 효모, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우, 발현벡터는 적어도 프로모터, 개시코돈, 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체(또는 그의 세포외영역)를 코드하는 DNA, 종지코돈을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또 시그날 펩티드를 코드하는 DNA, 엔헨서서열, 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 코드하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역, 스프라이싱접합부, 폴리아데닐레이션부위 (polyadenylation site), 선택마커영역 또는 복제 가능단위 등을 포함하고 있더라도 좋다. 또한, 목적에 따라 통상 사용되는 유전자 증폭유전자(마커)를 포함하고 있더라도 좋다.

세균중에서 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체(또는 그의 세포외영역)를 발현시키기 위한 프로모터 오퍼레이터영역은, 프로모터, 오퍼레이터 및 Shine-Dalgarno(SD)서열(예를 들면, AAGG 등)을 포함하는 것이다. 예를 들면 숙주가 에세리키아속 균(genusEscherichia)인 경우, 적절하게는 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 포함하는 것을 예시할 수 있다.

효모중에서 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체(또는 그의 세포외영역)를 발현시키기 위한 프로모터로서는, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH프로모터를 들 수 있고, 숙주가 바실루스속 균(genusBacillus)인 경우는, SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다.

또한, 숙주가 포유동물세포 등의 진핵세포인 경우, 예를 들면 SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 열쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 그러나, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 발현에는 엔핸서의 이용도 효과적인 방법이다.

적합한 개시코돈으로서는, 메티오닌 코돈(methionine codon)(ATG)을 예시할 수 있다.

종지코돈으로서는, 일반적으로 사용되는 종지코돈(예를 들면, TAG, TAA, TGA)을 예시할 수 있다.

터미네이터영역으로서는, 통상 사용되는 천연 또는 합성의 터미네이터를 사용할 수 있다.

복제 가능단위란, 숙주세포중에서 그의 전 DNA 서열을 복제할 수 있는 능력을 가지는 DNA를 말하고, 천연 플라스미드, 인공적으로 수식된 플라스미드(천연 플라스미드로부터 조제된 DNA 프래그먼트) 및 합성 플라스미드 등이 포함된다. 적절한 플라스미드로서는, E.coli에서는 플라스미드 pBR322 또는 그의 인공적 수식물(pBR322를 적당한 제한효소로 처리하여 얻어지는 DNA 프래그먼트)이, 효모에서는 효모 2 μ 플라스미드, 또는 효모 염색체 DNA가, 또 포유동물세포에서는 플라스미드 pRSVneo ATCC 37198, 플라스미드 pSV2dhfr ATCC 37145, 플라스미드 pdBPV-MMTneo ATCC 37224, 플라스미드 pSV2neo ATCC 37149, 플라스미드 pSV2bsr 등을 들수 있다.

엔헨서서열, 폴리아데닐레이션부위 및 스프라이싱접합부위에 대해서는, 예를 들면 각각 SV40에 유래하는 것 등, 당업자에 있어서 통상 사용되는 것을 사용할 수 있다.

선택마커로서는, 통상 사용되는 것을 일반적인 방법에 의해 사용할 수 있다. 예를 들면 테트라사이클린(tetracycline), 암피실린(ampicillin), 또는 카나마이신(kanamycin) 등의 항생물질 내성 유전자 등을 예시할 수 있다.

유전자 증폭 유전자로서는, 디히드로 엽산 리덕타아제(Dihydrofolate Reductase;DHFR)유전자, 티미딘 키나아제 유전자(thymidine kinase gene), 네오마이신 내성 유전자(neomycin resistance gene), 글루타민산 합성효소 유전자(glutamate synthase gene), 아데노신 데아미나아제 유전자(adenosine deaminase gene), 오르니틴 데카르복실라아제 유전자(ornithine decarboxylase gene), 히구로마이신-B-포스포트랜스페라아제 유전자(hygromycin-B-phosphotransferase gene), 아스파테이트 트랜스카르바밀라아제 유전자(aspartate transcarbamylase gene) 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는, 적어도, 상술의 프로모터, 개시코돈, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA, 종지코돈 및 터미네이터영역을 연속적이고 또한 고리상으로 적당한 복제 가능단위에 연결함으로써 조제할 수 있다. 또 이 때, 목적에 따라 제한효소에 의한 소화나 T4DNA 리가아제를 사용하는 라이게이션 등의 일반적인 방법에 의해 적당한 DNA 프래그먼트(예를 들면, 링커, 다른 제한효소부위 등)를 사용할 수있다.

본 발명의 형질전환세포는, 상술의 발현벡터를 숙주세포에 도입함으로써 조제할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 숙주세포로서는, 상기의 발현벡터에 적합하고, 형질전환될 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 기술분야에 있어서 통상 사용되는 천연세포 또는 인공적으로 수립된 재조합 세포 등 여러 세포(예를 들면, 세균(EscherichiaandBacillus), 효모(Saccharomyces,Pichia), 동물세포 또는 곤충세포 등)를 예시할 수 있다.

바람직하게는 대장균 또는 동물세포이고, 구체적으로는 대장균(DH5α, DH10B, TB1, HB101, XL-2Blue 등), 마우스 유래 세포(COP, L, C127, Sp2/0, NS-1 또는 NIH3T3 등), 래트 유래 세포, 햄스터 유래 세포(BHK 및 CHO 등), 원숭이 유래 세포(COS1, COS3, COS7, CV1 및 Velo 등) 및 인간 유래 세포(Hela, 2배체 섬유아세포에 유래하는 세포, 미엘로마세포 및 Namalwa 등) 등을 예시할 수 있다.

발현벡터의 숙주세포로의 도입(형질전환(형질이입))은 종래 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다.

예를 들면, 세균(E.coli, Bacillus subtilis 등)의 경우는, 예를 들면 Cohen 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972), 프로토플라스트법(protoplast method)(Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979)이나 컴피턴트법(competent method)(J. Mol. Biol., Vol.56, p.209, 1971)에 의해, Saccharomyces cerevisiae의 경우는, 예를 들면 하이넨(Hinnen) 등의 방법(Proc.Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978)이나 리튬법(J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983)에 의해, 동물세포의 경우는, 예를 들면 그라함(Graham)의 방법(Virology, Vol.52, P.456, 1973), 곤충세포의 경우는, 예를 들면 서머즈(Summers) 등의 방법(Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983)에 의해 각각 형질전환할 수 있다.

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 세포외영역(가용성 인간 TGF-βⅡ형 수용체)은, 상기와 같이 조제되는 발현벡터를 포함하는 형질전환세포(이하, 형질이입체를 포함하는 의미로 사용한다.)를 영양배지에서 배양함으로써 제조할 수 있다.

영양배지는, 숙주세포(형질전환체)의 생육에 필요한 탄소원, 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들면 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스 등을, 무기질소원 또는 유기질소원으로서는, 예를 들면 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스팁 ·리쿼(corn steep liquor), 펩톤, 카세인, 고기엑기스(meat extract), 대두박(soy bean cake), 감자추출액(potato extract) 등을 예시할 수 있다. 또한 목적에 따라 다른 영양소(예를 들면, 무기염(예를 들면 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네숨), 비타민류, 항생물질(예를 들면 테트라사이클린, 네오마이신, 암피시린, 카나마이신 등) 등)를 포함하고 있더라도 좋다.

배양은 당업계에 있어서 알려져 있는 방법에 의해 행해진다. 배양조건, 예를 들면 온도, 배지의 pH 및 배양시간은, 본 발명의 단백질이 대량으로 생산되도록 적절히 선택된다.

또한, 아래에 숙주세포에 따라 사용되는 구체적인 배지 및 배양조건을 예시하지만, 조금도 이들에 한정되는 것은 아니다.

숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들면 상기 영양원을 함유하는 액체배지가 적당하다. 바람직하게는, pH가 5~8인 배지이다.

숙주가 E.coli인 경우, 바람직한 배지로서 LB배지, M9배지(밀러(Miller) 등, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972), YT배지 등을 예시할 수 있다. 이러한 경우, 배양은, 필요에 따라 통기, 교반하면서 통상 14~43℃, 약 3~24시간 행할 수 있다.

숙주가 Bacillus속 균인 경우, 필요에 따라 통기, 교반을 행하면서 통상 30~40℃, 약 16~96시간 행할 수 있다.

숙주가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들면 Burkholder 최소배(보스티안(Bostian), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980)를 들 수 있고, pH는 5~8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20~35℃에서 약 14~144시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.

숙주가 동물세포인 경우, 배지로서 예를 들면 약 5~20%의 소태아혈청을 포함하는 MEM배지(Science, Vol.122, p.501, 1952), DMEM배지(Virology, Vol.8, p.396, 1959), RPMI1640배지(J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), 199배지(Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950), HamF12배지 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6~8인 것이 바람직하고, 배양은 통상 약 30~40℃에서 약 15~72시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.

숙주가 곤충세포인 경우, 예를 들면 소태아혈청을 포함하는 Grace's배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) 등을 들 수 있고, 그의 pH는 약 5~8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20~40℃에서 약 15~100시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 세포외영역(가용성 인간 TGF-βⅡ형 수용체)은, 상술한 바와 같은 형질전환세포(특히 동물세포 또는 대장균)를 배양함으로써, 배양상청중에 분비시킴으로써 제조할 수 있다. 즉, 얻어진 배양물을 여과 또는 원심분리 등의 방법으로 배양여과액(상청)을 얻어, 상기 배양여과액으로부터 천연 또는 합성단백질을 정제 및 단리하기 위해 일반적으로 사용되는 일반적인 방법에 따라 목적단백질을 정제, 단리한다.

단리, 정제방법으로서는, 예를 들면 어피니티컬럼 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 염석, 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔전기영동 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피나 히드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography) 등의 하전을 이용하는 방법, 역상 고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

한편, 목적단백질이 배양된 형질전환체의 페리플라즘(periplasm) 또는 세포질내에 존재하는 경우는, 배양물을 여과 또는 원심분리 등의 일반적인 방법으로 균체 또는 세포를 모아, 적당한 완충액에 현탁하여, 예를 들면 초음파나 리소자임 및동결융해 등의 방법으로 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 후, 원심분리나 여과 등의 방법으로 목적단백질을 함유하는 막획분을 얻는다. 상기 막획분을 Triton-X100 등의 계면활성제를 사용하여 가용화하여 조용액(crude extract)을 얻는다. 그리고, 해당 조용액을 앞서 예시한 바와 같은 일반적인 방법을 사용함으로써, 단리, 정제할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도1은, 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 정량한 재조합 인간 가용성 TβRⅡ(표준물질)의 검량선을 나타내는 도이다. 세로축은 형광강도를 나타내고, 가로축은 상기 표준물질의 농도를 나타낸다.

도2는, 웨스턴 블로팅 시험에 의한 정제 재조합 인간 가용성 TβRⅡ의 SDS 폴리아크릴아미드겔에서의 전기영동의 상태를 나타내는 사진이다. 레인 1 내지 3은 각각 아래의 전기영동의 상태를 나타낸다.

레인 1 : 마커분자.

레인 2 : 시판의 재조합 인간 가용성 TβRⅡ.

레인 3 : 본 발명에 있어서 조제한 정제 재조합 인간 가용성 TβRⅡ.

도3은, 재조합 인간 가용성 TβRⅡ의 인간 TGF-β1에 대한 결합활성을 나타내는 도이다.

세로축은 재조합 인간 가용성 TβRⅡ와 인간 TGF-β1의 결합활성의 지표가 되는 형광강도를 나타내고, 가로축은 가한 인간 TGF-β1의 농도를 나타낸다.

도4는, 재조합 인간 가용성 TβRⅡ를 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스에 면역하여 조제한 각종 인간 모노클로날항체의 특성을 나타내는 도이다. 동그라미 표시는, 각종 시험에 있어서 유의한 차를 가지고 저해활성을 나타낸 것을 나타낸다.

도5는, 플로 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 해석한 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 인간 폐 유래 세포주 NHLF에 대한 반응성(결합성)을 나타내는 도이다. 분도(a) 내지 (h)는 각각 아래의 시험결과를 나타낸다.

분도(a) : 1차항체 및 2차항체 모두 가하지 않고 스트렙토아비딘-PE 만 가한 경우의 시험결과.

분도(b) : 1차항체로서 항KLH 인간 모노클로날항체를 사용한 경우의 시험결과.

분도(c) : 1차항체로서 시판의 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체를 사용한 경우의 시험결과.

분도(d) : 1차항체로서 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 TR4C175를 사용한 경우의 시험결과.

분도(e) : 1차항체로서 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 TR4D204를 사용한 경우의 시험결과.

분도(f) : 1차항체로서 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 TR4D455를 사용한 경우의 시험결과.

분도(g) : 1차항체로서 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 TR4D465를 사용한 경우의 시험결과.

분도(h) : 1차항체로서 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 TR4B16을 사용한 경우의 시험결과.

도6은, 플로 사이토메트리에 의해 해석한 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 래트 신장 유래 섬유아세포주 NRK-49F에 대한 반응성(결합성)을 나타내는 도이다. 분도(a) 내지 (h)는 각각 아래의 시험결과를 나타낸다.

분도(h) : 1차항체로서 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 TR4B16을 사용한경우의 시험결과.

도7은, 인간 TGF-β1의 농도의존적인 인간 골육종 유래 세포주 MG-63의 세포증식활성을 나타내는 도이다. 세로축은 세포증식 촉진활성 강약의 지표로서의 [³H]티미딘의 세포내로의 섭취량(uptake)을 나타내고, 가로축은 인간 TGF-β1의 농도를 나타낸다.

도8은, 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 골육종 유래 세포주 MG-63의 세포증식의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체에 의한 저해활성을 나타내는 도이다. 세로축은 세포증식저해율을 나타내고, 가로축은 항체의 농도를 나타낸다.

도9는, 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 골육종 유래 세포주 MG-63의 세포증식의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체에 의한 저해활성을 나타내는 도이다. 세로축은 세포증식저해율을 나타내고, 가로축은 항체의 농도를 나타낸다.

도10은, 인간 TGF-β1의 농도 의존적인 인간 폐암 유래 세포주 A-549의 세포증식억제활성을 나타내는 도이다. 세로축은 세포증식 강약의 지표로서의 [³H]티미딘의 세포내로의 섭취량을 나타내고, 가로축은 인간 TGF-β1의 농도를 나타낸다.

도11은, 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 폐암 유래 세포주 A-549의 세포증식억제의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체에 의한 저해활성을 나타내는 도이다. 세로축은 세포증식억제의 저해율을 나타내고, 가로축은 항체의 농도를 나타낸다.

도12는, 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 유래 세포로부터의 피브로넥틴 생산의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체에 의한 저해활성을 나타내는 도이다. 세로축은 피브로넥틴의 생산량을 나타내고, 가로축은 항체의 종류를 나타낸다.

도13은, 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 유래 세포로부터의 결합조직 성장인자(CTGF) 생산의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체에 의한 저해활성을 나타내는 도이다. 세로축은 피브로넥틴의 생산량을 나타내고, 가로축은 항체의 종류를 나타낸다.

도14는, 신장질환 모델 래트를 사용한 시험에 있어서의 신장질환 파라미터로서의 뇨중 단백질의 증가에 대한 TGF-βⅡ형 수용체의 저해제에 의한 억제효과를 나타내는 도이다.

도15는, 신장질환 모델 래트를 사용한 시험에 있어서의 신장질환 파라미터로서의 혈청 크레아티닌의 증가에 대한 TGF-βⅡ형 수용체의 저해제에 의한 억제효과를 나타내는 도이다.

도16은, 신장질환 모델 래트를 사용한 시험에 있어서의 신장질환 파라미터로서의 신장에서의 피브로넥틴의 증가에 대한 TGF-βⅡ형 수용체의 저해제에 의한 억제효과를 나타내는 도이다.

도17은, 신장질환 모델 래트를 사용한 시험에 있어서의 신장질환 파라미터로서의 신장에서의 I형 콜라겐의 증가에 대한 TGF-βⅡ형 수용체의 저해제에 의한 억제효과를 나타내는 도이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 실시예로서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 상기 실시예에 기재되는 태양에만 한정되는 것은 아닌 것은 말할 것도 없다.

또한, 아래의 실시예에 있어서는, 「TGF-βⅡ형 수용체」를 「TβRⅡ」라고 칭하는 경우도 있다.

실시예 1 샌드위치 ELISA에 의한 인간 가용성 TβRⅡ 정량법의 확립

<1-1> 재조합 인간 가용성 TβRⅡ 정량을 위한 샌드위치 ELISA계의 확립

염소 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)를 인산완충액으로 희석하여, 0.1 ㎍/50 ㎕/웰의 농도로, ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Corning사제)의 각 웰에 가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트하여 상기 폴리클로날항체를 플레이트에 흡착시켰다.

플레이트를 인산완충액으로 세척한 후, 각 웰에 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 함유하는 인산완충액(200 ㎕/웰)을 가하고, 실온에서 2시간 인큐베이션함으로써 항체가 결합되어 있지 않은 부위를 블록했다. 이어서, 플레이트를 인산완충액으로 3회 세척했다.

항체를 고정화한 마이크로플레이트의 각 웰에, 측정시료(50 ㎕/웰)를 가하여, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. 이어서, 마이크로플레이트를, 0.1% Tween20을 함유하는 인산완충액으로 3회 세척후, 각 웰에, 1% BSA, 0.1% Tween20을 함유하는 인산완충액으로 희석한 비오틴 표지 염소 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)를 0.025 ㎍/50 ㎕/웰의 농도로 가하여, 실온하에서 1시간 인큐베이트했다.

이어서 마이크로플레이트를, 0.1% Tween20을 함유하는 인산완충액으로 3회 세척후, 0.5M의 NaCl과 20 mM의 HEPES로 된 용액(1 mg/ml의 BSA를 함유, pH7.0)으로 2000배로 희석한 스트렙토아비딘-β-갈락토시다아제(Streptoavidin-β-galactosidase, 50 ㎕, GIBCO BRL사제)를 각 웰에 가하여, 실온하에서 30분간 인큐베이트했다.

마이크로플레이트를, 0.1% Tween20을 함유하는 인산완충액으로 3회 세척후, 100 mM의 NaCl, 1 mM의 MgCl₂및 10 mM의 인산완충액(Na 및 K를 함유)으로 된 용액(1 mg/ml의 BSA를 함유, pH7.0)으로 희석한 1%의 4-메틸-움베리페릴-β-D-갈락토시드(4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside, 50 ㎕, 시그마(Sigma)사제)를 각 웰에 가하여, 실온하에서 15분간 인큐베이트했다.

각 웰에, 1M의 Na₂CO₃(100 ㎕)를 가하여, 반응을 멈췄다. 파장 460 nm(여기(excitation): 355 nm)에서의 형광강도를 플루오로스캔 II 마이크로플레이트 플루오로미터(Fluoroscan II microplate fluorometer, 라보시스템즈(Labsystems Inc.)사제)로 측정했다. 측정시료 중 재조합 인간 가용성 TβRⅡ량을, 하기 실시예에서 작성한 검량선으로부터 구했다.

<1-2> 검량선의 작성

시판의 재조합 인간 가용성 TβRⅡ(R & D사제)를 표준물질(스탠다드)로서 사용하여, 실시예 <1-1>에서 확립한 샌드위치 ELISA에 의해 검량선을 작성했다. 결과를 도1에 나타낸다.

지극히 저농도인 0.1 ng/ml~100 ng/ml의 농도범위에서 유의한 차를 가진 검량선이 얻어졌다.

실시예 2 재조합 인간 가용성 TβRⅡ의 조제

인간 TβRⅡ의 세포외영역(제1 내지 159번째의 아미노산서열, 서열번호 2)을 코드하는 cDNA(서열번호 1)를 PCR법을 사용하여 일반적인 방법에 의해 조제했다.

구체적으로는, 인간 신장으로부터 취득한 mRNA로부터 조제한 cDNA를 주형으로 하여, 인간 TβRⅡ의 cDNA(Cell, Vol.68, p.775-758, 1992; GenBank Accession No.:M85079)를 토대로 설계한 프라이머를 사용하여 일반적인 방법에 따라 PCR에 의해 합성했다.

얻어진 번역영역을 포함하는 인간 TβRⅡ의 cDNA를 플라스미드 pEF-BOS(일본국 특개평2-242687호 공보)에 삽입하여 발현벡터를 작성했다. 일렉트로포레이션에 의해 상기 벡터로 인간 신장 유래 섬유아세포주(fibroblast cell line)HEK293(ATCC CRL-1573)을 형질전환했다. 형질전환세포를, 무혈청배지 ASF104(아지노모토사제)속에서 4일간 배양하여, 재조합 인간 가용성 TβRⅡ를 일과성으로 발현시켰다. 인간 가용성 TβRⅡ의 발현은, 항인간 가용성 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 확인했다.

배양상청을 회수하여, 농축후, 항인간 가용성 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)를 사용한 컬럼크로마토그래피에 제공했다. 얻어진 용출액을 인산완충액으로 세척한 후, 0.1M의 Glycine-HCl(pH2.5)로 용출, 2M Tris-HCl(pH8.83)로 중화하여, 정제 인간 가용성 TβRⅡ 획분을 얻었다. 항인간 가용성 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해, 인간 가용성 TβRⅡ가 정제된 것을 확인했다. 결과를 도2에 나타낸다.

이 정제 인간 가용성 TβRⅡ의 양은, 실시예 1에서 확립한 샌드위치 ELISA법에 의해 정량했다.

실시예 3 정제 인간 TβRⅡ의 TGF-β1으로의 결합활성의 시험

실시예 2에서 조제한 정제 인간 가용성 TβRⅡ의 인간 TGF-β1과의 결합활성을 아래와 같이 시험했다.

재조합 인간 가용성 TβRⅡ(0.2 ㎍/웰)를, ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Corning사제)의 각 웰에 가하고, 실온에서 2시간 인큐베이트하여, 재조합 인간 가용성 TβRⅡ를 마이크로플레이트에 흡착시켰다. 이어서, 상청을 버리고, 각 웰에, 블로킹시약(200 ㎕, 3% BSA 함유 인산완충액)을 가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여, TβRⅡ가 결합되어 있지 않은 부위를 블록했다. 각 웰을, 0.1%의 Tween20을 함유하는 인산완충액(200 ㎕)으로 3회 세척했다. 이렇게 하여, 각 웰을 재조합 인간 가용성 TβRⅡ로 코팅한 마이크로플레이트를 제작했다.

각 웰에, 각종 농도(100, 50, 25, 12.5, 6.3 및 3.1 ng/ml)의 인간 TGF-β1(R & D사제)을 첨가하여, 1시간 반응시킨 후, 각 웰을, 0.1%의 Tween20을함유하는 인산완충액(200 ㎕)으로 3회 세척했다.

비오틴으로 표지한 염소 항인간 TGF-β1 항체(50 ㎕, R & D사제)를 가하여, 실온하에서 1시간 인큐베이트했다.

마이크로플레이트를, 0.1% Tween20을 함유하는 인산완충액으로 세척후, 1 mg/ml의 BSA를 함유하는 0.5M의 NaCl과 20 mM의 HEPES로 된 용액(pH7.0)으로 2000배로 희석한 스트렙토아비딘-β-갈락토시다아제(Streptoavidin-β-galactosidase, 50 ㎕, GIBCO BRL사제)를 각 웰에 가하여, 실온하에서 30분간 인큐베이트했다.

이어서, 마이크로플레이트를, 0.1% Tween20을 함유하는 인산완충액으로 세척후, 1 mg/ml의 BSA를 함유하는 100 mM의 NaCl, 1 mM의 MgCl₂및 10 mM의 인산완충액으로 된 용액(pH7.0)으로 희석한 1%의 4-메틸-움베리페릴-β-D-갈락토시드(4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside, 50 ㎕, 시그마(Sigma)사제)를 각 웰에 가하여, 실온하에서 10분간 인큐베이트했다. 각 웰에, 1M의 Na₂CO₃(100 ㎕)를 가하여, 반응을 멈췄다. 파장 460 nm(여기: 355 nm)에서의 형광강도를 플루오로스캔 II 마이크로플레이트 플루오로미터(Fluoroscan II microplate fluorometer, 라보시스템즈(Lab Systems Inc.)사제)로 측정했다.

또한, 양성대조로서, 시판의 재조합 인간 가용성 TβRⅡ(R & D사제)를 사용하여 상기와 동일하게 시험했다. 또한, 음성대조로서, 어느 하나의 인간 가용성 TβRⅡ(R & D사제)도 가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험했다.

결과를 도3에 나타낸다. 정제 재조합 인간 가용성 TβRⅡ가, 농도 의존적인인간 TGF-β1 결합활성을 유지하고 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 4 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날 항체생산 하이브리도마의 조제

본 실시예에 있어서의 모노클로날항체의 제작은, 실험의학(별책)세포공학 핸드북(구로키 토시오 등 편집, 요도샤발행, 제66-제74페이지, 1992년) 및 모노클로날항체 실험조작입문(안도 타미에 등 저작, 고단샤발행, 1991년) 등에 기재되는 바와 같은 일반적 방법에 따라 조제했다.

면역원으로서의 인간 TβRⅡ는, 실시예 2에서 조제한 정제 재조합 인간 가용성 TβRⅡ를 사용했다.

피면역동물로서는, 상술한 방법을 사용하여 제조한 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스를 사용했다(Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 일본국 특표평4-504365호 공보; 일본국 특표평7-509137호 공보; 닛케이사이언스, 6월호, 제40~제50페이지, 1995년 등).

세포배양조작은, 멀티웰 마이크로플레이트를 사용하여 행했다.

<4-1> 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날 항체생산 하이브리도마의 조제

상기의 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스에, 실시예 2에서 조제한 재조합 인간 가용성 TβRⅡ(6 ㎍/마리)를, 완전 프로인드 아쥬반트(Freund's Complete Adjuvant, ICN/CAPPEL사제)와 함께 풋패드내 주사함으로써 초회(0일) 면역했다. 초회면역으로부터 1주일 마다 동 재조합 인간 가용성 TβRⅡ를, 불완전 프로인드 아쥬반트(Freund's Incomplete Adjuvant, ICN/CAPPEL사제)와 함께 풋패드내 주사에 의해 3회 이상 추가면역하고, 더욱이 아래에 기술하는 림프절 세포의 취득 전전날에도 동 재조합 인간 가용성 TβRⅡ 만을 동일하게 하여 최종면역했다.

각각의 동물로부터 채취한 림프절 세포와 마우스 미엘로마세포 P3/X63-AG8.653(ATCC No.: CRL-1580)을 5:1로 혼합하여, 융합제로서 폴리에틸렌글리콜 4000 또는 폴리에틸렌글리콜 1500(GIBCO BRL사제)을 사용하여 세포융합시킴으로써 다수의 하이브리도마를 제작했다.

하이브리도마의 선택은, 10% FBS와 아미노프테린을 함유하는 HAT 함유 ASF104배지(아지노모토사제) 속에서 배양함으로써 행했다.

<4-2> 모노클로날 항체생산 하이브리도마의 ELISA에 의한 스크리닝

아래에 기술하는 ELISA에 의해, 실시예 2에서 조제한 하이브리도마로부터 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝했다.

실시예 2에서 조제한 정제 재조합 인간 가용성 TβRⅡ(0.2 ㎍/웰)를, ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Corning사제)의 각 웰에 가하고, 실온에서 2시간 인큐베이트하여, 재조합 인간 가용성 TβRⅡ를 마이크로플레이트에 흡착시켰다.

이어서, 상청을 버리고, 각 웰에, 블로킹시약(200 ㎕, 3% BSA 함유 인산완충액)을 가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여, 재조합 인간 가용성 TβRⅡ가 결합되어 있지 않은 부위를 블록했다. 각 웰을, 0.1%의 Tween20을 함유하는 인산완충액(200 ㎕)으로 3회 세척했다. 이와 같이 하여, 각 웰을 재조합 인간 가용성 TβRⅡ로 코팅한 마이크로플레이트를 제작했다.

각 웰에, 각각의 하이브리도마의 배양상청(100 ㎕)을 가하여, 2시간 반응시킨 후, 각 웰을 0.1%의 Tween20을 함유하는 인산완충액(200 ㎕)으로 3회 세척했다.

이어서, 각 웰에 퍼옥시다아제 표지한 염소 항인간 이뮤노 글로불린(Fc)항체(50 ㎕, American Qualex International Inc.)를 가하여, 실온하에서 1시간 인큐베이트했다.

마이크로플레이트를, 0.1%의 Tween20을 함유하는 인산완충액으로 세척후, 테트라메틸벤지딘(3,3',5,5',-tetramethylbenzidine(TMB), 100 ㎕, 바이오 래드(BIO-RAD)를 각 웰에 가하여, 실온하에서 15분간 인큐베이트했다.

이어서, 2N의 H₂SO₄(25 ㎕)를 각 웰에 가하여, 반응을 멈췄다. 파장 450 nm에서의 흡광도를 바이오 래드, 모델 3550 마이크로프렐이트 리더(Model 3550 Microplate Reader, 바이오 래드(BIO-RAD)사제)로 측정했다.

이 결과, 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마가 선택되었다.

실시예 5 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 조제

<5-1> 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 조제(방법 1)

상기 각각의 하이브리도마 클론을, 초저농도 소 이뮤노 글로불린 함유 FBS(Ultra Low Bovine IgG FBS, GIBCO-BRL사제)를 10% 함유하는 ASF104배지(아지노모토사제) 속에서 플라스크 배양했다. 10 내지 20일 배양후, 각각의 하이브리도마의 배양상청을 회수했다.

각각의 하이브리도마의 배양상청(100 ml)을 원심(3,000 rpm, 10분간)하여 얻은 원심상등에, 20 mM의 KH₂PO₄, 180 mM의 Na₂HPO₄및 154 mM의 NaCl로 된 용액(pH7.6)을 1/10량 가했다.

이어서, 각각의 원심상등 샘플에, 프로틴 A 겔(ProteinA Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Pharmacia사제)을 가하여, 교반하면서 하룻밤 반응시켰다. 이어서, 원심분리(3,000 rpm, 10분간)하여, 원심상등을 제거한 후, 프로틴 A 겔에 100 mM의 구연산과 150 mM의 NaCl로 된 용액(pH2.0~3.0)을 가하여 항체를 용출시켰다.

각각의 용출액을 원심분리(3,000 rpm, 10분간)하여 회수한 원심상등에, 500 mM의 Na₂HPO₄와 50 mM의 KH₂PO₄로 된 용액(pH8.7)을 가하여 중화한 후, 필터(Milliore사제)로 여과하여, 백색 침전물을 제거했다. 얻어진 여과액을 인산완충액으로 투석(하룻밤)하여 각각의 정제 인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체를 얻었다.

<5-2> 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 조제(방법 2)

10%의 Ultra Low Bovine IgG FBS(GIBCO-BRL사제)를 함유하는 ASF104배지(아지노모토사제)에 순화한 상기 각각의 하이브리도마 클론(각각 1~2×10⁶개/ml)을, 인테그라 셀라인 1000(INTEGRA CL1000, 인테그라 바이오사이언스사제)에 파종하여 배양을 행했다. 7 내지 10일간의 배양후, 배양세포수가 약 1×10⁸개/ml에 달한 시점에서, 각각의 하이브리도마의 배양상청을 회수했다.

이어서, 각각의 하이브리도마의 배양상청을 원심(3,000 rpm, 10분간)하여 얻은 원심상등을, 하이트랩 프로틴 G 컬럼(HiTrap affinity column Protein G, Amersham Pharmacia)에 제공했다. 이어서, 인산완충액으로 컬럼을 세척후, 프로틴 G 컬럼에 100 mM의 구연산과 150 mM의 NaCl로 된 용액(pH2.0)을 가하여 항체를 용출시켰다. 용출액에 750 mM의 Tris-HCl로 된 용액(pH9.0)을 가하여 중화한 후, 필터(Milliore사제)로 여과하여, 백색 침전물을 제거했다. 얻어진 여과액을 인산완충액으로 투석(하룻밤)한 후, 필터(Milliore사제)로 여과하여 각각의 정제 인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체를 얻었다.

실시예 6 모노클로날항체의 아이소타입의 결정

실시예 5에서 정제한 각각의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 아이소타입을, 인간 모노클로날항체 아이소타입 결정용 키트(American Qualex International Inc.)를 사용하여, 상기 키트에 첨부하는 실험조작 프로토콜에 따라 조작을 행해 결정했다.

어느 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체도 IgG2/κ 또는 IgG4/κ인 것이 확인되었다(도4).

상술한 바와 같이 하여 조제한 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마의 각각을 아래와 같이 기호를 사용하여 명명했다. 해당 기호중 TR의 바로 뒤에 기재한 숫자는, 그 하이브리도마가 생산하는 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 아이소타입을 나타낸다. 「2」는 IgG2/κ인 것을, 「4」는 IgG4/κ인 것을 나타낸다(도4).

TR2B19, TR2B64, TR2B209, TR2B518, TR2D245 및 TR2D249

TR4B16, TR4C175, TR4D204, TR4D455 및 TR4D465

또한, 본 실시예를 포함하여 아래 중 어느 하나의 실시예 중 및 해당 실시예에 있어서의 시험결과로서 나타낸 도면 또는 표에 있어서는, 상기의 명칭을 사용한다.

실시예 7 인간 TβRⅡ에 대한 반응성 및 래트 TβRⅡ에 대한 교차반응성

상술한 바와 같이 하여 조제한 여러 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 인간 TβRⅡ에 대한 반응성을, 인간 TβRⅡ를 세포표면에 발현하고 있는 폐 유래 세포주 NHLF(다까라주조제; 카탈로그번호:CC-2512)를 세포염색(플로 사이토메트리법에 의한)함으로써 해석했다.

또한, 동일하게 하여 상기 각각의 인간 모노클로날항체의 래트 TβRⅡ에 대한 반응성을, 래트 TβRⅡ를 세포표면에 발현하고 있는 래트 신장 유래 섬유아세포주 NRK-49F(ATCC CRL-1570)를 세포염색(플로 사이토메트리법에 의한)함으로써 해석했다.

플라스크에서 배양한 각각의 세포를, 10 mM의 EDTA와 0.1%의 BSA를 함유하는 인산완충액을 사용하여 완만히 회수했다.

각각의 세포(1~2×10⁴개)에, 0.1%의 BSA를 함유하는 인산완충액을 사용하여 희석한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 또는 시판의 염소 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)(300 ㎕, 5 ㎍/ml)를 가하여 4℃에서 1시간 인큐베이션했다. 이어서, 각각을 원심(1,500 rpm, 3분간)하여 상청을 버리고, 각각의 세포를 인산완충액으로 2회 세척했다. 인간 항체를 가한 샘플에는, 비오틴으로 표지한 항인간 이뮤노 글로불린(Fc)항체(200 ㎕, American Qualex International Inc.)를, 염소 항체를 가한 샘플에는, 비오틴으로 표지한 항염소 이뮤노 글로불린항체(200 ㎕, Amersham Pharmacia)를 가하여 4℃에서 1시간 인큐베이션했다.

이어서, 각각을 원심(1,500 rpm, 3분간)하여 상청을 버리고, 각각의 세포를 인산완충액으로 2회 세척했다. 이어서, 각각의 세포에 0.1%의 BSA를 함유하는 인산완충액을 사용하여 희석한 피코에리스린(phycoerythrin, PE)표지한 스트렙토아비딘(200 ㎕, Becton Dickinson)을 가하여 4℃에서 30분간 인큐베이션했다. 이어서, 각각 원심(1,500 rpm, 3분간)하여 상청을 버리고, 각각의 세포를 인산완충액으로 3회 세척후, 인산완충액(300 ㎕)을 가하여, 팍스터 형광표시식 셀소터(FACStar fluorescence-activated cell sorter)(Becton Dickinson)를 사용하여 형광해석(형광파장: DF585/42 필터, 여기파장: 488 nm)을 행했다.

또한, 음성대조시험으로서, 상술한 인간 항체생산 트랜스제닉 마우스에, KLH(keyhole limpet hemocyanin, 피어스(PIERCE)사제)를 면역하여 조제한 항KLH 인간 모노클로날항체를 사용하여, 상기와 동일하게 하여 시험했다.

인간 폐 유래 세포주 NHLF에 대한 반응성을, 도5에 나타낸다. 또, 래트 신장 유래 섬유아세포주 NRK-49F에 대한 반응성을 도6에 나타낸다.

본 발명의 모노클로날항체는, 인간 TβRⅡ에 유의하게 반응할 뿐 아니라, 래트 TβRⅡ로의 교차반응성을 갖는 것이 나타내어졌다.

실시예 8 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β의 자극에 의해 유도되는 세포증식의 저해활성

TGF-β의 세포증식활성은, 세포의 종류에 따라 다르고, 예를 들면, 상피세포, 혈관내피세포 및 혈구계 세포 등의 다종의 세포에 대해서는 증식촉진 보다도 오히려 증식을 억제하는 인자로서 작용하지만, 여러 조직의 섬유아세포나 혈관평활근세포 등의 간엽계의 세포에 대해서는 세포증식을 촉진한다(Roberts et al, The transforming growth factor-βs, In Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p.419-472).

본 시험에서는, 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의, TGF-β 자극에 의한 세포증식유도에 대한 저해효과를 아래와 같이 하여 해석했다.

<8-1> TGF-β1의 세포증식 촉진활성

96웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427, 5×10³개/웰)을 파종하여, 37℃에서 1일 배양했다. 이어서, 세포를 파종한 각 웰을 0.1% FBS를 포함하는 MEM Earle's 염 배지(100 ㎕, GIBCO BRL사제)로 2회 세척하여, 여러 농도로 희석한 인간 TGF-β1(R & D사제; 농도: 0.0001525~10 ng/ml의 범위)을 첨가하여, 37℃에서 40시간 배양했다.

이어서, 각 웰에, [³H]-티미딘(1 μCi/웰)을 첨가하고 더욱이 37℃에서 6시간 배양했다. 세포를 MicroMate 196 cell harvester(PACKARD사제)를 사용하여 회수(하비스트)하고, 세포내에 섭취된 [³H]-티미딘의 양을 매트릭스 9600M(PACKARD사제)으로 측정했다.

또한, 음성대조시험으로서, TGF-β1을 첨가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다.

결과를 도7에 나타낸다.

인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427)이 TGF-β1의 농도에 의존하여 증식하는 것이 나타내어졌다.

<8-2> 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β유도성 세포증식의 저해활성

96웰 마이크로타이터 플레이트에 인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427, 5×10³개/웰)을 파종하여, 37℃에서 1일 배양했다. 이어서, 세포를 파종한 웰을, 0.1% FBS를 포함하는 MEM Earle's염 배지(100 ㎕)로 2회 세척했다. 이어서, 각 웰에 여러 농도로 희석한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 또는 시판의 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)(농도: 0.078125~40 ㎍/ml의 범위)를 가하여 37℃에서 2시간 프레 인큐베이션(pre-incubation)했다.

이어서, 인간 TGF-β1(최종농도: 0.3 ng/ml, R & D사제)을 첨가하여, 37℃에서 40시간 배양했다. 이어서, 각 웰에 [³H]-티미딘(1 μCi/웰)을 첨가하고 더욱이 37℃에서 6시간 배양했다. 세포를 MicroMate 196 cell harvester(PACKARD사제)를 사용하여 회수(하비스트)하고, 세포내에 섭취된 [³H]-티미딘의 양을 매트릭스 9600M(PACKARD사제)으로 측정했다.

또한, 양성대조시험으로서, 어느 하나의 항체도 가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 또한, 음성대조시험으로서, 인간 TGF-β1 및 어느 하나의 항체도 첨가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 결과를 도8 및 도9에 나타낸다.

또한, 도4에, 본 시험(복수회)에 의해 측정한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β1 유도성 세포증식 저해활성의 유무를, 기호를 사용하여 간략화하여 나타냈다.

본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체는, TGF-β의 자극에 의한 인간 섬유아양 세포(human fibroblast-like cells)의 증식유도를 유의하게 저해하는것이 나타내어졌다.

실시예 9 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β의 자극에 의해 유도되는 세포증식억제의 저해활성

상술한 바와 같이, TGF-β는, 여러 조직의 섬유아세포나 혈관평활근세포 등의 간엽계의 세포에 대한 세포증식 촉진활성과는 반대로, 예를 들면, 상피세포, 혈관내피세포 및 혈구계 세포 등의 다종의 세포에 대해서는 세포증식을 억제하는 활성을 갖는다.

본 시험에서는, 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의, TGF-β 자극에 의한 세포증식의 억제에 대한 저해효과를 아래와 같이 하여 해석했다.

<9-1> TGF-β1의 세포증식 억제활성

96웰 마이크로타이터 플레이트에 인간 폐암 유래 세포주 A549(ATCC CCL-185, 5×10³개/웰)를 파종하여, 1일 배양했다. 이어서, 세포를 파종한 웰을 0.1% FBS를 포함하는 D-MEM배지(100 ㎕)로 2회 세척한 후, 여러 농도로 희석한 인간 TGF-β1(R & D사제; 농도: 0.0001525~10 ng/ml의 범위)을 첨가하여, 40시간 배양했다.

이어서, 각 웰에, [³H]-티미딘(1 μCi/웰)을 첨가하고 더욱이 6시간 배양했다. 세포를 MicroMate 196 cell harvester(PACKARD사제)를 사용하여 회수(하비스트)하여, 세포내에 섭취된 [³H]-티미딘의 양을 매트릭스 9600M(PACKARD사제)으로 측정했다.

또한, 음성대조시험으로서, 인간 TGF-β1을 첨가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 결과를 도10에 나타낸다.

인간 폐암 유래 세포주 A-549(ATCC CCL-185)의 세포증식이, TGF-β의 농도에 의존하여 억제되는 것이 나타내어졌다.

<9-2> 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β 유도성 세포증식억제의 저해활성

96웰 마이크로타이터 플레이트에 인간 폐암 유래 세포주 A-549(ATCC CCL-185, 5×10³개/웰)를 파종하여, 1일 배양했다. 이어서, 세포를 파종한 웰을, 0.1% FBS를 포함하는 D-MEM배지(100㎕)로 2회 세척했다.

각 웰에 여러 농도로 희석한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 또는 시판의 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)(농도: 0.625~40 ㎍/ml의 범위)를 가하여 37℃에서 2시간 프레 인큐베이션했다.

이어서, 인간 TGF-β1(최종농도: 0.1 ng/ml, R & D사제)을 첨가하여, 40시간 배양했다. 이어서, 각 웰에, [³H]-티미딘(1 μCi/웰)을 첨가하고 더욱이 6시간 배양했다. 세포를 MicroMate 196 cell harvester(PACKARD사제)를 사용하여 회수(하비스트)하여, 세포내에 섭취된 [³H]-티미딘의 양을 매트릭스 9600M(PACKARD사제)으로 측정했다.

또한, 양성대조시험으로서, 어느 하나의 항체도 가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 또한, 음성대조시험으로서 TGF-β1 및 어느 하나의 항체도 첨가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 결과를 도11에 나타낸다.

또한, 도4에, 본 시험(복수회)에 의해 측정한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β1 유도성 세포증식억제 저해활성의 유무를, 기호를 사용하여 간략화하여 나타냈다.

본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체는, TGF-β의 자극에 의한 인간 상피계 세포의 증식억제를 유의하게 저해하는 것이 나타내어졌다.

실시예 10 항인간 TβRⅡ 모노클로날항체의 TGF-β의 자극에 의한 세포외 매트릭스 및 세포증식인자의 생산촉진의 저해활성

TGF-β는 세포증식의 제어 뿐 아니라, 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin) 및 테나신 등의 세포외 매트릭스(ECM; Extracellular Martrix)의 생산을 촉진한다(Adv. Immunol., Vol.55, p.181, 1994 및 Seminars in Cell Biol., Vol.5, p.389, 1994).

또한, TGF-β는, ECM의 생산을 촉진할 뿐 아니라, FGF(fibroblast growth factor), TNF(Tumor necrosis factor), IL-1(Interleukin-1), 혈소판 유래 증식인자(Platelet-derived Growth Factor(PDGF)) 및 결합조직 성장인자(Connective Tissue Growth Factor(CTGF);Hcs24라고도 부른다. J. Cell Biology, Vol.114, No.6, p.1285-1294, 1991; Int. J. Biochem. Cell Biol., Vol.29, No.1, p.153-161, 1997; Circulation, Vol.95, No.4, p.831-839, 1997; Cell Growth Differ., Vol.7, No.4, p.469-480, 1996; J. Invest. Dermatol., Vol.106, No.4, p.729-733, 1996; J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.2, p.280-284, 1995; J. Invest. Dermatol., Vol.105, No.1, p.128-132, 1995) 등의 사이토카인이나 세포증식인자의 생산을 촉진한다.

본 시험에서는, 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의, TGF-β 자극에 의한 섬유아양 세포의 세포외 매트릭스 및 세포증식인자의 생산에 대한 저해효과를 아래와 같이 하여 조사했다.

96웰 마이크로타이터 플레이트에 인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427, 1×10⁴개/웰)을 파종하여, 1일 배양했다. 이어서, 세포를 파종한 웰을 0.1% FBS를 포함하는 MEM Earle's염 배지(100 ㎕)로 2회 세척하고, 0.1% FBS를 포함하는 MEM Earle's염 배지(100 ㎕)를 가하여, 1일 스타베이션 (starvation)했다.

이어서, 여러 농도로 희석한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체 또는 시판의 항인간 TβRⅡ 폴리클로날항체(R & D사제)(농도: 50 ㎍/ml)를, 각 웰에 가하여 2시간 프레인큐베이션했다.

이어서, TGF-β1(최종농도: 1~4 ng/ml, R & D사제)을 첨가하여, 65~72시간 배양했다. 이어서, 각 웰의 배양상청을 회수했다.

각각의 배양상청중의 피브로넥틴의 양을 피브로넥틴 EIA 키트(Fibronectin EIA Kit, 다까라주조사제)를 사용하여 측정했다.

또, 각각의 배양상청에 포함되는 결합조직 성장인자(CTGF)의 양을, 샌드위치 ELISA(Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.251,p.748-752,1998; 국제특허출원공개공보 WO99-33878호)로 측정했다.

또한, 양성대조시험으로서 어느 하나의 항체도 가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 또한, 음성대조시험으로서, TGF-β1 및 어느 하나의 항체도 첨가하지 않고 상기와 동일하게 하여 시험을 행했다. 결과를 도12 및 도13에 나타낸다.

또한, 도4에 본 시험(복수회)에 의해 측정한 본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 TGF-β1에 의해 유도되는 피브로넥틴 및 CTGF의 생산촉진 저해활성의 유무를 기호를 사용하여 간략화하여 나타냈다.

본 발명의 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체는, TGF-β에 의해 유도되는 인간 섬유아양 세포로부터의 세포외 매트릭스생산 및 세포증식인자의 생산을 유의하게 저해하는 것이 나타내어졌다.

실시예 11 TGF-βⅡ형 수용체 저해제의 신장질환에 대한 치료효과

기보와 동일한 방법에 따라, Wistar 래트(암컷, 150 g, 각군 5마리 또는 10마리, Charles River Laboratories Inc.제)에, 항Thy-1 모노클로날항체를, 500 ㎍/마리의 농도로 정맥내 투여하여 신장질환(신장염 및 신장섬유증 등의 증상)을 유도했다(Nephron, Vol.78, p.453-463, 1998; Kidney Blood Press Res., Vol.22, p.5-12, 1999).

항Thy-1 항체투여일(0일) 및 상기 항체투여로부터 4일 후에, 상기에서 조제한 항인간 TGF-βⅡ형 수용체 인간 모노클로날항체(클론: TRC175)를 10 mg/kg의 농도로 복강내 투여했다.

또한, 음성대조군에는, 생리식염수를 상기와 동일하게 하여 투여했다. 또한, 정상래트를 대조로 했다.

항인간 TGF-βⅡ형 수용체 인간 모노클로날항체에 의한 신장질환의 치료효과(신장기능 저하의 억제)는, 일반적인 방법에 따라 뇨중에 배설되는 단백질량(7일째) 및 혈청 크레아티닌(7일째)을 측정함으로써 해석했다.

더욱이, 항Thy-1 항체의 투여로부터 7일째에 각 피험동물로부터 채취한 신장의 동결조직 절편표본을 일반적인 방법에 따라 면역염색함으로써, 신장질환의 증상의 진행에 동반하여 증가하는 세포외 매트릭스인 피브로넥틴 및 I형 콜라겐의 양을 해석했다.

또한, 해당 세포외 매트릭스의 양은, 염색의 정도에 따라 아래와 같이 스코어화하여 구했다.

0점 : 사구체표본의 염색이 인정되지 않는다.

1점 : 사구체표본이 3분의 1까지 염색된다.

2점 : 사구체표본이 3분의 2까지 염색된다.

3점 : 사구체표본이 3분의 2 이상 염색된다.

결과를 도14 내지 도17에 나타낸다.

항TGF-βⅡ형 수용체항체의 투여군에서는, 음성대조에 비해 뇨중 단백질량의증가가 유의하게 억제되었다. 또한, 항TGF-βⅡ형 수용체항체의 투여군에서는, 음성대조에 비해, 혈청크레아티닌의 상승이 유의하게 억제되어, 그 양은 정상 래트와 동일한 정도였다.

더욱이, 항TGF-βⅡ형 수용체항체의 투여군에서는, 음성대조에 비해, 신사구체에서의 세포외 매트릭스의 생산이 유의하게 억제되어, 신장조직에 있어서의 섬유화가 억제되는 것이 나타내어졌다.

실시예 12 항인간 TβRⅡ 인간 모노클로날항체의 유전자서열 및 아미노산서열의 결정 및 해석

상기 실시예에서 제작된 여러 인간 TGFβRⅡ에 대한 인간 모노클로날항체를 구성하는 중쇄(Heavy Chain)의 가변영역을 코드하는 cDNA서열 및 경쇄(Light Chain)의 가변영역 및 정상영역을 코드하는 cDNA서열을 아래와 같이 하여 결정하는 동시에, 상기 유전자의 구조적 특징을 해석했다.

상기 실시예에서 제작한 인간 TGFβRⅡ에 대한 인간 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마(클론: TR4C175, TR4D204, TR4D455 및 TR4D465; 각각 약 1×10⁶세포)를 배양후, 원심분리하여, 침전물을 회수하고, 후술하는 PolyA⁺RNA의 추출시까지 -80℃에서 보존했다.

각각의 하이브리도마로부터의 PolyA⁺RNA의 추출, 정제는, 시판의polyA⁺quick 키트(Amersham Pharmacia제)를 사용하여 다음과 같이 하여 행했다. 상기 각각의 동결세포를, 세포용해 완충액(Lysis Buffer)에 용해하여, 시린지에 의해 세포를 파괴하여, 가용화시켰다. 상기 가용화물에 Oligo(dT) resin을 가하여 약 3분간 완만하게 진탕했다. 이어서, Oligo(dT) resin을 세척후, PolyA⁺RNA를 Ellution Buffer로 용출시켰다. 용출한 PolyA⁺RNA를 에탄올침전시켜, 20 ㎕의 Tris-EDTA 완충액에 용해했다. 얻어진 PolyA⁺RNA의 농도를, 260 nm의 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 결정했다.

얻어진 PolyA⁺RNA를 주형으로 하여, 시판의 cDNA synthesis Kit(GIBCO BRL제) 및 서열번호 19에 기재의 프라이머를 사용한 Reversetranscriptase법에 의해 두가닥 사슬 cDNA를 합성했다. 즉, 각각의 하이브리도마로부터 정제한 PolyA⁺RNA(1 내지 5 ㎍)를 주형으로 하여, 1st strand cDNA 및 2nd strand cDNA를 순차 합성했다. 상기 cDNA를, 페놀/클로로포름/이소아미노알코올 및 클로로포름을 사용하여 각각 1회씩 추출에 사용했다. 이어서, cDNA를 에탄올침전시켜, 어댑터 DNA(서열번호 20 및 서열번호 21)에 시판의 DNA Ligase(TOYOBO제)를 사용하여 연결시켰다. 더욱이 상기 DNA 반응물을 페놀/클로로포름/이소아미노알코올 및 클로로포름을 사용하여 각각 1회씩 추출에 사용했다.

이어서, 상기 DNA 반응물을 에탈올침전시켜, 시판의 제한효소 NotI(TOYOBO제)를 사용하여 소화하고, 시판의 ATP 용액(GIBCO BRL제)과 Nucleotide Kinase(TOYOBO제)로 그의 5'말단을 인산화했다. 이어서 얻어진 DNA 반응물을 폴리아크릴아미드겔전기영동으로 분획하여 약 500 bp~2000 bp의 DNA를 회수했다. 회수한 상기 DNA 각각과 시판의 람다 파지 벡터(lambda phage vector) λEXcell(Amersham Pharmacia제)을 시판의 DNA Ligase(TOYOBO제)를 사용하여 연결시켰다. 이어서 상기 DNA 반응물을 시판의 람다 파지 팩키징 키트 Gigapack III Gold(STRATAGENE)를 사용하여 람다 파지로 하고, 벡터 λEXcell에 첨부의 대장균 NM522를 숙주로 하여 cDNA 라이브러리로 했다.

각각의 cDNA 라이브러리를, 합성 올리고 DNA를 프로브로서 사용하여 일반적인 방법에 의해 스크리닝하고, 항체중쇄 및 항체경쇄를 각각 코드하는 cDNA를 조제했다. 항체중쇄의 프로브에는, 서열번호 22에 기재의 합성 올리고 DNA를 사용했다. 항체경쇄의 프로브에는, 서열번호 23에 기재의 합성올리고 DNA를 사용했다.

얻어진 각각의 cDNA의 염기서열의 결정을, 시판의 DyeTerminator Cycle Sequencing FS Kit(PE-Applied Biosystems제) 및 PRISM377 DNA Sequencer(PE-Applied Biosystems제)를 사용하여 행했다.

또한, 본 서열결정을 위한 Sequencing Primer는, 시판의 M13-20 프라이머(STRATAGENE), M13Reverse 프라이머(STRATAGENE)를 사용하고, 더욱이 항체중쇄의 본 서열결정을 위해서는 서열번호 24의 항체중쇄 정상영역의 서열을 가지는 Sequencing Primer를, 항체경쇄의 본 서열결정을 위해서는 서열번호 25의 항체경쇄 정상영역의 서열을 가지는 Sequencing Primer를 사용했다.

상기의 각각의 하이브리도마가 생산하는 인간 TGFβRⅡ에 대한 인간 모노클로날항체의 중쇄의 가변영역을 코드하는 cDNA서열, 경쇄(Light Chain)의 가변영역을 코드하는 cDNA서열 및 상기 각각의 cDNA서열로부터 추측되는 아미노산서열을 아래와 같이 서열표에 나타냈다.

<클론 TR4C175>

(중쇄의 가변영역)

DNA서열 : 서열번호 3(시그날서열: 염기번호 1 내지 57, V영역: 염기번호 58 내지 352)

아미노산서열: 서열번호 4(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 19, 가변영역: 아미노산번호 21 내지 117을 포함한다)

(경쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 11(시그날서열: 염기번호 1 내지 66, V영역: 염기번호 67 내지 352)

아미노산서열: 서열번호 12(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 22, 가변영역: 아미노산번호 23 내지 117을 포함한다)

<클론 TR4D204>

(중쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 5(시그날서열: 염기번호 1 내지 3, V영역: 염기번호 4 내지 295)

아미노산서열: 서열번호 6(시그날서열: 아미노산번호 1, 가변영역: 아미노산번호 2 내지 98을 포함한다)

(경쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 13(시그날서열: 염기번호 1 내지 57, V영역: 염기번호 58 내지 348)

아미노산서열: 서열번호 14(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 19, 가변영역: 아미노산번호 21 내지 116을 포함한다)

<클론 TR4D455>

(중쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 7(시그날서열: 염기번호 1 내지 57, V영역: 염기번호 58 내지 350)

아미노산서열: 서열번호 8(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 19, 가변영역: 아미노산번호 21 내지 116을 포함한다)

(경쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 15(시그날서열: 염기번호 1 내지 60, V영역: 염기번호 61 내지 362)

아미노산서열: 서열번호 16(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 20, 가변영역: 아미노산번호 22 내지 120을 포함한다)

<클론 TR4D465>

(중쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 9(시그날서열: 염기번호 1 내지 57, V영역: 염기번호 58 내지 353)

아미노산서열: 서열번호 10(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 19, 가변영역: 아미노산번호 21 내지 117을 포함한다)

(경쇄의 가변영역)

DNA서열: 서열번호 17(시그날서열: 염기번호 1 내지 51을 포함하는, V영역: 염기번호 52 내지 340)

아미노산서열: 서열번호 18(시그날서열: 아미노산번호 1 내지 17을 포함하는, 가변영역: 아미노산번호 18 내지 113을 포함한다)

결정된 각각의 DNA서열을 토대로, 유전자 서열해석 소포트웨어를 사용하여, Tomlinson 등에 의해 작성된 인간 이뮤노 글로불린의 가변영역 유전자의 라이브러리 V BASE Sequence(Immunol. Today, Vol.16, No.5, p.237-242, 1995)를 검색했다.

그 결과, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄 및 경쇄 각각의 V영역 유전자는, 각각 아래의 세그먼트로 구성되어 있었다.

<종쇄 V영역 유전자>

클론 TR4C175:3-21(DP-77)

클론 TR4D204:3-07(DP-54)

클론 TR4D455:5-51(DP-73)

클론 TR4D465:3-07(DP-54)

<경쇄 V영역 유전자>

클론 TR4C175:A30

클론 TR4D204:B-3(DPK-24)

클론 TR4D455:A19(DPK-15)

클론 TR4D465:A18(DPK-28)

실시예 13 항인간 TGF-βⅡ형 수용체 인간 모노클로날항체의 항원(인간 TGF-βⅡ형 수용체)에 대한 친화성 및 중화활성의 측정

상기에서 제작한 각종 항인간 TGF-βⅡ형 수용체 인간 모노클로날항체의 인간 TGF-βⅡ형 수용체와의 결합속도정수(ka), 해리속도정수(kd) 및 해리정수(Kd)를, 시판의 측정 키트 Biacore X(Amersham-Pharmacia제)를 사용하여 측정했다.

아래에 기술하는 항원(정제 인간 가용성 TβRⅡ)의 센서칩으로의 고정화 이외의 조작은, 시판의 측정키트 Biacore X(Amersham-Pharmacia제)에 첨부된 취급설명서 및 실험조작법에 따라 행했다.

키트에 부착된 플로 셀 1(Flow Cell-1)에, HBS완충액(0.01M의 HEPES, 0.15M의 NaCl, 3 mM의 EDTA 및 0.005%의 계면활성제 P20을 함유. pH7.0)을 5 ㎕/분으로 흘리고, 이어서 0.005M NHS(N-Hydroxysuccinimide)와 0.2M EDC(N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 된 용액(35 ㎕)을 첨가하여, 센서칩 표면에피복되어 있는 CM의 카르복실기를 활성화시켰다.

이어서, 70 ㎕의 실시예 2에서 조제한 정제 인간 가용성 TβRⅡ(30 ㎍/ml; 10 mM의 초산나트륨완충액(pH5.0)에 용해시켰다.)를 첨가하여, 상기 정제 인간 가용성 TβRⅡ를 센서칩에 고정화했다.

이어서, 미반응의 활성화된 카르복실기는, 35 ㎕의 1M Ethanol amine hydrochloride를 첨가함으로써 블록했다. 해당 고정화조작에 있어서, 고정화된 인간 가용성 TβRⅡ의 양은, 5234RU(resonance unit)였다. 또한, RU는 면적당 질량을 나타내고, 1 RU=1 pg/㎟이다.

레퍼런스로서의 플로 셀 2(Flow Cell-2)는, 상기 인간 가용성 TβRⅡ를 가하지 않고 상기와 동일하게 하여 처리함으로써 캡핑했다.

플로 셀(센서칩)에, 인산완충액을 20 ㎕/분의 유속으로 흘려, 상기 실시예에서 제작한 각각의 정제 항인간 TGF-βⅡ형 수용체 인간 모노클로날항체(40-100 ㎍/ml, 60 ㎕)를 첨가했다.

측정은, 결합상 3분간 및 해리상 200초간을 표준조건으로 하여 행했다. 항원에 대한 항체의 결합량 및 상기 항원으로부터의 항체의 해리량을 경시적으로 측정하여 센서그램(sensorgram)을 얻었다.

얻어진 센서 그램의 데이터를 토대로, 키트에 부착된 해석소프트(BIAevaluation3.0)를 사용하여, 결합속도정수(ka), 해리속도정수(kd) 및 해리정수(Kd; Kd=kd/ka)를 산출했다. 각각의 값을 아래에 나타낸다.

<클론명><ka(1/M.Sec)><kd[1/Sec]><Kd(M)>

TR4C1753.0×10⁵1.4×10^-25.1×10^-8

TR4D4555.2×10⁴1.2×10^-43.4×10^-9

TR4D2047.4×10³5.5×10^-47.5×10^-8

TR4D4651.2×10⁴2.3×10^-42.0×10^-8

TR2B 194.5×10⁵3.2×10^-31.0×10^-8

TR2B 645.2×10⁵3.6×10^-28.6×10^-8

TR2D2452.2×10⁵2.3×10^-41.1×10^-9

이 결과로부터 어느 하나의 항인간 TGF-βⅡ형 수용체 인간 모노클로날항체도, 인간 TGF-βⅡ형 수용체 대해 지극히 높은 결합친화성 및 중화활성을 가지고 있는 것이 명백해졌다.

산업상이용가능성

본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체는, 인간에 유래하는 항체인 것으로부터, 마우스 유래 항체 등의 비인간 포유동물 유래의 항체로 된 항체의약품의 치료상의 커다란 문제점(부작용)이었던 인간에 대한 항원성, 즉 HAMA(Human anti-mouse antigenicity)에 기인하는 숙주의 중독한 면역거절반응을 전혀 야기하지 않는 것으로부터, 항체의 의약품으로서의 가치를 극적으로 증대시키는 것이다.

따라서, 본 발명의 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체에 대표되는 상기 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 물질(다른 예로서는, 화학합성 저분자화합물이나 천연 동식물, 세균, 미생물 등으로부터의 단리화합물 등) 및 상기 물질을 포함하여 된 의약조성물은, TGF-β의 작용에 기인하는 여러 질환, 예를 들면, 신장질환(신장섬유증, 신장염, 신부전, 신장경화증 등), 폐질환(예를 들면, 폐섬유증, 폐렴 등), 간장질환(예를 들면, 간장조직 섬유증, 간경변, 간염 등), 피부질환(예를 들면, 창상, 강피증, 건선, 켈로이드 등), 관절염(예를 들면, 만성 류머치즘성관절염, 변형성 관절증 등), 혈관질환(예를 들면, 혈관재협착, 류마치성 혈관염 등), 여러 장기에서의 조직섬유증(여러 암에서 병발하는 조직섬유증을 포함한다) 및 동맥경화증(병발하는 조직섬유증을 포함한다) 등의 발증 및/또는 진행을 억제, 저지하여, 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약품으로서 유용하다.

Claims

인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제1항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 인간 TGF-β가 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합함으로써 생기는 시그날의 세포내로의 전달을 저해하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제1항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 아래의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부:

(a) 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 골육종 유래 세포주MG-63(ATCC CRL-1427)의 세포증식을 억제한다;

(b) 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 폐암세포주 A549(ATCC CCL-185)의 세포증식억제를 억제한다; 또는

(c) 인간 TGF-β1의 자극에 의해 유도되는 인간 골육종 유래 세포주 MG-63(ATCC CRL-1427)에 의한 피브로넥틴 또는 결합조직 성장인자의 생산을 억제한다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 인간항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 비인간 포유동물에 유래하는 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제4항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체가, 인간 TGF-βⅡ형 수용체를 발현하는 세포 또는 인간 TGF-βⅡ형 수용체의 전부 또는 일부를, 인간항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 비인간 포유동물에 면역함으로써 얻어지는 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 트랜스제닉 비인간 포유동물이, 트랜스제닉 마우스인 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄가변영역을 코드하는 V영역의 DNA가, DP-54(3-07), DP-73(5-51) 및 DP-77(3-21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 경쇄가변영역을 코드하는 V영역의 DNA가, A30, DPK-15(A19), DPK-24(B-3) 및 DPK-28(A18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄가변영역을 코드하는 V영역의 DNA가, DP-54(3-07), DP-73(5-51) 및 DP-77(3-21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하고, 또한 상기 인간 모노클로날항체의 경쇄가변영역을 코드하는 V영역의 DNA가, A30, DPK-15(A19), DPK-24(B-3) 및 DPK-28(A18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 V유전자 세그먼트에 유래하는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부.
제1항에 있어서, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄가변영역이, 하기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나의 아미노산서열을 포함하는 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부:

(a) 서열번호 4에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열;

(b) 서열번호 4에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(c) 서열번호 6에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 2 내지 98번째의 아미노산서열;

(d) 서열번호 6에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 2 내지 98번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(e) 서열번호 8에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열;

(f) 서열번호 8에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(g) 서열번호 10에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열; 또는

(h) 서열번호 10에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 117번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열.
제1항에 있어서, 상기 인간모노클로날의 경쇄가변영역이, 하기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나의 아미노산서열을 포함하는 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부:

(a) 서열번호 12에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 23 내지 117번째의 아미노산서열;

(b) 서열번호 12에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 23 내지 117번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(c) 서열번호 14에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열;

(d) 서열번호 14에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 21 내지 116번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(e) 서열번호 16에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 22 내지 120번째의 아미노산서열;

(f) 서열번호 16에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 22 내지 120번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열;

(g) 서열번호 18에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 18 내지 113번째의 아미노산서열; 또는

(h) 서열번호 18에 기재되는 아미노산서열의 아미노산번호 18 내지 113번째의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산서열.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날항체를 생산하는 세포.
제12항에 있어서, 상기 세포가, 상기 인간 모노클로날항체를 생산하는 능력을 포유동물 유래의 B세포와 포유동물 유래의 미엘로마세포를 융합하여 얻어지는 융합세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제12항에 있어서, 상기 세포가, 상기 인간 모노클로날항체의 중쇄를 코드하는 DNA 또는 그의 경쇄를 코드하는 DNA 중 어느 한쪽의 DNA, 또는 양쪽의 DNA가 세포내에 도입됨으로써 형질전환된 유전자 재조합 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물.
제15항에 있어서, 상기 의약조성물이, 인간 TGF-β가 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합함으로써 생기는 시그날의 세포내로의 전달을 저해하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
조직의 섬유화를 억제하기 위한 의약조성물로서, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제17항에 있어서, 상기 물질이, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 조직의 섬유화가, 폐, 간장, 신장 또는 피부에 있어서의 섬유화인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제19항에 있어서, 상기 조직의 섬유화가, 신장에 있어서의 섬유화인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
신장질환의 치료 또는 예방에 사용되는 의약조성물로서, 인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제17항에 있어서, 상기 물질이, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
인간 TGF-βⅡ형 수용체에 결합하여 상기 수용체를 매개로 하는 세포내로의 시그날전달을 억제 또는 저해하는 능력을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물로서, 상기 의약조성물이, 신장경화증, 폐섬유증, 간경변, 혈관재협착, 동맥경화증, 건선, 강피증, 아토피, 켈로이드 또는 관절염을 억제 또는 치료하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제17항에 있어서, 상기 물질이, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날항체 또는 그의 일부인 것을 특징으로 하는 의약조성물.