KR101164453B1 - 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법 - Google Patents

위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알코올 및 특정 pH 하에서 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 반응 및 분리시켜 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가된 다양한 펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법 {Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate}
본 발명은 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알코올 및 특정 pH 하에서 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 반응 및 분리시켜 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태이기 때문에 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위한 빈번한 주사로 인해 환자의 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 다양한 시도로서, 펩타이드 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드 약물을 체내로 전달하는 방법, 펩타이드를 안정화시키고 단백질 가수분해 효소에 의한 분해를 억제하기 위하여 단백질 가수분해 효소에 민감한 특정 아미노산 서열(예를 들어, 디펩티딜 펩티다아제에 의한 역가 상실을 막기 위한 GLP-1 아미노산 서열)을 변경하는 방법 및 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라 함)과 같이 용해도가 높은 비펩타이드성 중합체를 펩타이드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다.
상기와 같이 비펩타이드성 중합체로 사용되고 있는 PEG는 폴리펩타이드에 비특이적으로 결합하여 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, 국제특허공개 WO 06/076471호는 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가 펩타이드(B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있으며, 미국특허 제6,924,264호는 엑센딘(exendin)-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다.
이러한 방법들은 PEG 분자량을 증가시켜 생리활성 폴리펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장시킬 수 있긴 하지만, 분자량 증가에 따라 생리활성 폴리펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 생리활성 폴리펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다. 나아가, PEG가 생리활성 폴리펩타이드에 비특이적으로 결합함으로써 생리활성 폴리펩타이드의 활성 도메인을 가려 활성을 현저히 떨어뜨리는 문제가 있다.
따라서, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 간의 반응성을 높이고, 상기 비펩타이성 중합체가 생리활성 폴리펩타이드에 위치특이적으로 결합하여 활성을 떨어뜨리지 않도록 하는 새로운 제조방법이 요구된다.
이에 본 발명자는 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체를 결합시킨 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 제조하는데 있어서, 반응용액 내 알코올의 함량 및 pH의 조절에 의해 상기 비펩타이드성 중합체가 생리활성 폴리펩타이드에 위치특이적으로 결합한 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 고수율로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 비펩타이드성 중합체가 생리활성 폴리펩타이드에 위치특이적으로 결합된 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비펩타이드성 중합체를 생리활성 폴리펩타이드와 반응시켜 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 제조하는데에 있어서, 1) 알코올을 함유하며, 비펩타이드성 중합체가 생리활성 폴리펩타이드의 목적하는 부위에 결합하도록 하기 위한 pH를 갖는 반응 용액하에서, 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1의 반응 혼합물로부터 알코올을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 생리활성 폴리펩타이드의 특정 위치에 비펩타이드성 중합체가 결합된 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 고수율로 수득할 수 있으므로, 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가된 다양한 펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 DA-엑센딘-4-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체(Positional Isomer) 정제 프로파일이고,
도 2는 CA-엑센딘-4-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이고,
도 3은 CA-엑센딘-4의 페길화 시, 각 pH에 따른 Lys27 이성질체 비율을 나타낸 그래프이며,
도 4는 45% EtOH에서 CA-엑센딘-4 페길화 시, 각 pH에 따른 Lys27 이성질체 비율을 나타낸 그래프이며,
도 5는 pH7.5에서 CA-엑센딘-4 페길화 시, 에탄올 함량(%)에 따른 Lys27 이성질체 비율을 나타낸 그래프이며,
도 6은 pH7.5에서 CA-엑센딘-4 페길화 시, 이소프로판올 함량(%)에 따른 Lys27 이성질체 비율을 나타낸 그래프이며,
도 7은 CA-엑센딘-PEG-면역글로불린 Fc SDS-Page 분석 결과이고,
도 8은 CA-엑센딘-PEG Lys12 및 Lys27의 SDS-Page 분석 결과이며,
도 9는 CA-엑센딘-4의 Lys12 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑(Peptide mapping)을 통해 확인한 분석 프로파일이고,
도 10은 CA-엑센딘-4의 Lys27 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 11은 옥신토모둘린-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 12는 이미다조-아세틸 옥신토모둘린-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 13은 옥신토모둘린의 Lys30 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치이성체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 14는 이미다조-아세틸 옥신토모둘린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 SOURCE Q 컬럼을 이용하여 정제한 프로파일이며,
도 15는 이미다조-아세틸 옥신토모둘린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 SDS-Page 분석 결과이다.
도 16은 옥신토모둘린 유사체-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 17은 옥신토모둘린 유사체의 Lys27 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 18은 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 19는 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체의 Lys27 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 20은 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 SOURCE Q 컬럼을 이용하여 정제한 프로파일이며,
도 21은 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 SDS-Page 분석 결과이다.
도 22는 GLP-1-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 23은 GLP-1의 Lys34 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 24는 이미다조-아세틸 GLP-1-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 25는 이미다조-아세틸 GLP-1의 Lys34 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 26은 이미다조-아세틸 GLP-1-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 SOURCE Phe 컬럼을 이용하여 정제한 프로파일이며,
도 27은 이미다조-아세틸 GLP-1-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 SDS-Page 분석 결과이다.
도 28은 GLP-2-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 29는 GLP-2의 Lys30 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이며,
도 30은 이미다조-아세틸 GLP-2-PEG를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 31은 이미다조-아세틸 GLP-2-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 SOURCE Phe 컬럼을 이용하여 정제한 프로파일이며,
도 32는 이미다조-아세틸 GLP-2-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 SDS-Page 분석 결과이다.
도 33은 인간 인슐린-PEG(B1F)를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 34는 인간 인슐린-PEG(A1G)를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 35는 인간 인슐린-PEG(B29K)를 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체 정제 프로파일이며,
도 36은 각각 인간 인슐린의 B1F, A1G 및 B29K 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성질체를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 분석 프로파일이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 알코올을 함유하며, 비펩타이드성 중합체가 생리활성 폴리펩타이드의 목적하는 부위에 결합하도록 하기 위한 pH를 갖는 반응 용액하에서, 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 반응시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1의 반응 혼합물로부터 알코올 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명이 제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드 결합체(conjugate)는 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 한 말단이 공유결합으로 연결된 물질을 의미하며, 본 발명은 특정 조건 하에서 상기 폴리펩타이드와 중합체를 반응시키고, 특정 조건하에서 분리시켜 중합체가 폴리펩타이드의 목적하는 위치에 결합된 폴리펩타이드를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 사용되는 "생리활성 폴리펩타이드 또는 펩타이드"는 인체 내에서 생리활성을 나타낼 수 있는 펩타이드를 가리키는 것으로서, 예를 들어, 인슐린 분비 펩타이드, 혈액인자, 소화촉진 호르몬, 부신피질 호르몬, 갑상선호르몬, 장내 호르몬, 싸이토카인, 효소, 성장인자, 뉴로펩타이드(neuropeptide), 뇌하수체 호르몬, 시상하부 호르몬, 항-비만 펩타이드, 항-바이러스 펩타이드 및 생리활성을 갖는 비천연형 펩타이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 상기 생리활성 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 적혈구 증식인자, 백혈구 증식인자, 아밀린, 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴, PYY(peptide YY), NPY(neuropeptide Y), GLP-1, GLP-2, 엑센딘-4(Exendin-4), 옥신토모둘린(Oxyntomodulin), 그렐린(Ghrelin), 안지오텐신, 브래디키닌, 칼시토닌, 부신피질 자극호르몬(Corticotropin), 엘레도이신(Eledoisin), 가스트린, 렙틴, 옥시토신(Oxytocin), 바소프레신(vasopressin), 황체 형성호르몬, 황체 자극호르몬, 여포 자극호르몬, 부 갑상선 호르몬, 씨크레틴(secretin), 세르모레린(Sermorelin), 인간 성장호르몬(hGH), 성장호르몬 방출 펩타이드, 콜로니 자극인자(GCSF)류, 인터페론(IFN)류, 인터루킨(Interleukin)류, 프로락틴 방출 펩타이드, 오렉신(Orexin), 갑상선 방출 펩타이드, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin), 가스트린 억제 펩타이드, 칼모듈린, 가스트린 유리 펩타이드(Gastric releasing peptide), 모틸린(Motilin), 관활성장관 펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP), 바린나트륨이뇨 펩타이드(Barin natriuretic peptide; BNP), C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP), 뉴로키닌(Neurokinin) A, 뉴로메딘(Neuromedin), 레닌(Renin), 엔도텔린(Endothelin), 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide), 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide), 데모르핀(Dermorphin), 디노르핀(Dynorphin), 엔도르핀(Endorphin), 엔케팔린(Enkepalin), T 세포인자, 종양괴사인자, 종양괴사인자 수용체, 유로키나아제 수용체, 종양억제인자, 콜라게나제 억제제, 티모포이에틴(Thymopoietin), 티물린(Thymulin), 티모펜틴(Thymopentin), 티모신(Tymosin), 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor), 아드레노모둘린(Adrenomodullin), 알라토스타틴(Allatostatin), 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment), 항균성 펩타이드, 항산화제 펩타이드, 봄베신(Bombesin), 오스테오칼신(Osteocalcin), CART 펩타이드, E-셀렉틴(selectin), ICAM-1, VCAM-1, 류코카인(Leucokine), 크링글(Kringle)-5, 라미닌(Laminin), 인히빈(Inhibin), 갈라닌(Galanin), 피브로넥틴(Fibronectin), 판크레아스타틴(Pancreastatin) 및 푸제온(Fuzeon)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. 뿐만 아니라, 이러한 생리활성 폴리펩타이드에는 폴리펩타이드가 갖는 생리활성을 갖는 폴리펩타이드의 전구물질(precursors), 유도체(derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바람직한 생리활성 폴리펩타이드는 엑센딘, 인슐린, GLP-1, GLP-2, 옥신토모둘린, 그렐린, 안지오텐신, 브래디키닌, 칼시토닌 또는 이들의 유도체이다. 상기 유도체들은, 예를 들어 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예를 들어, alpha-methylation 또는 alpha-hydroxylation), 제거(예를 들어, deamination 또는 carbon deletion) 또는 수식(예를 들어 N-methylation)에 의해 제조될 수도 있는데, 이중 엑센딘 유도체의 제조는 대한민국 특허공개 제2009-008151호에 자세히 기술되어 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알코올, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 또는 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 생리활성 폴리펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하는 작용을 하는 것으로서, 생체 내 단백질 분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0.5 내지 100 kDa, 바람직하게는 0.5 내지 20 kDa 범위이며, 반응 몰비는 생리활성 폴리펩타이드:비펩타이드성 중합체가 1:1 내지 1:50인 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 한쪽 말단에만 반응기를 가지거나 양 말단에 가질 수 있다. 반응기를 양 말단에 가진 비펩타이드성 중합체의 경우, 지속형 제제로서의 기능을 수행할 수 있게 하는 생리활성 담체 및 단백질 약물과 결합될 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체의 말단 반응기는 알데하이드기, 프로피온 알데하이드기, 부틸 알데하이드기, 말레이미드(maleimide)기 및 숙신이미드(succinimide)기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 숙신이미드기의 예에는 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 하이드록시 숙신이미딜, 숙신이미딜 카르복시메틸 또는 숙신이미딜 카보네이트가 포함된다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 말단에 반응 알데하이드기 또는 반응 숙신이미드기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 생리활성 담체와 각각 결합하는데 효과적이다. 상기 알데하이드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 아민 결합을 형성할 수 있다. 또한, 숙신이미드 반응기는 pH 7.0~9.0에서 아미노 말단 또는 라이신 잔기와 안정적인 아미드 결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 단계 1)에서는 적절한 반응용액 하에서 비펩타이드성 중합체를 생리활성 폴리펩타이드에 위치특이적으로 결합시켜 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 제조하는 단계이다.
이때 사용되는 용어 "위치특이적"은 생리활성 폴리펩타이드의 아미노산 중 비펩타이드성 중합체와 결합시키고자 하는 아미노산 위치에 비펩타이드성 중합체가 특이적으로 결합하는 것, 바람직하게, 라이신 잔기 또는 N-말단 잔기의 아민에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 이와 같이 위치특이적으로 비펩타이드성 중합체를 결합시키는 경우, 제조하고자 하는 생리활성이 극대화된 생리활성 폴리펩타이드 결합체 외에, 생리활성 등에 중요한 아미노산 잔기와 비펩타이드성 중합체가 결합하여 지속형 제제의 생리활성이 저하된 부수적인 결합체가 제조되는 문제점을 미연에 방지할 수 있다. 예를 들어, 엑센딘-4의 경우, 비펩타이드성 중합체가 생리활성 폴리펩타이드의 N-말단에 결합하는 경우 in vitro 활성이 떨어지는 반면, 비펩타이드성 중합체가 라이신 잔기에 결합하는 경우 in vitro 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 특히, 12번째 또는 27번째 라이신 잔기 중에서도 27번째 라이신 잔기에 비펩타이드성 중합체가 결합되는 경우, 보다 높은 in vitro 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(실시예 10 및 표 2 참조).
본 발명자들은 비펩타이드성 중합체와 생리활성 폴리펩타이드의 위치특이적 결합을 위하여 단계 1에서 반응용액 내 알코올의 존재 유무 및 반응용액의 pH가 중요한 인자임을 발견하였다. 이에 본 발명의 단계 1에서는 알코올을 포함하며 특정 pH 범위를 갖는 반응용액을 사용하여 비펩타이드성 중합체를 생리활성 폴리펩타이드의 특정 위치에 결합(수식)시킨다.
단계 1)의 pH 조건을 변경하는 경우, pH 구간에 따른 생리활성 폴리펩타이드의 아미노산 위치 이성질체의 비율이 조절 가능하며, 동일 pH에서 알코올의 농도(%)에 따라 생리활성 폴리펩타이드의 아미노산 위치 이성질체의 비율 조절 또한 가능하여, 원하는 아미노산에 위치특이적으로 비펩타이드성 중합체를 결합시킬 수 있다.
구체적인 일예로 pH 조건을 변경하는 경우, 상기 단계 1)은 생리활성 폴리펩타이드의 활성을 떨어뜨리지 않는 부위에 비펩타이드성 중합체가 결합할 수 있게 하기 위한 pH에서 수행된다. 상기 pH 범위는 생리활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 생리활성 폴리펩타이드가 인슐린 분비펩타이드(예를 들어, 엑센딘-4)인 경우, 반응용액의 pH가 낮을수록 12번째 라이신의 비율이, pH가 높을수록 인슐린 분비 활성에 영향을 주지 않는 27번째 라이신의 비율이 높게 나타남을 알 수 있었는바(실시예 3 및 도 3 참조), 인슐린 분비 활성에 영향을 주지 않는 27번째 라이신 잔기에 위치 선택적으로 결합시키기 위하여, pH 7.5 내지 9.0에서 단계 1)을 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 알코올의 농도(%) 조건을 변경하는 경우, 상기 단계 1)은 생리활성 폴리펩타이드의 활성을 떨어뜨리지 않는 부위에 비펩타이드성 중합체가 결합할 수 있게 하기 위하여 알코올을 함유한 반응용액 하에서 수행된다. 상기 알코올은 1차, 2차 및 3차 알코올을 모두 포함하며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 10을 갖는 알코올, 더욱 바람직하게는 에탄올 또는 이소프로판올이 사용될 수 있다. 또한, 생리활성 폴리펩타이드가 인슐린 분비펩타이드(예를 들어, 엑센딘-4)인 경우 인슐린 분비 활성에 영향을 주지 않는 27번째 라이신 잔기에 위치 선택적으로 결합시키기 위하여 반응용액 전체 부피에 대하여 0.1% 내지 100% 범위의 알코올이 포함되며, 바람직하게는 25 내지 90%, 더욱 바람직하게는 35 내지 60% 범위의 알코올이 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 생리활성 폴리펩타이드가 엑센딘 또는 이의 유도체인 경우, 비펩타이드성 중합체가 Lys 27에 결합하는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH는 7.0 내지 10.0일 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 칼시토닌인 경우, 비펩타이드성 중합체가 N-말단에 결합하는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH는 4.0 내지 6.0 일 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 옥시토모둘린 또는 이의 유도체인 경우, 비펩타이드성 중합체가 Lys27 또는 Lys30에 결합하는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0일 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 인간 인슐린 또는 이의 유도체인 경우, B 사슬의 첫 번째 페닐알라닌 N-말단에 결합되는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH가 4.0 내지 6.0일 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 인간 인슐린 또는 이의 유도체인 경우, A 사슬의 첫 번째 글리신 N-말단에 결합되거나 B 사슬의 29번째 라이신에 결합되는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0일 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 GLP-1 또는 이의 유도체인 경우, 비펩타이드성 중합체가 Lys34에 결합하는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0일 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 GLP-2 또는 이의 유도체인 경우, 비펩타이드성 중합체가 Lys30에 결합하는 비율을 높이기 위하여 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0일 수 있다.
따라서, 본 발명에서 얻고자 하는 바람직한 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체는 PEG가 Lys27에 결합된 엑센딘-4, N-말단에 결합된 칼시토닌, Lys27 또는 Lys30에 결합된 옥시토모둘린 또는 이의 유사체, B 사슬의 첫 번째 페닐알라닌 N-말단에 결합되거나 A 사슬의 첫 번째 글리신 N-말단에 결합되거나 B 사슬의 29번째 라이신에 결합된 인간 인슐린 또는 이의 유사체, 또는 Lys34 또는 Lys30에 결합된 GLP-1 또는 GLP-2일 수 있다.
바람직한 일 양태로서, 생리활성 폴리펩타이드에 대한 비펩타이드성 중합체의 위치특이적 결합을 더욱 촉진하기 위해, 추가적으로 상기 생리활성 폴리펩타이드의 원하는 아미노산 위치 외의 아미노산에 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않도록, 결합을 원하는 아미노산 외의 아미노산 부분을 제거하거나 보호하는 펩타이드의 유도체를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 엑센딘의 경우, N-말단 아미노산인 히스티딘의 알파 아민기를 제거하거나, 히드록실기로 치환하거나, N-말단 히스티딘의 알파 아민기에 메틸기를 두 개 치환시키거나, N-말단 히스티딘의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 아민기를 제거하여 이미다조아세틸(imidazoacetyl) 기만을 남기는 방법 등을 사용하여 제조된 하기 화학식 1의 데스-아미노-히스티딜(DA)-엑센딘-4(Des-amino-histidyl(DA)-exendin-4), 화학식 2의 베타-하이드록시-이미다조프로피오닐(HY)-엑센딘-4(Beta-hydroxy-imidazopropionyl(HY)-exendin-4), 화학식 3의 이미다조아세틸(CA)-엑센딘-4(Imidazoacetyl(CA)-exendin-4), 또는 화학식 4의 디메틸-히스티딜(DM)-엑센딘-4(Dimethyl-histidyl(DM)-exendin-4) 등과 같은 엑센딘 유도체를 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 엑센딘 유도체의 구조 및 제조방법 등에 대해서는 대한민국 특허공개 제2009-008151호에 상세히 기술되어 있으며, 이는 참고문헌으로서 본 발명의 범위에 포함된다.
<화학식 1>
Figure 112010017281374-pat00001
<화학식 2>
Figure 112010017281374-pat00002
<화학식 3>
Figure 112010017281374-pat00003
<화학식 4>
Figure 112010017281374-pat00004
상기와 유사하게, 첫 번째 아미노산이 히스티딘인 옥신토모둘린, GLP-1 및 GLP-2 역시 결합을 원하는 아미노산 외의 아미노산 부분을 제거하거나 보호한 펩타이드의 유도체로 사용될 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 반응 용액의 pH 및 알코올의 함량%를 변경하여 비펩타이드성 중합체의 생리활성 폴리펩타이드에 대한 위치특이적인 결합 양상을 살펴본 결과, 인슐린 분비 펩타이드의 경우 pH의 변화 및 에탄올 또는 이소프로판올의 함량에 따라 12번째 라이신/27번째 라이신의 비율이 변화하며, 특히 pH 7.5에서 35% 내지 55%, 바람직하게는 45%의 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하는 경우, 결합시키기에 가장 바람직한 27번째 라이신 잔기의 위치 이성질체를 다량 확보하여, 이들에 비펩타이드성 중합체가 위치특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
상기 단계 1)에서 pH 및 알코올의 변화에 의하여 목적하고자 하는 비펩타이드성 중합체-생리활성 폴리펩타이드의 결합체의 비율을 높인 후에, 단계 2)에서는 목적하는 상기 결합체를 알코올 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 분리 및 정제할 수 있다.
상기 알코올은 정제용액에 포함되어 사용되며, 그 종류는 단계 1)에서 정의된 바와 같지만, 단계 1)에서는 생리활성 폴리펩타이드의 2차 또는 3차 구조를 변화시켜 반응성 및 위치특이성을 증가시키고자 사용된 반면, 본 단계에서는 분리 및 정제시 이온 교환 컬럼과 생리활성폴리펩타이드 결합체 사이의 비특이적 결합을 줄여 고해상도를 확보하여 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 분리 및 정제를 용이하게 하고자 사용된다. 상기 분리 및 정제는 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 다양한 방법이 적용될 수 있으나, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피, 더욱 바람직하게는 고압 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다.
한편, 위치 이성질체의 분리 및 정제를 용이하게 하기 위하여, 이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 상기 이온 교환크로마토그래피는 적정 pH 하에서 수행될 수 있는데, 단계 1의 pH는 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 위치 특이성을 증가시키기 위해 사용된 반면, 본 단계에서는 알코올이 포함된 정제 용액상에서 안정적으로 이온 교환 컬럼에 생리활성폴리펩타이드 결합체를 부착 및 탈착시키기 위한 목적으로 적절히 조정된다. 단계 2에서 사용되는 적절한 pH는 약 2.0 내지 약 6.0의 범위일 수 있다.
나아가, 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드 결합체는 추가로 생리활성 담체와 결합될 수 있다. 다만, 상기 결합체 내의 비펩타이드성 중합체는 생리활성 폴리펩타이드와 생리활성 담체와 결합하기 위하여 양 말단 비펩타이드성 중합체이어야 한다. 즉, 단계 2)에서 위치특이적으로 분리 정제된 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 공유결합되지 않은 비펩타이드성 중합체 말단에 생리활성 담체를 공유결합으로 연결시켜 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 생리활성 폴리펩타이드 및 생리활성 담체와 결합된 생리활성 폴리펩타이드-생리활성 담체의 결합체를 제조할 수 있다.
단계 2)에서 제조된 생리활성 폴리펩타이드 결합체는 이와 같이 생리활성 담체와 결합할 수 있고, 최종 생성된 생리활성 폴리펩타이드-생리활성 담체의 결합체는 생리활성 폴리펩타이드-비펩타이드성 결합체와는 전혀 다른 활성, 즉, 생리활성 폴리펩타이드의 약리 효과의 탁월한 지속성의 연장, 치료를 원하는 병소와 같은 특정 부위에의 타겟팅 또는 세포의 괴사 유도 등과 같은 탁월한 생리활성을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "생리활성 담체"는 비펩타이드성 중합체에 생리활성 폴리펩타이드와 함께 결합되어 생리활성 폴리펩타이드의 약리 효과와 같은 생리활성을 지속시키거나, 특정 부위에의 타겟팅 또는 세포 괴사 등을 유도시키는, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 갖는 생리활성과는 별개의 부가적인 활성을 나타내는 생리활성 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 생리활성 담체는 상기와 같은 활성을 갖는 물질이 제한 없이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, 트랜스페린, 앱타머, 톡신, 젤라틴, 콜라겐, 덱스트란, 다당류, 지방산 및 피브리노겐 등을 들 수 있다. 바람직하게는 알부민, 면역글로불린 Fc 영역 및 트랜스페린에서 생리활성 담체를 선택할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 천연형 면역글로불린 Fc와 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 면역글로불린 Fc 영역일 수도 있고, 인산화, 황화, 아크릴화, 당화, 메틸화, 파네실화, 아세틸화 및 아밀화 등으로 수식되는 면역글로불린 Fc 영역 등을 모두 포함한다. 이러한 면역글로불린 Fc의 범위, 제조방법 및 면역글로불린 Fc를 비펩타이드성 중합체-생리활성 폴리펩타이드 연결체에 공유 결합시키는 방법은 대한민국 등록특허 제775343호, 제725314호, 제725315호 및 제824505호 등에 상세히 기술되어 있으며, 이들은 참고문헌으로서 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 사용하는 경우, 생리활성 폴리펩타이드의 특정 아미노산에 위치특이적으로 비펩타이드성 중합체를 결합시킬 수 있어, 생리활성이 가장 탁월한 생리활성 폴리펩타이드 결합체 외의 다른 부가적인 결합체의 생성을 최소화시키는바, 약리학적으로 가치가 있는 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 수율을 증가시킬 수 있다는 효과를 갖는다.
이하 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 페길화된 DA-엑센딘-4(Lys27) 결합체의 제조 및 분리
<1-1> 페길화된 DA 엑센딘-4(Lys27) 결합체의 제조
펩타이드 내의 Lys와 PEG 간의 공유결합을 통하여 페길화(pegylation)된 펩타이드 결합체를 제조하기 위하여, 데스-아미노-히스티딜-엑센딘-4(DA-엑센딘-4, 농도 3 mg/mL, AP, 미국)를 2개의 프로피온알데하이드기를 갖고 있는 3.4K PropionALD(2) PEG(IDB Inc., 한국)와 1:30의 몰비로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판올을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)을 사용하고, 각 반응용액에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<1-2> 위치 이성질체의 분리
상기 단계 <1-1>의 반응액을 SOURCE Q 이온 교환 크로마토그래피(XK 16 mL, 지이 헬스케어, 한국)을 이용하여 하기의 조건하에서 일차적으로 모노-페길화된(Mono-pegylated) 펩타이드를 정제하였으며, 이를 SOURCE S 이온 교환 크로마토그래피(XK 16 mL,지이 헬스케어, 한국)을 이용하여 하기의 조건하에서 위치 이성질체를 분리하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체 분리를 용이하게 하였다. 용출된 피크는 펩타이드 맵핑 방법으로 페길화된 위치를 확인하였다.
컬럼 : SOURCE Q
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20 mM 트리스, pH 8.5) 및 B(A+0.5M NaCl); A의 농도구배 0→40%, 80분
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20 mM 시트르산, pH 3.0+45% 에탄올) 및 B(A+45% 에탄올+0.5M KCl); A의 농도구배 0→100%, 45분
위치 이성질체의 정제 프로파일 분석 결과, DA-엑센딘-4의 Lys12에 페길화된 피크가 가장 앞쪽에 나오고 그 뒤쪽으로 Lys27에 페길화된 피크가 나옴을 알 수 있었다(도 1).
실시예 2: 페길화된 CA-엑센딘-4(Lys27) 결합체의 제조 및 분리
실시예 1에서 DA-엑센딘-4 대신에 이미다조-아세틸-엑센딘-4(CA-엑센딘-4, Bachem, 미국)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 반응 및 정제과정을 수행하여 페길화된 CA-엑센딘-4(Lys 27) 결합체를 수득하였다. 위치 이성질체의 정제 프로파일 분석 결과, CA-엑센딘-4의 Lys12에 페길화된 피크가 앞쪽에 나오고, 그 뒤쪽으로 Lys27에 페길화된 피크가 나옴을 알 수 있었다(도 2).
실시예 3: 반응용액의 pH에 따른 페길화된 CA-엑센딘-4(Lys27) 결합체의 비율 변화
pH에 따른 특정 위치에 페길화된 폴리펩타이드의 비율 변화를 살펴보기 위하여, CA-엑센딘-4와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:30, CA-엑센딘-4의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 각각 100 mM 시트르산(pH 3.0), 100 mM NaOAc(pH 4.5), 100 mM Na-P(pH 7.5), 100 mM Na-P (pH 8.5), 100 mM HEPES(pH 8.0) 및 100 mM Na-Borate(pH 9.2) 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 각 반응액을 실시예 1과 동일한 방법으로 정제한 후, Lys27에 페길화된 결합체의 비율을 조사하여 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, pH가 높아질수록 Lys27에 페길화된 결합체의 비율이 증가하는 것으로 나타났으며, 최적의 pH는 7.0 내지 10.0으로 확인되었다.
실시예 4: 에탄올을 포함한 반응용액의 pH에 따른 페길화된 CA-엑센딘-4(Lys27) 결합체의 비율 변화
에탄올 및 pH에 따른 특정 위치에 페길화된 폴리펩타이드의 비율 변화를 살펴보기 위하여, CA-엑센딘-4와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:30, CA-엑센딘-4의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로 각각 100 mM 시트르산 pH 3.0/45% EtOH, 100 mM NaOAc pH 4.5/45% EtOH, 100 mM Na-P pH 7.5/45% EtOH, 100 mM HEPES pH 8.0/45% EtOH 및 100 mM Na-P pH 8.5/45% EtOH 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM의 NaCNBH3를 첨가하여 반응시켰다. 각 반응액을 실시예 1과 동일한 방법으로 정제한 후, Lys27에 페길화된 결합체의 비율을 조사하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 45% EtOH가 포함된 반응액에서 pH가 높아질수록 Lys27에 페길화된 결합체의 비율이 증가하는 것으로 나타났으며, 최적의 pH는 7.0 내지 9.0으로 확인되었다.
실시예 5: 반응용액 내 에탄올 농도에 따른 페길화된 CA-엑센딘-4(Lys27) 결합체의 비율 변화
반응용액 내 에탄올 농도에 따른 특정 위치에 페길화된 폴리펩타이드의 비율 변화를 살펴보기 위하여, CA-엑센딘-4와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:30, CA-엑센딘-4의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응은 각각 100 mM HEPES pH 7.5/0% EtOH, 100 mM HEPES pH 7.5/25% EtOH, 100 mM HEPES pH 7.5/35% EtOH, 100 mM HEPES pH 7.5/45% EtOH, 100 mM HEPES pH 7.5/55% EtOH, 100 mM HEPES pH 7.5/75% EtOH, 및 100mM HEPES pH 7.5/90% EtOH 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM의 NaCNBH3를 첨가하였다. 각 반응액을 실시예 1과 동일한 방법으로 정제한 후, Lys27에 페길화된 결합체의 비율을 조사하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 반응용액에 포함된 에탄올의 함량이 약 50% 정도까지는 Lys27에 페길화된 결합체의 비율이 증가하는 반면, 50% 이상에서는 점차 감소하는 것으로 나타나, 최적 에탄올 함량은 35% 내지 60%인 것으로 확인되었다.
실시예 6: 반응용액 내 이소프로판올 농도에 따른 페길화된 CA-엑센딘-4(Lys27) 결합체의 비율 변화
반응용액에 에탄올 대신에 이소프로판올을 사용하는 경우 특정 위치에 페길화된 폴리펩타이드의 비율 변화를 살펴보기 위하여, CA-엑센딘-4와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:30, CA-엑센딘-4의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액은 각각 100 mM HEPES pH 7.5/0% 이소프로판올, 100 mM HEPES pH 7.5/30% 이소프로판올, 100 mM HEPES pH 7.5/45% 이소프로판올 및 100 mM HEPES pH 7.5/60% 이소프로판올 완충액을 사용하였고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 각 반응액을 실시예 1과 동일한 방법으로 정제한 후, Lys27에 페길화된 결합체의 비율을 조사하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 반응용액에 포함된 에탄올의 함량이 약 50% 정도까지는 Lys27에 페길화된 결합체의 비율이 증가하는 반면, 50% 이상에서는 점차 감소하는 것으로 나타나, 최적 에탄올 함량은 35% 내지 60%인 것으로 확인되었다.
실시예 7: CA - 엑센딘 -4( Lys27 )- PEG -면역글로불린 Fc 결합체의 제조
실시예 6에서 얻은 CA-엑센딘-4(Lys27)-PEG 결합체를 인간 면역글로불린 Fc 단편(한미약품, 한국)과 결합시켰다. 펩타이드와 면역글로불린 Fc의 몰비를 1:8, 전체 단백질 농도를 20 mg/mL로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응용액은 100 mM K-P pH 6.0을 사용하였고, 여기에 환원제인 20 mM의 NaCNBH3를 첨가하였다. 결합 반응 후 하기의 조건하에서 SOURCE Phe 컬럼 및 SOURCE Q 컬럼을 이용하여 2단계로 정제하였다.
컬럼 : SOURCE Phe (XK 16ml, 지이 헬스케어)
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20 mM 트리스, pH 7.5) 및 B(A+1.5M NaCl); A의 농도구배 0→40%, 80분
컬럼 : SOURCE Q (XK 16ml, 지이 헬스케어)
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20 mM 트리스, pH 7.5) 및 B(A+1M NaCl); A의 농도구배 0→40%, 80분
상기 제조된 결합체를 SDS-PAGE로 분석하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 비환원(NR) 조건에서는 60K에 단일 밴드가 나타났으며, 환원(R) 조건에서는 35K와 25K에 두 개의 밴드가 나타났다.
실시예 8: CA - 엑센딘 -4( Lys27 )- PEG 결합체의 페길화 위치 확인
CA-엑센딘-4에 PEG가 결합된 위치를 확인하기 위하여, 실시예 2에서 얻어진 CA-엑센딘-4-PEG 결합체들을 단백분해 효소인 라이신-C로 절단 후, 역상크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
우선, CA-엑센딘-4-PEG 이성잘체들을 SDS-PAGE로 분석한 후(도 8), 정제된 각 CA-엑센딘-4-PEG 결합체 및 CA-엑센딘-4를 트리에틸아민-염산 완충액(10 mmol/L; pH 7.5)에 1 mg/mL 농도로 용해한 뒤 10 μL의 효소(0.1 mg/mL)를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후, 반응 혼합물을 역상크로마토그래피(HPLC(Agilent), jupiter C18(Phenomenex))를 사용하여 분석하였고, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다. 도 9에서 보는 바와 같이, CA-엑센딘-4에 PEG의 결합 위치가 Lys12인 경우, #1과 #2이 동시에 사라짐으로써 확인할 수 있으며, 도 10에서 보는 바와 같이, CA-엑센딘-4에 PEG의 결합 위치가 Lys27인 경우, #2과 #3이 동시에 사라짐으로써 확인 할 수 있다.
실시예 9: N-말단 페길화시 이소프로판올 농도에 따른 페길화 수율 확인
메톡시 폴리에틸렌글리콜 5K ALD(NOF Inc., 일본)를 연어 칼시토닌(Calcitonin Salmon, Bachem, 미국)의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 연어 칼시토닌과 PEG의 몰비를 1:1, 연어 칼시토닌의 농도를 1 mg/mL로 하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 이 때 반응용액은 각각 100 mM NaAc pH 5.2/0% 이소프로판올, 100 mM NaAc pH 5.2/45% 이소프로판올 완충액을 사용하였고, 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 각 반응액을 SOURCE S 컬럼(XK 16 mL, 지이 헬스케어)를 이용하여 하기의 조건에 따라 PEG가 단일 수식된 펩타이드를 정제하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.5 mL/분
용출액 : A(20 mM 아세테이트 pH 5.2) 및 B(A+1M NaCl); A의 농도구배 0→40%, 60분
반응 완충 용액 단일페길화된(monopegylated) 칼시토닌-5K의
수율 (%)
0.1M NaAc pH 5.2 36
0.1M NaAc pH 5.2 / 45 % IPA 51.3
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 이소프로판올 첨가에 의해 페길화된 칼시토닌의 수율이 높아짐을 알 수 있었다.
실시예 10: 페길화 및 페길화 위치에 따른 엑센딘-4의 in-vitro 활성 측정
페길화 및 페길화 위치에 따른 엑센딘-4 지속형 제제의 효력을 측정하기 위하여, in-vitro 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다. GLP-1의 in-vitro 활성 측정은 GLP-1 수용체를 클로닝시킨 CHO 세포주에 GLP-1을 처리함에 따른 세포 내의 cAMP 증가 여부를 측정하는 방법이다.
구체적으로, GLP-1이 클로닝된 세포주인 CHO/GLP-1R에 GLP-1 및 엑센딘-4와 하기 표 2의 시험물질을 농도별로 처리한 뒤, cAMP 발생 정도를 측정하여 EC50값을 비교하였다. 대조군으로는 시판되고 있는 엑센딘-4 제제인 Byetta(릴리)를 사용하였다. 시험물질 처리에 따른 in - vitro 역가(%)를 하기 표 2에 나타내었다.
시험물질 In vitro 역가 (%)
Byetta 100
CA-엑센딘-4 77
CA-엑센딘-4-PEG(Lys12) 2.1
CA-엑센딘-4-PEG(Lys27) 8.5
상기 표 2에서 보는 바와 같이, CA-엑센딘의 Lys27에 PEG가 수식된 경우 Lys12에 PEG가 수식된 경우에 비해 상대적으로 펩타이드의 생리활성이 적게 영향을 받는 것으로 나타났다.
실시예 11: 페길화된 옥신토모둘린 ( Oxyntomodulin )( Lys30 ) 결합체의 제조 및 분리
<11-1> 페길화된 옥시토모둘린 결합체( Lys30 )의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린(Anygen, 한국)의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥시토모둘린과 PEG의 몰비를 1:15, 옥시토모둘린의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 4.5시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판올을 포함하는 pH 9.0인 100 mM 농도의 Na-Borate 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<11-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여, 하기의 조건 하에서 Lys30에 페길화된 위치 이성질체를 정제하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다 (도 11).
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20mM Na-citrate, pH 3.0+45% 에탄올) 및 B(A+1M KCl); A의 농도구배 0→3%, 1분, B의 농도구배 0→40%, 222분
실시예 12: 페길화된 이미다조 -아세틸 옥신토모둘린 ( Lys30 ) 결합체 제조 및 분리
실시예 11에서 옥시토모둘린 대신에 이미다조-아세틸-옥신토모둘린(Anygen, 한국)을 사용하는 것과 반응용액으로서 45% 이소프로판올을 포함하는 pH 7.5인 100 mM 농도의 HEPES 완충액을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 11의 반응 및 정제를 반복하여 페길화된 이미다조-아세틸 옥신토모둘린(Lys30) 결합체를 제조하였다.
SOURCE S 컬럼을 이용하여 분리한 이성질체의 결과는 도 12에 나타내었고, Asp-N 단백질 가수분해효소를 이용한 펩타이드 맵핑 결과는 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보는 바와 같이 PEG가 Lys30에 수식되어 #4:Asp(22)-(37) 부분이 사라졌음을 알 수 있었다.
실시예 13: 이미다조 -아세틸 옥신토모둘린 ( Lys30 )- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 12에서 수득한 이미다조-아세틸 옥시토모둘린-PEG(Lys30) 결합체와 면역글로불린 Fc(한미약품, 한국)를 몰비가 1:10, 전체 단백질 농도를 20 mg/mL로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응용액으로서 100 mM 인산칼륨(pH 6.0)을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 반응종결 후, 반응액을 SOURCE 15Q 컬럼을 사용하여 하기의 조건하에서 정제하였다.
컬럼 : SOURCE Q
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20 mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 B(A+1M NaCl); A의 농도구배 0→20%, 100 분
CA-옥신토모둘린의 Lys30에 PEG가 수식된 위치 이성질체를 면역글로불린 Fc와 결합시킨 후 SOURCE Q를 이용하여 정제한 크로마토그램을 도 14에 나타내었고, CA-옥신토모둘린(Lys30)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과는 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보는 바와 같이 비환원(NR) 조건에서 60K에 단일 밴드가 나타났으며, 환원(R) 조건에서 35K 및 25K에 두 개의 밴드의 나타났다.
실시예 14: 페길화된 옥신토모둘린 유사체( Lys27 ) 결합체의 제조 및 분리
<14-1> 페길화된 옥신토모둘린 유사체( Lys27 ) 결합체의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모둘린 유사체([20Asp, 24Ala, 28Ser]-옥신토모둘린-[Deletion30-37])의 라이신27에 페길화시키기 위하여, 상기 옥신토모둘린 유사체(Anygen, 한국)와 PEG를 몰비 1:15, 옥시토모둘린 유사체 농도를 3 mg/mL로 4℃에서 3.5시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판올이 포함된 100 mM Sodium Borate pH 9.0를 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<14-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여 Lys27에 페길화된 위치 이성질체를 정제 및 분리하였다. 정제 및 분리 조건은 실시예 11과 동일하다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다(도 16). 정제한 모노-페길화된 옥신토모둘린 유사체의 라이신 선택성은 Lys-C 단백질 가수분해 효소를 이용한 펩타이드 맵핑법을 사용하여 확인하였다(도 17). 도 17에서 보는 바와 같이 PEG가 Lys27에 수식되어 #2 부분만 사라지는 것을 알 수 있었다.
실시예 15: 페길화된 이미다조 -아세틸 옥신토모둘린 유사체( Lys27 ) 결합체의 제조 및 분리
<15-1> 페길화된 이미다조 -아세틸 옥신토모둘린 유사체( Lys27 ) 결합체의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체([20Asp, 24Ala, 28Ser]-옥신토모둘린-[Deletion30-37])의 라이신27에 페길화시키기 위하여, 상기 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체(Anygen, 한국)와 PEG를 몰비 1:10, 옥시토모둘린 유사체 농도를 3 mg/mL로 4℃에서 2.5시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판을 포함하는 100 mM HEPES pH 7.5를 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<15-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여 Lys27에 페길화된 위치 이성질체를 정제 및 분리하였다. 정제 및 분리 조건은 실시예 11과 동일하다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다(도 18). 정제한 모노-페길화된 이미다조-아세틸 옥신토모둘린 유사체의 라이신 선택성은 Lys-C 단백질 가수분해 효소를 이용한 펩타이드 맵핑법을 사용하여 확인하였다(도 19). 도 19에서 보는 바와 같이, PEG가 Lys27에 수식되어 #2 부분이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 16: 페길화된 이미다조 -아세틸 옥신토모둘린 유사체( Lys27 )- 면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 15에서 수득한 Lys27에 페길화된 이미다조-아세틸 옥신토모듈린 유사체-PEG와 면역글로불린 Fc를 몰비가 1:10, 전체 단백질 농도를 20 mg/mL로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응용액으로서 100 mM 인산칼륨 pH 6.0을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 반응종결 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 컬럼을 사용하여 하기의 조건하에서 정제하였다.
컬럼 : SOURCE Q
유속 : 2.0 mL/분
용출액: A(20 mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 B(A+1M NaCl); A의 농도구배 0→20%, 100분
CA-옥신토모둘린 유사체의 Lys27에 PEG가 수식된 위치이성질체를 면역글로불린 Fc와 결합시킨 후 SOURCE Q를 이용하여 정제한 크로마토그램을 도 20에 나타내었고, CA-옥신토모둘린 유사체(Lys27)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에서 보는 바와 같이, 비환원(NR) 조건에서 60K에 단일 밴드가 나타났으며, 환원(R) 조건에서 35K 및 25K에 두 개의 밴드가 나타났다.
실시예 17: 페길화된 GLP -1( Lys34 ) 결합체의 제조 및 분리
<17-1> 페길화된 GLP -1 결합체( Lys34 )의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 GLP-1(Anygen, 한국)의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, GLP-1과 PEG의 몰비를 1:15, GLP-1의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 3.5시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판을 포함하는 pH 9.0인 100 mM 농도의 Na-Borate 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<17-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여, 하기의 조건 하에서 Lys34에 페길화된 위치 이성질체를 정제하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다 (도 22). 라이신 선택성은 Lys-C 단백질가수분해효소를 이용한 펩타이드 맵핑법(peptide mapping)을 사용하여 확인하였다(도 23).
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20mM Na-citrate, pH 3.0+45% 에탄올) 및 B(A+1M KCl); A의 농도구배 0→3%, 1분, B의 농도구배 3→40%, 150분
도 23에서 보는 바와 같이, Lys34에 PEG가 수식되어 #2 부분이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 18: 페길화된 이미다조 -아세틸 GLP -1( Lys34 ) 결합체의 제조 및 분리
<18-1> 이미다조 -아세틸 페길화된 GLP -1 결합체( Lys34 )의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 이미다조-아세틸 GLP-1(Anygen, 한국)의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 이미다조-아세틸 GLP-1과 PEG의 몰비를 1:10, 이마다조-아세틸 GLP-1의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판을 포함하는 pH 7.5인 100 mM 농도의 HEPES 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<18-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여, 하기의 조건 하에서 Lys34에 페길화된 위치 이성질체를 정제하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다 (도 24). 라이신 선택성은 Glu-C 단백질가수분해효소를 이용한 펩타이드 맵핑법(peptide mapping)을 사용하여 확인하였다(도 25).
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20mM Na-citrate, pH 3.0+45% 에탄올) 및 B(A+1M KCl); A의 농도구배 0→3%, 1분, B의 농도구배 3→40%, 150분
도 25에서 보는 바와 같이, Lys34에 PEG가 수식되어 #4 부분이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 19: 페길화된 이미다조 -아세틸 GLP -1( Lys34 )- 면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 18에서 수득한 Lys34에 페길화된 이미다조-아세틸 GLP-1-PEG와 면역글로불린 Fc를 몰비가 1:8, 전체 단백질 농도를 50 mg/mL로 하여 4℃에서 17시간 동안 반응시켰다. 반응용액으로서 100 mM 인산칼륨 pH 6.0을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 반응종결 후, 상기 반응액을 SOURCE Phe 컬럼을 사용하여 하기의 조건하에서 정제하였다.
컬럼 : SOURCE Phe
유속 : 2.0 mL/분
용출액: A(20 mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 B(A+2M NaCl); A의 농도구배 100→0%, 100분
CA-GLP-1의 Lys34에 PEG가 수식된 위치 이성질체를 면역글로불린 Fc와 결합시킨 후 SOURCE Phe를 이용하여 정제한 크로마토그램을 도 26에 나타내었고, CA-GLP-1(Lys34)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도 27에 나타내었다. 도 27에서 보는 바와 같이, 비환원(NR) 조건에서 60K에 단일 밴드가 나타났으며, 환원(R) 조건에서 35K와 25K에 두 개의 밴드가 나타났다.
실시예 20: 페길화된 GLP -2( Lys30 ) 결합체의 제조 및 분리
<20-1> 페길화된 GLP -2 결합체( Lys30 )의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 GLP-2(Anygen, 한국)의 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, GLP-1과 PEG의 몰비를 1:12, GLP-2의 농도를 5 mg/mL로 하여 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판을 포함하는 pH 9.0인 100 mM 농도의 Na-Borate 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<20-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여, 하기의 조건 하에서 Lys30에 페길화된 위치 이성질체를 정제하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다 (도 28). 라이신 선택성은 트립신 단백질가수분해효소를 이용한 펩타이드 맵핑법(peptide mapping)을 사용하여 확인하였다(도 29).
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20mM Na-citrate, pH 3.0+45% 에탄올) 및 B(A+1M KCl); A의 농도구배 0→3%, 1분, B의 농도구배 3→40%, 150분
도 29에서 보는 바와 같이 Lys30에 PEG가 수식되어 #2 부분이 사라지는 것을 확인하였다.
실시예 21: 페길화된 이미다조 -아세틸 GLP -2( Lys30 ) 결합체의 제조 및 분리
<21-1> 이미다조 -아세틸 페길화된 GLP -2 결합체( Lys30 )의 제조
3.4K PropionALD(2) PEG를 이미다조-아세틸 GLP-2(Anygen, 한국)의 라이신30 잔기에 페길화시키기 위하여, 이미다조-아세틸 GLP-2과 PEG의 몰비를 1:20, 이마다조-아세틸 GLP-2의 농도를 3 mg/mL로 하여 4℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액으로서 45% 이소프로판을 포함하는 pH 7.5인 100 mM 농도의 HEPES 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<21-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여, 하기의 조건 하에서 Lys30에 페길화된 위치 이성질체를 정제하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다 (도 30).
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20mM Na-citrate, pH 3.0+45% 에탄올) 및 B(A+1M KCl); A의 농도구배 0→3%, 1분, B의 농도구배 3→40%, 150분
실시예 22: 페길화된 이미다조 -아세틸 GLP -2( Lys30 )-면역글로불린 Fc 결합체 제조
실시예 21에서 수득한 Lys30에 페길화된 이미다조-아세틸 GLP-2-PEG와 면역글로불린 Fc를 몰비가 1:15, 전체 단백질 농도를 20 mg/mL로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응용액으로서 100 mM 인산칼륨 pH 6.0을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다. 반응종결 후, 상기 반응액을 SOURCE Phe 컬럼을 사용하여 하기의 조건하에서 정제하였다.
컬럼 : SOURCE Phe
유속 : 2.0 mL/분
용출액: A(20 mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 B(A+2M NaCl); A의 농도구배 100→0%, 100분
CA-GLP-2의 Lys30에 PEG가 수식된 위치 이성질체를 면역글로불린 Fc와 결합시킨 후 SOURCE Phe를 이용하여 정제한 크로마토그램을 도 31에 나타내었고, CA-GLP-2(Lys30)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도 32에 나타내었다. 도 32에서 보는 바와 같이 비환원(NR) 조건에서 60K에 단일 밴드가 나타났으며, 환원(R) 조건에서 35K와 25K에 두 개의 밴드가 나타났다.
실시예 23: 페길화된 인간 인 슐린 ( Insulin human , B1Phe) 결합체의 제조 및 분리
<23-1> 페길화된 인간 인 슐린 결합체의 제조
5K PropionALD(1) 메톡시PEG(프로피온알데하이드기를 1개 가지고 있는 PEG, NOF.,일본)를 인간 인슐린(Sigma)의 B 사슬의 첫번째 아미노산인 페닐알라닌 N-말단에 페길화시키기 위하여, 인간 인슐린과 PEG의 몰비를 1:2, 인간 인슐린의 농도를 2.3 mg/mL로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이때 반응용액으로서 45% 이소프로판올을 포함하는 pH 6.0인 100 mM의 인산칼륨 완충액을 사용하고, 여기에 환원제인 20 mM NaCNBH3를 첨가하였다.
<23-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여 하기의 조건하에서 위치 이성질체를 정제 및 분리하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체의 분리를 용이하게 하였다(도 33). 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE 젤을 이용하여 확인하였고, 라이신 선택성은 Glu-C 단백질 가수분해 효소를 이용한 펩타이드 맵핑법을 사용하여 확인하였다(도 36).
컬럼 : SOURCE S
유속 : 2.0 mL/분
용출액 : A(20 mM Na-citrate, pH 2.0+60% 에탄올) 및 B(A+0.5M KCl); A의 농도구배 0→3%, 1분, B의 농도구배 0→50%, 80분
도 36에서 보는 바와 같이, B1F에 PEG가 수식되어 #2 부분이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 24: 페길화된 인간 인슐린(A1Gly) 결합체의 제조 및 분리
<24-1> 페길화된 인간 인슐린(A1Gly) 결합체의 제조
5K 메톡시PEG-숙신이미딜 부타노에이트(1)(SBA 반응기를 1개 가지고 있는 PEG, NOF.,일본)를 인간 인슐린(Sigma)의 A 사슬의 첫번째 아미노산인 글리신 N-말단에 페길화시키기 위하여 인간 인슐린과 PEG의 몰비를 1:4, 인간 인슐린의 농도를 2 mg/mL로 하여 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이때 반응용액으로서 35% 이소프로판올을 포함하는 pH 9.0인 100 mM의 Na-Borate 완충액을 사용하였다.
<24-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여 위치 이성질체를 정제 및 분리하였다. 정제과정은 실시예 23과 동일하게 수행하였다. 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치이성체 분리를 용이하게 하였다(도 34). 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE 젤을 이용하여 확인하였고 라이신 선택성은 Glu-C 단백질가수분해효소를 이용한 펩타이드 맵핑법을 사용하여 확인하였다(도 36).
도 36에서 보는 바와 같이, A1G에 PEG가 수식되어 #1 부분이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 25: 페길화된 인간 인슐린(B29Lys) 결합체 제조 및 분리
<25-1> 페길화된 인간 인슐린(B29Lys) 결합체 제조 및 분리
5K 메톡시PEG-숙신이미딜 부타노에이트(1)를 인간 인슐린의 B 체인의 스물 아홉번째 아미노산인 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 인간 인슐린과 PEG의 몰비를 1:2, 인간 인슐린의 농도를 2 mg/mL로 하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 때 반응용액은 45% 이소프로판올을 포함하는 pH 9.0인 100 mM 농도의 Na-Borate 완충액을 사용하였다.
<25-2> 위치 이성질체의 분리
상기 반응액을 SOURCE 15S(XK16, 아머샴 바이오사이언스) 컬럼을 이용하여 위치 이성질체를 정제 및 분리하였다. 정제 및 분리과정은 실시예 23과 동일하게 수행하였고, 이 과정에서 정제용액에 에탄올을 사용하여 위치 이성질체 분리를 용이하게 하였다(도 35). 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE 젤을 이용하여 확인하였고, 라이신 선택성은 Glu-C 단백질 가수분해효소를 이용한 펩타이드 맵핑법을 사용하여 확인하였다(도 36).
도 36에서 보는 바와 같이, B29K에 PEG가 수식되어 #4 부분이 사라지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

1) 반응 용액의 알코올의 종류와 함량 및 pH에 따른, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 결합체의 아미노산 위치 이성질체의 비율을 확인하여, 목적하는 아미노산 위치 이성질체가 목적하지 않는 아미노산 위치 이성질체보다 많이 존재하게 되는 알코올의 종류와 함량 및 pH 범위를 결정하는 단계;
2) 상기 단계 1에서 결정된 알코올 종류와 함량 및 pH 범위를 갖는 반응 용액 하에서, 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 반응시키는 단계; 및
3) 상기 단계 2의 반응 혼합물로부터 알코올을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 분리 및 정제하는 단계
를 포함하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 인슐린 분비 펩타이드, 혈액인자, 소화촉진 호르몬, 부신피질 호르몬, 갑상선호르몬, 장내 호르몬, 싸이토카인, 효소, 성장인자, 뉴로펩타이드 (neuropeptide), 뇌하수체 호르몬, 시상하부 호르몬, 항-비만 펩타이드, 항-바이러스 펩타이드 및 생리활성을 갖는 비천연형 펩타이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 적혈구 증식인자, 백혈구 증식인자, 아밀린, 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴, PYY(peptide YY), NPY(neuropeptide Y), GLP-1, GLP-2, 엑센딘-4(Exendin-4), 옥신토모둘린(Oxyntomodulin), 그렐린(Ghrelin), 안지오텐신, 브래디키닌, 칼시토닌, 부신피질 자극호르몬(Corticotropin), 엘레도이신(Eledoisin), 가스트린, 렙틴, 옥시토신(Oxytocin), 바소프레신(vasopressin), 황체 형성호르몬, 황체 자극호르몬, 여포 자극호르몬, 부갑상선 호르몬, 씨크레틴(secretin), 세르모레린(Sermorelin), 인간 성장호르몬(hGH), 성장호르몬 방출 펩타이드, 콜로니 자극인자(GCSF)류, 인터페론(IFN)류, 인터루킨(Interleukin)류, 프로락틴 방출 펩타이드, 오렉신(Orexin), 갑상선 방출 펩타이드, 콜레시스토키닌(Cholecystokinin), 가스트린 억제 펩타이드, 칼모듈린, 가스트린 유리 펩타이드(Gastric releasing peptide), 모틸린(Motilin), 관활성장관 펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP), 바린나트륨이뇨 펩타이드(Barin natriuretic peptide; BNP), C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP), 뉴로키닌(Neurokinin) A, 뉴로메딘(Neuromedin), 레닌(Renin), 엔도텔린(Endothelin), 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide), 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide), 데모르핀(Dermorphin), 디노르핀(Dynorphin), 엔도르핀(Endorphin), 엔케팔린(Enkepalin), T 세포인자, 종양괴사인자, 종양괴사인자 수용체, 유로키나아제 수용체, 종양억제인자, 콜라게나제 억제제, 티모포이에틴(Thymopoietin), 티물린(Thymulin), 티모펜틴(Thymopentin), 티모신(Tymosin), 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor), 아드레노모둘린(Adrenomodullin), 알라토스타틴(Allatostatin), 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment), 항균성 펩타이드, 항산화제 펩타이드, 봄베신(Bombesin), 오스테오칼신(Osteocalcin), CART 펩타이드, E-셀렉틴(selectin), ICAM-1, VCAM-1, 류코카인(Leucokine), 크링글(Kringle)-5, 라미닌(Laminin), 인히빈(Inhibin), 갈라닌(Galanin), 피브로넥틴(Fibronectin), 판크레아스타틴(Pancreastatin) 및 푸제온(Fuzeon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 엑센딘, 인슐린, GLP-1, GLP-2, 옥신토모둘린, 그렐린, 칼시토닌 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 유도체는 하기 화학식 1 내지 화학식 4 중 어느 하나의 구조를 갖는 엑센딘, 옥신토모둘린, GLP-1 또는 GLP-2 유도체인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법:
<화학식 1>
Figure 112010017281374-pat00005

<화학식 2>
Figure 112010017281374-pat00006

<화학식 3>
Figure 112010017281374-pat00007

<화학식 4>
Figure 112010017281374-pat00008
.
제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알코올, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid), PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid), 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1 및 2의 알코올은 1 내지 10개의 탄소수를 갖는 1차 내지 3차 알코올인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 알코올이 반응용액 총량을 기준으로 35 내지 60부피%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 엑센딘 또는 이의 유도체인 경우, 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 옥시토모둘린 또는 이의 유도체인 경우, 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 인간 인슐린 또는 이의 유도체인 경우, 상기 단계 1의 pH가 4.0 내지 10.0인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 GLP-1 또는 이의 유도체인 경우, 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 GLP-2 또는 이의 유도체인 경우, 상기 단계 1의 pH가 7.0 내지 10.0인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체가 PEG가 Lys27에 결합된 엑센딘-4, N-말단에 결합된 칼시토닌, Lys27 또는 Lys30에 결합된 옥시토모둘린, A 사슬의 첫 번째 글리신 N-말단에 결합되거나 B 사슬의 29번째 라이신에 결합된 인간 인슐린, Lys34 또는 Lys30에 결합된 GLP-1 또는 GLP-2, 또는 이들의 유사체인 것을 특징으로 하는, 위치특이적 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
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