KR20170012145A - 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리활성폴리펩타이드가 비펩타이드성 중합체와의 공유결합으로 서로 연결된 생리활성폴리펩타이드의 결합체의 제조에 있어서, 비펩타이드성 중합체와 생리활성폴리펩타이드의 반응단계를 개선하여 전체 생리활성폴리펩타이드 결합체의 수율을 향상시키는 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 선택적 침전법을 통해 2 단계 반응을 수행하여 생리활성폴리펩타이드 결합체를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법은 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드의 결합체 및 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체를 고수율로 생산할 수 있는바, 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가된 다양한 펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법{Method for producing physiologically active polypeptide conjugate}
본 발명은 생리활성폴리펩타이드가 비펩타이드성 중합체와의 공유결합으로 서로 연결된 생리활성폴리펩타이드의 결합체의 제조에 있어서, 비펩타이드성 중합체와 생리활성폴리펩타이드의 반응단계를 개선하여 전체 생리활성폴리펩타이드 결합체의 수율을 향상시키는 제조방법으로, 구체적으로 선택적 침전법을 통해 2 단계 반응을 수행하여 생리활성폴리펩타이드 결합체를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃는다. 또한, 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다 그러나, 대부분 주사제 형태이기 때문에 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위한 빈번한 주사로 인해, 환자의 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도로서, 펩타이드의 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드 약물의 체내 전달; 펩타이드를 안정화시키고 단백질 가수분해 효소에 의한 분해를 억제하기 위하여 단백질 가수분해효소에 민감한 특정 아미노산 서열의 변경 (예를 들어, 디펩티딜 펩티데이즈에 의한 역가 상실을 막기 위한 GLP-1 아미노산 서열의 변경 등); 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 용해도가 높은 고분자 물질의 펩타이드 표면에 화학적으로 부가; 및 재조합 융합 기술을 이용한 생리활성폴리펩타이드와 인간 혈청 알부민 또는 면역글로불린 단편(Fc)과의 융합 단백질 제조 등이 있어왔다.
하지만, 상기 융합 단백질의 제조는, 생리활성펩타이드에 대한 비특이적 고분자 물질의 결합으로 인해 펩타이드의 활성 도메인이 가려져, 오히려 상기 펩타이드가 충분한 활성을 보이지 못했으며, 이를 방지하기 위한 위치 특이적 결합을 위하여 낮은 제조수율을 감수하거나 생리활성펩타이드에 인위적 조작을 가해야만 하는 문제가 있다.
이와 같은 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의결합체를 효과적으로 제조하지 못하는 문제점을 해소하기 위하여, 생리활성폴리펩타이드 결합체 중 가장 생리활성이 탁월한 생리활성폴리펩타이드의 특정 위치에 특이적으로 비펩타이드성 중합체를 수식하는 방법(대한민국 등록특허 제10-1164453호)을 시도해왔다. 또한, 생리활성폴리펩타이드와 인간 혈청 알부민 또는 면역글로불린 단편(Fc)과의 융합 단백질 제조에 두 개의 작용기를 가진 비펩타이드성 중합체를 이용한 결합체 제조에 있어서, 제조 수율을 높이기 위한 다양한 방법을 시도해왔다.
지속적인 연구를 거듭한 끝에 본 발명자들은 비펩타이드성 중합체와 생리활성폴리펩타이드의 1차 결합반응 후 반응(또는, 결합)하지 않은, 생리활성폴리펩타이드를 선택적 침전법을 통해 분리하여, 2차 반응을 실시하여 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드의 결합체를 고수율 및 고순도로 생산할 수 있고, 상기 결합체를 이용하면 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체를 고수율 및 고순도로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 1) 생리활성폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체를 위치 특이적으로 결합시키는 반응 혼합물로부터, 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드를 선택적으로 침전시키는 단계; 및 2) 상기 침전물로부터 회수된 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 단계 1)의 결합 반응하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조방법으로 제조된, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 비펩타이드성 중합체와 생리활성 담체를 공유결합으로 연결하여, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 생리활성 담체 및 생리활성폴리펩타이드와 결합된, 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 1) 생리활성폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체를 위치 특이적으로 결합시키는 반응 혼합물로부터, 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드를 선택적으로 침전시키는 단계; 및 2) 상기 침전물로부터 회수된 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 단계 1)의 결합 반응하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 침전된 생리활성폴리펩타이드를 용해한 후 비펩타이드성 중합체와 결합시키는 단계를 포함하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 단계 1)의 반응 혼합물은 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드를 반응 혼합물의 전체 중량 대비 10 중량 % 이상 포함하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 단계 1)의 선택적 침전은 유기용매를 이용하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 유기용매는 아이소프로판올인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 아이소프로판올을 단계 1)의 반응 혼합물에 반응 혼합물 부피의 2 배 이상으로 처리하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 아이소프로판올을 단계 1)의 반응 혼합물에 반응 혼합물 부피의 3 ~ 7 배로 처리하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 단계 2)는 회수된 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 0.5 ~ 4.0 시간 동안 반응시키는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성폴리펩타이드는 인슐린 분비 펩타이드, 혈액인자, 소화촉진 호르몬, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 부신피질 호르몬, 갑상선호르몬, 장내 호르몬, 싸이토카인, 효소, 성장인자, 뉴로펩타이드 (neuropeptide), 뇌하수체 호르몬, 시상하부 호르몬, 항-비만 펩타이드, 항-바이러스 펩타이드 및 생리활성을 갖는 비천연형 펩타이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성폴리펩타이드는 적혈구 증식인자, 백혈구 증식인자, 아밀린, 소마토스타틴, PYY(peptide YY), NPY(neuropeptide Y), 안지오텐신, 브래디키닌, 칼시토닌, 부신피질 자극호르몬(Corticotropin), 엘레도이신(Eledoisin), 가스트린, 렙틴, 옥시토신(Oxytocin), 바소프레신(vasopressin), 황체 형성호르몬, 황체 자극호르몬, 여포 자극호르몬, 부 갑상선 호르몬, 씨크레틴(secretin), 세르모레린(Sermorelin), 인간성장 호르몬(hGH), 성장호르몬 방출 펩타이드, 콜로니 자극인자(GCSF)류, 인터페론(IFN)류, 인터루킨(Interleukin)류, 프로락틴 방출 펩타이드, 오렉신(Orexin), 갑상선 방출 펩타이드, 콜로시스토키닌(Cholecystokinin), 가스트린 억제 펩타이드, 칼모듈린, 가스트린 유리 펩타이드(Gastric releasing peptide), 모틸린(Motilin), 관활성장관 펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP), 바린나트륨이뇨 펩타이드(Barin natriuretic peptide; BNP), C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP), 뉴로키닌(Neurokinin) A, 뉴로메딘(Neuromedin), 레닌(Renin), 엔도텔린(Endothelin), 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide), 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide), 데모르핀(Dermorphin), 디노르핀(Dynorphin), 엔도르핀(Endorphin), 엔케팔린(Enkepalin), T 세포인자, 종양괴사인자, 종양괴사인자 수용체, 유로키나아제 수용체, 종양억제인자, 콜라게나제 억제제, 티모포이에틴(Thymopoietin), 티물린(Thymulin), 티모펜틴(Thymopentin), 티모신(Tymosin), 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor), 아드레노모둘린(Adrenomodullin), 알라토스타틴(Allatostatin), 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment), 항균성 펩타이드, 항산화제 펩타이드, 봄베신(Bombesin), 오스테오칼신(Osteocalcin), CART 펩타이드, E-셀렉틴(selectin), ICAM-1, VCAM-1, 류코킨(Leucokine), 크링글(Kringle)-5, 라미닌(Laminin), 인히빈(Inhibin), 갈라닌(Galanin), 피브로넥틴(Fibronectin), 판크레아스타틴(Pancreastatin) 및 푸제온(Fuzeon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성폴리펩타이드는 엑센딘, 엑센딘 유도체, 인슐린, 인슐린 유도체, 또는 이들의 조합인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 엑센딘 유도체는 데스-아미노-히스티딜(DA)-엑센딘-4, 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐(HY)-엑센딘-4, 이미다조-아세틸(CA)-엑센딘-4 및 디메틸-히스티딜(DM)-엑센딘-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 생리활성폴리펩타이드인, 엑센딘 또는 엑센딘 유도체의 27번째 라이신에 결합하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 생리활성폴리펩타이드인, 인슐린, 인슐린 아날로그 베타 체인, 또는 이들의 유도체의 N-말단에 결합하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 반응기를 포함하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 알데히드 그룹의 반응기를 포함하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 알데히드 그룹은 프로피온 알데히드 그룹인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 분자량이 500 내지 100,000Da 인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 단계 2) 이후, 생리활성폴리펩타이드 결합체를 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 분리는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 이온 교환 크로마토그래피는 고압 이온 교환 크로마토그래피인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 생리활성폴리펩타이드와 생리활성 담체의 결합체(생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체, 폴리펩타이드-담체 결합체)의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 상기 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법으로 제조된, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 비펩타이드성 중합체와 생리활성 담체를 공유결합으로 연결하여, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 생리활성 담체 및 생리활성폴리펩타이드와 결합된, 결합체(생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체, 폴리펩타이드-담체 결합체)를 생성하는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 생리활성 담체는 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, 트랜스페린, 앱타머, 톡신, 젤라틴, 콜라겐, 덱스트란, 다당류, 지방산 및 피브리노겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성 담체는 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 선택적 침전법을 통한 2 단계 반응을 통해, 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드의 결합체 및 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체를 고수율로 생산할 수 있는바, 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가된 다양한 펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 선택적 침전법에 의한 페길화 제조방법에 대한 기존 공정과 개선 공정에 대한 모식도이다.
도 2는 이미다조-아세틸-엑센딘-4(CA-엑센딘-4) 15 mg/ml 농도 및 3 시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물을 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체(Positional Isomer)의 정제 프로파일이다.
도 3은 인슐린 아날로그 5 mg/mL 농도 및 2 시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물을 SP-HP 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체의 정제 프로파일이다.
도 4는 이미다조-아세틸-엑센딘-4 15mg/ml 농도 및 3시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물에, 선택적 침전을 위해 아이소프로판올, 1-프로판올, 1-부탄올, 아세톤 및 아세토나이트릴을 처리하여, 생성된 수용액 및 침전물의 함유물을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 인슐린 아날로그 5 mg/mL 농도 및 2 시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물에, 선택적 침전을 위해 아이소프로판올, 에탄올, 1-프로판올, 아세톤 및 아세토나이트릴을 처리하여, 생성된 수용액 및 침전물의 함유물을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 이미다조-아세틸-엑센딘-4 15 mg/ml 농도 및 3시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물에 아이소프로판올을 처리하여 침전물 제거한 후의 수용액 상태를 SOURCE S (LRC, 15 X 161 mm, 28 mL, PALL) 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체의 정제 프로파일이다.
도 7은 이미다조-아세틸-엑센딘-4 15 mg/ml 농도 및 3시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물에 아이소프로판올을 처리하여 형성된 침전물을 페길화 시킨 후, SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체의 정제 프로파일이다.
도 8은 페길화 시킨 반응물 및 선택적 침전법을 적용하여 형성된 침전물을 페길화 시킨 반응물을 SOURCE S 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체의 정제 프로파일이다.
도 9는 인슐린 아날로그 5 mg/mL 농도 및 2 시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물에 아이소프로판올을 처리한 후 침전물을 제거하여 수득한 수용액으로부터 SP-HP (Hitrap, 5 mL x 4 each, 20 mL, GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체의 정제 프로파일이다.
도 10은 인슐린 아날로그 5 mg/mL 농도 및 2 시간 반응 조건으로 반응시킨, 페길화 반응물에 아이소프로판올을 처리하여 수득한 침전물로부터 SP-HP (Hitrap, 5 mL x 4 each, 20 mL, GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 정제한 위치 이성질체의 정제 프로파일이다.
도 11은 기존 페길화 방법에 대한 선택적 침전법 적용 페길화 방법의 향상된 수율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 1에서 제조된, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG(CA-엑센딘-4-PEG) 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 실시예 7에서 제조된, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 실시예 1에서 제조된, 이미다조-아세틸-액센딘-4의 Lys27 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성체를 펩타이드 맵핑(Peptide mapping)을 통해 확인한 분석 프로파일이다.
도 15는 실시예 7에서 제조된, 이미다조-아세틸-액센딘-4의 Lys27 아민 잔기에 PEG가 결합한 위치 이성체를 펩타이드 맵핑(Peptide mapping)을 통해 확인한 분석 프로파일이다.
도 16은 실시예 1에서 제조된, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이다.
도 17은 실시예 7에서 제조된, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG-면역글로블린 Fc 결합체 순도를 역상컬럼으로 분석한 결과이다.
도 18은 선택적 침전법 적용 페길화 방법을 이용하여 제조한, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG-면역글로블린 Fc(면역글로블린 Fc-CA-엑센딘-4-PEG(Lys27)) 결합체의 수율과 기존 페길화 방법을 이용하여 제조한 결합체의 수율을 비교한 그래프이다.
도 19는 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 전의 상태 변화를 확인하기 위한 펩타이드 맵핑(Peptide mapping) 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 후의 상태 변화를 확인하기 위한 펩타이드 맵핑(Peptide mapping) 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 전후의 이미다조-아세틸-엑센딘-4의 1차 구조적 시퀀싱 상태 변화를 확인한 도이다(IPA: 아이소프로판올).
도 22는 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 전후의 이미다조-아세틸-엑센딘-4의 2차 구조 상태 변화를 확인한 도이다(IPA: 아이소프로판올).
도 23은 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 전후의 이미다조-아세틸-엑센딘-4의 cAMP 실험법을 통해 생리 활성도를 확인한 도이다.
본 발명의 하나의 양태는 1) 생리활성폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체를 위치 특이적으로 결합시키는 반응 혼합물로부터, 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드를 선택적으로 침전시키는 단계; 및 2) 상기 침전물로부터 회수된 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 단계 1)의 결합 반응하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "생리활성폴리펩타이드 결합체"는 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 한 말단이 공유결합으로 연결된 물질을 의미한다. 본 발명에서 상기 생리활성폴리펩타이드 결합체는 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드 결합체와 혼용된다.
본 발명의 단계 1)에서는 (1차) 결합 반응 혼합물에서 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은, 생리활성폴리펩타이드를 선택적으로 침전 시키는 것을 특징으로 한다. 상기 (1차) 결합 반응은 비펩타이드성 중합체와 생리활성폴리펩타이드를 결합, 구체적으로, 특이적으로 결합, 더욱 구체적으로, 위치 특이적으로 결합시킨다.
본 발명에서 상기 "비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드"는 "미반응 생리활성폴리펩타이드" 또는 "결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드"와 혼용된다.
본 발명에서 용어, "위치 특이적"은 생리활성폴리펩타이드의 아미노산 중 비펩타이드성 중합체와 결합시키고자하는 아미노산 위치에 비펩타이드성 중합체가 특이적으로 결합하는 것, 구체적으로, 라이신 잔기 또는 N-말단 잔기의 아민에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 이와 같이 위치 특이적으로 비펩타이드성 중합체를 결합시키는 경우, 제조하고자 하는 생리활성이 극대화된 지속성 제제는 다른 물질의 존재, 목적하지 않은 결합체, 예를 들어, 생리활성에 중요한 아미노산 잔기와 비펩타이드성 중합체가 결합한 결합체로 인한 생리활성의 감소가 방지될 수 있다. 예를 들어, 엑센딘-4의 경우, 비펩타이드성 중합체가 생리활성폴리펩타이드의 N-말단에 결합하는 경우 in vitro 활성이 떨어지는 반면, 비펩타이드성 중합체가 라이신 잔기에 결합하는 경우 in vitro 활성이 유지된다. 특히, 엑센딘-4의 12번째 또는 27번째 라이신 잔기 중에서도 27번째 라이신 잔기에 비펩타이드성 중합체가 결합되는 경우, 보다 높은 in vitro 활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서 생리활성폴리펩타이드가 엑센딘 또는 엑센딘 유도체인 경우, 상기 비펩타이드성 중합체는 위치 특이적으로 엑센딘 또는 엑센딘 유도체의 12번째 또는 27번째 라이신에 결합할 수 있으며, 구체적으로 27번째 라이신에 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 액센딘의 페길화 방법은 대한민국 공개특허 제10-2010-0105494호에 상세히 기술되어 있으며, 이는 참고문헌으로서 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 용어, "선택적 침전"은 비펩타이드성 중합체와 생리활성폴리펩타이드를 결합시키는 반응 혼합물에서 생성된, 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드 결합체는 수용액상에 남고, 반응하지 않은 생리활성폴리펩타이드는 선택적으로 침전되는 것을 의미한다.
본 발명에서 선택적 침전은 상기 반응 혼합물에서 미반응 생리활성폴리펩타이드를 침전시킬 수 있다면 제한 없이 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 널리 공지된 침전 방법의 실시예는 다음과 같다:
1. 염석(salting out),
2. 등전 침전(isoionic precipitation),
3. C2 유기 조용매 침전(two-carbon (C2) organic cosolvent precipitation),
4. C4 및 C5 유기 조용매 침전(C4 and C5, organic cosolvent precipitation), 단계별 분리(phase partitioning), 및 폴리펩타이드의 추출,
5. 폴리펩타이드 배제(polypeptide exclusion), 크라우딩제[(crowding agents(중성 중합체)] 및 삼투물질(osmolytes),
6. 합성 및 반합성의 고분자전해질 침전(Synthetic and semisynthetic polyelectrolyte precipitation),
7. 금속 및 폴리페놀의 헤테로폴리음이온 침전(Metallic and polyphenolic heteropolyanion precipitation),
8. 소수성 이온 쌍(HIP) 강화 리간드[Hydrophobic ion pairing (HIP) entanglement ligands],
9. 매트릭스 스태팅 리간드 공동 침전(Matrix-stacking-ligand coprecipitation),
10. 2가 및 3가 금속 양이온 침전(Di- and trivalent metal cation precipitation).
상기 선택적 침전은 상기 나열된 각각의 방법 또는 이들의 적절한 조합을 이용할 수 있다.
구체적으로, 유기용매를 상기 반응 혼합물에 첨가하여 미반응 생리활성폴리펩타이드를 선택적으로 침전시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 유기용매는 구체적으로, 알콜, 케톤, 나이트릴 또는 이들의 조합, 더욱 구체적으로, 에탄올, 아이소프로판올, 1-프로판올, 1-부탄올, 아세톤, 아세토나이트릴 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유기용매는 미반응 생리활성폴리펩타이드의 선택적 침전을 위하여 반응 혼합물에 반응 혼합물 부피의 2 배 이상, 구체적으로 2 ~ 7 배, 더욱 구체적으로 3 ~ 7, 4 ~ 7, 또는 5 ~ 7 배, 더더욱 구체적으로 3 ~ 7 배 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 선택적 침전에 사용되는 상기 반응 혼합물은 미반응 생리활성폴리펩타이드를 반응 혼합물의 전체 중량 대비 10 중량 % 이상, 구체적으로 20 중량 % 이상 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "생리활성펩타이드"는 인체 내에서 생리활성을 나타내게 하고자 하는 물질을 의미한다. 본 발명에서 생리활성펩타이드는 생리활성을 나타낼 수 있는 펩타이드는 모두 해당될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 분비 펩타이드, 혈액인자, 소화촉진 호르몬, 글루카곤, 인슐린, 옥신토모듈린(Oxintomodulin), 부신피질 호르몬, 갑상선호르몬, 장내 호르몬, 싸이토카인, 효소, 성장인자, 뉴로펩타이드 (neuropeptide), 뇌하수체 호르몬, 시상하부 호르몬, 항-비만 펩타이드, 항-바이러스 펩타이드 및 생리활성을 갖는 비천연형 펩타이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 적혈구 증식인자, 백혈구 증식인자, 아밀린, 소마토스타틴, PYY(peptide YY), NPY(neuropeptide Y), 안지오텐신, 브래디키닌, 칼시토닌, 부신피질 자극호르몬(Corticotropin), 엘레도이신(Eledoisin), 가스트린, 렙틴, 옥시토신(Oxytocin), 바소프레신(vasopressin), 황체 형성호르몬, 황체 자극호르몬, 여포 자극호르몬, 부 갑상선 호르몬, 씨크레틴(secretin), 세르모레린(Sermorelin), 인간성장 호르몬(hGH), 성장호르몬 방출 펩타이드, 콜로니 자극인자(GCSF)류, 인터페론(IFN)류, 인터루킨(Interleukin)류, 프로락틴 방출 펩타이드, 오렉신(Orexin), 갑상선 방출 펩타이드, 콜로시스토키닌(Cholecystokinin), 가스트린 억제 펩타이드, 칼모듈린, 가스트린 유리 펩타이드(Gastric releasing peptide), 모틸린(Motilin), 관활성장관 펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP), 바린나트륨이뇨 펩타이드(Barin natriuretic peptide; BNP), C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP), 뉴로키닌(Neurokinin) A, 뉴로메딘(Neuromedin), 레닌(Renin), 엔도텔린(Endothelin), 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide), 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide), 데모르핀(Dermorphin), 디노르핀(Dynorphin), 엔도르핀(Endorphin), 엔케팔린(Enkepalin), T 세포인자, 종양괴사인자, 종양괴사인자 수용체, 유로키나아제 수용체, 종양억제인자, 콜라게나제 억제제, 티모포이에틴(Thymopoietin), 티물린(Thymulin), 티모펜틴(Thymopentin), 티모신(Tymosin), 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor), 아드레노모둘린(Adrenomodullin), 알라토스타틴(Allatostatin), 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment), 항균성 펩타이드, 항산화제 펩타이드, 봄베신(Bombesin), 오스테오칼신(Osteocalcin), CART 펩타이드, E-셀렉틴(selectin), ICAM-1, VCAM-1, 류코킨(Leucokine), 크링글(Kringle)-5, 라미닌(Laminin), 인히빈(Inhibin), 갈라닌(Galanin), 피브로넥틴(Fibronectin), 판크레아스타틴(Pancreastatin) 및 푸제온(Fuzeon)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
뿐만아니라, 이러한 생리활성폴리펩타이드에는 폴리펩타이드가 갖는 생리활성을 갖는 폴리펩타이드의 전구물질(precursors), 유도체(derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등도 포함된다.
또한, 구체적으로 상기 생리활성폴리펩타이드는 엑센딘, GLP-1, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤 및 그의 유도체, 또는 칼시토닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 엑센딘 유도체는 예를 들어, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination), 수식(예; N-methylation) 또는 이들의 조합에 의해 제조될 수도 있는데, 이러한 엑센딘 유도체는 대한민국 공개특허 제10-2009-0008151호에 자세히 기술되어 있다. 또한, 상기 엑센딘 유도체는 구체적으로 데스-아미노-히스티딜(DA)-엑센딘-4, 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐(HY)-엑센딘-4, 이미다조-아세틸(CA)-엑센딘-4 및 디메틸-히스티딜(DM)-엑센딘-4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는, 반복 단위가 1개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid), PVP (Polyvinylpyrrolidone) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜이나, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 비펩타이드성 중합체는 생리활성폴리펩타이드가 활성을 충분히 발휘할 수 있도록 생체 내 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되지 않는, 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 이러한 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0.5 내지 100 kDa 범위, 구체적으로는 0.5 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 생리활성폴리펩타이드와 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 한쪽 말단에만 반응기를 가지거나 양 말단에 반응기를 가질 수 있다. 반응기를 양 말단에 가진 비펩타이드성 중합체의 경우, 지속형 제제로서의 기능을 수행할 수 있게 하는 생리활성 담체 및 단백질 약물과 결합 될 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 중합체의 말단 반응기는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 더욱 구체적으로 알데히드 그룹, 더욱더 구체적으로 프로피온 알데히드 그룹일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 말단에서 생리활성폴리펩타이드 및 생리활성 담체와 각각 결합하는데 효과적이다. 또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 또한, 알데히드 반응기는 낮은 pH, 예를 들어 pH 2.0 ~ 7.0, 구체적으로, pH 3.0 ~ 6.0, 더욱 구체적으로 pH 4.0 ~ 6.0에서 아미노 말단에 선택적으로 반응할 수 있다. 또한, 알데히드 반응기는 높은 pH, 예를 들어 pH 6.5 ~ 9.0, 구체적으로, pH 6.5 ~ 8.0, 더욱 구체적으로 pH 6.5 ~ 7.5 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 본 발명에서 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 비펩타이드성 중합체는 말단에 알데히드 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜이고, 단계 1)의 결합 반응은 위치 특이적 페길화일 수 있다. 상기 위치 특이적 페길화는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 라이신의 ε-아미노기와 같은 아미노기, 또는 생리활성폴리펩타이드의 N-말단에 대한 환원적 아민화(reductive amination)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어, "생리활성폴리펩타이드 결합체"는 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 한 말단이 공유결합으로 연결된 물질을 의미한다. 본 발명에서 생리활성폴리펩타이드 결합체는 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드 결합체와 혼용된다.
또한, 본 발명에서 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응에 있어서, 반응 몰비는 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체가 공유결합을 형성하는한 제한이 없지만, 생리활성폴리펩타이드 : 비펩타이드성 중합체가 1 : 1 내지 1 : 30인 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응에 있어서, 반응 시간은 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체가 공유결합을 형성하는한 제한이 없지만, 구체적으로, 0.5 ~ 4.0 시간, 더욱 구체적으로, 0.5 ~ 2.0 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응에 있어서, 반응 온도는 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체가 공유결합을 형성하는한 제한이 없지만, 구체적으로, 0 ~ 14 ℃ 또는 15 ~ 30 ℃, 더욱 구체적으로, 4 ~ 8 ℃ 또는 20 ~ 25 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응에 있어서, 생리활성폴리펩타이드의 농도는 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체가 공유결합을 형성하는한 제한이 없지만, 구체적으로, 1 ~ 25 mg/ml, 더욱 구체적으로, 5 ~ 18 mg/ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태는 변이된 엑센딘-4가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 양 말단에 알데히드 작용기를 가진, 3.4kDa의 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 3.4K ALD(2) PEG)를 변이된 엑센딘-4인, 이미다조-아세틸-엑센딘-4(CA-엑센딘-4)의 Lys 위치에 페길화시키기 위하여, 펩타이드와 PEG의 몰비를 약 1 : 7.5, 펩타이드의 농도를 약 5 ~ 18 mg/ml로 하여, 0.5 ~ 4.0 시간 동안 4 ~ 8 ℃ 및 20 ~ 25 ℃에서 환원제인 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride, SCB, NaCNBH3)를 첨가한, 100 mM HEPES　pH 6.5 ~ 7.5 완충액으로 반응시킬 수 있다. 구체적으로 펩타이드 15 mg/ml로 3 시간 동안 4 ~ 8 ℃에서 반응시킨 후, 씨트릭액시드 pH 2.0 완충액과 KCl 선형 농도 구배 방법을 적용한 SOURCE 15S 컬럼을 사용하여, 상기 각 반응액에서 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG를 분리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 반응 혼합물에서 (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12)가 약 10 ~ 40 %, 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG가 약 40 ~ 50 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 약 20 ~ 50 %의 함량을 차지함을 확인하였다(표 1 및 2).
또한, 본 발명의 다른 일 양태는 인슐린 아날로그가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다. 상기 인슐린 아날로그는 3.4K ALD(2) PEG)를 인슐린 아날로그의 베타 체인의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 펩타이드와 PEG의 몰비를 약 1 : 4, 펩타이드의 농도를 약 5 ~ 18 mg/ml로 하여, 0.5 ~ 4.0 시간 동안 4 ~ 8 ℃ 및 20 ~ 25 ℃에서 환원제인 3 ~ 5 mM 소듐 시트레이트(sodium cyanoborohydride, SCB, NaCNBH3)를 첨가한, 50 mM 소듐 시트레이트　pH 4.0 ~ 6.0 완충액으로 반응시킬 수 있다. 구체적으로, 펩타이드 5 mg/ml로 2 시간 동안 4 ~ 8 ℃에서 반응시킨 후, 씨트릭액시드 pH 3.0 완충액과 KCl 선형 농도 구배 방법을 적용한 SP-HP 컬럼을 사용하여, 상기 각 반응액에서 인슐린 아날로그를 분리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 반응 혼합물에서 (PEG)n-인슐린 아날로그가 약 10 ~ 20 %, 인슐린 아날로그-PEG가 약 50 ~ 60 %, 미반응 인슐린 아날로그가 약 5 ~ 20 %의 함량을 차지함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 CA-exendin-4 또는 인슐린 아날로그의 페길화된 결합체의 반응 혼합물에 (반응 혼합물 부피의) 2 배 이상, 구체적으로는 3 ~ 7 배의 아이소프로판올을 첨가하여 반응시킨다. 상기 이소프로판올을 처리한 반응액에서, 페길화된 결합체(CA-exendin-4 또는 인슐린 아날로그의 결합체)를 포함한 수용액과 결합하지 않은 생리활성폴리펩타이드의 침전물, 예를 들어 페길화되지 않은, 미반응 이미다조-아세틸-엑센딘-4 또는 미반응 인슐린 아날로그를 분리한다(도 4 및 5). 예를 들어, 수용액을 정제하였고(도 6 및 9), 그 결과, 본 발명자들은 수용액에 포함된, (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12)가 약 10 ~ 40 %, 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG가 약 40 ~ 50 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 약 5 ~ 15 %의 함량을 차지함을 확인하였다. 또한, 분리된 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물은 15 ~ 30 % 함량임을 확인하였다. 인슐린 아날로그의 경우, 수용액은 10 ~ 20%의 (PEG)n-인슐린 아날로그, 50 ~ 60%의 인슐린 아날로그-PEG, 및 약 5 ~ 15%의 미반응 (PEG)n-인슐린 아날로그를 포함한다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 아이소프로판올의 처리 전후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 변화를 확인한 결과, 아이소프로판올의 처리 전후 모두 동일한 상태이며(도 19 및 20), 1차 구조가 동일하고(도 21), 2차 구조 함량이 동일하며(도 22 및 표 7), 동등한 활성을 가짐을 알 수 있었다(도 23 및 표 8). 이를 통해, 아이소프로판올의 처리에 의한 선택적 침전법은 생리활성폴리펩타이드인 이미다조-아세틸 엑센딘-4에 부정적인 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
본 발명에서 이미다조-아세틸-액센딘-4-PEG는 이미다조-아세틸-액센딘-4-PEG(Lys27), 이미다조-아세틸 엑센딘-4(Lys27)-PEG, CA-액센딘-4-PEG 및 CA-액센딘-4-PEG(Lys27)와 혼용된다.
본 발명의 단계 2)에서는 상기 단계 1)의 침전물에서 회수된 생리활성폴리펩타이드를 이용하여, 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드 결합체를 제조하기 위해, 상기 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 결합시키는, 2차 반응 혼합물을 생성시키는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 침전된 생리활성폴리펩타이드를 용해한 후 비펩타이드성 중합체와 결합, 구체적으로 특이적 결합, 더욱 구체적으로 위치 특이적 결합시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 2차 반응 혼합물 및 상기 1차 반응 혼합물에 선택적 침전법이 적용되어 형성된 수용액은 제조된, 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드 결합체를 함유하고 있다.
본 발명에서 상기 침전된 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 조건은 침전된 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체가 공유결합을 형성할 수 있는 한 제한이 없으나, 구체적으로, 상기 단계 1)의 반응 조건으로 수행될 수 있다.
특히, 상기 침전된 생리활성폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응시간은 구체적으로, 0.5 ~ 4.0 시간, 더욱 구체적으로, 0.5 ~ 2.0 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 실시예 3에서 아이소프로판올을 처리하여 선택적 침전화를 통해 분리된 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물 약 20 ~ 30 %를 재사용하여 페길화를 실시한 결과, 미페길화 이미다조-아세틸 엑센딘-4 침전물의 재 페길화 반응액의 정제 결과, 상기 반응액에서 (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12)가 약 15 ~ 40 %, 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG가 40 ~ 50 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 약 10 ~ 40 %의 함량을 차지함을 확인하였다(도 7).
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 단계 2) 이후, 생리활성폴리펩타이드 결합체를 분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 과정은 당업계에 알려진 크로마토그래피와 같은 다양한 물질의 분리 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 이온 교환 크로마토그래피 더욱 구체적으로, 고압 이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 1차 반응 혼합물, 1차 반응 혼합물에 선택적 침전법이 적용되어 형성된 수용액, 2차 반응 혼합물 또는 이들의 조합으로부터 생리활성폴리펩타이드 결합체를 분리할 수 있다.
특히, 1차 반응 혼합물에 선택적 침전법이 적용되어 형성된 수용액 및 상기 침전된 생리활성폴리펩타이드를 이용하여 형성된 2차 반응 혼합물을 합쳐서, 이로부터 생리활성폴리펩타이드 결합체를 분리하는 경우, 1차 반응 혼합물로부터 분리하는 경우에 비해 생리활성폴리펩타이드 결합체의 수율이 현저히 증가한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 1차 반응 혼합물에 선택적 침전법이 적용되어 형성된 수용액; 및 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4 또는 인슐린 아날로그를 함유한 침전물을 재용해하여 페길화 반응을 수행한, 2차 반응 혼합물을 합쳐서, 씨트릭액시드 pH 2.0 ~ 3.0 완충액과 KCl 선형 농도 구배 방법을 적용한 SOURCE 15S 컬럼 또는 SP-HP 컬럼으로 분리한 결과, 선택적 침전법 적용 페길화 방법에 따라 제조된, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG 결합체의 수율이 기존 페길화 방법에 따른 수율보다 매우 높음을 가짐을 확인하였다(도 11 및 표 4).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 기존 페길화 방법 및 아이소프로판올을 이용한 선택적 침전법 적용 페길화 방법에 따른 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 순도가 97 %로 동등하며, 페길화 위치 순도도 유사함을 확인하였다(표 5).
또한, 본 발명의 다른 양태는 상기 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법으로 제조된, 생리활성폴리펩타이드 결합체 중 비펩타이드성 중합체와 생리활성 담체를 공유결합으로 연결하여, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 생리활성 담체 및 생리활성폴리펩타이드와 결합된, 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 양태에서, 선택적 침전법을 통한 2 단계의 위치 특이적 페길화 반응으로 제조된, 생리활성폴리펩타이드의 결합체를 이용하여, 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체(폴리펩타이드-담체 결합체)를 고수율 및 고순도로 생산할 수 있다. 상기 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체는 생리활성폴리펩타이드 결합체와는 전혀 다른 활성, 즉, 생리활성폴리펩타이드의 약리효과의 지속성의 연장, 치료를 원하는 병소와 같은 특정 부위에서 타겟팅 또는 세포의 괴사 유도 등과 같은 탁월한 생리활성을 가진다.
본 발명에서 상기 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체 내의 비펩타이드성 중합체는 생리활성폴리펩타이드와 생리활성 담체와 결합하기 위하여 양 말단을 가지는 비펩타이드성 중합체이어야 한다. 즉, 상기 생리활성폴리펩타이드 결합체의 공유결합되지 않은 비펩타이드성 중합체의 말단에 생리활성 담체를 공유결합으로 연결시켜 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 생리활성폴리펩타이드 및 생리활성 담체와 결합된, 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "생리활성 담체"는 비펩타이드성 중합체의 생리활성폴리펩타이드와 함께 결합되어 생리활성폴리펩타이드의 약리 효과와 같은 생리 활성을 지속시키거나, 특정 부위의 타겟팅 또는 세포 괴사를 유도시키는, 상기 생리활성폴리펩타이드가 갖는 생리활성과는 별개의 부가적인 활성을 나타내는 생리 활성 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 생리활성 담체는 상기와 같은 활성을 갖는 물질이 제한 없이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, 트랜스페린, 앱타머, 톡신, 젤라틴, 콜라겐, 덱스트란, 다당류, 지방산 및 피브리노겐 등을 들 수 있다. 구체적으로는 생리활성 담체는 알부민, 면역글로불린 Fc 영역 또는 트랜스페린일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 천연형 면역글로불린 Fc와 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 면역글로불린 Fc 영역일 수도 있고, 인산화, 황화, 아크릴화, 당화, 메틸화, 파네실화, 아세틸화 및 아밀화 등으로 수식되는 면역글로불린 Fc 영역 등을 모두 포함한다. 이러한 면역글로불린 Fc의 범위, 제조방법 및 면역글로불린 Fc를 비펩타이드성 중합체-생리활성폴리펩타이드 결합체에 공유 결합시키는 방법은 대한민국 등록특허 제10-775343호, 제10-725314호, 제10-725315호 및 제10-824505호 등에 상세히 기술되어 있으며, 이들은 참고문헌으로써 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 일 양태에서, 생리활성폴리펩타이드 결합체는 생리활성폴리펩타이드의 특정아미노산에 위치 특이적으로 비펩타이드성 중합체가 결합되어 있어, 생리활성이 가장 탁월한 생리활성폴리펩타이드 결합체 외의 다른 부가적인 결합체의 생성을 최소화시킬 수 있다. 이로 인해, 약리학적으로 가치가 있는 생리활성폴리펩타이드 결합체의 수율을 증가시킬 수 있다는 효과를 갖는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 기존 페길화 방법 및 아이소프로판올을 이용한 선택적 침전법 적용 페길화 방법에 따른 이미다조-아세틸 엑센딘-4(Lys27)-PEG 결합체를 각각 인간 면역글로불린 Fc 단편과 결합시키고, 이미다조-아세틸-액센딘-4-면역글로불린 FC의 순도 및 수율을 분석한 결과, 순도는 27.6%로 동일하지만(표 5), 수율은 선택적 침전법 적용 페길화 방법으로 제조된 이미다조-아세틸 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체가 기존 방법에 비해 높음을 알 수 있었다.
본 발명에서 이미다조-아세틸-액센딘-4-면역글로불린 FC는 CA-액센딘-4-PEG-Immunoglobulin Fc 또는 면역글로불린 FC-CA-액센딘-4-PEG(Lys27)과 혼용된다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다.
그러나, 이들 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4( Imidazo -acetyl exendin - 4)의 페길화 및 위치 이성질체 분리
3.4K ALD(2) PEG (알데히드기를 2개 가지고 있는, 3.4kDa의 PEG, NOF, 일본)를 사용하여 이미다조-아세틸-엑센딘-4 (CA-엑센딘-4, Bachem, 미국)의 Lys에 페길화를 실시하였다.
3.4K ALD(2) PEG를 이미다조-아세틸-엑센딘-4의 Lys 위치에 페길화시키기 위하여, 펩타이드와 PEG의 몰비를 약 1:3 내지 1:30, 펩타이드의 농도를 약 5 ~ 18 mg/ml로 하여 0.5 ~ 4.0 시간동안 4 ~ 8 ℃ 및 20 ~ 25 ℃에서 반응시켰다. 이때 반응은 각각 100 mM HEPES　pH 6.5 ~ 7.5 완충액에서 이루어졌으며, 환원제인 20 내지 30 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 구체적인 반응 조건 및 하기와 같은 방법으로 분리한 결과를 하기 표 1 및 2에 나타내었다. 또한, 구체적으로는 펩타이드 15 mg/ml로 3 시간동안 4 ~ 8 ℃에서 반응시킨 후, 하기와 같은 방법으로 분리한 결과를 도 2에 나타내었다.
씨트릭액시드 pH 2.0 ~ 4.0 완충액과 KCl 선형 농도 구배 방법을 적용한 SOURCE 15S 컬럼을 사용하여, 상기 각 반응액에서 멀티 페길화된 형태(하기 표 1의 (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4) 및 미반응 형태와 같은 불순물과 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG를 분리하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
그 결과, (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 및 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12) 피크가 앞쪽에 나오고, 그 뒤쪽으로 Lys27에 페길화된 피크가 나오며, 미반응 이미다조-아세틸-엑센딘-4 피크가 마지막에 나옴을 알 수 있었다(도 2). 또한, (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12)가 약 10 ~ 40 %, 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG가 약 40 ~ 50 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 약 10 ~ 50 %의 함량을 차지함을 확인하였다.
실시예 2. 인슐린 아날로그의 페길화 및 위치 이성질체 분리
3.4K ALD(2) PEG를 사용하여 인슐린 아날로그(WO 2014-133324, 한미약품, 한국)의 베타 체인의 N-말단에 페길화를 실시하였다.
3.4K ALD(2) PEG를 인슐린 아날로그의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 펩타이드와 PEG의 몰비를 약 1:4, 펩타이드의 농도를 약 5 ~ 18 mg/ml로 하여 0.5 ~ 4.0 시간동안 4 ~ 8 ℃ 및 20 ~ 25 ℃에서 반응시켰다. 이때 반응은 각각 50 mM 소듐 시트레이트　pH 4.0 ~ 6.0 완충액에서 이루어졌으며, 환원제인 3 내지 5 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 구체적으로는, 펩타이드 5 mg/ml로 2 시간 동안 4 ~ 8 ℃에서 반응시킨 후, 하기와 같은 방법으로 분리한 결과를 도 3에 나타내었다.
씨트릭액시드 pH 2.0 ~ 4.0 완충액과 KCl 선형 농도 구배 방법을 적용한 SP-HP 컬럼을 사용하여, 상기 각 반응액에서 인슐린 아날로그-PEG를 분리하였다.
그 결과, (PEG)n-인슐린 아날로그의 피크가 앞쪽에 나오고, 그 뒤쪽으로 N-말단에 페길화된 피크가 나오며, 미반응 인슐린 아날로그의 피크가 마지막에 나옴을 알 수 있었다(도 3). 또한, (PEG)n-인슐린 아날로그가 약 10 ~ 20 %, 인슐린 아날로그-PEG가 약 50 ~ 60 %, 미반응 인슐린 아날로그가 약 5 ~ 20 %의 함량을 차지함을 확인하였다.
실시예 3. 유기용매를 이용한 선택적 침전을 통해 이미다조 -아세틸- 엑센딘 -4의 페길화 및 미페길화된 이미다조 -아세틸- 엑센딘 -4의 분리
3.4K ALD(2) PEG를 이미다조-아세틸-엑센딘-4(CA-엑센딘-4, Bachem, 미국)의 Lys 위치에 페길화를 실시하였다.
반응 조건은 실시예 1과 동일하였다. 페길화 반응액에 아이소프로판올, 1-프로판올, 1-부탄올, 아세톤, 아세토나이트릴을 반응액 부피의 2 배 이상 첨가하여 반응 시켰다. 구체적으로는 3 ~ 7 배의 유기용매를 처리하였다. 유기용매를 처리한 반응액에서, 페길화된 이미다조-아세틸-엑센딘-4 수용액과 페길화되지 않은, 미반응 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물을 분리하였다(도 4). 이 중, 수용액을 실시예 1과 동일한 방법으로 정제하였고(도 6), 정제된 각 분획의 함량을 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pat00003
수용액에 포함된, (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12)가 약 10 ~ 40 %, 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG가 약 40 ~ 50 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 약 5 ~ 15 %의 함량을 차지함을 확인하였다. 또한, 분리된 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물은 15 ~ 30 % 함량임을 확인하였다(표 3).
실시예 4. 유기용매를 이용한 선택적 침전을 통해 인슐린 아날로그의 페길화 및 미페길화된 인슐린 아날로그의 분리
3.4K ALD(2) PEG를 이용하여 인슐린 아날로그(한미약품, 한국)의 베타 체인의 N-말단에 페길화를 실시하였다.
반응 조건은 실시예 2와 동일하였다. 페길화 반응액에 아이소프로판올, 에탄올, 1-프로판올, 아세톤, 아세토나이트릴을 반응액 부피의 2 배 이상 첨가하여 반응 시켰다. 구체적으로는 3 ~ 7 배의 유기용매를 처리하였다. 유기용매를 처리한 반응액에서, 페길화된 인슐린 아날로그 수용액과 페길화되지 않은, 미반응 인슐린 아날로그 침전물을 분리하였다(도 5). 이 중, 수용액을 실시예 2와 동일한 방법으로 정제하였다(도 9).
실시예 5. 미페길화된 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4의 선택적 침전물의 재 페길화 및 위치 이성질체 분리
3.4K ALD(2) PEG (알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 이미다조-아세틸-엑센딘-4(CA-엑센딘-4, Bachem, 미국)의 Lys 위치에 페길화를 실시하였고, 실시예 3과 동일한 방법으로 아이소프로판올을 처리하여 선택적 침전화를 통해 분리된 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물 약 20 ~ 30 %를 재사용하여 페길화를 실시하였다.
3.4K ALD(2) PEG를 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물의 Lys에 페길화 시키기 위하여, 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물과 PEG의 몰 비를 1 : 7.5, 이미다조-아세틸-엑센딘-4 침전물을 재용해한 반응액의 농도를 약 15 mg/ml로 하여, 0.5 ~ 2.0 시간동안 20 ~ 25 ℃에서 반응시켰다. 이때 반응은 각각 100 mM HEPES　pH 7.５ 완충액에서 이루어졌으며, 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 정제방법은 실시예 1과 동일하였다. 미페길화된 이미다조-아세틸 엑센딘-4 침전물의 재 페길화 반응액의 정제 결과, (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG(Lys12)가 약 15 ~ 40 %, 이미다조-아세틸 액센딘-4-PEG가 40 ~ 50 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 약 10 ~ 40 %의 함량을 차지함을 확인하여(도 7), 1차 페길화 결과(표 2)와 유사한 결과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 6. 미페길화된 인슐린 아날로그의 선택적 침전물의 재 페길화 및 위치 이성질체 분리
3.4K ALD(2) PEG를 인슐린 아날로그(한미약품, 한국)의 베타 체인의 N-말단에 페길화를 실시하였고, 실시예 4와 동일한 방법으로 아이소프로판올을 처리하여 선택적 침전화를 통해 분리된 인슐린 아날로그 침전물 약 0.5 ~ 10 %를 재사용하여 페길화를 실시하였다.
3.4K ALD(2) PEG를 인슐린 아날로그 침전물의 N-말단에 페길화를 시키기 위하여, 인슐린 아날로그 침전물과 PEG의 몰 비를 1 : 4, 인슐린 아날로그 침전물을 재용해한 반응액의 농도를 약 5 ~18 mg/ml로 하여, 0.5 ~ 4.0 시간동안 4 ~ 8 ℃에서 반응시켰다. 이때 반응은 각각 50 mM 소듐 시트레이트　pH 4.0 ~ 6.0 완충액에서 이루어졌으며, 환원제인 3 ~ 5 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 정제방법은 실시예 2와 동일하였다. 미페길화된 인슐린 아날로그 침전물의 재 페길화 반응액의 정제 결과, (PEG)n-인슐린 아날로그가 약 0 ~ 15 %, 인슐린 아날로그-PEG가 20 ~ 40 %, 미반응 인슐린 아날로그가 약 30 ~ 45 %의 함량을 차지함을 확인하였다(도 10).
실시예 7. 페길화된 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4 수용액 및 재 페길화된 침전물의 혼합물에서 위치 이성질체 분리 후 수율 확인
3.4K ALD(2) PEG를 이미다조-아세틸-엑센딘-4(CA-엑센딘-4, Bachem, 미국)의 Lys 위치에 페길화를 실시하였다. 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시키고, 반응액에 실시예 3과 같은 방법으로 아이소프로판올을 처리하여 선택적 침전을 시킨 후, 침전물을 실시예 5과 동일한 방법으로 재 페길화 시켰다. 반응액에 아이소프로판올을 처리하여 얻은 수용액과 재 페길화된 침전물을 합쳐서, 실시예 1과 동일한 방법으로 정제하여 위치 이성질체를 분리하였다(도 8).
정제 결과, (PEG)n-이미다조-아세틸 액센딘-4 + 이미다조-아세틸-엑센딘-4(Lys12)-PEG가 약 25 ~ 30 %, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG가 약 50 ~ 60 %, 미반응 이미다조-아세틸 액센딘-4가 10 ~ 20 %의 함량을 차지함을 확인하였다.
또한, 선택적 침전법 적용 페길화 방법에 따라 제조된, 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG 결합체의 수율을 기존 페길화 방법에 따른 수율과 비교한 결과를 도 11 및 하기 표 4에 나타내었다. 그 결과, 선택적 침전법 적용 페길화 방법이 기존 페길화 방법보다 매우 높은 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG 결합체의 수율을 가짐을 확인하였다.
Figure pat00004
실시예 8. 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4 페길화 위치 이성질체 분리 후 순도 확인
기존 페길화 방법 및 아이소프로판올을 이용한 선택적 침전법 적용 페길화 방법에 따른 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 순도 차이를 확인하기 위해, 실시예 1 및 7의 정제 용출액을 사용하여 각각 HPLC 역상분석(RP)을 실시하였다(도 12 및 13).
그 결과, 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 기존 방법에 해당하는 실시예 1 및 선택적 침전법 적용 페길화 방법에 해당하는 실시예 7의 순도가 97 %로 동등함을 확인하였다(표 5).
Figure pat00005
실시예 7. 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4 페길화 위치 이성질체 분리 후 Lys -C 펩타이드 맵핑
이미다조-아세틸-액센딘-4에 PEG가 접합된 위치를 확인하기 위하여, 단백질 효소인 라이신-C로 절단 후, 역상 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 실험은 실시예 1 및 실시예 7의 정제된 각 PEG 결합체; 및 이미다조-아세틸-액센딘-4를, 트리에틸아민-염산 완충액 (10 mmol/L; pH7.5)에 1 mg/ml 농도로 용해한 뒤, 10 ㎕의 효소 (0.1 mg/ml)를 첨가하여 37 ℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 반응 혼합물을 역상크로마토그래피를 사용하여 분석하였다(도 14 및 15).
그 결과, 각 반응에 따른 페길화 위치 순도를 상기 표 5에 나타내었으며, 실시예 1 및 실시예 7의 정제된 PEG 결합체 각각은 유사한 순도를 가짐을 확인하였다.
실시예 10. 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4- 면역글로블린 Fc 결합체 제조
이미다조-아세틸 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체를 제조하기 위해, 실시예 1에서 얻은 이미다조-아세틸-엑센딘-4-PEG 결합체와 한미약품(한국)에서 구입한, 인간 면역글로불린 Fc 단편을 결합시켰다. 이미다조-아세틸-엑센딘-4(Lys27)-PEG 결합체와 면역글로불린 Fc의 몰비를 1:2.5, 전체 단백질 농도를 약 10 mg/mL로 하여 4 ~ 8 ℃에서 12 ~ 16시간 동안 반응시켰다. 반응용액은 100 mM HEPES pH 8.2을 사용하였고, 여기에 3% Triton X-100 및 환원제인 50 mM의 NaCNBH3를 첨가하였다. 결합 반응 후 커플링 반응액의 HPLC 역상 분석(RP) 결과(도 16), 이미다조-아세틸 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체의 순도는 27.6 %이었다(표 5).
실시예 11. 선택적 침전방법 적용에 의한 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4- 면역글로블린 Fc 결합체 제조
실시예 7에서 얻은 이미다조-아세틸 엑센딘-4(Lys27)-PEG 결합체를 한미약품(한국)에서 구입한, 인간 면역글로불린 Fc 단편과 결합시켰다. 실시예 10과 동일한 방법으로 결합시키고 순도를 분석하였다. 반응액의 HPLC 역상 분석 결과(도 17), 순도는 27.6%이었다(표 5). 실시예 7에 의한 수율 향상이 이미다조-아세틸 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체 수율 향상에 미치는 결과를 실시예 1에 의한 수율과 비교하여 도 18 및 하기 표 6에 나타내었다. 그 결과, 선택적 침전법 적용 페길화 방법으로 제조된 이미다조-아세틸 엑센딘-4-PEG 결합체의 수율이 기존 방법에 비해 높으므로, 선택적 침전법 적용 페길화 방법으로 제조된 이미다조-아세틸 엑센딘-4-PEG 결합체를 이용하여 이미다조-아세틸 엑센딘-4-면역글로블린 Fc 결합체를 제조하는 경우 기존 페길화 방법을 이용하는 것보다 수율이 높음을 알 수 있었다.
Figure pat00006
실시예 12 선택적 침전법 ( 아이소프로판올에 의한) 적용에 따른 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4의 순도 확인을 위한 라이신 -C 펩타이드 맵핑
아이소프로판올의 처리 전후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 상태 변화를 확인하기 위하여, 라이신-C 펩타이드 맵핑을 실시하였다. 도 19의 결과는 아이소프로판올 처리전의 상태이고, 도 20의 결과는 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 맵핑 결과이다. 분석 결과 처리 전후 상태 모두 동일한 상태임을 알 수 있었다. 분석 방법은 실시예 9와 동일하였다.
실시예 13. 침전법( 아이소프로판올에 의한) 적용에 따른 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4의 순도 확인을 위한 LC-Mass
아이소프로판올의 처리 전후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 1차 구조인 단백질 서열을 확인하기 위해서, LC-Mass 분석을 실시하였다. 분석 결과 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 전후의 1차 구조가 동일함을 확인하였다(도 21).
실시예 14. 침전법( 아이소프로판올에 의한) 적용에 따른 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4의 2차 구조 확인을 위한 원편광 분석 (CD spectroscopy)
아이소프로판올(IPA)의 처리 전후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 2차 구조의 변화를 확인하기 위해서, CD 분석을 실시하였다. 분석 결과 선택적 침전법 적용 (아이소프로판올 처리) 전후의 2차 구조 함량이 동일함을 확인하였다(도 22 및 표 7).
Figure pat00007
실시예 15. 선택적 침전법 적용 전후 이미다조 -아세틸 엑센딘 -4의 in vitro 활성 측정
아이소프로판올의 처리 전후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 지속형 제제의 효력을 측정하기 위해, in vitro 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다. GLP-1의 in vitro 활성 측정 방법은 GLP-1 receptor를 클로닝한 CHO 세포를 이용하여, ㅅ상기 클로닝한 세포 라인에 GLP-1을 처리함에 따른 세포 내의 cAMP 증가 여부를 측정하는 방법이다.
본 시험에서 사용된 in-vitro 활성 측정 방법은 CHO/GLP-1, 엑센딘-4와 시험물질을 농도별로 처리한 후, cAMP 발생 정도를 측정하여 EC50 값을 비교하는 시험으로 진행하였다. 아이소프로판올 처리 후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4의 대조군으로 아이소프로판올 처리 전의 이미다조-아세틸 엑센딘-4를 사용하였다. in vitro 활성 측정 결과를 도 23 및 표 8에 나타내었다. 그 결과, 아이소프로판올의 처리 전후의 이미다조-아세틸 엑센딘-4가 동등한 활성을 가짐을 알 수 있었다.
Figure pat00008
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

1) 생리활성폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체를 위치 특이적으로 결합시키는 반응 혼합물로부터, 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드를 선택적으로 침전시키는 단계; 및
2) 상기 침전물로부터 회수된 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 단계 1)의 결합 반응하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)는 침전된 생리활성폴리펩타이드를 용해한 후 비펩타이드성 중합체와 결합시키는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 반응 혼합물은 비펩타이드성 중합체가 결합되지 않은 생리활성폴리펩타이드를 반응 혼합물의 전체 중량 대비 10 중량 % 이상 포함하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 선택적 침전은 유기용매를 이용하는 것인, 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 유기용매는 아이소프로판올, 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올, 아세톤, 아세토나이트릴 또는 이들의 조합인 것인, 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 아이소프로판올을 단계 1)의 반응 혼합물에 반응 혼합물 부피의 2 ~ 7 배로 처리하는 것인, 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 아이소프로판올을 단계 1)의 반응 혼합물에 반응 혼합물 부피의 4 ~ 6 배로 처리하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)는 회수된 생리활성폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 0.5 ~ 4.0 시간 동안 반응시키는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성폴리펩타이드는 인슐린 분비 펩타이드, 혈액인자, 소화촉진 호르몬, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 부신피질 호르몬, 갑상선호르몬, 장내 호르몬, 싸이토카인, 효소, 성장인자, 뉴로펩타이드 (neuropeptide), 뇌하수체 호르몬, 시상하부 호르몬, 항-비만 펩타이드, 항-바이러스 펩타이드 및 생리활성을 갖는 비천연형 펩타이드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성폴리펩타이드는 적혈구 증식인자, 백혈구 증식인자, 아밀린, 소마토스타틴, PYY(peptide YY), NPY(neuropeptide Y), 안지오텐신, 브래디키닌, 칼시토닌, 부신피질 자극호르몬(Corticotropin), 엘레도이신(Eledoisin), 가스트린, 렙틴, 옥시토신(Oxytocin), 바소프레신(vasopressin), 황체 형성호르몬, 황체 자극호르몬, 여포 자극호르몬, 부 갑상선 호르몬, 씨크레틴(secretin), 세르모레린(Sermorelin), 인간성장 호르몬(hGH), 성장호르몬 방출 펩타이드, 콜로니 자극인자(GCSF)류, 인터페론(IFN)류, 인터루킨(Interleukin)류, 프로락틴 방출 펩타이드, 오렉신(Orexin), 갑상선 방출 펩타이드, 콜로시스토키닌(Cholecystokinin), 가스트린 억제 펩타이드, 칼모듈린, 가스트린 유리 펩타이드(Gastric releasing peptide), 모틸린(Motilin), 관활성장관 펩타이드(Vasoactive intestinal peptide), 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP), 바린나트륨이뇨 펩타이드(Barin natriuretic peptide; BNP), C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP), 뉴로키닌(Neurokinin) A, 뉴로메딘(Neuromedin), 레닌(Renin), 엔도텔린(Endothelin), 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide), 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide), 데모르핀(Dermorphin), 디노르핀(Dynorphin), 엔도르핀(Endorphin), 엔케팔린(Enkepalin), T 세포인자, 종양괴사인자, 종양괴사인자 수용체, 유로키나아제 수용체, 종양억제인자, 콜라게나제 억제제, 티모포이에틴(Thymopoietin), 티물린(Thymulin), 티모펜틴(Thymopentin), 티모신(Tymosin), 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor), 아드레노모둘린(Adrenomodullin), 알라토스타틴(Allatostatin), 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment), 항균성 펩타이드, 항산화제 펩타이드, 봄베신(Bombesin), 오스테오칼신(Osteocalcin), CART 펩타이드, E-셀렉틴(selectin), ICAM-1, VCAM-1, 류코킨(Leucokine), 크링글(Kringle)-5, 라미닌(Laminin), 인히빈(Inhibin), 갈라닌(Galanin), 피브로넥틴(Fibronectin), 판크레아스타틴(Pancreastatin) 및 푸제온(Fuzeon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생리활성폴리펩타이드는 엑센딘, 엑센딘 유도체, 인슐린, 인슐린 유도체 또는 이들의 조합인 것인, 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 엑센딘 유도체는 데스-아미노-히스티딜(DA)-엑센딘-4, 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐(HY)-엑센딘-4, 이미다조-아세틸(CA)-엑센딘-4 및 디메틸-히스티딜(DM)-엑센딘-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 생리활성폴리펩타이드인, 엑센딘 또는 엑센딘 유도체의 27번째 라이신에 결합하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 생리활성폴리펩타이드인, 인슐린, 인슐린 아날로그 베타 체인, 또는 이들의 유도체의 N-말단에 결합하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제15항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 반응기를 포함하는 것인, 제조방법.
제17항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 알데히드 그룹의 반응기를 포함하는 것인, 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 알데히드 그룹은 프로피온 알데히드 그룹인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 분자량이 500 내지 100,000Da 인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2) 이후, 생리활성폴리펩타이드 결합체를 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는, 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 분리는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것인, 제조방법.
제22항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 고압 이온 교환 크로마토그래피인 것인, 제조방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 생리활성폴리펩타이드 결합체의 비펩타이드성 중합체와 생리활성 담체를 공유결합으로 연결하여, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 생리활성 담체 및 생리활성폴리펩타이드와 결합된, 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 생리활성폴리펩타이드-생리활성 담체 결합체의 제조방법.
제24항에 있어서, 상기 생리활성 담체는 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, 트랜스페린, 앱타머, 톡신, 젤라틴, 콜라겐, 덱스트란, 다당류, 지방산 및 피브리노겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 생리활성 담체는 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 제조방법.
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