TWI472342B - 用於製備具位置專一性之生理活性多肽綴合物的方法 - Google Patents

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Description

用於製備具位置專一性之生理活性多肽綴合物的方法 發明領域
本發明係關於一種用於製備具位置專一性之生理活性多肽綴合物之方法，更特別係關於一種經由鏈接生理活性多肽與非肽基聚合物而用於以高產率製備該聚合物之方法。
 發明背景
胜肽類由於安定性低而容易變性，藉活體內蛋白酶分解，及由於其大小相當小而經由腎臟排泄。如此為了於血中維持呈活性形式之胜肽藥物的特定濃度，需要經常將胜肽藥物投予病人。但胜肽藥物通常係以注射製劑形式投予，如此頻繁投藥造成病人的嚴重不適。為了解決此項問題，已經開發多種方法，例如經由提高胜肽藥物通過生物膜的通透性來經由口咽吸入或鼻咽吸入而遞送胜肽藥物之方法；一種對蛋白酶敏感之特定胺基酸序列(例如GLP-1胺基酸序列用以防止因二肽基肽酶而喪失力價)經改性俾便經由抑制被酶所分解而安定化胜肽之方法；以及一種用於胜肽表面上以化學方式添加具高溶解度之非肽基聚合物諸如聚乙二醇(PEG)之方法。
PEG已經用作為非肽基聚合物中之一者，PEG非專一性地結合至標靶胜肽之一特定位置或多個位置來達成增加胜肽分子量的效果，所得PEG-胜肽可對抗透過腎臟及酶催化水解作用的損失而未造成任何副作用。舉例言之，國際專利公告案第WO 2006/076471號說明經由結合PEG至其上而維持B型利鈉尿胜肽(BNP)用作為充血性心衰竭治療劑的生理活性；及美國專利第6,924,264號說明藉由PEG結合至其離胺酸殘基而增加艾森素(exendin)-4藥物之活體內駐留時間。
此等方法經由增加PEG之分子量而延長胜肽藥物之活體內駐留時間，但隨著分子量的增加，胜肽藥物之力價變成顯著減低。此外，PEG之非專一性結合可能遮蔽生理活性多肽之活性功能部位而顯著降低該多肽之活性。
因此需要發展一種用於製備生理活性多胜與非肽基聚合物之綴合物之改良方法，其中該聚合物係以不會影響多肽的活性之位置專一性方式鏈接至該肽胜。
本發明人藉由證實經由調整反應介質之pH及醇含量，可以高產率製備具有具位置專一性鏈接的非肽基聚合物之生理活性多肽綴合物而完成本發明。
 發明概要
如此，本發明之一目的係提供一種其中非肽基聚合物係以位置專一性結合至生理活性多肽之生理活性多肽綴合物之高產率製備方法。
根據本發明之一個面相，提供一種用於製備具位置專一性之生理活性多肽綴合物之方法，包含下列步驟：i)於含特定量之醇且具有特定pH之反應介質，進行生理活性多肽與非肽基聚合物之反應來允許該非肽基聚合物結合至生理活性多肽之標靶位置；及ii)使用醇，藉離子交換層析術自該步驟(i)之反應混合物分離及純化該生理活性多肽綴合物。
圖式簡單說明
本發明之此等及其它目的及特徵由後文之發明說明結合附圖將更為彰顯，附圖分別顯示：第1圖：使用索爾斯(SOURCE) S管柱的DA-艾森素-4-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第2圖：使用索爾斯S管柱的CA-艾森素-4-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第3圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於各種pH PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；第4圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於各種pH及於45%乙醇PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；第5圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於pH 7.5及於不等量(%)乙醇PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；第6圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於pH 7.5及於不等量(%)異丙醇PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；第7圖：為CA-艾森素-PEG-免疫球蛋白Fc之SDS-PAGE分析；第8圖：為CA-艾森素-PEG Lys12及Lys27之SDS-PAGE分析；第9圖：藉胜肽映射的CA-艾森素-4之Lys12-PEG化異構物之分析側寫資料；第10圖：藉胜肽映射的CA-艾森素-4之Lys27-PEG化異構物之分析側寫資料；第11圖：使用索爾斯S管柱的調酸素(oxyntomodulin)-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第12圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯調酸素-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第13圖：藉胜肽映射的調酸素之Lys30-PEG化異構物之分析側寫資料；第14圖：使用索爾斯Q管柱的咪唑-乙醯調酸素-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；第15圖：咪唑-乙醯調酸素-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；第16圖：使用索爾斯S管柱的調酸素類似物-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第17圖：藉胜肽映射的調酸素類似物之Lys27-PEG化異構物之分析側寫資料；第18圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯調酸素類似物-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第19圖：藉胜肽映射的咪唑-乙醯調酸素類似物之Lys27-PEG化異構物之分析側寫資料；第20圖：使用索爾斯Q管柱的咪唑-乙醯調酸素類似物-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；第21圖：咪唑-乙醯調酸素類似物-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；第22圖：使用索爾斯S管柱的GLP-1-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第23圖：藉胜肽映射的GLP-1之Lys34-PEG化異構物之分析側寫資料；第24圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯GLP-1-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第25圖：藉胜肽映射的咪唑-乙醯GLP-1之Lys34-PEG化異構物之分析側寫資料；第26圖：使用索爾斯Phe管柱的咪唑-乙醯GLP-1-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；第27圖：咪唑-乙醯GLP-1-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；第28圖：使用索爾斯S管柱的GLP-2-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第29圖：藉胜肽映射的GLP-2之Lys30-PEG化異構物之分析側寫資料；第30圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯GLP-2-PEG之位置異構物之純化側寫資料；第31圖：使用索爾斯Phe管柱的咪唑-乙醯GLP-2PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；第32圖：咪唑-乙醯GLP-2-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；第33圖：使用索爾斯S管柱的人胰島素-PEG(B1F)之位置異構物之純化側寫資料；第34圖：使用索爾斯S管柱的人胰島素-PEG(A1G)之位置異構物之純化側寫資料；第35圖：使用索爾斯S管柱的人胰島素-PEG(B29K)之位置異構物之純化側寫資料；及第36圖：藉胜肽映射的人胰島素之A1G-、B1F-、或B29K-PEG化異構物之分析側寫資料。
 較佳實施例之詳細說明
後文說明本發明之細節。
本發明提供一種用於製備具位置專一性之生理活性多肽綴合物之方法，包含下列步驟：
i)於含有特定量醇且具有特定pH來允許非肽基聚合物結合至生理活性多肽之標靶位置的反應介質，以該非肽基聚合物處理該生理活性多肽；及
ii)使用醇，藉離子交換層析術自該步驟(i)之反應混合物分離及純化該生理活性多肽綴合物。
根據本發明之生理活性多肽綴合物係指其中生理活性多肽與非肽基聚合物之末端彼此共價鏈接之一種物質，及本發明係以經由於特定條件下鏈接多肽與聚合物及分離具有該多肽鏈接於其標靶位置上之該所得多肽綴合物為其特徵。
如此處使用，「生理活性多肽或胜肽」一詞係指於活體內具有生理活性之胜肽，例如可選自於由促胰島素肽、血液因子、消化激素、促腎上腺皮質激素、甲狀腺激素、腸激素、細胞激素、酶、生長因子、神經肽、促生理機能降低(hypophyseotropic)激素、促垂體素、抗肥胖肽、抗病毒肽、及保有生理活性性質之非天然肽衍生物所組成之組群，但非限制性。特定言之，生理活性多肽或胜肽或選自於由紅血球生成素、GM-CSF(粒狀細胞巨噬細胞群落刺激因子)、澱粉素、升糖素、胰島素、體抑素、PYY(胜肽YY)、NPY(神經肽Y)、GLP-1、GLP-2、艾森素(exendin)-4、調酸素(oxyntomodulin)、飢餓激素(ghrelin)、血管收縮素(angiotensin)、緩激肽(bradykinin)、抑鈣素(calcitonin)、促腎上腺皮質素(corticotropin)、章魚唾腺素(eledoisin)、胃泌素(gastrin)、瘦素(leptin)、催產素(oxytocin)、血管升壓素(vasopressin)、LH(黃體激素)、促乳素(prolactin)、FSH(濾泡刺激激素)、PTH(副甲狀腺激素)、胰泌素(secretin)、舍莫瑞林(sermorelin)、hGH(人生長激素)、生長激素釋放肽、G-CSFs(粒狀細胞群落刺激因子)、干擾素類、介白素類(interleukins)、促乳素釋放肽、食欲激素(orexin)、甲狀腺素釋放肽、縮膽激肽(cholecystokinin)、胃泌素抑制肽、調鈣素(calmodulin)、胃泌素釋放肽、蠕動素(motilin)、血管活性腸肽、ANP(心房利鈉尿肽)、BNP(腦利鈉尿肽)、CNP(C型利鈉尿肽)、神經激肽(neurokinin)A、神經介素(neuromedin)、腎素(renin)、內皮素(endothelin)、角蛙毒素(sarafotoxin)肽、牛乳啡肽(carsomorphin)胜肽、蛙皮啡肽(dermorphin)、強啡肽(dynorphin)、腦內啡(endorphin)、腦啡肽(enkepalin)、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、尿激酶(urokinase)受體、腫瘤抑制因子、膠原酶抑制劑、胸腺生成素(thymopoietin)、胸腺刺激素(thymulin)、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺激素(tymosin)、胸腺體液因子、腎上腺髓質素(adrenomodullin)、咽側體抑素(allatostatin)、類澱粉β-蛋白質片段、抗微生物肽、抗氧化劑肽、鈴蟾素(bombesin)、骨鈣化素(osteocalcin)、CART肽、E-選擇素(E-selectin)、ICAM-1、VCAM-1、白激素(leucokine)、克靈格(kringle)-5、層黏蛋白(laminin)、抑制素(inhibin)、甘丙胺激素(galanin)、纖維黏連蛋白(fibronectin)、胰抑素(pancreastatin)、及福艾(fuzeon)所組成之組群。此外，生理活性多肽包括前驅物、衍生物、片段、或其變異株。
用於本發明之較佳生理活性多肽為艾森素、胰島素、GLP-1、GLP-2、調酸素、飢餓激素、血管收縮素、緩激肽、抑鈣素或其衍生物。其衍生物例如可經由胺基酸殘基上的任何基團之化學取代(例如α-甲基化或α-羥基化)、刪失(例如去胺化或碳刪失)或改性(例如N-甲基化)製備，特別艾森素衍生物之製備細節係說明於韓國專利申請案第2008-69234號。
同時如此處使用，「非肽基聚合物」一詞係指包括藉共價鍵(胜肽鍵除外)彼此鏈接的兩個或多個重複單元之生物可相容性聚合物。
可用於本發明之非肽基聚合物可選自於由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇類、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物分解聚合物諸如PLA(聚(乳酸))及PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂質聚合物、甲殼聚糖類、玻尿酸及其組合物所組成之組群，及較佳為聚乙二醇。熟諳技藝人士已知或基於技藝界技巧容易製備之其衍生物也含括於本發明之範圍。可用於本發明之非肽基聚合物其功能係增高生理活性多肽之分子量來防止綴合物通過腎臟損耗。任何非肽基聚合物只要可對抗活體內蛋白酶則皆可使用而無任何限制。非肽基聚合物之分子量可於0.5kDa至100kDa較佳為0.5kDa至20kDa之範圍，生理活性多肽與非肽基聚合物之適當莫耳比可選自於自1:1至1:50之範圍。
本發明使用之非肽基聚合物於一端或於兩端具有一個反應性基團。於非肽基聚合物於兩端具有反應性基團之情況下，其係結合至生理活性載體及蛋白質藥物來協助發揮作為長效配方之功能。
於非肽基聚合物之一端或兩端的該反應性基團較佳係選自於反應性醛基、丙醛基、丁醛基、順丁烯二醯亞胺基及丁二醯亞胺基所組成之組群。丁二醯亞胺基之實例包括丁二醯亞胺基丙酸根、丁二醯亞胺基丁酸根、羥丁二醯亞胺基、丁二醯亞胺基羧甲基、或丁二醯亞胺基碳酸根。特定言之，當非肽基聚合物於一端具有反應性醛基或反應性丁二醯亞胺基時，可有效於兩端鏈接生理活性多肽及免疫球蛋白而極少有非專一性反應。醛反應基於低pH選擇性地結合至N端，及可於高pH諸如pH 9.0結合至離胺酸殘基來形成胺。此外，丁二醯亞肽反應基可於pH 7.0至9.0與胺基端或離胺酸殘基形成安定的醯胺鍵結。
進一步，於非肽基聚合物兩端之反應性基團可相同或相異。當於其兩端具有反應性羥基之聚乙二醇用作為非肽基聚合物時，該羥基可藉化學反應活化成為多個反應性基團，或可使用具有已改性之反應性基團之市售聚乙二醇。
本發明之步驟(i)係經由於適當反應介質，位置專一性地鏈接非肽基聚合物與生理活性多肽來製備生理活性多肽綴合物。
如此處使用，「位置專一性」或「位置專一性地」一詞係指非肽基聚合物鏈接至生理活性多肽之特定標靶胺基酸位置，較佳為離胺酸殘基或N端之胺。位置專一性鏈接或鍵結可防止其中該非肽基聚合物係鏈接至生理上重要的胺基酸殘基之意外的綴合物形成。舉例言之，當非肽基聚合物結合至艾森素-4之N端時，艾森素-4之試管試驗活性變減低，但當非肽基聚合物結合至離胺酸殘基時，維持試管試驗活性。特別，當非肽基聚合物結合至第27個離胺酸殘基而非第12個離胺酸殘基時，觀察得遠更高的試管試驗活性(參考實例10及表2)。
本發明人發現於反應介質中醇的存在及於步驟(i)中反應介質之pH為非肽基聚合物與生理活性多肽之位置專一性鍵結的關鍵重要性因素。如此，於本發明之步驟(i)中，使用含醇之特定含量且具有特定pH之反應介質，非肽基聚合物變成鏈接至生理活性多肽之特定位置。
於本發明之特定實施例中，多肽綴合物之特定位置異構物之比例可基於反應介質之pH或基於於相同pH時醇之濃度(%)而改變。因此可以位置專一性方式將非肽基聚合物鏈接至生理活性多肽之期望胺基酸。
換言之，本發明之步驟(i)係於特定pH進行來允許非肽基聚合物結合至期望(或標靶)位置，換言之，不影響多肽的活性。pH範圍係依據生理活性多肽之類別決定。舉例言之，於促胰島素肽(例如艾森素-4)之情況下，於反應介質之低pH高度觀察得其中該聚合物係鏈接至第12個離胺酸之異構物；而其中聚合物係鏈接至不會影響促胰島素活性之第27個離胺酸之異構物則係於反應介質之高pH高度觀察得(參考實例3及第3圖)。如此步驟(i)較佳係於pH 7.5至pH 9.0進行，因而非肽基聚合物係選擇性耦合至第27個離胺酸。
進一步，本發明之步驟(i)係於含醇之反應介質進行，使得非肽基聚合物可結合至不影響多肽的活性之位置。醇之實例包括第一醇、第二醇、及第三醇，較佳為具有1至10碳原子數之醇，更佳為乙醇及異丙醇。以促胰島素肽(例如艾森素-4)為例，以反應介質之總體積為基準，醇可以自0.1%至100%體積比，較佳自25%至90%，更佳自35%至60%之範圍之數量存在於反應介質，來允許非肽基聚合物結合至不影響促胰島素活性之第27個離胺酸。
於本發明之實施例中，當生理活性多肽為艾森素-4或其衍生物時，步驟(i)採用之pH可為7.0至10.0俾便提升非肽基聚合物結合至Lys27之結合比。於本發明之另一個實施例中，當生理活性多肽為抑鈣素時，步驟(i)採用之pH可為4.0至6.0俾便提升非肽基聚合物結合至N端之結合比。於本發明之另一個實施例中，當生理活性多肽為調酸素或其衍生物時，步驟(i)採用之pH可為7.0至10.0俾提升非肽基聚合物結合至Lys27或LyS30之結合比。於本發明之另一個實施例中，當生理活性多肽為人胰島素或其衍生物時，步驟(i)採用之pH可為4.0至6.0俾提升非肽基聚合物結合至B鏈之Phe1(第1個苯丙胺酸)N端之結合比。於本發明之另一個實施例中，當生理活性多肽為人胰島素或其衍生物時，步驟(i)採用之pH可為7.0至10.0俾提升非肽基聚合物結合至A鏈中之Gly1(第1個甘胺酸)N端或結合至B鏈之Lys29(第29個離胺酸)之結合比。於本發明之另一個實施例中，當生理活性多肽為GLP-1或其衍生物時，步驟(i)採用之pH可為7.0至10.0俾提升非肽基聚合物結合至Lys34之結合比。於本發明之另一個實施例中，當生理活性多肽為GLP-2或其衍生物時，步驟(i)採用之pH可為7.0至10.0俾提升非肽基聚合物結合至Lys30之結合比。
如此，本發明之較佳位置專一性之生理活性多肽綴合物為艾森素-4綴合物其中PEG係鏈接至Lys27、抑鈣素綴合物其中PEG係鏈接至N端、調酸素綴合物或其類似物其中PEG係鏈接至Lys27或Lys30、人胰島素綴合物或其類似物其中PEG係鏈接至B鏈中之Phe1 N端、A鏈中之Gly1 N端，或鏈接至B鏈之Lys29或GLP-1或GLP-2綴合物其中PEG係鏈接至Lys34或30Lys。
於本發明之較佳面相中，胜肽衍生物(或類似物)可用來協助非肽基聚合物與生理活性多肽間之位置專一性鍵結。衍生物為具有其它非標靶胺基酸位置中之任一者已刪失或已保護俾便防止非期望之鏈接之胜肽。舉例言之，於促胰島素肽諸如艾森素之情況下，可使用多種艾森素衍生物，諸如式(I)脫胺-組胺醯基(DA)艾森素-4、式(II)β-羥-咪唑丙醯基(HY)-艾森素-4、式(III)咪唑乙醯基(CA)-艾森素-4、及式(IV)二甲基-組胺醯基(DM)艾森素-4，其係使用下列方法製備，此處N端胺基酸組胺酸之α胺基被刪失，N端胺基以羥基取代，組胺酸之N端α胺基以兩個甲基改性，或N端組胺酸之α碳基係結合至胺基被刪失而留下咪唑乙醯基，但非限制性。此等艾森素衍生物實例之結構式及其製備方法係說明於韓國未審查專利公開案第2009-0008151號，以引用方式併入本發明之範圍。
同理，具有組胺酸作為第1胺基酸之調酸素GLP-1及GLP-2也可用作為具有選自於式(I)至式(IV)之任一種結構式之衍生物。
於本發明之特定實施例中，發明人研究反應介質之pH及醇含量(%)對非肽基聚合物之位置專一性結合面相的影響，證實具有聚合物鏈接至第12個離胺酸/第27個離胺酸之促胰島素肽綴合物之比特別係依據pH的變化及乙醇或異丙醇數量之變化而異。特別言之，當於pH 7.5使用35%至55%較佳約45%乙醇或異丙醇時，大部分獲得具有非肽基聚合物結合至第27個離胺酸殘基之更佳異構物。
於步驟(i)中經由調整成特定pH及醇含量而提升期望的非肽基聚合物-生理活性多肽綴合物之比後，可於步驟(ii)使用醇，藉離子交換層析術分離及純化期望的綴合物。
步驟(ii)使用之醇其存在於純化溶液，其特例係與步驟(i)定義之實例相同。但步驟(i)之醇採用於藉改性其第二或第三結構式而提高多肽的反應性及位置專一性之目的，而步驟(ii)之醇係採用於經由減少離子交換管柱與綴合物間之非專一性鍵結而協助位置專一性生理活性多肽綴合物之高產出量分離及純化之目的。分離及純化可使用熟諳技藝人士已知之多種方法進行，較佳係藉離子交換層析術，更佳係藉高壓離子交換層析術。
同時，為了協助位置異構物之分離及純化，離子交換層析術可於特定pH進行。於步驟(i)適合調整pH來提高綴合物的位置專一性，而於步驟(ii)再度調整來於含醇的純化溶液中將綴合物附接至離子交換管柱或自離子交換管柱脫離。步驟(ii)採用之適當pH可於自約2.0至約6.0之範圍。
此外，本發明之生理活性多肽可進一步鏈接生理活性載體。於此種情況下，非肽基聚合物須為有兩端俾結合生理活性載體之非肽基聚合物。換言之，生理活性載體共價結合至非肽基聚合物之未與該生理活性多肽共價鏈接之一端，如此可製備一種綴合物，其中非肽基聚合物兩端係與生理活性多肽及生理活性載體鏈接。
如前文說明，步驟(ii)製備之生理活性多肽綴合物可進一步與生理活性載體結合，所得多肽-聚合物-載體綴合物顯示比較多肽-聚合物-綴合物全然不同的活性，換言之，優異生理活性諸如靶定於特定位置諸如欲治療之病灶之生理活性多肽的優異長期持續的藥理效果或壞死之誘導。
如此處使用，「生理上活性載體」一詞係指顯示與該多肽的天然生理活性不同之額外活性之一種生理活性物質，其可保有該多肽之生理活性諸如藥理效果，或經由以生理活性多肽共同結合至非肽基多肽而靶定於特定位置或壞死。
用於本發明之生理上活性載體包括具有前述活性物質但非限制性，例如白蛋白、免疫球蛋白Fc區、轉鐵蛋白(transferrin)、適配子(aptamer)、毒素、膠原蛋白、葡聚糖、多醣類、脂肪酸類、纖維蛋白原(fibrinogen)等。較佳該生理上活性載體可選自於白蛋白、免疫球蛋白Fc區、及轉鐵蛋白更佳為免疫球蛋白Fc區。
本發明之免疫球蛋白Fc區係指免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)，重鏈及輕鏈之可變區、重鏈恆定區1(CH1)及輕鏈恆定區1(CL1)除外。可進一步包括一鉸接區於該重鏈恆定區。又，本發明之免疫球蛋白Fc區可為含全部或部分Fc區之延長形式包括重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)，但重鏈及輕鏈之可變區除外，只要其具有實質上類似於或優於天然免疫球蛋白Fc之生理功能且可包括藉磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖化、甲基化、法尼基化、乙醯化、醯胺化等改性之免疫球蛋白Fc即可。免疫球蛋白Fc之範圍、及製法及共價鏈接免疫球蛋白Fc至非肽基聚合物-生理活性多肽綴合物之方法係揭示於韓國專利案第775343、725314、725315、及824505號，各案係以引用方式含括於本發明之範圍。
根據本發明方法，經由位置專一性鏈接非肽基聚合物至生理活性多肽之特定胺基酸，同時減少額外綴合物之形成，可以高產率製備具有優異生理活性之期望的多肽綴合物。
下列實例意圖進一步舉例說明本發明但非限制其範圍。
實例1：PEG化DA-艾森素-4(Lys27)綴合物之製備及分離 <1-1>PEG化DA-艾森素-4(Lys27)綴合物之製備
為了經由共價鏈接胜肽中之Lys與PEG來製備PEG化胜肽綴合物，脫胺-組胺醯基-艾森素-4(DA-艾森素-4，AP，美國)及3.4K PropionALD(2) PEG(具有兩個丙醛基之PEG，IDB公司，韓國)以1:30之莫耳比與3毫克/毫升胜肽濃度於4℃接受反應12小時。此時，含40%異丙醇之100mM HEPES緩衝液(pH 7.5)用作為反應介質，及於其中添加20mM NaCNBH3 作為還原劑。
<1-2>位置異構物之分離
經由於下列條件下使用索爾斯(SOURCE) Q離子交換層析術(XK 16毫升，GE健康照護公司(GE healthcare)，韓國)，主要自實例<1-1>之反應混合物純化一-PEG化肽，經由於下列條件下使用索爾斯S離子交換層析術(XK 16毫升，GE健康照護公司，韓國)分離位置異構物。於本方法中，使用乙醇經由含括於純化溶液來協助異構物的分離。藉胜肽映射法自洗提峰證實PEG化位置。
管柱：索爾斯Q
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris，pH 8.5)及B(A+0.5M NaCl)；梯度A 0→40%，80分鐘
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸，pH 3.0+4.5%乙醇)及B(A+45%乙醇+0.5M KCl)；梯度A 0→100%，45分鐘
由位置異構物之純化側寫資料分析，發現Lys12-PEG化DA-艾森素-4之峰較為容易洗提，然後於最末部分洗提Lys27-PEG化峰(第1圖)。
實例2：PEG化CA-艾森素-4(Lys27)綴合物之純化及分離
重複實例1之程序，但使用咪唑乙醯基-艾森素-4(CA-艾森素-4，美占公司(Bachem)，美國)替代實例1之DA-艾森素-4來獲得PEG化CA-艾森素-4(Lys27)綴合物。由位置異構物之純化側寫資料分析，發現Lys12-PEG化CA-艾森素-4之峰較早洗提，然後於最末部分洗提Lys27-PEG化峰(第2圖)。
實例3：PEG化CA-艾森素-4(Lys27)綴合物之比依據反應介質之pH而改變
為了研究藉pH改變於特定位置之多肽PEG化之比，CA-艾森素-4及3.4K PropionALD(2)PEG接受PEG化，係經由於1:30之莫耳比以3毫克/毫升之胜肽濃度允許該胜肽與PEG於4℃反應12小時。此時，分別使用100mM檸檬酸(pH 3.0)、100mM NaOAc(pH 4.5)、100mM Na-P(pH 7.5)、100mM Na-P(pH 8.5)、100mM HEPES(pH 8.0)、及100mM硼酸鈉(pH 9.2)緩衝液作為反應介質，及於其中添加20mM NaCNBH3 作為還原劑。各反應混合物係藉實例1所述方法純化，接著分析Lys27-PEG化綴合物之比。如第3圖所示，Lys27-PEG化綴合物之比隨著pH之增高而增加，證實最佳pH為7.0至10.0。
實例4：PEG化CA-艾森素-4(Lys27)綴合物之比根據含乙醇之反應介質之pH而改變
為了研究藉乙醇及pH改變於特定位置之多肽PEG化之比，CA-艾森素-4及3.4K PropionALD(2)PEG接受PEG化，係經由於1:30之莫耳比以3毫克/毫升之胜肽濃度允許該胜肽與PEG於4℃反應12小時。此時，分別使用100mM檸檬酸(pH 3.0)/45%乙醇、100mM NaOAc(pH 4.5)/45%乙醇、100mM Na-P(pH 7.5)/45%乙醇、100mM HEPES(pH 8.0)/45%乙醇、及100mM Na-P(pH 8.5)/45%乙醇緩衝液作為反應介質，及於其中添加20mM NaCNBH3 作為還原劑。各反應混合物係藉實例1所述方法純化，接著分析Lys27-PEG化綴合物之比。如第4圖所示，Lys27-PEG化綴合物之比隨著於含45%乙醇之反應介質中pH之增高而增加，證實最佳pH為7.0至9.0。
實例5：PEG化CA-艾森素-4(Lys27)綴合物之比根據反應介質中之乙醇濃度之pH而改變
為了研究藉反應介質中之乙醇濃度改變於特定位置之多肽PEG化之比，CA-艾森素-4及3.4K PropionALD(2)PEG接受PEG化，係經由於1:30之莫耳比以3毫克/毫升之胜肽濃度允許該胜肽與PEG於4℃反應12小時。此時，使用100mM HEPES(pH 7.5)/0%乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/25%乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/35%乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/45%乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/55%乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/75%乙醇及100mM HEPES(pH 7.5)/90%乙醇緩衝液作為反應介質，及於其中添加20mM NaCNBH3 作為還原劑。各反應混合物係藉實例1所述方法純化，接著分析Lys27-PEG化綴合物之比。如第5圖所示，Lys27-PEG化綴合物之比升高直到乙醇含量達到約50%，而超過50%乙醇時減低，及證實乙醇之最佳含量為35%至60%。
實例6：PEG化CA-艾森素-4(Lys27)綴合物之比根據反應介質中之異丙醇濃度之pH而改變
為了研究藉於反應介質使用異丙醇替代乙醇改變於特定位置之多肽PEG化之比，CA-艾森素-4及3.4K PropionALD(2)PEG接受PEG化，係經由於1:30之莫耳比以3毫克/毫升之胜肽濃度允許該胜肽與PEG於4℃反應12小時。此時，使用100mM HEPES(pH 7.5)/0%異丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/30%異丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/45%異丙醇、及100mM HEPES(pH 7.5)/60%異丙醇緩衝液作為反應介質，及於其中添加20mM NaCNBH3 作為還原劑。各反應混合物係藉實例1所述方法純化，接著分析Lys27-PEG化綴合物之比。如第6圖所示，Lys27-PEG化綴合物之比升高直到乙醇含量達到約50%，而超過50%乙醇時減低，及證實乙醇之最佳含量為35%至60%。
實例7：CA-艾森素-4(Lys27)-PEG及免疫球蛋白Fc之綴合物之製備
CA-艾森素-4(Lys27)-PEG綴合物耦合免疫球蛋白Fc片段(漢米製藥公司(Hanmi Pharm. Co. Ltd.)，韓國)，其方式係經由以1:8之莫耳比以20毫克/毫升胜肽濃度允許綴合物與片段於4℃反應16小時。此時使用100mM K-P緩衝液(pH 6.0)作為反應介質及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。於偶合反應後，於下列條件下，使用索爾斯phe及索爾斯Q管柱進行二步驟式純化。
管柱：索爾斯Phe(XK 16毫升，GE健康照護公司)
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris，pH 7.5)及B(A+1.5M NaCl)；梯度A 0→40%，80分鐘
管柱：索爾斯Q(XK 16毫升，GE健康照護公司)
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris，pH 7.5)及B(A+1M NaCl)；梯度A 0→40%，80分鐘
如上製備之綴合物使用SDS-PAGE分析。如第7圖所示，於非還原條件下觀察得60K之單一帶，而於還原條件下觀察得具35K及25K之二帶。
實例8：CA-艾森素-4(Lys27)-PEG4之PEG化位置之識別。
為了識別PEG結合至CA-艾森素-4之結合位置，CA-艾森素-4(Lys27)-PEG綴合物使用蛋白酶離胺酸-C消化，及使用反層析術分析。
CA-艾森素-4-PEG異構物係藉SDS-PAGE分析(第8圖)，及然後已純化之CA-艾森素-4-PEG綴合物及CA-艾森素-4溶解於三乙胺鹽酸緩衝液(10毫莫耳/升；pH 7.5)，10微升酶(0.1毫克/毫升)添加至其中及於37℃反應4小時。反應結束時，反應混合物係藉反層析術(HPLC艾吉蘭(Agilent)、丘彼特(Jupiter)C18(費諾米涅(Phenomenex)))分析。分析結果顯示於第9圖及第10圖。如第9圖所示，經由#1與#2之同時消失證實Lys12-PEG化CA-艾森素-4異構物，及如第10圖所示，經由#2與#3之同時消失證實Lys27-PEG化CA-艾森素-4異構物。
實例9：藉N端PEG化之異丙醇濃度識別PEG化產率
為了PEG化甲氧聚乙二醇5K ALD(NOF公司，日本)至鮭魚抑鈣素(美占公司，美國)之N端，鮭魚抑鈣素及PEG係經由以1:1之莫耳比，以1毫克/毫升之胜肽濃度允許該胜肽與該PEG於4℃反應1小時而接受PEG化。此時，分別使用100mM NaAc pH 5.2/0%異丙醇、100mM NaAc pH 5.2/45%異丙醇緩衝液作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。於下列條件下藉索爾斯S管柱(XK 16毫升，GE健康照護公司，韓國)自各反應混合物純化一-PEG化胜肽。結果顯示於下表1。
管柱：索爾斯S
流速：2.5毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM乙酸鹽，pH 5.2)及B(A+1M NaCl)；梯度A 0→40%，60分鐘
如表1所示，經由添加異丙醇，PEG化抑鈣素之產率變增高。
實例10：藉PEG化及PEG化位置測量艾森素-4之試管試驗活性
為了測量藉PEG化及PEG化位置之艾森素-4長效製劑之功效，使用測量試管試驗活性之方法。GLP-1之試管試驗活性之測量為測定GLP-1對選殖GLP-1受體之CHO細胞系處理後細胞內的cAMP是否增加之方法。
特定言之其中轉殖GLP-1之細胞系CHO/GLP-1R使用GLP-1、艾森素-4及表1所述試驗材料以不等濃度處理。測量cAMP的出現，因此比較EC50值。至於對照組，使用市售貝它(Byetta)(禮來公司(Eli Lilly))。根據試驗材料之處理，試管試驗活性(%)顯示於表2。
如表2所述，當PEG於Lys27改性時，比較Lys12，胜肽之生理活性相對較少受影響。
實例11：PEG化調酸素(Lys30)綴合物之製備及純化 <11-1>PEG化調酸素綴合物(Lys30)之製備
為了製備PEG化調酸素綴合物，3.4K PropionALD(2)PEG及調酸素(艾尼金公司(Anygen)，韓國)經由以1:15之莫耳比，以3毫克/毫升之胜肽濃度，允許該胜肽與PEG於4℃反應4.5小時而接受PEG化。此時，使用含45%異丙醇之100mM硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<11-2>位置異構物之分離
Lys30-PEG化位置異構物經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司(Amersham Bioscience))自反應混合物純化。於此方法中，乙醇用於純化溶液來協助異構物之分離(第11圖)。
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸鈉，pH 3.0+45%乙醇)及B(A+1M KCl)；梯度A 0→3%，1分鐘，梯度B 0→40%，222分鐘
實例12：PEG化咪唑-乙醯基調酸素(Lys30)綴合物之製備及分離
重複實例11之程序，但使用咪唑-乙醯基-調酸素(艾尼金公司，韓國)替代調酸素及使用實例11之含45%異丙醇之100mM HEPES緩衝液(pH 7.5)來獲得PEG化咪唑-乙醯基調酸素(Lys30)綴合物。
使用索爾斯Q管柱純化之異構物顯示於第12圖，及使用Asp-N蛋白酶之胜肽映射顯示於第13圖。如第13圖所示，部分#4:Asp(22)-(37)經由於Lys30之PEG改性而消失。
實例13：咪唑-乙醯基調酸素(Lys30)-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之製備
咪唑-乙醯基調酸素-PEG(Lys30)綴合物及免疫球蛋白Fc(漢米製藥公司，韓國)以1:10之莫耳比，以20毫克/毫升總蛋白質濃度於4℃接受反應16小時。此時，使用100mM磷酸鉀(pH 6.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。反應結束後，反應混合物於下列條件下藉索爾斯15Q管柱純化。
管柱：索爾斯Q
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)及B(A+1M NaCl)；梯度A 0→20%，100分鐘
經由鏈接Lys30-PEG化CA-調酸素與免疫球蛋白Fc及使用索爾斯Q純化綴合物所達成之層析圖顯示於第14圖，及CA-調酸素(Lys30)-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE結果顯示於第15圖。如第15圖所示，於非還原條件下觀察到具60K之單一帶，及於還原條件下觀察得具35K及25K之二帶。
實例14：PEG化調酸素類似物(Lys27)綴合物之製備及分離 <14-1>PEG化調酸素類似物(Lys27)綴合物之製備
為了將3.4K PropionALD(2) PEG化至調酸素類似物([20Asp,24Ala,28Ser]-調酸素-[刪失30-37])之離胺酸，以1:15之莫耳比，以3毫克/毫升之胜肽濃度，PEG及調酸素類似物(艾尼金公司，韓國)於4℃接受反應3.5小時。此時使用含45%異丙醇之100mM硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<14-2>位置異構物之分離
經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)自反應混合物純化Lys27-PEG化位置異構物。純化及分離條件係與實例11所述相同。於本方法中，乙醇用於純化溶液來協助異構物之分離(第16圖)。已純化之一-PEG化調酸素類似物之離胺酸選擇性係使用Lys-C蛋白酶藉胜肽映射法證實(第17圖)。如第17圖所示，#2部分藉於Lys27之PEG改性而消失。
實例15：PEG化咪唑-乙醯基調酸素類似物(Lys27)綴合物之製備及分離 <15-1>PEG化咪唑-乙醯基調酸素類似物(Lys27)綴合物之製備
為了將3.4K PropionALD(2) PEG化至咪唑-乙醯基調酸素類似物([20Asp,24Ala,28Ser]-調酸素-[刪失30-37])之離胺酸，咪唑-乙醯基調酸素類似物(艾尼金公司，韓國)及PEG於1:10之莫耳比以3毫克/毫升之總蛋白質濃度於4℃接受反應2.5小時。此時使用含45%異丙醇之100mM HEPES(pH 7.5)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<15-2>位置異構物之分離
經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)自反應混合物純化Lys27-PEG化位置異構物。純化及分離條件係與實例11所述相同。於本方法中，乙醇用於純化溶液來協助異構物之分離(第18圖)。已純化之一-PEG化調酸素類似物之離胺酸選擇性係使用Lys-C蛋白酶藉胜肽映射法證實(第19圖)。如第19圖所示，#2部分藉於Lys27之PEG改性而消失。
實例16：PEG化咪唑-乙醯基調酸素類似物(Lys27)與免疫球蛋白Fc之綴合物之製備及分離
實例15所製備之Lys27-PEG化咪唑-乙醯基調酸素類似物-PEG及免疫球蛋白Fc(漢米製藥公司，韓國)以1:10之莫耳比，以20毫克/毫升總蛋白質濃度於4℃接受反應16小時。此時，使用100mM磷酸鉀(pH 6.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。反應結束後，反應混合物於下列條件下藉索爾斯15Q管柱純化。
管柱：索爾斯Q
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)及B(A+1MNaCl)；梯度A 0→20%，100分鐘
經由鏈接Lys27-PEG化CA-調酸素類似物與免疫球蛋白Fc及使用索爾斯Q純化綴合物所達成之層析圖顯示於第20圖，及CA-調酸素類似物(Lys27)-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE結果顯示於第21圖。如第21圖所示，於非還原條件下觀察到具60K之單一帶，及於還原條件下觀察得具35K及25K之二帶。
實例17：PEG化GLP-1(Lys34)綴合物之製備及分離 <17-1>PEG化GLP-1(Lys34)綴合物之製備
為了將3.4K PropionALD(2)PEG PEG化至GLP-1之離胺酸殘基，GLP-1及PEG於1:15之莫耳比以3毫克/毫升總蛋白質濃度於4℃接受反應3.5小時。此時，使用含45%異丙醇之100mM硼酸鈉(pH 9.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<17-2>位置異構物之分離
Lys34-PEG化位置異構物係經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)而自反應混合物純化。於本方法中，使用乙醇於純化溶液來協助異構物之分離(第22圖)。經由使用Lys-C蛋白酶之胜肽映射法，證實已純化之一-PEG化調酸素類似物之離胺酸選擇性(第23圖)。
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸鈉，pH 3.0+45%乙醇)及B(A+1M KCl)；梯度A 0→3%，1分鐘，梯度B 3→40%，150分鐘
如第23圖所示，#2部分經由於Lys34之PEG改性而消失。
實例18：PEG化咪唑-乙醯基GLP-1(Lys34)綴合物之製備及分離 <18-1>PEG化咪唑-乙醯基GLP-1(Lys34)綴合物之製備
為了將3.4K PropionALD(2)PEG PEG化至咪唑-乙醯基GLP-1之離胺酸殘基，咪唑-乙醯基GLP-1及PEG於1:10之莫耳比以3毫克/毫升總蛋白質濃度於4℃接受反應4小時。此時，使用含45%異丙醇之100mM HEPES(pH 7.5)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<18-2>位置異構物之分離
Lys34-PEG化位置異構物係經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)而自反應混合物純化。於本方法中，使用乙醇於純化溶液來協助異構物之分離(第24圖)。經由使用Lys-C蛋白酶之胜肽映射法，證實已純化之一-PEG化調酸素類似物之離胺酸選擇性(第25圖)。
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸鈉，pH 3.0+45%乙醇)及B(A+1M KCl)；梯度A 0→3%，1分鐘，梯度B 3→40%，150分鐘
如第25圖所示，#4部分經由於Lys34之PEG改性而消失。
實例19：PEG化咪唑-乙醯基GLP-1(Lys34)與免疫球蛋白Fc之綴合物之製備及分離
實例18所製備之Lys34-PEG化咪唑-乙醯基GLP-1-PEG及免疫球蛋白Fc以1:8之莫耳比，以50毫克/毫升胜肽濃度於4℃接受反應17小時。此時，使用100mM磷酸鉀(pH 6.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。反應結束後，反應混合物於下列條件下藉索爾斯Phe管柱純化。
管柱：索爾斯Phe
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)及B(A+2M NaCl)；梯度A 100→0%，100分鐘
經由鏈接Lys34-PEG化CA-GLP-1異構物與免疫球蛋白Fc及使用索爾斯Phe純化綴合物所達成之層析圖顯示於第26圖，及CA-GLP-1(Lys34)-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE結果顯示於第27圖。如第27圖所示，於非還原條件下觀察到具60K之單一帶，及於還原條件下觀察得具35K及25K之二帶。
實例20：PEG化GLP-2(Lys30)綴合物之製備及分離 <20-1>PEG化GLP-2(Lys30)綴合物之製備
為了將3.4K PropionALD(2)PEG PEG化至GLP-2(艾尼金公司，韓國)之離胺酸殘基，GLP-2及PEG於1:12之莫耳比以5毫克/毫升總蛋白質濃度於4℃接受反應3小時。此時，使用含45%異丙醇之100mM硼酸鈉(pH 9.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<20-2>位置異構物之分離
Lys30-PEG化位置異構物係經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)而自反應混合物純化。於本方法中，使用乙醇於純化溶液來協助異構物之分離(第28圖)。離胺酸選擇性係經由使用胰蛋白酶之胜肽映射法證實(第29圖)。
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸鈉，pH 3.0+45%乙醇)及B(A+1M KCl)；梯度A 0→3%，1分鐘，梯度B 3→40%，150分鐘
如第29圖所示，#2部分經由於Lys30之PEG改性而消失。
實例21：PEG化咪唑-乙醯基GLP-2(Lys30)綴合物之製備及分離 <21-1>PEG化咪唑-乙醯基GLP-2(Lys30)綴合物之製備
為了將3.4K PropionALD(2)PEG PEG化至咪唑-乙醯基GLP-2(艾尼金公司，韓國)之離胺酸殘基，咪唑-乙醯基GLP-2及PEG於1:20之莫耳比以3毫克/毫升總蛋白質濃度於4℃接受反應6小時。此時，使用含45%異丙醇之100mM HEPES(pH 7.5)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。
<21-2>位置異構物之分離
Lys30-PEG化位置異構物係經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)而自反應混合物純化。於本方法中，使用乙醇於純化溶液來協助異構物之分離(第30圖)。
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸鈉，pH 3.0+45%乙醇)及B(A+1M KCl)；梯度A 0→3%，1分鐘，梯度B 3→40%，150分鐘
實例22：PEG化咪唑-乙醯基GLP-2(Lys30)與免疫球蛋白Fc之綴合物之製備及分離
實例21所製備之Lys30-PEG化咪唑-乙醯基GLP-2-PEG及免疫球蛋白Fc以1:15之莫耳比，以20毫克/毫升胜肽濃度於4℃接受反應16小時。此時，使用100mM磷酸鉀(pH 6.0)作為反應介質，及作為還原劑之20mM NaCNBH3 添加至其中。反應結束後，反應混合物於下列條件下藉索爾斯Phe管柱純化。
管柱：索爾斯Phe
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)及B(A+2M NaCl)；梯度A 100→0%，100分鐘
經由鏈接Lys30-PEG化CA-GLP-2異構物與免疫球蛋白Fc及使用索爾斯Phe純化綴合物所達成之層析圖顯示於第31圖，及CA-GLP-2(Lys30)-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE結果顯示於第32圖。如第32圖所示，於非還原條件下觀察到具60K之單一帶，及於還原條件下觀察得具35K及25K之二帶。
實例23：PEG化人胰島素(B1Phe)綴合物之製備及分離 <23-1>PEG化人胰島素(B1Phe)綴合物之製備
為了將5K PropionALD(1)甲氧PEG(有一個丙醛基之PEG，NOF日本)PEG化至屬於人胰島素(西革馬公司(Sigma))B鏈之第一個胺基酸苯丙胺酸之N端，該PEG及人胰島素於1:2之莫耳比以2.3毫克/毫升胜肽濃度於4℃接受反應12小時。此時，使用100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)作為反應介質，及20mM NaCNBH3 添加至其中作為還原劑。
<23-2>位置異構物之分離
經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)自該反應混合物純化位置異構物。於此方法中，於純化溶液使用乙醇來協助異構物之分離(第33圖)。藉SDS-PAGE分析證實洗提出之峰經一-PEG化，及離胺酸選擇性係經由使用Glu-C蛋白酶之胜肽映射法證實(第36圖)。
管柱：索爾斯S
流速：2.0毫升/分鐘
洗提溶液：A(20mM檸檬酸鈉，pH 2.0+60%乙醇)及B(A+0.5M KCl)；梯度A 0→3%，1分鐘，梯度B 0→50%，80分鐘
如第36圖所示，#2部分經由於BlF之PEG改性而消失。
實例24：PEG化人胰島素(AlGly)綴合物之製備及分離 <24-1>PEG化人胰島素(AlGly)綴合物之製備
為了將5K甲氧PEG-丁二醯亞胺基丁酸酯(1)(具有一個SBA反應性基團之PEG，NOF日本)PEG化至屬於人胰島素(西革馬公司)A鏈之第一個胺基酸之甘胺酸之N端，該PEG及人胰島素於1:4之莫耳比以2毫克/毫升胜肽濃度於25℃接受反應3小時。此時，使用含35%異丙醇之100mM硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)作為反應介質。
<24-2>位置異構物之分離
經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)自該反應混合物純化位置異構物。純化程序係與實例23所述相同。於本方法中，於純化溶液使用乙醇來協助異構物之分離(第34圖)。洗提峰之一-PEG化係藉SDS-PAGE分析證實，及離胺酸選擇性係經由使用Glu-C蛋白酶藉胜肽映射法證實(第36圖)。
如第36圖所示，#1部分經由於A1G之PEG改性而消失。
實例25：PEG化人胰島素(B29Lys)綴合物之製備及分離 <25-1>PEG化人胰島素(B29Lys)綴合物之製備
為了將5K甲氧PEG-丁二醯亞胺基丁酸酯(1)人胰島素(西革馬公司)B鏈之第29個胺基酸離胺酸殘基，該PEG及人胰島素於1:2之莫耳比以2毫克/毫升胜肽濃度於25℃接受反應1小時。此時，使用含45%異丙醇之100mM硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)作為反應介質。
<25-2>位置異構物之分離
經由使用索爾斯15S管柱(XK 16毫升，阿默山生科公司)自該反應混合物純化位置異構物。純化程序係與實例23所述相同。於本方法中，於純化溶液使用乙醇來協助異構物之分離(第35圖)。洗提峰之一-PEG化係藉SDS-PAGE分析證實，及離胺酸選擇性係經由使用Glu-C蛋白酶藉胜肽映射法證實(第36圖)。
如第36圖所示，#4部分經由於B29K之PEG改性而消失。
雖然已經就前述特定實施例說明本發明，但須瞭解熟諳技藝人士可對本發明做出多項修改及變化其亦落入於如隨附之申請專利範圍界定之本發明之範圍。
本發明之此等及其它目的及特徵由後文之發明說明結合附圖將更為彰顯，附圖分別顯示：
第1圖：使用索爾斯(SOURCE) S管柱的DA-艾森素-4-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第2圖：使用索爾斯S管柱的CA-艾森素-4-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第3圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於各種pH PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；
第4圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於各種pH及於45%乙醇PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；
第5圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於pH 7.5及於不等量(%)乙醇PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；
第6圖：線圖顯示當CA-艾森素-4於pH 7.5及於不等量(%)異丙醇PEG化時所得Lys27-PEG化異構物之線圖；
第7圖：為CA-艾森素-PEG-免疫球蛋白Fc之SDS-PAGE分析；
第8圖：為CA-艾森素-PEG Lys12及Lys27之SDS-PAGE分析；
第9圖：藉胜肽映射的CA-艾森素-4之Lys12-PEG化異構物之分析側寫資料：
第10圖：藉胜肽映射的CA-艾森素-4之Lys27-PEG化異構物之分析側寫資料：
第11圖：使用索爾斯S管柱的調酸素(oxyntomodulin)-PEG之位置異構物之純化側寫資料：
第12圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯調酸素-PEG之位置異構物之純化側寫資料：
第13圖：藉胜肽映射的調酸素之Lys30-PEG化異構物之分析側寫資料：
第14圖：使用索爾斯Q管柱的咪唑-乙醯調酸素-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；
第15圖：咪唑-乙醯調酸素-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；
第16圖：使用索爾斯S管柱的調酸素類似物-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第17圖：藉胜肽映射的調酸素類似物之Lys27-PEG化異構物之分析側寫資料；
第18圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯調酸素類似物-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第19圖：藉胜肽映射的咪唑-乙醯調酸素類似物之Lys27-PEG化異構物之分析側寫資料；
第20圖：使用索爾斯Q管柱的咪唑-乙醯調酸素類似物-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；
第21圖：咪唑-乙醯調酸素類似物-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；
第22圖：使用索爾斯S管柱的GLP-1-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第23圖：藉胜肽映射的GLP-1之Lys34-PEG化異構物之分析側寫資料；
第24圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯GLP-1-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第25圖：藉胜肽映射的咪唑-乙醯GLP-1之Lys34-PEG化異構物之分析側寫資料；
第26圖：使用索爾斯Phe管柱的咪唑-乙醯GLP-1-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；
第27圖：咪唑-乙醯GLP-1-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；
第28圖：使用索爾斯S管柱的GLP-2-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第29圖：藉胜肽映射的GLP-2之Lys30-PEG化異構物之分析側寫資料；
第30圖：使用索爾斯S管柱的咪唑-乙醯GLP-2-PEG之位置異構物之純化側寫資料；
第31圖：使用索爾斯Phe管柱的咪唑-乙醯GLP-2PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之純化側寫資料；
第32圖：咪唑-乙醯GLP-2-PEG與免疫球蛋白Fc之綴合物之SDS-PAGE分析；
第33圖：使用索爾斯S管柱的人胰島素-PEG(B1F)之位置異構物之純化側寫資料；
第34圖：使用索爾斯S管柱的人胰島素-PEG(A1G)之位置異構物之純化側寫資料；
第35圖：使用索爾斯S管柱的人胰島素-PEG(B29K)之位置異構物之純化側寫資料；及
第36圖：藉胜肽映射的人胰島素之A1G-、B1F-、或B29K-PEG化異構物之分析側寫資料。

Claims (9)

  1. 一種用於製備具位置專一性之生理活性多肽綴合物之方法，包含下列步驟：i)藉由鑑定生理活性多肽與非肽基聚合物的綴合物之所欲及非所欲位置異構物之比例，其係依反應介質中醇之類型與量以及pH的改變而不同，來決定所欲位置異構物存在量多於非所欲位置異構物時醇之類型與量以及pH範圍；ii)於一具有步驟i)中所決定之類型與量的醇及pH範圍的反應介質中，將生理活性多肽與非肽基聚合物反應；以及iii)使用醇，藉由離子交換層析術自步驟(ii)之反應混合物分離及純化該生理活性多肽綴合物，其中該具位置專一性之生理活性多肽綴合物為艾森素-4綴合物，其中PEG係鏈接至Lys27；抑鈣素綴合物，其中PEG係鏈接至N端；調酸素綴合物，其中PEG係鏈接至Lys27或Lys30；人類胰島素綴合物，其中PEG係鏈接至A鏈中之Gly1 N端或鏈接至B鏈之Lys29；或GLP-1或GLP-2綴合物，其中PEG係鏈接至Lys34或Lys30；且其中該醇為乙醇或異丙醇。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該生理活性多肽為具有選自於式(I)至(IV)中之任一結構式之艾森素、調酸素、GLP-1或GLP-2衍生物：
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該非肽基聚合物係選自於由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇類、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、PLA(聚(乳酸))、PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂質聚合物、甲殼聚糖類、玻尿酸及其等之組合所組成之組群。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該醇係以該反應介質之總量為基準，以35%至60%體積比之量存在於該反應介質中。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中當該生理活性多肽為艾森素或其衍生物時，於步驟(i)所採用之pH為7.0至10.0。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中當該生理活性多肽為調酸素或其衍生物時，於步驟(i)所採用之pH為7.0至10.0。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中當該生理活性多肽為人類胰島素或其衍生物時，於步驟(i)所採用之pH為4.0至10.0。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中當該生理活性多肽為GLP-1或其衍生物時，於步驟(i)所採用之pH為7.0至10.0。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中當該生理活性多肽為GLP-2或其衍生物時，於步驟(i)所採用之pH為7.0至10.0。
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