CN102369209B - 制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法 - Google Patents

制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102369209B
CN102369209B CN201080012890.8A CN201080012890A CN102369209B CN 102369209 B CN102369209 B CN 102369209B CN 201080012890 A CN201080012890 A CN 201080012890A CN 102369209 B CN102369209 B CN 102369209B
Authority
CN
China
Prior art keywords
methionin
binding substances
peg
pegylation
active polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080012890.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102369209A (zh
Inventor
宋大海
申载熙
李才敏
朴荣敬
权世昌
李宽淳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Science Co Ltd
Hanmi Holdings Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Holdings Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanmi Holdings Co Ltd filed Critical Hanmi Holdings Co Ltd
Publication of CN102369209A publication Critical patent/CN102369209A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102369209B publication Critical patent/CN102369209B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins

Abstract

本发明提供了一种在一种醇和特定pH的存在下，用非肽基聚合物处理生理活性多肽，以高产率制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法，其可望用于开发具有高体内活性和明显延长的血液半衰期的各种肽类药物的长效制剂。

Description

制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法
技术领域
本发明涉及制备一种特异性位点生理活性多肽结合物的方法，更特别地涉及一种通过将生理活性多肽和非肽基聚合物连接从而以高产率制备所述结合物的方法。
背景技术
由于其低稳定性，肽类很容易变性，被蛋白酶体内降解，并由于其相对小的尺寸而从肾脏中排泄出去。因此，为了以其活性形式维持肽药物在血液中的具体浓度，需要频繁给予患者肽药物。然而，肽药物通常是以注射制剂形式给药的，这种频繁给药引起患者的严重不适。为了解决此问题，已经开发了很多方法，例如通过增加肽药物通过生物膜的渗透，经咽或经鼻吸入将肽药物转移的方法，通过抑制酶促降解从而稳定肽，修饰对蛋白酶敏感的特定氨基酸序列(例如阻止由二肽基肽酶引起的效价损失的GLP-1氨基酸序列)的方法，以及在肽的表面化学添加一个高溶解度的非肽基聚合物，例如聚乙二醇(PEG)的方法。
PEG，已经被用作非肽基聚合物中的一种，它和靶向肽的一个特异性位点或多个位点非特异性地结合，从而达到增加肽的分子量的效果，所得的PEG-肽复合物耐受肾脏损失和酶水解，而无任何副作用。例如，国际专利公开文本WO2006/076471描述了通过将用作充血性心力衰竭治疗剂的B-型利尿钠肽(BNP)和PEG结合从而维持生理活性，美国专利US6,924,264描述了通过将PEG和其上的赖氨酸残基结合而增加药物exendin-4的体内滞留时间。
这些方法通过增加PEG的分子量延长了肽的体内滞留时间，但是由于分子量增加，肽药物的效价显著降低。此外，PEG的非特异性结合可能遮蔽生理活性多肽的活性域从而显著降低多肽活性。
从而，需要开发一种改善的用于制备生理活性多肽和非肽基聚合物的结合物的方法，其中聚合物以在不影响多肽活性的特异位点的方式和肽连接。
本发明人通过证实通过调节反应媒介的pH和醇含量以高产率制备出在特异性位点连接有非肽基聚合物的生理活性多肽的结合物完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种高产率制备生理活性多肽结合物的方法，在所述生理活性多肽结合物中非肽基聚合物在特异性位点和生理活性多肽相连接。
与本发明的一个方面相一致，提供了一种制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法，包括步骤：i)将生理活性多肽和非肽基聚合物置于包含特定量的醇和特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位点结合的反应媒介中进行反应；ii)从步骤i)的反应混合物中使用醇并通过离子交换色谱分离和纯化生理活性多肽结合物。
附图说明
当考虑到下文附带的附图时，下文对本发明的描述将使本发明的上述和其他目的和特征变得明显，其各自如下：
图1：使用SOURCE S柱纯化DA-exendin-4-PEG的位置异构体的图谱；
图2：使用SOURCE S柱纯化CA-exendin-4-PEG的位置异构体的图谱；
图3：显示当在不同pH值下对CA-exendin-4聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图4：显示当在45％乙醇中于不同pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图5：显示当在不同量(％)乙醇中于7.5的pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图6：显示当在不同量异丙醇(％)中于7.5的pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图7：CA-exendin-PEG-免疫球蛋白Fc的SDS-PAGE分析；
图8：CA-exendin-PEG-第12位和第27位赖氨酸的SDS-PAGE分析；
图9：通过肽图分析的CA-exendin-4第12位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图10：通过肽图分析的CA-exendin-4第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图11：使用SOURCE S柱纯化胃泌酸调节素-PEG的位置异构体的图谱；
图12：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG的位置异构体的图谱；
图13：通过肽图分析的胃泌酸调节素的第30位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图14：使用SOURCE Q柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的图谱；
图15：咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG和免疫球蛋白Fc结合物的SDS-PAGE分析；
图16：使用SOURCE S柱纯化胃泌酸调节素类似物-PEG的位置异构体的图谱；
图17：通过肽图分析的胃泌酸调节素类似物的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图18：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物-PEG的位置异构体的图谱；
图19：通过肽图分析的咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图20：使用SOURCE Q柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的图谱；
图21：咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE分析；
图22：使用SOURCE S柱纯化GLP-1-PEG的位置异构体的图谱；
图23：通过肽图分析的GLP-1的第34位赖氨酸-聚乙二醇化异构体的分析图谱；
图24：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-1-PEG的位置异构体的图谱；
图25：通过肽图分析的咪唑并-乙酰基-GLP-1的第34位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱
图26：使用SOURCE Phe柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-1-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的图谱；
图27：咪唑并-乙酰基-GLP-1-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE分析；
图28：使用SOURCE S柱纯化GLP-2-PEG的位置异构体的图谱；
图29：通过肽图分析的GLP-2的第30位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图30：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-2-PEG的位置异构体的图谱；
图31：使用SOURCE Phe柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-2-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的图谱；
图32：咪唑并-乙酰基-GLP-2-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE分析；
图33：使用SOURCE S柱纯化人类胰岛素-PEG(B1F)的位置异构体的图谱；
图34：使用SOURCE S柱纯化人类胰岛素-PEG(A1G)的位置异构体的图谱；
图35：使用SOURCE S柱纯化人类胰岛素-PEG(B29K)的位置异构体的图谱；以及
图36：通过肽图分析的人类胰岛素的A1G-、B1F-或B29K-聚乙二醇化异构体的分析图谱。
具体实施方式
下文中，将对本发明进行详细描述。
本发明提供了一种制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法，包括步骤：
i)在包含特定量的醇和具有特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位点结合的反应媒介中用非肽基聚合物处理生理活性多肽；并
ii)从步骤(i)的反应混合物中使用醇并通过离子交换色谱分离和纯化生理活性多肽结合物。
基于本发明的生理活性多肽结合物指的是其中生理活性多肽和非肽基聚合物的一个末端被共价地彼此连接的物质，且本发明的特征即在于将多肽和聚合物在特定条件下连接，并将所得的具有在其靶向位点上连接的聚合物的多肽结合物分离出来。
此处使用的术语“生理活性多肽或肽”指的是能够在体内显示生理活性的肽，例如可以选自促胰岛素释放肽、血液因子、消化激素、促肾上腺皮质激素、甲状腺激素、肠激素、细胞因子、酶、生长因子、神经肽、促垂体激素(hypophyseotropichormone)、促垂体素(hypophysiotropic hormone)、抗肥胖肽、抗病毒肽，以及保持生理活性性质的非天然肽衍生物，但不仅仅限于这些。更特别地，生理活性多肽或肽选自促红细胞生成素、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、淀粉素、胰高血糖素、胰岛素、生长激素抑制素、PPY(肽YY)、NPY(神经肽Y)、GLP-1、GLP-2、exendin-4、胃泌酸调节素、饥饿激素(ghrelin)、血管紧张肽、血管舒缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素、唾液腺十一肽、胃泌素、瘦素、催产素、加压素、LH(促黄体激素)、催乳激素、FSH(卵泡刺激素)、PTH(甲状旁腺激素)、肠促胰液素、舍莫瑞林、hGH(人类生长激素)、生长激素释放肽、G-CSFs(粒细胞集落刺激因子)、干扰素、白介素、催乳素释放肽、促食素、甲状腺释放肽、缩胆囊素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃泌素释放肽、促胃动素、血管活性肠肽、ANP(心房利钠肽)、BNP(脑钠肽)、CNP(C型利钠肽)、神经激肽A、神经介肽、肾素、内皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、蛋脑啡肽(enkepalin)、T细胞因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制因子、胶原酶抑制剂、促胸腺生成素、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽、胸腺肽(tymosin)、胸腺体液因子、肾上腺髓质素、咽侧体抑制素、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、铃蟾肽、骨钙素、CART肽、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、白细胞激肽、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰抑制素和恩夫韦地。此外，生理活性多肽包括其前体、衍生物、片段或其变体。
本发明中使用的优选的生理活性多肽为exendin、胰岛素、GLP-1、GLP-2、胃泌酸调节素、饥饿激素、血管紧张肽、缓激肽、降钙素或其衍生物。其衍生物可以例如通过对氨基酸残基上的任何基团的化学取代(例如α-甲基化或α-羟基化)、缺失(例如脱氨基或碳缺失)或修饰(例如N-甲基化)而制备，尤其是如韩国专利申请No.2008-69234中详细描述的exendin衍生物的制备。
同时，此处使用的术语“非肽基聚合物”指的是包括由除肽键之外的共价键连接彼此的两种或更多重复单元的生物可相容性聚合物。
可以用于本发明的非肽基聚合物可以选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚乳乙醇酸)、脂类聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，且优选是聚乙二醇。本领域公知的或基于本领域的技术可以容易制备出的衍生物也被包括在本发明的范围之内。可用于本发明的非肽基聚合物功能是增加生理活性多肽的分子量从而阻止结合物通过肾的流失。可以不受任何限制地使用任何非肽基聚合物，只要它能在体内耐受蛋白酶。非肽基聚合物的分子量可以在0.5到100kDa的范围内，优选0.5到20kDa，生理活性多肽和非肽基聚合物的适宜的摩尔比率可以选自1∶1到1∶50的范围。
本发明中使用的非肽基聚合物在一个末端或在两个末端具有反应基团。对于在两个末端均具有反应基团的非肽基聚合物，它可以和生理活性载体以及帮助作为长效制剂功能的蛋白药物结合。
非肽基聚合物的一个末端或两个末端的反应基团优选选自活性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基。琥珀酰亚胺基的实例包括琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、羟基琥珀酰亚胺、羧甲基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺碳酸酯。尤其是，当非肽基聚合物在一个末端具有一个活性醛基或活性琥珀酰亚胺基团时，它可有效地以最低的非特异性反应在两端和生理活性多肽和免疫球蛋白连接。在低pH值下，醛基活性基团选择性地和N-末端结合，并能在高pH值例如9.0的pH值下和赖氨酸残基结合从而形成胺键。此外，琥珀酰亚胺反应基团能够在pH 7.0～9.0下和氨基末端或赖氨酸残基形成稳定的酰胺键。
进而，在非肽基聚合物两端的活性基团可以是相同的或不同的。当在其两端均具有活性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，可以使用已知的化学反应将羟基活化成各种活性基团，或可使用可以商购的具有修饰的活性基团的聚乙二醇。
本发明的步骤(i)是为了在适宜反应媒介中通过使非肽基聚合物和生理活性多肽通过特异性位点连接从而制备出生理活性多肽结合物。
此处使用的术语“位点特异的”或“位点特异地”指的是使非肽基聚合物连接到生理活性多肽的特异的靶向氨基酸位点，优选赖氨酸残基或N-末端的胺基上。特异性位点连接或结合可以阻止形成非肽基聚合物连接到生理重要的氨基酸残基上的随机结合。例如，当非肽基聚合物和exendin-4的N-末端结合时，exendin-4的体外活性变低，但当非肽基聚合物和赖氨酸残基结合时，体外活性得以保持。尤其是，当非肽基聚合物和第27位赖氨酸残基而非第12位赖氨酸残基结合时，观测到更高的体外活性(参见实施例10和表2)。
本发明人发现在步骤i)中反应媒介中醇的存在和反应媒介的pH值是非肽基聚合物和生理活性多肽的特异性位点结合的关键因素。因此，在本发明的步骤i)中，通过使用含有特定含量的醇和特定pH值的反应媒介使非肽基聚合物和生理活性多肽的特异性位点连接。
在本发明的一个具体实施方式中，多肽结合物的特异性位置异构体的比率基于反应媒介的pH值，或基于在相同pH值下的醇浓度(％)而变化。因此使非肽基聚合物以特异性位点方式连接到生理活性多肽的期望的氨基酸上成为可能。
即，本发明的步骤i)在特定pH值下进行，从而使非肽基聚合物能够和期望的(或靶向)位点也就是不影响多肽活性的位点结合。pH值范围可能依赖于生理活性多肽的类型。例如，对于促胰岛素释放肽(例如exendin-4)，在反应媒介处于低pH值下，观测到主要是聚合物和第12位赖氨酸连接的异构体，然而在反应媒介处于高pH值下，观测到主要是不影响促胰岛素释放活性的聚合物和第27位赖氨酸连接的异构体(参见实施例3和图3)。从而，步骤i)优选于pH值7.5到9.0之间进行，从而使非肽基聚合物选择性地和第27位赖氨酸连接。
进而，本发明的步骤i)在包含醇的反应媒介中进行，从而使非肽基聚合物能够结合到不影响多肽活性的位点。醇的实例包括伯醇、仲醇和叔醇，优选具有1到10个碳原子的醇，更优选乙醇或异丙醇。对于促胰岛素释放肽(例如exendin-4)，为了使非肽基聚合物能结合到不影响促胰岛素释放活性的第27位赖氨酸上，反应媒介中的醇含量范围可以是基于反应媒介的总体积，从体积份为0.1％到100％，优选从25％到90％，更优选从35％到60％。
在本发明的一个具体实施方式中，当生理活性多肽是exendin-4或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第27位赖氨酸的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是降钙素时，步骤i)中使用的pH值可以是4.0到6.0，以增加非肽基聚合物结合到N-末端的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是胃泌酸调节素或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第27位赖氨酸或第30位赖氨酸的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是人胰岛素或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是4.0到6.0，以增加非肽基聚合物结合到B链中Phe1(1位苯丙氨酸)N-末端的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是人胰岛素或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到A链中Gly1(1位甘氨酸)N-末端，或B链中Lys29(第29位赖氨酸)的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是GLP-1或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第34位赖氨酸的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是GLP-2或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第30位赖氨酸的比例。
从而，本发明的优选的特异性位点生理活性多肽结合物是将PEG连接到第27位赖氨酸上的exendin-4结合物、将PEG连接到N-末端的降钙素结合物、将PEG连接到第27位赖氨酸或第30位赖氨酸上的胃泌酸调节素结合物或其类似物、将PEG连接到B链的Phe1的N-末端、A链的Gly1的N-末端、或B链的第29位赖氨酸的人类胰岛素结合物或其类似物，或将PEG连接到第34位赖氨酸或第30位赖氨酸的GLP-1或GLP-2结合物。
在本发明的一个优选方面中，可以使用一种肽衍生物(或类似物)来促进非肽基聚合物和生理活性多肽之间的特异性位点键合。衍生物指的是具有任何其他删除的或保护的非靶向氨基酸位点以防止不期望的连接。例如，对于促胰岛素释放肽例如exendin，可以使用各种exendin衍生物，例如式(I)的脱-氨基-组氨酰基(DA)-exendin-4(Des-amino-histidyl(DA)-exendin-4)、式(II)的β-羟基-咪唑丙酰基(HY)-exendin-4、式(III)的咪唑并乙酰基-exendin-4(Imidazoacetyl(CA)-exendin-4)，以及式(IV)的二甲基-组氨酰基-exendin-4(Dimethyl-histidyl(DM)-exendin-4)，使用但并不仅限于如下方法制备它们：其中N-末端氨基酸，组氨酸的α-胺基被缺失，N-末端胺基被羟基取代、组氨酸的N-末端α-胺基用二个甲基修饰，或者N-末端组氨酸的α-碳和其上结合的胺基被缺失从而留下咪唑并乙酰基。这样的实例性的exendin衍生物的结构和其制备方法记载在韩国未审查的专利公报No.2009-0008151中，通过引用其被包括在本发明的范围内。
类似地，具有以组氨酸作为第1位氨基酸的胃泌酸调节素、GLP-1和GLP-2也可以用做具有选自式(I)到式(IV)的任意结构的衍生物。
在本发明的一个特别的具体实施方式中，本发明人研究了反应媒介的pH和醇含量(％)对非肽基聚合物的特异性位点结合方面的影响，并证实了具有于第12位赖氨酸/第27位赖氨酸连接的聚合物的促胰岛素释放肽结合物的比例特别依赖于pH和乙醇或异丙醇的含量的变化而变化。尤其是，当在pH 7.5使用35％到55％，更优选约45％的乙醇或异丙醇含量时，大量获得更优选的具有和第27位赖氨酸残基结合的非肽基聚合物的异构体。
在步骤i)中通过调整到特定pH值和醇含量而增加期望的非肽基聚合物-生理活性多肽结合物的比例之后，可以通过使用步骤ii)中的醇并通过离子交换色谱将期望的结合物分离和纯化出来。
步骤ii)中使用的醇存在于纯化溶液中，其具体例子和步骤i)中确定的相同。然而，步骤i)中使用的醇是为了通过对其二级结构或三级结构进行修饰而增加多肽反应性和位点特异性的目的，而步骤ii)中使用的醇是为了通过降低在离子交换柱和结合物之间的非特异性键而促进特异性位点生理活性多肽结合物高通量分离和纯化的目的。分离和纯化可以使用各种本领域技术人员公知的方法进行，优选通过离子交换色谱，更优选地通过高压离子交换色谱。
同时，为了促进位置异构体的分离和纯化，可以使离子交换色谱在特定pH值下进行。对pH进行适宜地调整，从而增加步骤i)中结合物的位点特异性，反之将其重新调整从而使结合物吸附到步骤ii)中的包含醇的纯化溶液中的离子交换柱上并从其上分离。步骤ii)中使用的适宜pH值可以在从约2.0到约6.0的范围内。
进而，本发明的生理活性多肽可以进一步和生理活性载体连接。在这种情况下，非肽基聚合物应当是具有双末端的非肽基聚合物，以和生理活性载体结合。即，生理活性载体和未与生理活性多肽共价连接的非肽基聚合物的一个末端共价结合，因此能够制备出一种非肽基聚合物两端和生理活性多肽和生理活性载体连接的结合物。
如上所述，步骤ii)中制备出来的生理活性多肽结合物可以进一步和生理活性载体结合，所得的多肽-聚合物-载体结合物显示出与多肽-聚合物结合物完全不同的活性，也就是，优异的生理活性例如生理活性多肽药效出色的延长的持续时间、对特异性位点例如待处理的病变或坏死的诱导的靶向。
此处使用的术语“生理活性载体”指的是显示出不同于天然多肽的生理活性的额外活性的生理活性物质，它能通过和非肽基聚合物以及生理活性多肽的结合维持多肽的生理活性例如药效，或诱导对特异位点或坏死部位的诱导靶向。
本发明使用的生理活性载体不受任何限制地包括具有前述活性的物质，例如白蛋白、免疫球蛋白Fc区域、转铁蛋白、适配子、毒素、胶原蛋白、葡聚糖、多糖、脂肪酸、纤维蛋白原等。优选地，生理活性载体可选自白蛋白、免疫球蛋白Fc区域和转铁蛋白，更优选地是免疫球蛋白Fc区域。
本发明的免疫球蛋白Fc区域指的是免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，不包括重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。其还可进一步包括重链恒定区的铰链区。另外，本发明的免疫球蛋白Fc区域可以是一个包含Fc区域的一部分或全部的延伸形式，包括重量恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，不包括重链和轻链可变区，只要其具有大致相同于天然免疫球蛋白Fc或比其更好的生理功能，可以包括由磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰的免疫球蛋白Fc区域。免疫球蛋白Fc的范围、其制备方法以及使免疫球蛋白Fc和非肽基聚合物-生理活性多肽结合物共价连接的方法公开于韩国专利No.775343、725314、725315和824505，其被通过引用包括在本专利的范围之内。
根据本发明的方法，可以通过非肽基聚合物和生理活性多肽的特定氨基酸的特异性位点连接以高产率制备出期望的具有优异生理活性的多肽结合物，同时使其他结合物的形成最小化。
下列实施例被用来进一步阐释本发明但并非用以限定其范围。
实施例1：聚乙二醇化DA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物的制备和分离
<1-1>聚乙二醇化DA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物的制备
为了通过多肽中的赖氨酸和PEG共价连接制备聚乙二醇化肽结合物，使脱氨基组氨酰-exendin-4(DA-exendin-4，AP，U.S.)和3.4K的PropionALD(2)PEG(具有两个丙醛基的PEG，IDB Inc.，韩国)以1∶30的摩尔比在4℃反应12小时，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<1-2>位置异构体的分离
从实施例<1-1>中的反应混合物中使用SOURCE Q离子交换色谱(XK 16mL，GE healthcare，韩国)在下述条件下初步纯化单-聚乙二醇化肽，使用SOURCE S离子交换色谱(XK 16mL，GE healthcare，韩国)在下述条件下分离位置异构体。在此过程中，通过将乙醇包含在纯化溶液中，使用乙醇来促进异构体的分离。通过肽图的方法从洗脱峰证实聚乙二醇化的位点。
柱：SOURCE Q
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris，pH 8.5)和B(A+0.5M NaCl)；梯度A 0→40％，80min
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+45％乙醇+0.5MKCl)；梯度A 0→100％，45min
从位置异构体的纯化图谱分析发现，第12位赖氨酸聚乙二醇化的DA-exendin-4的峰较早洗脱，然后在最后部分洗脱的是第27位赖氨酸聚乙二醇化的峰(图1)。
实施例2：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物的制备和分离
重复实施例1中的程序，除了使用咪唑并-乙酰基-exendin-4(CA-exendin-4，Bachem，美国)代替实施例1中的DA-exendin-4，以获得聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物。从位置异构体的纯化图谱分析发现第12位赖氨酸聚乙二醇化的CA-exendin-4的峰较早洗脱，然后在最后部分洗脱的是第27位赖氨酸聚乙二醇化的峰(图2)。
实施例3：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于反应媒 介pH值的变化
为了研究由pH而导致的在特定位点上聚乙二醇化多肽的比例变化，使CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过使肽和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别使用100mM柠檬酸(pH 3.0)、100mM NaOAc(pH 4.5)、100mM Na-P(pH 7.5)、100mM Na-P(pH 8.5)、100mM HEPES(pH 8.0)和100mM硼酸钠(pH 9.2)的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种反应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸-聚乙二醇化结合物的比例。如图3中所示，第27位赖氨酸-聚乙二醇化结合物的比例基于pH值的增加而增加，证实最适宜的pH值为7.0到10.0。
实施例4：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于包含乙醇 的反应媒介pH值的变化
为了研究由乙醇和pH值导致的在特定位点上聚乙二醇化的多肽比例变化，使CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过使多肽和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别使用100mM柠檬酸(pH 3.0)/45％乙醇、100mM NaOAc(pH 4.5)/45％乙醇、100mM Na-P(pH 7.5)/45％乙醇、100mM HEPES(pH 8.0)/45％乙醇和100mM Na-P(pH 8.5)/45％乙醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种反应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例。如图4中所示，第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例基于包含45％乙醇的反应媒介的pH值的增加而增加，证实最适宜的pH值为7.0到9.0。
实施例5：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于反应媒 介中乙醇浓度的变化
为了研究反应媒介中乙醇浓度导致的在特定位点上聚乙二醇化的多肽比例变化，使CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过使多肽和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别使用100mM HEPES(pH 7.5)/0％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/25％乙醇、100mMHEPES(pH 7.5)/35％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/45％乙醇、100mM HEPES(pH7.5)/55％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/75％乙醇和100mM HEPES(pH 7.5)/90％乙醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种反应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例。如图5中所示，第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例直至乙醇含量达到约50％时都增加，而当乙醇超过50％后开始降低，证实乙醇最适宜的量是35％到60％。
实施例6：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于反应媒 介中异丙醇浓度的变化
为了研究在反应媒介中使用异丙醇代替乙醇导致的在特定位点上聚乙二醇化的多肽比例变化，使CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过使多肽和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别使用100mM HEPES(pH 7.5)/0％异丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/30％异丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/45％异丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/60％异丙醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种反应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例。如图6中所示，第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例直至乙醇含量达到约50％时仍增加，而当乙醇超过50％后开始降低，证实乙醇最适宜的量是35％到60％。
实施例7：CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的制 备
结合物和片段以1∶8的摩尔比在4℃下进行反应16小时，其中肽的浓度为20mg/mL，从而使CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc片段(HanmiPharm.Co.Ltd.，韩国)相结合。同时，使用100mM K-P缓冲液(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。在结合反应后，使用SOURCE phe和SOURCE Q柱基于下述条件进行两步纯化。
柱：SOURCE Phe(XK 16mL，GE healthcare)
流速：2.0mL/min
洗脱溶液：A(20mM Tris，pH 7.5)和B(A+1.5M NaCl)；梯度A 0→40％，80min
柱：SOURCE Q(XK 16mL，GE healthcare)
流速：2.0mL/min
洗脱溶液：A(20mM Tris，pH 7.5)和B(A+1.5M NaCl)；梯度A 0→40％，80min
使用SDS-PAGE分析上面制备的结合物。如图7所示，在非还原性条件下观察到一条单独的60K的带，而在还原性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例8：CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG结合物的聚乙二醇化位点的鉴 别
为了鉴别PEG和CA-exendin-4的结合位点，使用赖氨酸-C蛋白酶消化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG结合物，使用反相色谱分析。
特别地，使用SDS-PAGE分析CA-exendin-4-PEG异构体(图8)，然后将纯化的CA-exendin-4-PEG结合物和CA-exendin-4溶解于三乙胺-盐酸缓冲液(10mmol/L；pH 7.5)，向其中加入10μL的酶(0.1mg/mL)，在37℃下反应4小时。反应终止后，利用反相色谱(HPLC(Agilent)，Jupiter C18(Phenomenex))分析反应混合物。分析结果显示于图9和图10。如图9中所显示，#1和#2的同时消失证实了第12位赖氨酸聚乙二醇化的CA-exendin-4异构体，并如图10中所显示，#2和#3的同时消失证实了第27位赖氨酸聚乙二醇化的CA-exendin-4异构体。
实施例9：利用异丙醇浓度鉴别在N-末端聚乙二醇化的聚乙二醇化产率的
为了使甲氧基聚乙二醇5K ALD(NOF Inc.，日本)聚乙二醇化到鲑鱼降钙素(Bachem，美国)的N-末端，使鲑鱼降钙素和PEG以1∶1的摩尔比在4℃下进行反应1小时进行聚乙二醇化，其中肽的浓度为1mg/mL。同时，分别使用100mM NaAcpH 5.2/0％异丙醇、100mM NaAc pH 5.2/45％异丙醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。使用SOURCE S柱(XK 16mL，GEhealthcare，韩国)在下述条件下纯化每种反应混合物的单-聚乙二醇化肽。结果显示于下表1。
柱：SOURCE S
流速：2.5mL/min
洗脱液：A(20mM醋酸盐，pH 5.2)and B(A+1M NaCl)；梯度A 0→40％，60min
<表1>
  反应缓冲液   单-聚乙二醇化降钙素-5K的产率(％)
  0.1M NaAc pH 5.2   36
  0.1M NaAc pH 5.2/45％ IPA   51.3
如表1中所示，通过添加异丙醇增加了聚乙二醇化降钙素的产率。
实施例10：通过聚乙二醇化和聚乙二醇化位点测量exendin-4体外活性
为了测量通过聚乙二醇化和聚乙二醇位点制备的exendin-4长效制剂的功效，使用了测量体外活性的方法。GLP-1的体外活性的测量是一种经过将GLP-1处理到克隆了GLP-1受体的CHO细胞系上后，测量细胞内cAMP’s是否增加的方法。
特定地，用GLP-1、exendin-4和表1中描述的测试材料在不同浓度下处理CHO/GLP-1R-一种其中克隆了GLP-1的细胞系。测量到产生了cAMP’s，从而比较彼此的EC50值。作为对照，使用商购的Byetta(Eli Lilly)。基于测试材料处理的体外活性(％)显示于表2。
<表2>
如表2中所示，当PEG修饰位于第27位赖氨酸时，相对于第12位赖氨酸，肽的生理活性较少受到影响。
实施例11：聚乙二醇化胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合物的制备和分离
<11-1>聚乙二醇化胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合物的制备
为了制备聚乙二醇化胃泌酸调节素结合物，3.4K的PropionALD(2)PEG和胃泌酸调节素(Anygen，韩国)通过使肽和PEG以1∶15的摩尔比在4℃反应4.5小时聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<11-2>位置异构体的分离
使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)从反应混合物中纯化第30位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在此过程中，在纯化溶液中使用乙醇从而促进异构体的分离(图11)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A0→3％，1min，梯度B 0→40％，222min
实施例12：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合 物的制备和分离
除了使用咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(Anygen，韩国)代替胃泌酸调节素并使用实施例11中的包含45％异丙醇的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)之外，重复实施例11的程序，从而获得聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合物。
使用SOURCE Q柱纯化的异构体显示于图12，使用Asp-N蛋白酶进行的肽图分析显示于图13。如图13所示，通过在第30位赖氨酸的PEG-修饰，一部分#4：Asp(22)-(37)消失了。
实施例13：咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)-PEG和免疫球 蛋白Fc结合物的制备
使咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素-PEG(第30位赖氨酸)结合物和免疫球蛋白Fc(Hanmi Pharm.Co.Ltd.，韩国)以1∶10的摩尔比在4℃反应16小时，总蛋白浓度为20mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，使用SOURCE 15Q柱在下述条件下纯化反应混合物。
柱：SOURCE Q
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+1M NaCl)；梯度A 0→20％，100min
通过第30位赖氨酸-聚乙二醇化的CA-胃泌酸调节素和免疫球蛋白Fc的连接和使用SOURCE Q纯化结合物得到的色谱图显示于图14，CA-胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图15。如图15所示，在非还原性条件下观察到60K的单带，而在还原性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例14：聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)结合物的制备 和分离
<14-1>聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到胃泌酸调节素类似物([20Asp，24Ala，28Ser]-胃泌酸调节素-[缺失30-37])的赖氨酸上，使PEG和胃泌酸调节素类似物(Anygen，韩国)以1∶15的摩尔比在4℃下进行反应3.5小时，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<14-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化第27位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。纯化和分离条件与实施例11中描述的相同。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图16)。使用Lys-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖氨酸选择性(图17)。如图17中所示，通过在第27位赖氨酸的PEG修饰，#2部分消失了。
实施例15：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸) 结合物的制备和分离
<15-1>聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物([20Asp，24Ala，28Ser]-胃泌酸调节素-[缺失30-37])的第27位赖氨酸上，使咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(Anygen，韩国)和PEG以1∶10的摩尔比在4℃下进行反应2.5小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM HEPES(pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<15-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化第27位赖氨酸-聚乙二醇化位置异构体。纯化和分离条件与实施例11中描述的相同。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图18)。使用Lys-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖氨酸选择性(图19)。如图19中所示，通过在第27位赖氨酸的PEG修饰，#2部分消失了。
实施例16：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸) 和免疫球蛋白Fc结合物的制备和分离
使实施例15中制备得到的第27位赖氨酸聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶10的摩尔比在4℃反应16小时，肽浓度为20mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，使用SOURCE 15Q柱在下述条件下纯化反应混合物。
柱：SOURCE Q
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+1M NaCl)；梯度A 0→20％，100min
通过第27位赖氨酸-聚乙二醇化的CA-胃泌酸调节素类似物和免疫球蛋白Fc的连接以及使用SOURCE Q纯化该结合物所得到的色谱图显示于图20，CA-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图21。如图21所示，在非还原性条件下观察到60K的单带，而在还原性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例17：聚乙二醇化GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制备和分离
<17-1>聚乙二醇化GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到GLP-1的赖氨酸残基上，使GLP-1和PEG以1∶15的摩尔比在4℃下进行反应3.5小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠(pH 9.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<17-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化第34位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图22)。使用Lys-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖氨酸选择性(图23)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
如图23中所示，通过在第34位赖氨酸的PEG修饰，#2部分消失了。
实施例18：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制 备和分离
<18-1>聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到咪唑并-乙酰基GLP-1的赖氨酸残基上，使咪唑并-乙酰基GLP-1和PEG以1∶10的摩尔比在4℃下进行反应4小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM HEPES(pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<18-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化第34位赖氨酸-聚乙二醇化位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图24)。使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖氨酸选择性(图25)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
如图25中所示，通过在第34位赖氨酸的PEG修饰，#4部分消失了。
实施例19：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-GLP-1(第34位赖氨酸)和免疫球蛋白 Fc结合物的制备和分离
使实施例18中制备得到的第34位赖氨酸聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基-GLP1-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶8的摩尔比在4℃反应17小时，肽浓度为50mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，利用SOURCE Phe柱在下述条件下纯化反应混合物。
柱：SOURCE Phe
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+1M NaCl)；梯度A 100→0％，100min
通过第34位赖氨酸聚乙二醇化的CA-GLP-1异构体和免疫球蛋白Fc的连接以及使用SOURCE Phe纯化该结合物所得到的色谱图显示于图26，CA-GLP-1(第34位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图27。如图27所示，在非还原性条件下观察到一条60K的单带，而在还原性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例20：聚乙二醇化GLP-2(第30位赖氨酸)结合物的制备和分离
<20-1>聚乙二醇化GLP-2(第30位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到GLP-2(Anygen，韩国)的赖氨酸残基上，使GLP-2和PEG以1∶12的摩尔比在4℃下进行反应3小时，其中总蛋白浓度为5mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠(pH 9.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<20-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化第30位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图28)。使用-胰蛋白酶通过肽图分析的方法证实了赖氨酸选择性(图29)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
如图29中所示，通过在第30位赖氨酸的PEG修饰，#2部分消失了。
实施例21：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基GLP-2(第30赖氨酸)结合物的制备和 分离
<21-1>聚乙二醇化咪唑并-乙酰基GLP-2(第30位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到咪唑并-乙酰基GLP-2(Anygen，韩国)的第30位赖氨酸残基上，使咪唑并-乙酰基GLP-2和PEG以1∶20的摩尔比在4℃下进行反应6小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM HEPES(pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<21-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化第30位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图30)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
实施例22：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基GLP-2(第30位赖氨酸)和免疫球蛋白 Fc结合物的制备和分离
使实施例21中制备得到的第30位赖氨酸聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基GLP2-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶15的摩尔比在4℃反应16小时，肽浓度为20mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，利用SOURCE Phe柱在下述条件下纯化反应混合物。
柱：SOURCE Phe
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+2M NaCl)；梯度A 100→0％，100min
通过第30位赖氨酸聚乙二醇化的CA-GLP-2异构体和免疫球蛋白Fc的连接以及使用SOURCE Phe纯化该结合物所得到的色谱图显示于图31，CA-GLP-2(第30位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图32。如图32所示，在非还原性条件下观察到一条60K的单带，而在还原性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例23：聚乙二醇化人类胰岛素(B1Phe)结合物的制备和纯化
<23-1>聚乙二醇化人类胰岛素(B1Phe)结合物的制备
为了使5K的PropionALD(1)甲氧基PEG(具有一个丙醛基的PEG，NOF.，日本)聚乙二醇化到人类胰岛素(Sigma)的B链上首位氨基酸苯丙氨酸的N-末端上，使PEG和人类(hyman)胰岛素以1∶2的摩尔比在4℃下进行反应12小时，其中肽浓度为2.3mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<23-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图33)。通过SDS-PAGE分析证实了单-聚乙二醇化的洗脱峰，使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析方法证实了赖氨酸的选择性(图36)。
柱：SOURCE S
洗脱速率：2.0mL/min
洗脱溶液：A(20mM柠檬酸钠，pH 2.0+60％乙醇)和B(A+0.5M KCl)；梯度A 0→3％，1min，梯度B 0→50％，80min
如图36中所示，通过在B1F的PEG修饰#2部分消失了。
实施例24：聚乙二醇化人类胰岛素(A1Gly)结合物的制备和分离
<24-1>聚乙二醇化人类胰岛素(A1Gly)结合物的制备
为了使5K的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(1)(具有一个SBA活性基团的PEG，NOF.，日本)聚乙二醇化到人类胰岛素(Sigma)的A链上首位氨基酸甘氨酸的N-末端上，使PEG和人类胰岛素以1∶4的摩尔比在25℃下进行反应3小时，其中肽浓度为2mg/mL。同时，使用包含35％异丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)作为反应媒介。
<24-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化位置异构体。纯化过程与实施例23中描述的方法相同。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图34)。通过SDS-PAGE分析证实了洗脱峰的单-聚乙二醇化，使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析方法证实了赖氨酸选择性(图36)。
如图36中所示，通过在A1G的PEG修饰#1部分消失了。
实施例25：聚乙二醇化人类胰岛素(B29Lys)结合物的制备和分离
<25-1>聚乙二醇化人类胰岛素(B29Lys)结合物的制备
为了使5K的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(1)聚乙二醇化到人类胰岛素(Sigma)的B链上第29位氨基酸赖氨酸上，使PEG和人类胰岛素以1∶2的摩尔比在25℃下进行反应1小时，其中肽浓度为2mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反应媒介。
<25-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化位置异构体。纯化过程与实施例23中描述的方法相同。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图35)。通过SDS-PAGE分析证实了洗脱峰的单-聚乙二醇化，使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析方法证实了赖氨酸选择性(图36)。
如图36中所示，通过在B29K的PEG修饰，#4部分消失了。
尽管本发明已经用上述具体实施方式进行了描述，应当明白对于本技术领域技术人员来说，对本发明所作的各种修饰和改变仍将落入如所附的权利要求所限定的发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法，包括步骤：
i)在包含特定量的醇和具有特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位点结合的反应媒介中，用非肽基聚合物处理生理活性多肽；及
ii)从步骤i)的反应媒介中使用醇并通过离子交换色谱分离和纯化生理活性多肽结合物，
其中
生理活性多肽是exendin、胰岛素、GLP-1、GLP-2、胃泌酸调节素、降钙素、或其衍生物之一；
非肽基聚合物是聚乙二醇；
醇是乙醇或异丙醇；
基于反应媒介的总量，反应媒介中醇的存在量为25％到90％体积份；
当生理活性多肽是exendin或其衍生物、胃泌酸调节素或其衍生物、GLP-1或其衍生物、GLP-2或其衍生物时，步骤i)中所用的pH值为7.0到10.0；
当生理活性多肽是人类胰岛素或其衍生物时，步骤i)中所用的pH值为4.0到10.0，以及
其中特异性位点生理活性多肽结合物是PEG连接到第27位赖氨酸上的exendin-4结合物、PEG连接到N-末端上的降钙素结合物、PEG连接到第27位赖氨酸或第30位赖氨酸上的胃泌酸调节素结合物、PEG连接到A链的Glyl的N-末端上或B-链的第29位赖氨酸上的人类胰岛素结合物、或PEG连接到第34位赖氨酸位或第30位赖氨酸上的GLP-1或GLP-2结合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中生理活性多肽是具有选自式(I)到(IV)的任意结构的exendin、胃泌酸调节素、GLP-1或GLP-2的衍生物：
CN201080012890.8A 2009-03-20 2010-03-18 制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法 Active CN102369209B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20090023953 2009-03-20
KR10-2009-0023953 2009-03-20
PCT/KR2010/001674 WO2010107256A2 (en) 2009-03-20 2010-03-18 Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102369209A CN102369209A (zh) 2012-03-07
CN102369209B true CN102369209B (zh) 2015-06-10

Family

ID=42740133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080012890.8A Active CN102369209B (zh) 2009-03-20 2010-03-18 制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法

Country Status (25)

Country Link
US (1) US8895281B2 (zh)
EP (1) EP2408800B1 (zh)
JP (2) JP5759976B2 (zh)
KR (1) KR101164453B1 (zh)
CN (1) CN102369209B (zh)
AR (1) AR075913A1 (zh)
AU (1) AU2010225523B2 (zh)
BR (1) BRPI1013626B8 (zh)
CA (1) CA2755395C (zh)
DK (1) DK2408800T3 (zh)
ES (1) ES2587397T3 (zh)
HK (1) HK1163120A1 (zh)
HR (1) HRP20161055T1 (zh)
HU (1) HUE030373T2 (zh)
IL (1) IL215165A (zh)
MX (1) MX2011009803A (zh)
MY (1) MY150536A (zh)
NZ (1) NZ595848A (zh)
PL (1) PL2408800T3 (zh)
PT (1) PT2408800T (zh)
RU (1) RU2495881C2 (zh)
SG (1) SG174320A1 (zh)
TW (1) TWI472342B (zh)
WO (1) WO2010107256A2 (zh)
ZA (1) ZA201107658B (zh)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9278146B2 (en) 2010-10-08 2016-03-08 Kyoto University Peptide derivative and use of the same
JP5669765B2 (ja) * 2010-10-08 2015-02-18 国立大学法人京都大学 ペプチド誘導体及びその使用
CN102675452B (zh) * 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
CN102718868A (zh) * 2011-03-30 2012-10-10 上海华谊生物技术有限公司 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法
EP2714070B1 (en) * 2011-06-02 2024-03-20 OPKO Biologics Ltd. Long-acting glp-1/glucagon receptor agonists
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
SG10201604564XA (en) * 2011-06-10 2016-07-28 Hanmi Science Co Ltd Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
UA114709C2 (uk) * 2011-06-17 2017-07-25 Ханмі Сайенс Ко., Лтд. Кон'югат, що містить похідну оксинтомодуліну, fc-ділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, та його застосування
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
KR101895047B1 (ko) * 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AU2013273135B2 (en) 2012-06-04 2017-12-07 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
KR101968344B1 (ko) * 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
NZ739063A (en) 2012-11-06 2019-11-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
KR20140088837A (ko) * 2013-01-03 2014-07-11 한미약품 주식회사 Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체
MX361083B (es) 2013-02-26 2018-11-27 Hanmi Pharma Co Ltd Conjugado de insulina específico de sitio.
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
CN103804483A (zh) * 2014-03-13 2014-05-21 中国人民解放军第四军医大学 Orexin-A聚乙二醇化修饰物及其制备方法
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
US11123436B2 (en) 2015-07-24 2021-09-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
KR101974305B1 (ko) * 2018-02-14 2019-04-30 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
CN109678930B (zh) * 2018-12-05 2022-04-29 西北工业大学 聚乙二醇修饰的npff及其用途
CN109535244B (zh) * 2018-12-11 2020-12-01 上海景峰制药有限公司 一种重组人脑利钠肽的纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
WO2009011544A2 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Insulinotropic peptide derivative wherein its n-terminal amino acid is modified

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996041813A2 (en) * 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
EP0922446A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
AU775063C (en) * 1999-04-30 2005-05-12 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US7256258B2 (en) * 2000-10-05 2007-08-14 Ares Trading S.A. Regioselective liquid phase pegylation
US8423976B2 (en) * 2003-03-13 2013-04-16 Northrop Grumman Corporation Extreme pipeline and optimized reordering technology
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
UA92451C2 (en) * 2003-03-19 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Polyethelene glycol link glp-1 compounds
KR100507796B1 (ko) * 2003-04-03 2005-08-17 한미약품 주식회사 생체내 반감기가 증가된 ｐｅｇ-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법
BRPI0409322B8 (pt) * 2003-04-11 2021-05-25 Antriabio Inc método para preparar um conjugado de insulina-polímero
PL1664108T3 (pl) * 2003-08-21 2010-03-31 Novo Nordisk As Rozdzielanie polipeptydów zawierających racemizowany aminokwas
RU2423380C2 (ru) * 2004-11-12 2011-07-10 БАЙЕР ХЕЛСКЕА ЛЛСи Сайт-направленная модификация fviii
US8168592B2 (en) * 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
WO2009011544A2 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Insulinotropic peptide derivative wherein its n-terminal amino acid is modified

Also Published As

Publication number Publication date
US20120003712A1 (en) 2012-01-05
ES2587397T3 (es) 2016-10-24
CN102369209A (zh) 2012-03-07
JP2012520873A (ja) 2012-09-10
PT2408800T (pt) 2016-08-23
IL215165A (en) 2016-11-30
NZ595848A (en) 2014-04-30
KR101164453B1 (ko) 2012-07-11
HUE030373T2 (en) 2017-05-29
SG174320A1 (en) 2011-10-28
KR20100105494A (ko) 2010-09-29
TWI472342B (zh) 2015-02-11
EP2408800A2 (en) 2012-01-25
JP5759976B2 (ja) 2015-08-05
RU2495881C2 (ru) 2013-10-20
MY150536A (en) 2014-01-30
EP2408800A4 (en) 2012-12-05
CA2755395C (en) 2015-02-24
BRPI1013626B1 (pt) 2021-05-11
ZA201107658B (en) 2012-12-27
EP2408800B1 (en) 2016-05-25
IL215165A0 (en) 2011-12-29
AU2010225523A1 (en) 2011-11-10
WO2010107256A2 (en) 2010-09-23
HK1163120A1 (zh) 2012-09-07
AU2010225523B2 (en) 2012-05-24
US8895281B2 (en) 2014-11-25
BRPI1013626B8 (pt) 2021-05-25
DK2408800T3 (en) 2016-08-29
BRPI1013626A2 (pt) 2016-04-19
JP2015127330A (ja) 2015-07-09
HRP20161055T1 (hr) 2016-11-04
PL2408800T3 (pl) 2016-11-30
WO2010107256A3 (en) 2011-03-17
MX2011009803A (es) 2011-09-30
AR075913A1 (es) 2011-05-04
RU2011142332A (ru) 2013-04-27
TW201036640A (en) 2010-10-16
CA2755395A1 (en) 2010-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102369209B (zh) 制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法
US8106007B2 (en) Conjugates of a polypeptide and a pentasaccharide
KR101352225B1 (ko) 신규한 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트
CN102869371A (zh) 使用免疫球蛋白片段的胰岛素缀合物
KR20110092253A (ko) 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린분비 펩타이드 약물 결합체
US20200254065A1 (en) Long-acting glp-2 analogs
US10202469B2 (en) Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same
KR20180119549A (ko) 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법
AU2016273045A1 (en) Pegylated oxyntomodulin variants
KR101104574B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도
US20210187077A1 (en) GLP-1 Agonist Conjugates for Sustained Glycemic Control

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1163120

Country of ref document: HK

C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Seoul, South Kerean

Applicant after: Hanmi Holdings Co., Ltd.

Address before: Seoul, South Kerean

Applicant before: Hanmi Pharm Ind Co.,Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: HANMI HOLDINGS CO., LTD. TO: HANMI SCIENCE CO., LTD.

C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Gyeonggi Do city of East China South Beach Dongtan is Hing Road 550 GA

Applicant after: Hanmi Holdings Co., Ltd.

Address before: Seoul, South Kerean

Applicant before: Hanmi Holdings Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1163120

Country of ref document: HK