PL192082B1 - Sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG, koniugat hGRF-PEG i jego zastosowanie, związek [Lys (alloc)¹²ˑ²¹] -hGRF i związek [N α-izopropylo-Tyr¹,Lys (Alloc)¹²] -hGRF oraz kompozycja farmaceutyczna - Google Patents
Sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG, koniugat hGRF-PEG i jego zastosowanie, związek [Lys (alloc)¹²ˑ²¹] -hGRF i związek [N α-izopropylo-Tyr¹,Lys (Alloc)¹²] -hGRF oraz kompozycja farmaceutycznaInfo
- Publication number
- PL192082B1 PL192082B1 PL341139A PL34113998A PL192082B1 PL 192082 B1 PL192082 B1 PL 192082B1 PL 341139 A PL341139 A PL 341139A PL 34113998 A PL34113998 A PL 34113998A PL 192082 B1 PL192082 B1 PL 192082B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hgrf
- peg
- lys
- peptide
- conjugates
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 15
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims description 46
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 24
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 7
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 7
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 140
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 89
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 79
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 27
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 16
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 15
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 9
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- -1 succinimidyl ester Chemical class 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101000997535 Homo sapiens Growth hormone-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 2-[di(propan-2-yl)amino]ethylsulfanyl-methylphosphinic acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCSP(C)(O)=O UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 2
- UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 6-amino-2-[[(e)-(3-formylphenyl)methylideneamino]carbamoylamino]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1NC(=O)N\N=C\C1=CC=CC(C=O)=C1 SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 2
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 229920000361 Poly(styrene)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 101001075370 Rattus norvegicus Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 208000002854 epidermolysis bullosa simplex superficialis Diseases 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N sermorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N 0.000 description 2
- 229960002758 sermorelin Drugs 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJBNDXHENJDCBA-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-(prop-2-enoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OCC=C)C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 OJBNDXHENJDCBA-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical compound [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVESKLRPSXPGCH-UHFFFAOYSA-N 3,4,5-trichloro-2h-thiazine Chemical compound ClC1=C(Cl)C(Cl)=CSN1 GVESKLRPSXPGCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002375 Peptide(-Tyr) Polymers 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N Trinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1 UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011208 chromatographic data Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N ornithyl group Chemical group N[C@@H](CCCN)C(=O)O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- JAHCMOSSKRAPEL-IBFVROBCSA-N somatorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAHCMOSSKRAPEL-IBFVROBCSA-N 0.000 description 1
- 229960002090 somatorelin Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Birds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1. Sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG zawierajacego jedna albo wiecej jednostek PEG (na hGRF) kowalencyjnie zwiazanych z co najmniej jedna sposród Lys 12 , Lys 21 i N a , znamienny tym, ze obejmuje przeprowadzenie reakcji pegylacji miedzy peptydem hGRF i aktywowanym PEG w roztworze przy pH pomiedzy 7 a 9, a nastepnie izolowanie i oczysz- czanie pozadanego hGRF-PEG z mieszaniny. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG, koniugat hGRF-PEG i jego zastosowanie, związek [Lys(alloc)12,21]-hGRF i związek [Na-izopropylo-Tyr1,-Lys(Alloc)12]-hGRF oraz kompozycja farmaceutyczna.
We wczesnych latach '80 kilka zespołów wyizolowało czynnik uwalniający hormon wzrostu (GRF).
GRF (zwany również somatoreliną) jest peptydem wydzielanym przez podwzgórze, który działa na swój receptor i może promować uwalnianie hormonu wzrostu (GH) z przedniego płata przysadki. Występuje on jako peptyd o długości 44, 40 i 37 aminokwasów; postać obejmująca 44 aminokwasy może ulec przekształceniu w postaci krótsze. Istnieją doniesienia, że wszystkie trzy postaci są czynne, przy czym aktywność jest związanaz pierwszymi 29 aminokwasami. Syntetyczny peptyd odpowiadający sekwencji aminokwasowej 1-29 ludzkiego GRF [hGRF(1-29)], zwany również sermoreliną, wytworzono technologią rekombinacji DNA, jak to opisano w patencie europejskim EP 105 759.
Sermorelinę zastosowano w postaci octanu do diagnostyki i leczenia niedoboru hormonu wzrostu.
W rzeczywistości, GRF posiada wartość terapeutyczną w leczeniu niektórych zaburzeń związanych z hormonem wzrostu. Zastosowanie GRF do pobudzania uwalniania GH jest fizjologicznym sposobem zwiększania wzrostu kości długich albo anabolizmu białka.
Jeden z problemów związanych z zastosowaniem GRF polega na jego krótkim biologicznym okresie półtrwania (około 12-30 minut). hGRF(1-29)-NH2 jest przedmiotem degradacji enzymatycznej iulega gwałtownemu rozkładowi w osoczu przez cięcie dipeptydylopeptydazą IV (DPP-IV) pomiędzy resztami Ala2 i Asp3.
Stąd, korzystne jest opracowanie stabilnych biologicznie, długotrwale działających analogów GRF, przez chemiczną modyfikację GRF, w celu zapobieżenia albo spowolnienia rozkładu enzymatycznego.
Glikol polietylenowy (PEG) jest hydrofilowym, zgodnym biologicznie i nietoksycznym polimerem o wzorze ogólnym H(OCH2CH2)nOH, w którym n > 4. Jego ciężar cząsteczkowy może wahać się wgranicach od 200 do 20000.
Wykazano, że chemiczne sprzęganie PEG w postaci monometoksylowanej z białkami i/lub peptydami w sposób istotny wydłuża czas ich biologicznego działania. Podobnie jak grupy węglowodanowe w glikoproteinie, PEG zapewnia ochronną powłokę i zwiększa wielkość cząsteczki, zmniejszając wten sposób rozkład metaboliczny i tempo klirensu nerkowego.
Sprzęganie z PEG jest już ustaloną metodyką dla peptydów i białek, przy czym pionierskie prace opublikowali Davis i Abuchowski (Abuchowski i in., 1977a i 1977b). Sprzęganiepeptydów i białek zPEG zasadniczo powoduje niespecyficzne przyłączanie chemiczne PEG do więcej niż jednej reszty aminokwasowej. Jednym z kluczowych zagadnień tej technologii jest znalezienie odpowiedniej metody kowalencyjnego sprzęgania cząsteczek PEG z konkretnymi resztami aminokwasowymi.
Przykładowo, PEG aktywowany trichlorotiazyną, który jak stwierdzono jest toksyczny i reaguje nieswoiście, został zastąpiony przez różne reagenty PEG z chemicznymi resztami, które swoiście reagują z grupami aminokwasowymi (Benchamp i in., 1983; Veronese i in., 1985; Zalipsky i in., 1983; Zalipsky i in., 1990; i Delgado i in., 1990), z grupami sulfhydrylowymi (Sartore i in., 1991; Morpurgo iin., 1996) alboz resztami guanidynowymi (Pandei in., 1980).
Stwierdzono, że różne koniugaty PEG-białko są chronione przed proteolizą i/lub mają zmniejszoną immunogenność(Monfardini i in., 1995; Vamasuki i in., 1988).
Inna techniczna trudność pegylacji białek wynika z faktu, że koniugaty PEG z białkiem zwykle posiadają różną liczbę przyłączonych cząsteczek PEG i dają mieszaninę koniugatów o różnej stechiometrii PEG:białko. Ukierunkowana pegylacja pozostaje wyzwaniem dla chemików. Koniugacja PEG z GH przedstawia typowy przykład tego problemu (Clark i in., 1996). Wykazano, że reszty Lys wGH ulegały pegylacji w losowych pozycjach.
W celu uniknięcia albo zmniejszenia aktywności, enzymatycznej, miejsce aktywne można uprzednio chronić powodując w ten sposób pegylację enzymu w miejscu nieaktywnym (Caliceti i in., 1993).
Ostatnio zaproponowano inne podejście dla ukierunkowanego sprzęgania PEG z peptydami oniskim ciężarze cząsteczkowym, takimi jak GRF, wytworzonymi syntezą peptydów na podłożu stałym. W tych koniugatach aminokwas pegylowany, wytworzony wcześniej, wprowadzano do sekwencji peptydowej podczas syntezy w fazie stałej. Jednakże, procedura ta komplikuje dramatycznie oczyszczanie produktu, co, jak wiadomo, jest kluczowym etapem syntezy podłożu fazie stałej. Obecność PEG, z powodu jego wysokiego ciężaru cząsteczkowego i polidyspersyjności, daje produkt końcowy
PL 192 082 B1 o niemożliwych do zaakceptowania zanieczyszczeniach i/lub produkty z brakującymi aminokwasami, przy czym te ostatnie uważane są za występujące powszechnie w procedurze Merrifielda.
Ostatnio opisano w literaturze monopegylację, co oznacza, że tylko jedna cząsteczka PEG jest przyłączona, z użyciem syntezy na podłożu stałym, do swoistej reszty aminokwasowej [Ala15]-hGRF(1-29)-NH2 (Felix i in., 1995). Badanie wykazało, że [Ala15]-hGRF(1-29)-NH2 pegylowany na reszcie 21 albo 25 zachowuje pełną siłę działania in vitro macierzystego [Ala15]-hGRF(1-29)-NH2. Jednakże, nie istnieją dane in vivo wykazujące, że te pegylowane koniugaty wykazują dłuższy okres działania w porównaniu z nie-pegylowanymi odpowiednikami.
Całkiem ostatnio wykazano (Campbell i in., 1997), że przyłączenie PEG o różnych ciężarach cząsteczkowych do końca C kilku analogów hGRF, przy użyciu syntezy w fazie stałej, wywołało przedłużone trwanie działania na modelu świńskim i mysim w porównaniu z niepegylowanymi odpowiednikami.
Według wynalazku sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG zawierającego jedną albo więcej jednostek PEG (na hGRF) kowalencyjnie związanych z co najmniej jedną spośród
Lys12, Lys21 i Na, obejmuje przeprowadzenie reakcji pegylacji między peptydem hGRF i aktywowanym PEG w roztworze przy pH pomiędzy 7 a 9, a następnie izolowanie i oczyszczanie pożądanego hGRF-PEG z mieszaniny.
Korzystnie w sposobie według wynalazku roztwór jest stężonym wodnym roztworem nikotynamidu albo buforowanym wodnym roztworem czynnika denaturującego, albo stosuje się roztwór w polarnym rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid/bufor albo acetonitryl/bufor.
Korzystnie koniugat hGRF-PEG izoluje się z mieszaniny reakcyjnej i oczyszcza się metodami chromatograficznymi.
Korzystnym peptydem hGRF jest hGRF(1-29)-NH2.
W korzystnej postaci wykonania w sposobie według wynalazku przed reakcją pegylacji do peptydu hGRF wprowadza się grupy ochronne w jednej albo wielu pozycjach: N0 Lys12 i Lys21.
Korzystniej sposób według wynalazku obejmuje również reakcję usuwania grup ochronnych po reakcji pegylacji.
Korzystnie w sposobie według wynalazku aktywowanym PEG jest alkilujący albo acylujący PEG wmonometoksylowanej postaci.
Ponadto korzystnie reakcję pegylacji prowadzi się w temperaturze otoczenia.
W zakres wynalazku wchodzi także koniugat hGRF-PEG zawierający jedną albo wiele jednostek PEG (na hGRF) kowalencyjnie związanych z co najmniej jedną spośród Lys12, Lys21 i N0.
Korzystnie w koniugacie hGRF-PEG według wynalazku 1 jednostka PEG jest kowalencyjnie 12 21 związana z Lys12 albo 1 jednostka PEG jest kowalencyjnie związana z Lys21, albo 1 jednostka PEG jest kowalencyjnie związana z każdą spośród Lys12 i Lys12.
Szczególnie korzystnie w koniugaciehGRF-PEG 1jednostka PEG jest kowalencyjnie związana
21 α z każdą spośród Lys , Lys i N .
Wynalazek stanowi również koniugaty hGRF-PEG według wynalazku do zastosowania jako lek.
Wynalazek obejmuje również związek [Lys(alloc)12,21]-hGRF i związek [Na-izopropylo-Tyr1,Lys-(Alloc)12]-hGRF jako związki pośrednie w reakcji pegylacji w sposobie według wynalazku. W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie koniugatów według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania albo diagnostyki zaburzeń związanych z hormonem wzrostu, korzystnie do wytwarzania leku do leczenia albo diagnostyki niedoboru hormonu wzrostu (GHD).
Wynalazek obejmuje również kompozycję farmaceutyczną obejmującą koniugaty według wynalazku wraz z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub zaróbką.
W przeciwieństwie do wytwarzania monopegylowanych hGRF na podłożu stałym znanych ze stanu techniki, niniejszy wynalazek dotyczy ukierunkowanej pegylacji hGRF w fazie ciekłej.
Stwierdzono, że hGRF ma niską rozpuszczalność w roztworze buforów obojętnych/alkalicznych, czyli w warunkach, w których reakcja pegylacji zachodzi w sposób najskuteczniejszy. W rozcieńczonym roztworze hGRF, hydroliza aktywowanego PEG (takiego jak ester PEG) zmniejsza wydajność reakcji pegylacji.
Stwierdzono, że w odpowiednim rozpuszczalniku, w którym hGRF ma dobrą rozpuszczalność, możliwe jest przeprowadzenie reakcji ukierunkowanej pegylacji w fazie ciekłej. W ten sposób, nawet gdy wyjściowy peptyd hGRF nie jest chroniony, łańcuchy PEG będą wiązały się z dużą wydajnością i niemal wyłącznie z pierwszorzędowymi grupami aminowymi (grupy ε-aminowe) Lys12, Lys21 i/lub N0, zależnie od warunków reakcji. Otrzymano poniższe cztery koniugaty, stanowiące również przedmiot
PL 192 082 B1 wynalazku, przy czym stosunek stechiometryczny hGRF:PEG w koniugatach zależał głównie od stosunku molarnego PEG do hGRF:
koniugat hGRF-PEG, w którym 1 cząsteczka PEG związana była kowalencyjnie z Lys12;
koniugat hGRF-PEG, w którym 1 cząsteczka PEG związana była kowalencyjnie z Lys21;
21 koniugat hGRF-2PEG, w którym 2 cząsteczki PEG związane były kowalencyjnie z Lys12 i Lys21; 12 21 koniugat hGRF-3PEG, w którym 3 cząsteczki PEG związane były kowalencyjnie z Lys12 i Lys21 oraz Να.
W znaczeniu tu zastosowanym „Na” oznacza grupę aminową w pozycji N-końcowej peptydu (Tyr).
Po tym etapie, możliwe jest przeprowadzenie prostego frakcjonowania chromatograficznego koniugatów otrzymanych w reakcji, przez filtrację żelową albo przez bezpośrednie zastosowanie kolumny HPLC C18 eluowanej gradientem woda/acetonitryl. Korzystny jest drugi ze sposobów, ponieważ umożliwia on wytwarzanie i oczyszczanie produktów na dużą skalę.
Stąd, głównym wykonaniem niniejszego wynalazku jest sposób ukierunkowanego wytwarzania różnych koniugatów hGRF-PEG zawierających jedną albo więcej niż jedną cząsteczkę PEG (na hGRF) kowalencyjnie związanych z Lys12 i/lub Lys21 i/lub N^ charakteryzujący się tym, że reakcję koniugacji pomiędzy peptydem hGRF i aktywowanym PEG przeprowadza się w roztworze, zaś pożądany koniugat hGRF-PEG oczyszcza się, przykładowo metodami chromatograficznymi.
Według innego wykonania niniejszego wynalazku, jeżeli jedna albo więcej z tych trzech grup aminowych, z którymi wiąże się łańcuch PEG, będzie w odwracalny sposób chroniona przed pegylowaniem przez pewne grupy chemiczne, reakcja pegylacji da pożądane koniugaty o wybranych miejscach pegylacji, które następnie można wyizolować z mieszaniny reakcyjnej przez, przykładowo, ultrafiltrację albo inne metody chromatograficzne. W tym przypadku sposób wytwarzanie może ewentualnie obejmować reakcję usuwania grupy ochronnej.
Reakcję usuwania grupy ochronnej przeprowadza się korzystnie znanymi sposobami i zależnie od usuwanej grupy ochronnej.
Według wynalazku, określenie „hGRF”, o ile inaczej nie zaznaczono, ma obejmować dowolne peptydy ludzkiego hGRF, ze szczególnym odniesieniem do peptydów 1-44, 1-40, 1-29 i odpowiadających im amidów (zawierających grupę amidową na końcu N albo C). Korzystnym peptydem hGRF jest hGRF (1-29)-NH2, którego sekwencję aminokwasową podano jako Id. Sekw. nr. 1.
„Aktywowany PEG” (albo „czynnik pegylujący”) jest dowolną pochodną PEG, którą można zastosować jako modyfikator białka, ponieważ zawiera grupy funkcyjne zdolne do reagowania z niektórymi grupami funkcyjnymi w białku/peptydzie z wytworzeniem koniugatów PEG-białko/peptyd. Podsumowanie pochodnych PEG przydatnych jako modyfikatory białka można znaleźć w Harris (1985). Aktywowany PEG może być reagentem alkilującym, takim jak aldehyd PEG, epoksyd PEG albo tresylan PEG, albo może też być reagentem acylującym, takim jak ester PEG.
Aktywowany PEG jest korzystnie stosowany w postaci monometoksylowanej. Korzystnie ma on ciężar cząsteczkowy od 2000 do 20000. Monometoksylowany PEG5000 jest szczególnie korzystny do wytwarzania aktywowanego PEG stosowanego w sposobie według wynalazku.
Jeżeli aktywowany PEG jest czynnikiem acylującym, korzystnie zawiera on resztę norleucynową albo ornitynową związaną z cząsteczką PEG przez wiązanie amidowe. Te reszty umożliwiają precyzyjne określenie związanych jednostek PEG na mol peptydu (patrz, przykładowo Sartore i in., 1991). Stąd, jeszcze konkretniej, korzystnym aktywowanym PEG jest monometoksylowany PEG5000 powiązany wiązaniem amidowym z grupą alfa aminową norleucyny, która jest aktywowana na grupie karboksylowej jako ester sukcynimidylowy.
W powszechnym użyciu są również rozgałęzione PEG. Rozgałęzione PEG mogą być przedstawiane jako R(-PEG-OH)m, w których R oznacza centralną grupę rdzeniową, taką jak pentaerytrytol albo gliceryna, zaś m oznacza liczbę rozgałęzień. Liczba rozgałęzień (m) może zmieniać się od trzech do stu albo więcej. Grupy hydroksylowe są przedmiotem modyfikacji chemicznej.
Inna postać rozgałęziona, taka jak opisana w zgłoszeniu PCT WO 96/21469, ma jeden z końców, który jest przedmiotem modyfikacji chemicznej. Ten rodzaj PEG może być przedstawiony jako (CH3O-PEG-)PR-X, w którym p równa się 2 albo 3, R oznacza centralny rdzeń, taki jak lizyna albo gliceryna, zaś X oznacza grupę funkcyjną taką jak karboksylowa, która ulega aktywacji chemicznej. Jeszcze inna postać rozgałęziona, tzw. „pendant PEG” ma grupy reaktywne, takie jak karboksylowa wzdłuż szkieletu PEG zamiast na końcu łańcuchów PEG.
Wszystkie z tych PEG można „aktywować” jak wskazano wyżej.
PL 192 082 B1 „Metody chromatograficzne” oznaczają dowolną technikę, którą stosuje się do rozdziału składników mieszaniny przez ich oddziaływanie z podłożem (fazą stacjonarną), przez którą przepływa rozpuszczalnik (faza ruchoma). Zasada rozdziału chromatografii opiera się na różnicy właściwości fizycznych fazy stacjonarnej i ruchomej.
Niektóre konkretne rodzaje metod chromatograficznych, które są dobrze znane w literaturze obejmują: chromatografię cieczową, wysokociśnieniową cieczową, jonowowymienną, absorpcyjną, powinowactwa, rozdziału, hydrofobową, z odwróconymi fazami, filtrację żelową, ultrafiltrację albo chromatografię cienkowarstwową.
„Pegylacja” jest reakcją, dzięki której otrzymuje się koniugat PEG-białko/peptyd wychodząc z aktywowanego PEG i odpowiedniego białka/peptydu.
Stosunek molowy PEG do hGRF może wynosić 1:1, 2:1 albo 3:1, zależnie od tego, który z koniugatów ma być otrzymany z duża wydajnością.
Rozpuszczalnik reakcji pegylacji wybrany jest z grupy obejmującej silnie stężony roztwór wodny nikotynamidu, buforowany roztwór wodny czynnika denaturującego (takiego jak mocznik) albo rozpuszczalnik polarny wybrany z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid/bufor albo acetonitryl/bufor.
pH roztworu utrzymuje się pomiędzy 7 i 9.
21
Nie ograniczająca lista ochronnych grup dla Lys12 i Lys21 obejmuje: grupę Alloc (alliloksykarbonylową), Dde (1-(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylową), Adpoc (1-(1'-adamantylo)-1-metylo-etoksykarbonylową) albo 2-C1-Z (2-chlorobenzyloksykarbonylową). Dla grup lizynowych korzystną grupą ochronną jest Alloc.
Po pegylacji grupę Alloc można usunąć jednym ze sposobów opisanych w Greene i in., 1991. Dde można usunąć 2% hydrazyną w DMF (patrz, Chan i in., 1995). Adpoc można usunąć podobnie jak Alloc (patrz również Dick i in., 1997). 2-C1-Z może wymagać deprotekcji silniejszym kwasem (HF,
TFMSA, HBr) albo uwodornienia (patrz również, Tam i in., 1987).
Grupami ochronnymi dla Na mogą być grupy alkilowe, takie jak metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, t-butylowa, benzylowa albo cykloheksylowa. Grupa izopropylowa jest korzystna. Te grupy alkilowe można wprowadzać przez alkilację redukcyjną (patrz, Murphy i in., 1988; Hocart i in., 1987).
α 12 12,21
[N -izopropylo-TyrLys(alloc) ]-hGRF oraz [Lys(alloc) , ]-hGRF są również objęte niniejszym wynalazkiem jako przydatne i nowe związki pośrednie reakcji pegylacji.
Stwierdzono, że reakcja pegylacji w sposobie według wynalazku:
1. nie modyfikuje konformacji peptydu;
2. zwiększa odporność na rozkład proteolityczny;
3. nie wpływa albo tylko nieznacznie zmniejsza aktywność biologiczną, zależnie od zakresu pegylacji; i
4. umożliwia otrzymanie produktów (koniugatów), które są bardziej rozpuszczalne w buforowanych roztworach wodnych.
W dalszym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza zastosowania koniugatów według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania albo diagnozowania zaburzeń związanych zhormonem wzrostu, takich jak np. niedobór hormonu wzrostu (GDH), w szczególności pediatryczny niedobór hormonu wzrostu.
Lek jest korzystnie w postaci kompozycji farmaceutycznej obejmującej koniugaty według wynalazku z jednym albo wieloma dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami i/lub zaróbkami.
Farmakologicznie czynne ilości koniugatów według wynalazku można podawać osobnikowi narażonemu na ryzyko rozwoju choroby związanej z hormonem wzrostu albo osobnikowi wykazującemu już taką patologię.
Sposób leczenia, zapobiegania albo diagnostyki zaburzenia związanego z hormonem wzrostu, obejmuje podawanie skutecznej ilości koniugatów według wynalazku w obecności jednego albo wielu zaróbek dopuszczalnych farmaceutycznie.
„Skuteczna ilość” dotyczy ilości składnika czynnego, która jest wystarczająca do wpływu na przebieg albo ciężkość opisanego wyżej zaburzenia, prowadząc do zmniejszenia albo remisji patologii. Skuteczna ilość zależy od drogi podania oraz stanu pacjenta.
Określenie „dopuszczalne farmaceutycznie” obejmuje dowolny nośnik, który nie zakłóca skuteczności aktywności biologicznej składnika czynnego i nie jest toksyczny wobec gospodarza, któremu się go podaje. Przykładowo, do podawania pozajelitowego, powyższe składniki można formułować
PL 192 082 B1 w postaci dawek jednostkowych do wstrzykiwania w nośnikach, takich jak roztwór soli, roztwór dekstrozy, albumina surowicy i roztwór Ringera.
Oprócz nośników dopuszczalnych farmaceutycznie, kompozycja według wynalazku może również obejmować niewielkie ilości dodatków, takich jak stabilizatory, zaróbki, bufory i konserwanty.
Można zastosować dowolną drogę podawania zgodną ze składnikiem czynnym. Korzystną drogą podania jest droga pozajelitowa, taka jak wstrzyknięcie podskórne, domięśniowe albo dożylne. Podawana dawka składnika czynnego zależeć będzie od wskazania zależnie od wieku, ciężaru i osobniczej reakcji pacjenta.
Dawka składnika czynnego do terapii człowieka może zawierać się pomiędzy 5 a 6000 μg/kg ciężaru ciała, zaś korzystnie pomiędzy 10 i 300 μg/kg ciężaru ciała.
Wynalazek został opisany w odniesieniu do konkretnych wykonań, ale zawartość opisu obejmuje wszystkie modyfikacje i zastąpienia, które mogą być przeprowadzone przez specjalistę w dziedzinie, bez wychodzenia poza znaczenie i przeznaczenie zastrzeżeń.
Wynalazek zostanie opisany przez poniższe przykłady, których nie należy uważać za ograniczenie niniejszego wynalazku. Przykłady odnoszą się do załączonych figur.
Figura 1 pokazuje sekwencję aminokwasową hGRF(1-29)-NH2. Strzałki wskazują ewentualne miejsca pegylacji.
Figura 2 pokazuje chromatografię HPLC z odwróconymi fazami mieszaniny otrzymanej po reakcji pegylacji w DMSO przeprowadzonej w sposób opisany w przykładzie 1. Pierwsze dwa główne piki odpowiadają koniugatom zawierającym 1łańcuch PEG na mol hGRF. Następujące później mniejsze piki oznaczają koniugat hGRF:2PEG, zaś najmniejszy pik oznacza koniugat hGRF:3PEG.
Figura 3a przedstawia rozkład hGRF(1-29) i koniugatów PEG według wynalazku przez subtylizynę.
Figura 3b przedstawia rozkład hGRF(1-29) i koniugatów PEG według wynalazku przez chymotrypsynę.
12,21
Figura 4 przedstawia charakterystykę spektroskopową [Lys(MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF-(1-29) -NH2] przeprowadzoną metodą dichroizmu kołowego. Widma można odnieść względem „natywnego”hGRF.
Figura 5 przedstawia działanie biologiczne różnych koniugatów hGRF-PEG (z pierwszej partii wytwarzanej w DMSO) w teście in vitro CHO-hGRF-LUC. Dane wyrażają średnią z trzech niezależnych doświadczeń.
Figura 6 pokazuje działanie biologiczne różnych koniugatów hGRF-PEG (z drugiej partii wytwarzanej w DMSO) w teście in vitro CHO-hGRFR-LUC. Dane wyrażają średnią z dwóch niezależnych doświadczeń.
Figura 7 pokazuje działanie biologiczne różnych koniugatów hGRF-PEG (z partii wytwarzanej w nikotynamidzie) w teście in vitro CHO-hGRFR-LUC. Dane wyrażają średnią z dwóch niezależnych doświadczeń.
Figura 8 pokazuje działanie biologiczne różnych koniugatów hGRF-PEG (z pierwszej partii wytwarzanej w DMSO) na uwalnianie GH z komórek przysadki szczura in vitro.
Figura 9 pokazuje działanie biologiczne różnych koniugatów hGRF-PEG (z drugiej partii wytwarzanej w DMSO) na uwalnianie GH z komórek przysadki szczura in vitro.
Figura 10 pokazuje krzywą reakcji poziomów osoczowego hGRF i surowiczego GH w czasie po podaniu hGRF (400 μg/szczura) i.v. Każdy z punktów przedstawia średnią ± SEM otrzymaną z 9 szczurów.
Figura 11A(patrz pierwszy wykres na stronie) pokazuje krzywą reakcji poziomu surowiczego GH w czasie po wstrzyknięciu i.v. 400 μg/szczura koniugatów hGRF-PEG (wytwarzanie DMSO) uszczurów. Każdy z punktów oznacza wartość średnią obliczoną dla trzech szczurów.
Figura 11B (patrz drugi wykres na stronie) pokazuje krzywą reakcji poziomu osoczowego hGRF w czasie po wstrzyknięciu i.v. 400 μg/szczura koniugatów hGRF-PEG (wytwarzanie DMSO) u szczurów. Każdy z punktów oznacza wartość średnią obliczoną dla trzech szczurów.
Figura 12 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pcDNAS-hGRF-R zastosowanego w teście z genem reporterowym do badania aktywności GRF.
Figura 13 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTF5-53LUC zastosowanego w teście z genem reporterowym do badania aktywności GRF.
PL 192 082 B1
Przykłady
Skróty
Acetonitryl (ACN), alliloksykarbonyl (Alloc), benzyl (BZL), tert-butyloksykarbonyl (Boc), dichlorometan (DCM), diizopropyloetyloamina (DIEA), dimetyloformamid (DMF), dimetylosulfotlenek (DMSO), 9-fluorenylometyloksykarbonyl (FMOC), heksafluorofosforan 2-[1H-benzotriazolo-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy (HBTU), 1-hydroksybenzotriazol (HOBt), eter metylowo-t-butylowy (MTBE), norleucyna (Nie), N-metylopirolidon (NMP), 2,2,5,7,8-pentametylo-chromano-6-sulfonyl (Pmc), tert-butyl (tBu), kwas trifluorooctowy (TFA), trifenylometyl (Trt).
Przykład 1.Pegylacja hGRF w fazie ciekłej (w roztworze)
W tych doświadczeniach jako reagent pegylujący zastosowano monometoksylowany PEG5000 (MPEG5000) połączony przy użyciu wiązania amidowego z grupą alfa aminową norleucyny, którą aktywowano na grupie karboksylowej jako ester sukcynimidylowy. Można go wytworzyć, przykładowo, jak to opisano w Lu i in., 1994.
Ludzki GRF1-29hGRF(1-29)-NH2 dostarczony przez Bachem zastosowano jako peptyd hGRF.
Z powodu słabej rozpuszczalności hGRF(1-29) w roztworach wodnych o obojętnym albo lekko alkalicznym pH koniecznym do pegylacji, zastosowano alternatywne warunki od A do E:
A. Dimetylosulfotlenek: 20 mg peptydu rozpuszczono w 1ml DMSO i dodano odpowiednią ilość reagenta pegylującego.
B. Dimetyloformamid/0,2 M bufor boranowy pH 8,0 w stosunku objętościowym 1:1, peptyd i odpowiednią ilość reagenta pegylującego dodano odrazu.
C. Wysoce stężony wodny roztwór nikotynamidu (200 mg/ml): 200 mg nikotynamidu dodano do roztworu 40 mg hGRF (1-29) w 1ml 10 mM kwasu octowego, 1ml 0,2M buforu boranowego o pH 8,0 dodano do kwaśnego roztworu w celu uzyskania pożądanego pH przed dodaniem odpowiednich ilości reagenta pegylującego.
D. Acetonitryl/0,2 M bufor boranowy pH 8,0 w stosunku objętościowym 1:1 i odpowiednia ilość reagenta pegylującego dodana od razu.
E. 0,2 M bufor boranowy, 5 M mocznik, pH 8,0 i odpowiednia ilość reagenta pegylującego dodana od razu.
Suchy reagent pegylujący dodano mieszając do uzyskania stosunku molowego PEG:hGRF równego 1:1, 2:1 albo 3:1. Korzystny był stosunek 2:1.
Zastosowanie różnych stosunków molowych PEG:hGRF umożliwiło wytworzenie mieszaniny reakcyjnej z pożądanym koniugatem jako dominującym.
Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 5 godzin w temperaturze pokojowej, po czym oczyszczono.
Otrzymano następujące 4koniugaty hGRF-PEG (A1-A4):
A1: [Lys (MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2],
A2: [Lys (MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2],
A3: [Lys (MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(1-29)-NH2] i
A4: Nc,-((MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO) [Lys(MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12’21-hGRF(1 -29)-NH2].
Nadmiar DMSO, DMF, ACN i mocznika oraz produkty uboczne reakcji (hydroksysukcynimid) usunięto przez ultrafiltrację żelową stosując membranę o ciężarze odcięcia 1000 Da. Objętość doprowadzono do 10 ml przy użyciu 10 mM kwasu octowego i zmniejszono do 1ml. Procedurę powtarzano trzykrotnie.
Koniugaty hGRF-PEG wyizolowano przez chromatografię żelową albo chromatografię z odwóconymi fazami.
Przykład 2. Chromatografia żelowa
Metodą chromatografii żelowej produkty frakcjonowano na podstawie różnych ciężarów cząsteczkowych składników (w tym przypadku koniugatów hGRF-PEG 1:1 MW=8358, hGRF-PEG 1:2 MW = 13358 i hGRF-PEG 1:3 MW = 18358, nie sprzęgnięty hGRF MW = 3358). Rozdział przeprowadzono stosując szeregowy układ kolumnSuperdex 75 -Superose 12 (Biotech, Pharmacia) eluując 10 ml kwasu octowego przy prędkości przepływu 1,5 ml/min.
Zebrane frakcje po 1ml analizowano na OD przy 280 nm na zawartość białka i w teście jodkowym na zawartość PEG (Sims i in., 1980).
Po pegylacji w DMSO przy stosunku molowym hGRF:PEG 1:1 otrzymano trzy piki: koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 132 ml (główny pik); koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 108 ml (mniejszy pik); i niesprzęgnięty hGRF przy objętości elucji 108 ml (mniejszy pik).
PL 192 082 B1
Po pegylacji w DMSO przy stosunku molowym hGRF:PEG równym 1:2 otrzymano trzy piki: koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 108 ml (główny pik); koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 132 ml (mniejszy pik); i koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 73 ml (mniejszy pik).
Po pegylacji w DMSO przy stosunku molowym hGRF:PEG 1:3 otrzymano dwa piki: koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 73 ml (główny pik); koniugat hGRF-PEG przy objętości elucji 108 ml (mniejszy pik).
Eluowane frakcje pików zebrano, zatężono przez ultrafiltrację stosując membranę o ciężarze odcięcia 1000 Da, liofilizowano, rozpuszczono w 10 mM kwasie octowym i scharakteryzowano jak opisano w celu identyfikacji i obliczenia ilościowego.
Pik przy objętości 73 ml odpowiadał związkowi A4.
Piki przy objętości 132 ml odpowiadał związkowi A3.
Pik przy objętości 108 ml odpowiadał mieszaninie związków A2 i A1.
Pik przy objętości 232 ml odpowiadał związkowi nie sprzęgniętemu hGRF.
Jednakże, ten sposób oczyszczania nie umożliwia rozdzielenia koniugatów hGRF-PEG o tym samym ciężarze, ale różnym miejscu pegylacji (izomery pozycyjne).
Przykład 3. Chromatografia z odwróconymi fazami
Bardziej specyficzne frakcjonowanie przeprowadzono przez chromatografię hydrofobową stosując kolumnę RP-HPLC C18. Procedura pozwoliła rozdzielić ewentualne izomery o tym samym ciężarze cząsteczkowym. W rzeczywistości, przy użyciu tej metody pojedynczy pik odpowiadający koniugatom o 1PEG kowalencyjnie związanym otrzymany przez filtrację żelową uległ rozdzieleniu na dwa piki.
Chromatografię z odwróconymi fazami przeprowadzono stosując preparatywną kolumnę RP-HPLC C18 (Vydac), eluowaną gradientem H2O/0,05% TFA (Eluent A) i acetonitryl/0,05% TFA (eluent B) w następujący sposób:
0-5 min. 5-35 min. 35-38 min 38-40 min
35% A 35% A 2% A 2% A
2% A
35% A
Prędkość przepływu 10 ml/min.; pętla 1 pi; wykrywanie UV-Vis. 280 nm.
Po pegylacji w DMSO przy stosunku molowym hGRF:PEG 1:1, otrzymano 4 piki:
13,2 min. 13,7 min. 14,4 min. 8,9 min.
główny pik; główny pik; mniejszy pik; i mniejszy pik.
Po pegylacji wDMSO przy stosunku molowym hGRF:PEG 1:2, otrzymano 4 piki:
13,2 min. 13,7 min.
14.4 min.
15.5 min.
mniejszy pik; mniejszy pik; główny pik; i mniejszy pik.
Po pegylacji w DMSO przy stosunku molowym hGRF:PEG 1:3, otrzymano 2 piki:
14,4 min. mniejszy pik; i
15,5 min. mniejszy pik;
Eluowane frakcje pików zebrano, odparowano w celu wyeliminowania acetonitrylu i TFA, a następnie liofilizowano. Suchy produkt rozpuszczono w 10 mM roztworze kwasu octowego i analizowano w opisany sposób.
Koniugat eluowany przy 13,2 min. był związkiem A1(GRF-1PEG, 1-szy pik).
był związkiem A2 (GRF-1PEG, 2-gi pik). był związkiem A3 (GRF-2PEG). był związkiem A4 (GRF-3PEG).
Pik otrzymany podczas eluowania przy 8,9 min. był niesprzęgniętym hGRF.
Jako typowy przykład, chromatografię z odwróconymi fazami produktów pegylacji otrzymanych przy stosunku molowym PEG:hGRF 2:1 przedstawiono na fig. 2.
Suchy produkt otrzymano przez odparowanie rozpuszczalnika/liofilizację.
Koniugat eluowany przy 13,7 min. Koniugat eluowany przy 14,4 min. Koniugat eluowany przy 15,5 min.
PL 192 082 B1
Pr zy kł a d 3a. Pegylacja hGRF w fazie ciekłej przy użyciu PEG1000
W tym przykładzie zastosowano rozgałęziony monometoksy PEG o ciężarze cząsteczkowym 10000 z lizyną jako odstępnikiem (Shearwater Polymers, Inc.). Ten rozgałęziony PEG otrzymano przez połączenie każdej z grup aminowych lizyny z PEG5000.
Aktywowaną jako ester sukcynimidylowy grupę karboksylową lizyny, która jest odstępnikiem, poddano reakcji w DMSO z grupami aminowymi hGRF(1-29)-NH2 przy stosunku molowym 0,9 PEG do 1 GRF.
Rozpuszczalnik usunięto i frakcjonowano pozostałość przez chromatografię żelową na preparatywnej kolumnie Superose 12 TM. Eluowano frakcje dwóch pików odpowiadające dwóm koniugatom hGRF-PEG. Pierwszy mniejszy pik odpowiadał koniugatowi o dwóch jednostkach PEG sprzęgniętych z hGRF, drugi większy pik odpowiadał koniugatowi o jednej jednostce PEG sprzęgniętej z hGRF.
Pr zy kł a d 3a. Pegylacja hGRF w fazie ciekłej przy użyciu PEG20000
W tym przykładzie zastosowano rozgałęziony monometoksy PEG o ciężarze cząsteczkowym 20000 z lizyną jako odstępnikiem (Shearwater Polymers, Inc.).
Ten rozgałęziony PEG otrzymano przez połączenie każdej z grup aminowych lizyny z PEG10000.
Grupę karboksylową odstępnika lizynowego aktywowaną jako ester sukcynimidylowy poddano reakcji w DMSO z grupami aminowymi hGRF(1-29)-NH2 stosując stosunek molowy 0,9 PEG do 1GRF.
Rozpuszczalnik usunięto i frakcjonowano pozostałość przez chromatografię żelową na preparatywnej kolumnie Superose 12 TM. Otrzymany pojedynczy pik odpowiadał koniugatowi zawierającemu jedną jednostkę PEG20000 sprzęgniętą z hGRF.
Pr zy kł a d 4. Charakterystyka analityczna koniugatów hGRF-PEG
Produkty otrzymane w opisany sposób badano w kierunku związanych łańcuchów PEG na podstawie następujących testów:
1. metodę kolorymetryczną opartą na sulfonianie trinitrobenzenu zastosowano do określenia wolnych grup aminowych (jak opisano w Habeed i in., 1966);
2. metodę kolorymetryczną opartą na teście jodkowym zastosowano w celu określenia zawartości PEG (jak to opisano w Sims i in., 1980);
3. określanie liczby łańcuchów PEG na norleucynie jako reporter łańcuchów w analizie aminokwasowej (Sartore i in., 1991);
4. spektroskopię mas zastosowano w celu określenia ciężaru cząsteczkowego koniugatów.
Spektrometrię mas MALDI zastosowano w celu stwierdzenia ciężaru cząsteczkowego koniugatów i ich polidyspersyjności wynikającej z polidyspersyjności PEG.
Analizę miejsc przyłączenia PEG w koniugatach hGRF-PEG przeprowadzono na podstawie sekwencji aminokwasowej. Każdą próbkę rozcieńczono 100-krotnie. 10 μΐ roztworu (około 50 pmoli) wprowadzono do sekwenatora.
Czystość produktu końcowego potwierdzono przez chromatografię analityczną RP-HPLC.
Analizę przeprowadzono stosując kolumnę RP-HPLC C18 (Vydac), eluowaną gradientem H2O/0,05%TFA (Eluent A) i acetonitryl/0,05% TFA(eluent B) w następujący sposób:
0-5 min. 80% A
5-50 min. 80% A > 5% A
50-52 min. 5% A
52-54 min. 5% A >80% A
Prędkość przepływu 1 ml/min.; pętla 20 μ|; wykrywanie UV-Vis. 226 nm.
Nie sprzęgnięty hGRF eluował w 20,7 min.
Związek A1 eluował w 22,9 min, związek A2 eluował przy 23,4 min., związek A3 eluował przy 24,4 min., zaś związek A4 przy 25,5 min.
Charakterystykę konformacyjną natywnego i związanego z polimerem peptydu przeprowadzono przy użyciu analizy metodą dichroizmu kołowego.
Charakterystykę spektroskopową nie sprzęgniętego hGRF i hGRF-PEG przeprowadzono metodą analizy dichroizmu kołowego w zakresie 190-300 nm. Próbki (50 μΙ/ml) rozpuszczono w 10 mM kwasie octowym albo mieszaninie metanolu z 10 mM kwasem octowym w stosunku molowym 30:70 i 60:40. We wszystkich powyższych mieszaninach nie sprzęgnięty hGRF i koniugaty hGRF-PEG wykazywały zachowanie „superimpozyjne”, jak pokazano na fig. 4 dla związku A3. W roztworze kwasu octowego peptydy wykazywały losową konformację, podczas gdy zwiększenie zawartości metanolu powodowało konformację α-helisy.
PL 192 082 B1
Wyniki pokazują, że sprzęganie PEG nie zmienia w sposób istotny właściwości strukturalnych peptydu.
Przykład 5. Badanie stabilności koniugatów hGRF-PEG
Stabilność wobec proteolizy hGRF i koniugatów hGRF-PEG badano stosując enzymy proteolityczne, takie jak subtylizyna i chymotrypsyna.
Badanie z subtylizyną przeprowadzono przez inkubowanie w 4°C 0,297 mM roztworu peptydu w 0,1 M Tris HC1 0,05 M CaCl2pH 8,0 w stosunku peptyd/proteaza 1:50000.
W przypadku chymotrypsyny, peptyd rozpuszczono w 0,08 M Tris HCl, 0,1 M CaCl2 pH 7,8 w stosunku peptyd/proteaza 1:15000.
Rozkład badano analityczną RP-HPLC stosując kolumnę C18 eluowaną w tych samych warunkach co opisane w przykładzie 4. Wysokość odpowiednich pików dla związku wyjściowego obliczono przed inkubacją z enzymem proteolitycznym i po określonych okresach inkubacji. Procent pozostałej wysokości w określonym czasie obliczono i przedstawiono na fig. 3a i b.
Przykład 6. Pegylacja z alkilującym PEG hGRF sprzęgnięto z monometoksylowanym PEG aktywowanym różnymi grupami arylującymi, jak również alkilującymi.
Alkilujący PEG wykazywał zalety uzyskiwania koniugatów, które zachowywały ładunek dodatni na reszcie lizynowej.
Izolowanie i charakterystykę przeprowadzono jak to opisano w przykładach 1-4.
Przykład 7. Badanie aktywności koniugatów hGRF-PEG
Materiały
Związki badane
Ludzki hGRF1-29 hGRF (1-29)-NH2, partia 1299201, Bachem;
Ludzki hGRF3-29hGRF (3-29)-NH2, Bachem;
Ludzki hGRF3-29ISL; i koniugaty hGRF-PEG wytworzone w opisany wyżej sposób.
Reagenty
Test in vitroCHO-hGRF-LUC
Pożywka MEM alfa z rybonukleozydami i dezoksyrybonukleozydami (GIBCO) z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej (GIBCO) + 600 μg/ml siarczanu genetycyny G418 (Gibco).
Odczynnikdo lizy komórkowej (Promega);
Reagent do testu lucyferazy (Promega);
Luclite (Packard).
Test biologiczny in vitrokomórek przysadki szczura
Zrównoważona sól Earle'a (EBSS) GIBCO) z dodatkiem 50 μg/ml siarczanu gentamycyny (Sigma).
Pożywka 199 (M199) z solami Earle'a (Gibco) z 12,5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 50 μg/ml siarczanu gentamycyny.
Szczurzy zestaw GH z Amersham.
Roztwór enzymów do trawienia tkanek (do 30 ml EBSS).
120 mg kolagenazy (Sigma) mg hialuronidazy (Sigma) mg DNAzy I (Sigma)
900 mg BSA (Sigma)
Po odtworzeniu, roztwór sterylizowano przez filtrowanie i umieszczono w 37°C.
Test biologiczny in vivo
Test radioimmunologiczny szczurzego GH zakupiono w Amersham.
Zestaw radioimmunologiczny ludzkiego GRF(1-44) zakupiono w Phoenix Pharmaceuticals.
Zwierzęta
Dorosłe szczury SPF Sprague-Dawley, o ciężarze ciała 200-250g zakupiono w Charles River i zastosowano po okresie aklimatyzacji przynajmniej przez 7 dni.
Sposoby
Test in vitro CHO-hGRF-LUC
CHO-hGRF-LUC (klon 1-11-20) jest klonowaną linią komórkową, którą uzyskano przez równoczesną transfekcję wektorów pcDNA3-hGRF-R i pTF5-53LUC do linii komórkowej CHO-DUKX.
PL 192 082 B1
Plazmid pcDNA3-hGRF-R skonstruowano przez wprowadzenie cDNA ludzkiego receptora czynnika uwalniającego hormon wzrostu (hGRF-R) do wektora ekspresyjnego pcDNAS. Plazmid Bluescript zawierający cDNA hGRF-R łaskawie udostępnił Dr B. Gaylinn (University of Virginia), ssaczy wektor ekspresyjny pcDNAS otrzymano z Invitrogen. Sekwencja kodująca hGRF-R była pod kierunkiem promotora ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV). Jego mapę restrykcyjną pokazano na fig. 12.
Plazmid pTF5-53LUC skonstruowano przez wprowadzenie elementu reagującego na c-fos cAMP zendogennym promotorem powyżej genu kodującego lucyferazę w plazmidzie poLUC. Element reagujący na cAMP i promotor c-fos otrzymano z plazmidu pTF5-53 (opisanego przez Fish iin., 1989). Wektor genu reporterowego bez promotora (poLuc) z wielokrotnymi miejscami klonowania powyżej sekwencji kodującej lucyferazę uzyskano od Dr Brasier (University of Texas, Galvestone). Jego mapę restrykcyjną pokazano na figurze 13.
Komórki CHO-DUKX otrzymane w wyniku równoczesnej transfekcji hodowano w pożywce MEM alfa zawierającej rybonukleozydy i dezoksyrybonukleozydy z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej i 600 μg/ml siarczanu genetycyny G418.
Komórki wysiano (40000 komórek/studzienkę) w białych płytkach 96-studzienkowych (Dynatech) i inkubowano przez 16-18 godzin w 200 μl pożywki hodowlanej przed testem.
Następnego dnia, pożywkę usunięto i zastąpiono pożywką zawierającą różne stężenia hGRF(1-29) stanowiącego wzorzec odniesienia (Bachem) albo różnych koniugatów hGRF-PEG, po czym inkubowano płytki w 37°C, 5% CO2 przez dwie godziny. Na zakończenie inkubacji, komórki CHO-hGRFR-LUC płukano dwukrotnie 200 fil PBS (Sigma), a następnie poddano lizie przez dodanie 50 μl reagenta do lizy komórek (Promega) do każdej studzienki. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej płytki odczytano w luminometrze (Dynatech) po wprowadzeniu 150 μl odczynnika lucyferazy (Promega).
Alternatywnie, komórki CHO-hGRFR-LUC wysiane w ilości 50000 komórek/studzienkę na zakończenie inkubacjiz różnymi koniugatami hGRF-PEGpłukano PBS, jak omówiono wyżej.Do każdej studzienki dodano 100 μl PBS zawierającego jony wapnia i magnezu, po czym dodano 100 μl Luclite (Packard). Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki odczytywano luminometrem (Lumicount -Packard).
Wyniki wyrażono jako względne jednostki światła (RLU).
Test biologiczny komórek szczurzej przysadki in vitro dla hGRF(1-29)
Zwierzęta (SPF, samce szczurów Sprague-Dawley, o ciężarze ciała 200 g) uśmiercono w CO2 ipobrano ich przysadki. Tkankę rozdrobniono i włożono do butelki z roztworem enzymów w celustrawienia tkanki. Butelkę umieszczono w inkubatorze w 37°C na godzinę.
Trawioną tkankę odzyskano, zaś komórki płukano dwukrotnie, policzono i doprowadzono do gęstości 5x105 komórek/ml. Komórki wysiano w płytce 48-studzienkowej (200 fal/studzienkę) i umieszczonow inkubatorze na 72 godziny.
Po 72 godzinach, komórki inkubowano z różnymi stężeniami hGRF przez4 godziny. Nazakończenie inkubacji, supernatant zebrano i przechowywano w -80°C.
Zawartość GH w każdej z próbek badano dostępnym w handlu testem radioimmunologicznym szczurzego GH.
Test in vivo
Zwierzętom wstrzyknięto i.v. hGRF(l-29) (400 μg/szczura). Parę minut przed pobraniem krwi, zwierzęta znieczulono (ketaminą-ksylazyną). 2 ml krwi pobrano z dolnej żyły czczej od każdego ze szczurów. Próbkę podzielono na dwie porcje: 1 ml pobrano jako taką i uzyskano z niej surowicę po okresie inkubacji około 3 godzin w 37°C i następnie odwirowaniu. Pozostały 1 ml zebrano do probówki zawierającej 50 μl roztworu 4 mg/ml heparyny, natychmiast schłodzono na lodzie i odzyskano przez odwirowanie w 4°C.
Próbki krwi pobrano w różnych punktach czasu i natychmiast zamrożono i przechowywano w -20°C.
Poziom GH w surowicy zmierzono dostępnym w handlu zestawem RIA; poziom hGRF wsurowicy zmierzono dostępnym w handlu zestawem RIA na hGRF(1-44).
Wyniki
Uwaga: w tym podrozdziale i związanych z nim figurach „pierwszy pik GRF-1PEG” odpowiada [Lys (MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2], „drugi pik GRF-1PEG” odpowiada [Lys-(MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29) -NH2], ,„GRF-2PEG” odpowiada[Lys (MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12-21--hGRF(1-29)-NH2], zaś „GRF-3PEG” odpowiada N0-((MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)-[Lys-(MPEG5000-CH2-CO-Nle-CO)12,21-hGRF(1-29)-NH2].
PL 192 082 B1
Test in vitro CHO-hGRFR-LUC
Aktywność dwóch różnych partii koniugatów hGRF-PEG, wytworzonych przy użyciu DMSO, wteście in vitro CHO-hGRFR-LUC pokazano na fig. 5 i 6.
Wykazano, że wszystkie preparaty były aktywne, mimo że w mniejszym stopniu niż porównywane natywne hGRF (hGRF poddano takim samym etapom oczyszczania, jakie zastosowano dla związków pegylowanych), przy czym GRF-1PEG (zarówno frakcja piku 1jaki 2) były bardziej aktywne niż GRF-2PEG i GRF-3PEG. Nie zaobserwowano różnicy dla hGRF i „natywnego” hGRF (dane nie przedstawione).
Zaobserwowano podobną bioaktywność dla koniugatów hGRF-PEG z obydwu partii wytworzonych w DMSO (fig. 5 versus fig. 6), jak również z partii wytworzonych z zastosowaniem roztworu nikotynamidu (fig. 7). Figura 6 pokazuje również, że dwa różne preparaty hGRF(3-29) nie wykazywały znaczącej aktywności in vitro w porównaniu z hGRF(1-29).
Test biologiczny komórek szczurzej przysadki in vitro dla hGRF1-29
W obydwu testach wykonanych dla koniugatów hGRF-PEG z dwóch partii wytworzonych wDMSO zaobserwowano, że GRF-1PEG odpowiadający pikowi 1 jest związkiem o największej aktywności, a następnie kolejno GRF-1PEG z piku 2, GRF-2PEG i GRF-3PEG (fig. 8 i 9). Wyniki te są zgodne z wynikami testu z zastosowaniem genu reporterowego.
Test in vivo
We wstępnych doświadczeniach poziomy surowicze GH i osoczowe hGRF określano u szczurów po wstrzyknięciu i.v. 400 μg hGRF. Istotne wyniki przedstawiono na fig. 10. Jak pokazano, poziomyzarówno GH,jaki hGRF były najwyższe po 10 minutach po wstrzyknięciu hGRF. Następie surowicze poziomy GH gwałtownie obniżały się i powracały do poziomu podstawowego po 60 min, przy czym w tym samym czasie stężenia osoczowego hGRF pozostawały na tym samym poziomie.
Na figurach 11A i 11B zostały przedstawione poziomy GH i GRF we krwi w różnych punktach czasowych do 48 godzin po potraktowaniu szczurów iniekcją i.v. 400 μg GRF-1PEG 1 i 2 piku oraz GRF-2PEG i GRF-3PEG (partie wytworzone w DMSO).
Wszystkie pegylowane preparaty wywołują maksymalny poziom GH w surowicy po 10 minutach od momentu wstrzyknięcia i.v., podobnie do hGRF1-29.Jednakże podczas GRF-1PEF 1 i 2 piku oraz GRF-2PEG wywołują podobne poziomy GH co hGRF1-29, GRF-3PEG wykazuje mniejszą aktywność in vitro.
O ile uwzględniane są poziomy osoczowe GRF, obserwowano całkowicie inny wzorzec GRF-1PEG dla pierwszego i drugiego piku w porównaniu z GRF-2PEG i GRF-3PEG niezależnie od zastosowanego wytwarzania (DMSO czy nikotynamid). W 48 godzin po wstrzyknięciu GRF-1PEG pik 1i 2, stężenia GRF w osoczu powracały do poziomu podstawowego, podczas gdy przyużyciu GRF-2PEG i GRF-3PEG uzyskano przedłużone poziomy.
Pr z y k ł a d 8. Synteza w fazie stałej miejscowo chronionych pochodnych hGRF(1-29)-NH2 jako związków wyjściowych w procesie pegylacji
Przeprowadzono syntezę na podłożu stałym pochodnych hGRF(1-29)-NH2 zawierających swoistą grupę ochronną (grupa N-alliloksykarbonylowa) na pierwszorzędowych grupach aminowych lizyny 12 i 21. Jest to ukierunkowana pegylacja na końcu N0. Inną pochodną amino-chronioną wytwarza się przez zablokowanie końca N0 przez acylację i grupę N-alliloksykarbonylową na lizynie 12. Pochodną tę stosuje się do ukierunkowanej pegylacji lizyny 21.
Materiały i metody
Procedury syntezy peptydów
Wszystkie pochodne hGRF związano początkowo stosując reakcję Fmoc na syntezatorze Applied Biosystems Inc. Model 431A Peptide Synthesiser, z użyciem żywicy o niskim stopniu podstawiania (0,16 mtnoli/g) PAL-PEG-PS i stosując procedurę podwójnego sprzęgania i czapeczkowania (ang. „camping”) dla każdej reszty w celu optymalizacji ilości i czystości surowego produktu. Oprócz tego, żywicę-peptyd [N-izopropylo-Tyr1,Lys(alloc)12-hGRF(1-29)-NH2 poddano poza syntezatorem reakcji redukcyjnego alkilowania aby dodać na końcu N grupę izopropylową.
Wszystkie żywice z peptydami cięto mieszaniną TFA/1,2-etanoditiolu/tioanizolu/wody (10:0,5:0,5:0,5 obj.) przez 2 godziny, zaś surowe peptydy izolowano przez precypitację w MTBE iodwirowanie. Liofilizowane surowe peptydy oczyszczono przez HPLC z odwróconymi fazami stosując preparatywną kolumnę Vydac C18 i układ 0,1% TFA/woda/bufor. Wszystkie oczyszczone peptydy scharakteryzowano przez analityczną HPLC z odwróconymi fazami i spektrometrią mas MALDI-TOF.
PL 192 082 B1
Materiały
F-moc-L-aminokwasy(Bachem Bioscience, Perseptive Biosystems, NovaBiochem), DMF 20 litrowy pojemnik (JT Baker), piperydyna (Applied Biosystems, Chem-Impex), HBTU (Rainin, Richelieu Biotechnologies), NMM (Aldrich), bezwodnik octowy (Applied Biosystems), żywice (Perseptive Biosystems, NovaBiochem), kwas α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowy (Sigma), kwas synapinowy (Aldrich), acetonitryl (JT Baker), TFA (Sigma, Pierce), dejonizowana H2O (Millipore, Milli-Q Water Systems). Inne odczynniki i reagenty są wymienione niżej:
| Reagent/rozpuszczalniki | Dostawca |
| NMP | Applied Biosystems Inc.,TJ Baker |
| HBTU | Applied Biosystems Inc., Richelieu Biotechnologies Inc. |
| 0,5 M HOBt wDMF | Applied Biosystems Inc. |
| 2,0 M DIEAw NMP | Applied Biosystems Inc. |
| piperydyna | Applied Biosystems Inc. |
| dichlorometan | Applied Biosystems Inc. |
| bezwodnik octowy | Applied Biosystems Inc. |
Aminokwasy: większość Fmoc-aminokwasów zastosowanych w syntezatorze ABI 431A zakupiono w Applied Biosystems jako zważone wkłady 1,0 mmol. FMOC-Lys(alloc)-OH zakupiono w Perseptive Biosystems (Framingham, MA) jako substancję i wypełniono wkłady w laboratorium. Wszystkie zastosowane aminokwasy miały konfigurację L.
Żywice: pierwszorzędowe żywice zastosowane do analogów hGRF były żywicami PAL-PEG-PS (Peptide Amide Linkers Polyethylene Glycol - Polystyrene). Podłoża PAL-PEG-PS zakupione w Perseptive Biosystems, wykazywały lepsze właściwości czystości i wydajności surowego produktu. Dla wszystkich pochodnych zastosowano żywice o niskim stopniu podstawiania 0,16 mmol/mg. Żywice oniskim stopniu podstawiania są stosowane powszechnie dla długich, trudnych sekwencji w celu zapewnienia lepszego sprzęgania przez zmniejszenie zawady przestrzennej i tworzenia kartek β.
Metody
Łączenie łańcucha -Applied Biosystems Inc. Model 431A Peptide Synthesizer
Chronione łańcuchy peptydowe łączono początkowo stosując strategię FMOC na Applied Bio™ systems Inc. Model 431APeptide Synthesizer wykorzystującym szybki cykl FMOC (FastMoc™). HBTU zastosowano do aktywacji i sprzęgania, 20% piperydynę do deprotekcji, zaś NMP jako główny rozpuszczalnik podczas deprotekcji, rozpuszczania aminokwasów i płukania żywicy.
Łączenie aminokwasów -Procedura
Etapy dla programowanych cykli 0,25 mmol podsumowano poniżej:
1. Usuwanie grup ochronnych piperydyną -żywicę przepłukano NMP, następnie 18% roztworem piperydyny/NMP i odblokowywano przez 3 minuty. Naczynie reakcyjne opróżniono i dodano 20% roztworu piperydyny i kontynuowano deprotekcję przez około 8 minut.
2. Rozpuszczanie aminokwasów - NMP (2,1 g) i 0,9 mmol 0,45 M HBTU/HOBt w DMF (2,0 g) dodano do wkładu i mieszano przez 6 minut.
3. Płukanie NMP -naczynie reakcyjne opróżniono i 5 razy płukano żywicę stosując NMP.
4. Aktywacja aminokwasów i przeniesienie do naczynia reakcyjnego (RV) - 1 ml 2 M DIEA wNMP dodano do wkładu w celu aktywowania rozpuszczonego aminokwasu,a następnie przeniesiono z wkładu do RV.
5. Sprzęganie i płukanie końcowe - reakcja sprzęgania pomiędzy aktywowanym aminokwasem a żywicą z peptydem z odblokowanym N-końcem przebiegała w ciągu 20 minut, po czym RV opróżniano i płukano żywicę w NMP.
6. Czapeczkowanie (jeżeli to konieczne) - około 12 ml 0,5 M bezwodnika octowego, 0,125 M DIEA i 0,015 M HOBtw roztworze NMP dodano do naczynia reakcyjnego i wytrząsano przez 5 minut.
Kompletny protokół tych cykli można znaleźć w biuletynie użytkownika Applied Biosystems nr 5 ™ (FastMoc™ 0,25 i 0,10 na modelu 431A).
Standardowe etapy protokołu dla typowej syntezy:
Etap 1. płukanie żywicy 3X DMF
Etap 2. usuwanie grup ochronnych 2X przez 5 minut 20% piperydyną/DMF
Etap 3. płukanie żywicy 6X DMF
Etap 4. sprzęganie przez 45 min. z aminokwasem aktywowanym HBTU/NMM w DMF
Etap 5. płukanie żywicy 3X DMF
PL 192 082 B1
Dla trudnych sekwencji, dodatkowy etap czapeczkowania może być dodany po reakcji sprzęgania, w którym stosuje się 70% bezwodnik octowy w DMF przez 20 minut w celu acetylowania jakichkolwiek niesprzężonych miejsc w układzie peptyd-żywica, czego wynikiem jest otrzymywanie w końcowym nieoczyszczonym produkcie sekwencji skróconych raczej,niż sekwencji z delecjami.
Cięcie/ekstrakcja
Mieszanina do cięcia zastosowana w celu usunięcia grup ochronnych łańcuchów bocznych iuwolnienia peptydu z żywicy jest standardową mieszaniną stosowaną do peptydów zawierających argininę i/lub metioninę. Dla 0,1-1,5 g peptyd-żywica stosuje się 10 ml kwasu trifluorooctowego, 0,5ml wody dejonizowanej, 0,5 ml tioanizolu, 0,5 ml etanoditiolu (87% kwas trifluorooctowy, 4,3% wody D.I., 4,3% tioanizolu, 4,3% etanoditiolu).
Procedura cięcia
100 mg - 1 g układu peptyd-żywica umieszczono w 20 ml szklanym naczyniu i schłodzono na lodzie. Koktajl do cięcia jest przygotowany i także schłodzony na lodzie, a następnie dodano żywicypeptydu w objętości około 10 ml.
Naczynie usunięto z kąpieli lodowej i pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej. Naczynie przykryto, a mieszaninę reakcyjną miesza się przez 2 godz. w temperaturze pokojowej.
Po 2 godzinach roztwór filtrowano pod próżnią przez filtr o średniej do grubej porowatości do około 30 ml MTBE. Naczynie reakcyjne przemyto 1 ml TFA, który przesączono przez ten sam lejek filtracyjny do zimnego MTBE. Całą zawiesinę następnie przeniesiono do 50 ml probówki do wirowania i odwirowywano przez około 10 minut przy 2000 obr./min. w temperaturze pokojowej. Supernatant odciągnięto, a osad zawieszono w 40 ml zimnego MTBE i ponownie wirowano. Etap powtórzono jeszcze raz. Końcowy supernatant odciągnięto, a osad osuszono strumieniem azotu w celu odparowania pozostałego eteru.
Peptyd rozpuszczono w 20-30 ml wodnego roztworu 1-10% kwasu octowego, rozcieńczonego do około 100-150 ml wodą dejonizowaną, zamrożono i liofilizowano.
Oczyszczanie
Metoda RP-HPLC
Układ - Waters Delta Prep 4000
Kolumna - VYDAC RP C18, 10 pm, 2,2 x 25 cm (nr kat 218TP1022)
Bufory - A: woda/0,1% TPA;B: acetonitryl/0,1%TFA
Przepływ - 15 ml/min.
Wykrywanie - Waters 484 UV Detector, 220 nm.
Gradient - zmienny, zwykle 0,2% B/min do 1,0% B/min.
Liofilizowane surowe peptydy przygotowano przez rozpuszczenie 50-100 mg peptydu w 200 ml wodnego 0,1% TFA. Roztwór peptydów ładowano bezpośrednio na kolumnę preparatywną przez linię zbiornika buforu „A”i uruchamiano program gradientu.
Zebrane frakcje puszczono przez noc na autoanalitycznym układzie HPLC. Nakładające się frakcje oceniane jako czyste w > 92% przez integrację pików zbierano razem, rozcieńczano 4:1 wwodzie dejonizowanej, mrożono i liofilizowano z zastosowaniem urządzenia Virtis 25 SL Freezdryer.
Charakteryzacja
RP-HPLC
Układ - Waters 510 pumps, 717 autosampler, 490 multiwavelenght UV detector
Kolumna - VYDAC RP Cl 8, 5 um, 2,2 x 25 cm (nr kat 218TP1022)
Bufory - A: woda/0,1% TFA;B: acetonitryl/0,1%TFA
Przepływ - 1ml/min.
Wykrywanie - UV 214 nm, 280 nm.
Gradient - 2% B/min.
Oczyszczone liofilizowane próbki peptydów przygotowano przez rozpuszczenie 0,2-1,0 mg peptydu w wodnym roztworze 0,1 % TFA w stężeniu 0,5-1,0 mg/ml.
15-18 pl wstrzykiwano do kolumny i eluowano gradientem 0-50% ACN w 25 minut. Dane chromatograficzne zbierano i przechowywano przy zastosowaniu systemu oprogramowania Waters Expert-Ease.
Spektrometria mas
Rodzaj: MALDI-TOF(Matrix-assistedlaser desorption/ionization Time-of-flight)
Układ: Perseptive Biosystems Voyager Elite
PL 192 082 B1
Macierz: kwas α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowy, 10 mg/ml w 67% ACN/0,1% TFA albo kwas synapinowy, 10 mg/ml w 50% ACN/0,1% TFA.
Próbki peptydów przygotowano w stężeniu 1-20 μmol w 50% ACN/0,1% TFA 0,5 μl roztworu macierzy, po czym 0,5 μl próbkę peptydu umieszczano w studzience płytki do analizy i pozostawiono do wyschnięcia. Płytkę do analizy umieszcza się w urządzeniu, a próbki skanuje się i analizuje z wykorzystaniem sposobu Reflector Delayed-Extraction zoptymalizowanego dla peptydów. Dla każdej próbki skumulowane dane dla sygnału z 23-128 prześwietleń lasera są zebrane i analizowane. Każdy przebieg obejmuje studzienkę próbki z peptydem standardowym docelów kalibracji.
Ukierunkowana synteza
Wytwarzanie [Lys (alloc)12,21]-hGRF(1-29)-NH2
[Lys (alloc)12,21]-hGRF(1-29)-NH2-PAL-PEG-PSnażywicywytworzono wstępnie przez reakcję z zastosowaniem Fmoc w syntezatorze Applied Biosystems 431A (patrz metody syntezy), łącznie zusunięciem N-końcowej reszty Fmoc.
Układ peptyd-żywica poddano cięciu mieszaniną TFA:1,2-etanoditiol:tioanizol:woda [10:0,5:0,5:0,5 (obj./obj.)] przez 2 godziny i wyizolowany peptyd wytrącano w MTBE otrzymując 240 mg nie oczyszczonego peptydu. Oczyszczanie RP-HPLC z odwróconymi fazami przy użyciu kolumny Vydac C18 (22 x 250 mm) dało 60 mg oczyszczonego produktu (>95% w HPLC). Analiza spektralna mas w MALDI-TOF: obliczona masa 3523,8; obserwowana masa 3524,2.
Wytwarzanie [N^izopropylo-Tyr/Lys^lloc/j-hGRFO^FNHOtrzymanie początkowego układu [Lys(alloc)12]-hGRF(1-29)-PAL-PS-żywica
[Lys (alloc)12]-hGRF (1-29)-NH2-PAL-PEG-PS na żywicy wytworzono wstępnie przez reakcję z zastosowaniem Fmoc na syntezatorze Applied Biosystems 431A (patrz metody syntezy), łącznie zusunięciem N-końcowej reszty Fmoc.
N^izopropylacja przez redukcyjną alkilację
Grupę ^-izopropylową dodano przez redukcyjną alkilację żywicy-peptydu stosując cyjanoborowodorek sodu i odpowiedni keton (aceton), jak to opisano przez Hocart i in., 1987. 880 mg układu peptyd-żywica (około 70 μmoli) umieszczono w 5 ml DCM na 30 min. w celu jego spęcznienia. Następnie dodano 10 mmoli (174 μθ acetonu w 7 ml MeOH/1%HOAc, a mieszaninę mieszano przez 2godziny z przerwami w temperaturze otoczenia, po czym dodano 2 mmole (129 mg) cyjanoborowodorku sodu w 12 ml MeOH/1%HOAc, mieszaninę mieszano z przerwami przez 2 godz., a następnie pozostawiono przez noc (15 godzin). Jakościowe monitorowanie z zastosowaniem ninhydryny wskazywało na całkowite zajście reakcji (brak niebieskiego zabarwienia). Układ peptyd-żywica poddano cięciu mieszaniną TFA:1,2-etanoditiol:tioanizol:woda [10:0,5:0,5:0,5 (obj./obj.)] przez 2 godziny i peptyd izolowano przez wytrącanie w MTBE otrzymując około 200 mg nie oczyszczonego peptydu. Wwyniku oczyszczania RP-HPLC przy użyciu kolumny Vydac C18 (22 x 250 mm) z wykorzystaniem układu woda/acetonitryl/0,1% TFA otrzymano 50 mg oczyszczonego produktu (>95% w HPLC). Analiza spektralna mas MALDI-TOF: obliczona masa 3489,1; obserwowana masa 3481,8.
Przykład 9. Pegylacja chronionego hGRF(1-29)
Pochodne hGRF, wytworzone jak to opisano w przykładzie 8, sprzęgnięto z aktywowanym PEG, jak to opisano w przykładach 1i 6.
Oczyszczanie obejmowało w tym przypadku jedynie oddzielanie nadmiaru reagentów iproduktów ubocznych,nie istniała natomiast potrzeba na wykonanie procedury opisanej w przykładzie 2i 3.
Literatura
Abuchowski A. et al., J. Biol Chem., 252, 3571-3581, 1977a;
Abuchowski A, et al., J. Biol Chem., 252, 3582-3586, 1977b;
Benchamp C.O. et al., Anal. Biochem., 131, 25-33, 1983;
Caliceti et al, J. Bioactive Compatible Polymer, 8, 41-50, 1993;
Campbell R. et al. J. Peptide Res., 49, 527-537, 1997;
Chan W. C. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun,, 2209, 1995;
Clark R. et al.,J. Biol. Chem., 36, 21969-21977, 1996;
DelgadoC. et al., Biolechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128, 1990;
F. Dick et al., Peptides 1996, Proceedings of the 24th European Peptide Symposium, Edinburgh, Scotland, 1997;
Felix A.M. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 46, 253-264, 1995;
PL 192 082 B1
Fish et al., Genes and Development, 3, 1989, 198-211;
Greene T W. et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc. Pub., pp. 331-333, 1991;
Habeed A. S. F.A. et al, Anal. Biochem., 14, 328-336, 1966;
Harris J.M., Rev. Macromol Chem. Phys., C25, 325-76, 1985;
Hocart et al., J. Med. Chem., 30(4), 739-743, 1987;
Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 127-138;
Monfardini et al., Biocon. Chem., 6, 62-69, 1995;
Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368, 1996;
Murphy, W. A. et al., Peptide Research, 1(1), 36, 1988;
Pande C. S., et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 77, 895-899, 1980;
Sartore L. et al., Appl. Biochem. Biotechnol, 27, 45, 1991;
Sartore L., et al., Applied Biochem. Biotechnol, 31, 213-22, 1991;
Sims G. E. C. et al., Anal Biochem., 107, 60-63, 1980;
Tam, J. P. et al., Strong acid deprotection of synthetic peptides. In The Peptides, 9,
S. Udenfriend and J. Meienhofer, eds., Academic Press, NY, 185-248, 1987;
Veronese F. M., et al., Appl.Biochem.,11, 141-152 (1985);
Yamsuki et al., Agric. Biol. Chem., 52, 2185-2196, 1988;
Zalipsky S. et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACSSymposium series 469, 1990; and
Zalipsky S. et al., Europ. Pofym. J., 19, 1177-1183, 1983.
Claims (20)
1.Sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG zawierającego jedną albo więcej jednostek PEG (na hGRF) kowalencyjnie związanych z co najmniej jedną spośród Lys12, Lys21 i Να, znamienny tym, że obejmuje przeprowadzenie reakcji pegylacji między peptydem hGRF i aktywowanym PEG w roztworze przy pH pomiędzy 7 a 9, a następnie izolowanie i oczyszczanie pożądanego hGRF-PEG z mieszaniny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór jest stężonym wodnym roztworem nikotynamidu albo buforowanym wodnym roztworem czynnika denaturującego.
3.Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór w polarnym rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy obejmującej dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid/bufor albo acetonitryl/bufor.
4.Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że koniugat hGRF-PEG izoluje się z mieszaniny reakcyjnej i oczyszcza się metodami chromatograficznymi.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptydem hGRF jest hGRF(1-29)-NH2.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed reakcją pegylacji do peptydu hGRF α 12 21 wprowadza się grupy ochronne w jednej albo wielu pozycjach: N , Lys i Lys .
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ponadto obejmuje reakcję usuwania grup ochronnych po pegylacji.
8.Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że aktywowanym PEG jest alkilujący albo acylujący PEG w monometoksylowanej postaci.
9.Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję pegylacji prowadzi się w temperaturze otoczenia.
10. Koniugat hGRF-PEG zawierający jedną albo wiele jednostek PEG (na hGRF) kowalencyjnie związanych z co najmniej jedną spośród Lys12, Lys21 i Na.
11. Koniugat hGRF-PEG według zastrz. 10, znamienny tym, że 1 jednostka PEG jest kowalencyjnie związana z Lys12.
12,21
12. Koniugat hGRF-PEG według zastrz. 10, znamienny tym, że 1 jednostka PEG jest kowalencyjnie związana z Lys21.
13. Koniugat hGRF-PEG według zastrz. 10, znamienny tym, że1 jednostka PEG jest kowalencyjnie związana z każdą spośród Lys12 i Lys12.
14. Koniugat hGRF-PEG według zastrz. 10, znamienny tym, że 1 jednostka PEG jest kowalencyjnie związana z każdą spośród Lys12, Lys21 i Na.
PL 192 082 B1
15. Związek [Lys(alloc)12,21]-hGRF jako związek pośredni w reakcji pegylacji określonej w zastrz. 1.
16. Związek [Nc-izopropylo-Tyr1,Lys (Alloc)12]-hGRF jako związek pośredni w reakcji pegylacji określonej w zastrz. 1.
17. Koniugaty hGRF-PEG określone w zastrz. 10 do zastosowania jako lek.
18. Zastosowanie koniugatów określonych w zastrz. 10 do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania albo diagnostyki zaburzeń związanych z hormonem wzrostu.
19. Zastosowanie według zastrz. 18 do wytwarzania leku do leczenia albo diagnostyki niedoboru hormonu wzrostu (GHD).
20. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje koniugaty określone w zastrz.10 wraz z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub zaróbką.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121264A EP0922446A1 (en) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates |
| PCT/EP1998/007748 WO1999027897A1 (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL341139A1 PL341139A1 (en) | 2001-03-26 |
| PL192082B1 true PL192082B1 (pl) | 2006-08-31 |
Family
ID=8227732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL341139A PL192082B1 (pl) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Sposób ukierunkowanego wytwarzania koniugatu hGRF-PEG, koniugat hGRF-PEG i jego zastosowanie, związek [Lys (alloc)¹²ˑ²¹] -hGRF i związek [N α-izopropylo-Tyr¹,Lys (Alloc)¹²] -hGRF oraz kompozycja farmaceutyczna |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6528485B1 (pl) |
| EP (2) | EP0922446A1 (pl) |
| JP (2) | JP2001524505A (pl) |
| KR (1) | KR100561768B1 (pl) |
| CN (1) | CN1149967C (pl) |
| AR (1) | AR017780A1 (pl) |
| AT (1) | ATE236607T1 (pl) |
| AU (1) | AU755285B2 (pl) |
| BG (1) | BG64815B1 (pl) |
| BR (1) | BR9815159A (pl) |
| CA (1) | CA2312004C (pl) |
| DE (1) | DE69813291T2 (pl) |
| DK (1) | DK1037587T3 (pl) |
| EA (1) | EA004269B1 (pl) |
| EE (1) | EE200000319A (pl) |
| ES (1) | ES2194376T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0100507A3 (pl) |
| IL (2) | IL136551A0 (pl) |
| NO (1) | NO327238B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ504570A (pl) |
| PL (1) | PL192082B1 (pl) |
| PT (1) | PT1037587E (pl) |
| SI (1) | SI1037587T1 (pl) |
| SK (1) | SK8242000A3 (pl) |
| TR (1) | TR200001615T2 (pl) |
| TW (1) | TWI254641B (pl) |
| UA (1) | UA73716C2 (pl) |
| WO (1) | WO1999027897A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA9811068B (pl) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010055581A1 (en) | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US7229841B2 (en) * | 2001-04-30 | 2007-06-12 | Cytimmune Sciences, Inc. | Colloidal metal compositions and methods |
| US6407218B1 (en) * | 1997-11-10 | 2002-06-18 | Cytimmune Sciences, Inc. | Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs |
| CA2422707A1 (en) | 2000-10-05 | 2002-04-11 | Ares Trading S.A. | Regioselective liquid phase pegylation |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| ES2291613T3 (es) | 2002-01-16 | 2008-03-01 | Biocompatibles Uk Limited | Conjugados de polimeros. |
| US7998705B2 (en) * | 2002-08-06 | 2011-08-16 | FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc | Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol |
| RU2005111253A (ru) * | 2002-09-18 | 2005-11-20 | Сантр Оспиталье Де Л` Юниверсите Де Монреаль (Схюм) (Ca) | Аналоги ghrh |
| GB0301014D0 (en) * | 2003-01-16 | 2003-02-19 | Biocompatibles Ltd | Conjugation reactions |
| EP1585758A4 (en) * | 2003-01-18 | 2006-06-07 | Pegsphere Co Ltd | PEPTIDES WITH PROTECTED AMINES OF UNCENTRICATED PLACES, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF AND OF SPECIFICALLY CONJUGATED PEG-PEPTIDES THEREWITH |
| US20050058658A1 (en) * | 2003-07-15 | 2005-03-17 | Barros Research Institute | Compositions and methods for immunotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) |
| JP2008500005A (ja) * | 2003-07-15 | 2008-01-10 | バロス リサーチ インスティテュート | 癌及び感染症の免疫療法のための組成物及び方法 |
| CA2548179A1 (en) * | 2003-12-02 | 2005-07-21 | Cytimmune Sciences, Inc. | Methods and compositions for the production of monoclonal antibodies |
| JP4833862B2 (ja) * | 2004-01-28 | 2011-12-07 | サイトイミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | 官能化コロイド金属組成物および方法 |
| CN100355784C (zh) * | 2004-02-12 | 2007-12-19 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法 |
| US20050261475A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-11-24 | Harvard Medical School | Solid-phase capture-release-tag methods for phosphoproteomic analyses |
| US6986264B1 (en) * | 2004-07-15 | 2006-01-17 | Carrier Corporation | Economized dehumidification system |
| US7632921B2 (en) | 2004-11-12 | 2009-12-15 | Bayer Healthcare Llc | Site-directed modification of FVIII |
| US20070027301A1 (en) * | 2005-07-26 | 2007-02-01 | Gabriella Cristobal-Lumbroso | Polymers with pendant poly(alkyleneoxy) substituent groups and their use in personal care applications |
| US20070238656A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Eastman Kodak Company | Functionalized poly(ethylene glycol) |
| US20080096819A1 (en) * | 2006-05-02 | 2008-04-24 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| US7632492B2 (en) | 2006-05-02 | 2009-12-15 | Allozyne, Inc. | Modified human interferon-β polypeptides |
| CA2659990C (en) * | 2006-08-04 | 2016-03-22 | Prolong Pharmaceuticals, Inc. | Polyethylene glycol erythropoietin conjugates |
| US20080083154A1 (en) * | 2006-10-05 | 2008-04-10 | Timothy M Gregory | Bait retention fish hook |
| RU2345608C2 (ru) * | 2007-01-09 | 2009-02-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Кавказский государственный технический университет" | Вареная колбаса с использованием pse свинины и способ ее производства |
| CA2707840A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| US20110014118A1 (en) * | 2007-09-21 | 2011-01-20 | Lawrence Tamarkin | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| WO2009039502A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Cytimmune Sciences, Inc. | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| WO2009062151A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
| WO2010053990A2 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Janssen Pharmaceutica Nv | Crhr2 peptide agonists and uses thereof |
| HRP20161055T1 (hr) * | 2009-03-20 | 2016-11-04 | Hanmi Science Co., Ltd. | Postupak proizvodnje konjugata specifičnog za mjesto od fiziološki djelotvornog polipeptida |
| EP2421548A4 (en) * | 2009-04-20 | 2012-09-26 | Theratechnologies Inc | USE OF (HEXENOYL TRANS-3) HGRF (1-44) NH2 AND SIMVASTATIN IN COMBINED TREATMENT |
| WO2010121351A1 (en) * | 2009-04-20 | 2010-10-28 | Theratechnologies Inc. | Use of (hexenoyl trans-3)hgrf(1-44)nh2 and ritonavir in combination therapy |
| JP5906184B2 (ja) | 2009-06-22 | 2016-04-20 | バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ | Ｃ末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質を使用する方法および組成物 |
| MX2012005262A (es) * | 2009-11-04 | 2012-09-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | Metodo para tratar la insuficiencia cardiaca con petidos tipo estrescopina. |
| WO2012118778A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated car peptides and methods and compositions using truncated car peptides |
| JP6113144B2 (ja) | 2011-04-21 | 2017-04-12 | セラテクノロジーズ・インコーポレーテッド | 成長ホルモン放出因子（ｇｒｆ）類似体およびその使用 |
| CA2837588A1 (en) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Airware, Inc. | Re-calibration of ab ndir gas sensors |
| US10179801B2 (en) | 2011-08-26 | 2019-01-15 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated LYP-1 peptides and methods and compositions using truncated LYP-1 peptides |
| WO2013190520A2 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-27 | The General Hospital Corporation | Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions |
| US10064940B2 (en) | 2013-12-11 | 2018-09-04 | Siva Therapeutics Inc. | Multifunctional radiation delivery apparatus and method |
| EP3303378B1 (en) | 2015-05-28 | 2021-04-21 | Institut National de la Recherche Scientifique | Inhibitors of prototypic galectin dimerization and uses thereof |
| JP7134093B2 (ja) * | 2016-04-19 | 2022-09-09 | グリフォン・ファーマシューティカルズ・アンテルナシオナル・エスアー | ペグ化バイオアクティブペプチド及びその使用 |
| CN110317826B (zh) * | 2019-05-22 | 2020-11-10 | 中国农业大学 | 调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用 |
| JP7665215B2 (ja) | 2019-12-19 | 2025-04-21 | トランスフェルト・プラス・ソシエテ・アン・コマンディテ | 腸のニューロパチーを治療するためのグリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）の使用 |
| WO2021133407A1 (en) | 2019-12-27 | 2021-07-01 | Compagnie Generale Des Etablissements Michelin | Rubber mix with high specific surface area and high structure acetylene carbon black |
| CA3206260A1 (en) | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Ilse Roodink | Anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies and the therapeutic use thereof |
| WO2024081918A1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | Talem Therapeutics Llc | Anti-trkb/cd3 antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| ES2085297T3 (es) * | 1989-05-27 | 1996-06-01 | Sumitomo Pharma | Procedimiento para preparar derivados de poli(etilenglicol) y proteina modificada. |
| EP0544706A4 (en) * | 1990-06-29 | 1993-10-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Histidine substituted growth hormone releasing factor analogs |
| JP3051145B2 (ja) * | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
| WO1992018531A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| EP0518295A3 (en) * | 1991-06-14 | 1993-09-01 | Millipore Corporation | Allyl side chain protection in peptide synthesis |
| FR2687681B1 (fr) * | 1992-02-20 | 1995-10-13 | Transgene Sa | Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses. |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| AU7273196A (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-29 | Theratechnologies Inc. | Method of grf peptides synthesis |
-
1997
- 1997-12-03 EP EP97121264A patent/EP0922446A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-01-12 UA UA2000063885A patent/UA73716C2/uk unknown
- 1998-12-01 EE EEP200000319A patent/EE200000319A/xx unknown
- 1998-12-01 SI SI9830400T patent/SI1037587T1/xx unknown
- 1998-12-01 BR BR9815159-2A patent/BR9815159A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-01 WO PCT/EP1998/007748 patent/WO1999027897A1/en not_active Ceased
- 1998-12-01 EA EA200000601A patent/EA004269B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 ES ES98959898T patent/ES2194376T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 PL PL341139A patent/PL192082B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 AU AU15633/99A patent/AU755285B2/en not_active Expired
- 1998-12-01 CN CNB988117592A patent/CN1149967C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-01 JP JP2000522885A patent/JP2001524505A/ja active Pending
- 1998-12-01 EP EP98959898A patent/EP1037587B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 TR TR2000/01615T patent/TR200001615T2/xx unknown
- 1998-12-01 PT PT98959898T patent/PT1037587E/pt unknown
- 1998-12-01 DE DE69813291T patent/DE69813291T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 CA CA002312004A patent/CA2312004C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 DK DK98959898T patent/DK1037587T3/da active
- 1998-12-01 HU HU0100507A patent/HUP0100507A3/hu unknown
- 1998-12-01 NZ NZ504570A patent/NZ504570A/en unknown
- 1998-12-01 SK SK824-2000A patent/SK8242000A3/sk unknown
- 1998-12-01 IL IL13655198A patent/IL136551A0/xx unknown
- 1998-12-01 KR KR1020007005736A patent/KR100561768B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-01 AT AT98959898T patent/ATE236607T1/de active
- 1998-12-02 AR ARP980106098A patent/AR017780A1/es active IP Right Grant
- 1998-12-03 ZA ZA9811068A patent/ZA9811068B/xx unknown
-
1999
- 1999-01-26 TW TW088101139A patent/TWI254641B/zh not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-24 NO NO20002664A patent/NO327238B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-05-29 BG BG10448A patent/BG64815B1/bg unknown
- 2000-06-04 IL IL136551A patent/IL136551A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-05 US US09/587,460 patent/US6528485B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-11-20 US US10/299,790 patent/US6869932B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-12-15 US US11/011,617 patent/US7317002B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-10-30 JP JP2009251100A patent/JP5431874B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1037587B1 (en) | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates | |
| AU2001295589B2 (en) | Regioselective liquid phase pegylation | |
| AU2001295589A1 (en) | Regioselective liquid phase pegylation | |
| US20080085860A1 (en) | Selective Vpac2 Receptor Peptide Agonists | |
| US20100048460A1 (en) | Selective vpac2 receptor peptide agonists | |
| US20090082276A1 (en) | Selective vpac2 receptor peptide agonists | |
| US20090118167A1 (en) | Selective Vpac2 Receptor Peptide Agonists | |
| CZ20002055A3 (cs) | Způsob selektivní přípravy specifických konjugátů polyethylenglykol - GRF | |
| MXPA00005138A (en) | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20091201 |