TW201718022A - 製備生理活性多肽接合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種製備生理活性多肽接合物的方法,其中,生理活性多肽及非肽基聚合物係經由共價鍵彼此連接。該方法係藉由增進該非肽基聚合物及該生理活性多肽之反應而增進該生理活性多肽接合物之總產率,具體而言,該方法係藉由透過選擇性沉澱施行二步驟反應而以高產率製備生理活性多肽接合物。本發明之製備方法係用於以高產率製造非肽基聚合物-生理活性多肽接合物以及生理活性多肽-生理活性載體接合物,因此,該方法可用於開發以相對高水平維持活體內活性且具有明顯增加的血中半衰期之各種胜肽藥物之長效調配物。
Description
本發明係關於一種製備生理活性多肽接合物的方法,其中,生理活性多肽及非肽基聚合物係經由共價鍵彼此連接。該方法係藉由增進該非肽基聚合物及該生理活性多肽之反應而增進該生理活性多肽接合物之總產率,具體而言,該方法係藉由透過選擇性沉澱施行二步驟反應而以高產率製備生理活性多肽接合物。
胜肽有容易因其較低的安定性而變性以及受活體內蛋白水解酵素所降解,而喪失活性之傾向。胜肽係具有相對較小的尺寸,從而容易通過腎臟。於是,為了維持含括胜肽作為醫藥活性成分之藥物的血中水平及效力,必須對患者頻繁地投予該胜肽藥物。然而,該胜肽藥物通常係以可注射製劑之形式進行投予,而該種用以維持該生理活性胜肽的血中水平之頻繁的投予會對患者造成劇烈的疼痛。已有許多嘗試來解決此等問題,包括:藉由增加該胜肽藥物的生物膜穿透性而透過經口或經鼻吸入將胜肽藥物輸送入體內;將對蛋白酶敏感之特定胺基酸序列進
行修飾以使該胜肽安定化並防止受蛋白酶降解(例如對GLP-1胺基酸序列進行修飾以防止因二肽基肽酶而喪失效力等);將諸如聚乙二醇(PEG)等具有較高溶解度之聚合物材料化學加成至胜肽之表面;以及使用重組融合技術製備生理活性多肽及人類血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)之融合蛋白。
然而,製備融合蛋白之問題在於該聚合物非特異性結合至該生理活性胜肽會阻擋該胜肽的活性結構域而降低該胜肽的活性,因而為了防止非特異性結合會降低製備產率,進行區位特異性結合或需要對該生理活性胜肽進行人為操作。
為了解決無效率製備該生理活性多肽及該非肽基聚合物之接合物之問題,已有嘗試將在該生理活性多肽接合物中之該生理活性多肽的特異性區位以非肽基聚合物進行修飾(韓國專利第10-1164453號)。再者,在藉由使用具有二個官能基之非肽基聚合物製備生理活性多肽及人類血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)之融合蛋白之情況,已嘗試許多方法來增加製備產率。
本發明者等人持續進行研究,並發現在非肽基聚合物與生理活性多肽間之第一次接合反應後,藉由選擇性沉澱分離未反應(未接合)之生理活性多肽,並接著使其進行第二次反應而以高產率及高純度製造非肽基聚合物-生理活性多肽接合物,以及使用該接合物以高產率及高純度製造生理活性多肽-生理活性載體接合物,從而完
成本發明。
本發明之目的係提供一種製備生理活性多肽接合物的方法,該方法係包括:1)自反應混合物中選擇性沉澱未接合至非肽基聚合物之生理活性多肽,該反應係將該非肽基聚合物接合至該生理活性多肽之胺基酸殘基;以及2)使自沉澱物中回收之該生理活性多肽在步驟1)之接合反應下與該非肽基聚合物進行反應。
本發明之另一目的為提供一種製備生理活性多肽及生理活性載體之接合物的方法,該方法係包含經由共價鍵將如上述所製備之該生理活性多肽接合物與生理活性載體進行接合以製備多肽-載體接合物,其中,在該多肽-載體接合物中,該非肽基聚合物之兩端係分別接合至該生理活性載體及該生理活性多肽。
為了達成上述目的,本發明之一態樣係提供一種製備生理活性多肽接合物的方法,該方法係包括:
1)自反應混合物中選擇性沉澱未接合至非肽基聚合物之生理活性多肽,該反應係將該非肽基聚合物接合至該生理活性多肽之胺基酸殘基;以及2)使自沉澱物中回收之該生理活性多肽在步驟1)之接合反應下與該非肽基聚合物進行反應。
本發明之一特定具體例係提供該製備方法,其中,將該經沉澱之生理活性多肽進行溶解並接著接合至非肽基聚合物。
本發明之另一特定具體例係提供該製備方法,其中,在步驟1)中之該反應混合物包括以該混合物的總重量為基準計,10重量%或更多的未結合有該非肽基聚合物之生理活性多肽。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,在步驟1)中之選擇性沉澱係使用有機溶劑施行。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該有機溶劑為異丙醇。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,在步驟1)中之該反應混合物係以該反應混合物體積之2體積或更多的異丙醇進行處理。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,在步驟1)中之該反應混合物係以該反應混合物體積之3至7體積的異丙醇進行處理。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,在步驟2)中,該經回收之生理活性多肽係與該非肽基聚合物進行反應0.5小時至4小時。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該生理活性多肽係選自下列者所組成之群組:胰島素分泌肽、凝血因子、消化促進激素、胰島素、調酸素(oxyntomodulin)、升糖素、腎上腺皮質激素、甲狀腺激
素、腸激素、細胞介素、酵素、生長因子、神經肽、腦下垂體激素、下視丘激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、以及具生理活性之非天然胜肽衍生物。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該生理活性多肽係選自下列者所組成之群組:紅血球生成素、顆粒球-群落刺激因子、澱粉素(amylin)、體抑素(somatostatin)、肽YY(PYY)、神經肽Y(NPY)、血管收縮素、緩激肽、抑鈣素、促皮質素、章魚涎肽(eledoisin)、胃泌素、瘦素(leptin)、催產素、血管加壓素、黃體成長激素、黃體分泌激素、濾泡刺激激素、副甲狀腺激素、胰泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放肽、顆粒球群落刺激因子(GCSF)、干擾素(IFN)、介白素、泌乳素釋放肽、食慾素、甲狀腺釋放肽、膽囊收縮素、胃泌素抑制肽、調鈣素、胃泌素釋放肽、腸動素(motilin)、血管活性腸肽、心房利尿鈉肽(ANP)、腦部利尿鈉肽(BNP)、C型利尿鈉肽(CNP)、神經激肽A、神經介素(neuromedin)、腎素、內皮素、角蝰毒素肽(sarafotoxin peptide)、酪啡肽、皮啡肽(dermorphin)、強啡肽(dynorphin)、腦內啡、腦啡肽、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、尿激酶受體、腫瘤抑制物、膠原蛋白酶抑制劑、促胸腺生成素(thymopoietin)、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺肽(tymosin)、胸腺體液因子、腎上腺髓質素(adrenomodullin)、咽側體抑制素(allatostatin)、澱粉樣β-蛋白片段、抗細菌肽、抗氧化肽、鈴蟾素(bombesin)、
骨鈣素(osteocalcin)、CART肽、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、白細胞激肽、Kringle-5、層黏連蛋白、抑制素、甘丙胺素(galanin)、纖維黏連蛋白、胰抑素、以及恩夫韋肽(fuzeon)。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該生理活性多肽為艾塞那肽(exendin)、胰島素、艾塞那肽衍生物、胰島素衍生物或其組合。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該艾塞那肽衍生物係選自下列者所組成之群組:去-胺基-組胺醯基(DA)-艾塞那肽-4、β-羥基-咪唑-丙醯基(HY)-艾塞那肽-4、咪唑-乙醯基(CA)-艾塞那肽-4、以及二甲基-組胺醯基(DM)-艾塞那肽-4。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物係接合至作為生理活性多肽之艾塞那肽或其衍生物之Lys27。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物係接合至作為生理活性多肽之胰島素、胰島素類似物β鏈或其衍生物之N-端。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物係選自下列者所組成之群組:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、以及其組合。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物為聚乙二醇。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物包括至少一種選自下列者所組成之群組之反應性基團:醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基、以及琥珀醯亞胺衍生物。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物具有醛基作為反應性基團。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該醛基為丙醛基。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該非肽基聚合物具有500Da至100,000Da之分子量。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其係進一步包括在步驟2)後分離該生理活性多肽接合物。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該分離係使用離子交換層析施行。
本發明之再一特定具體例係提供該製備方法,其中,該離子交換層析為高壓離子交換層析。
本發明之另一態樣係提供製備生理活性多肽及生理活性載體之接合物(生理活性多肽-生理活性載體、多肽-載體接合物)的方法。此方法係包括藉由共價鍵將該生理活性載體與如上述所製備之該生理活性多肽接合
物進行接合,從而製備接合物(生理活性多肽-生理活性載體、多肽-載體接合物),其中,該非肽基聚合物之兩端係分別接合至該生理活性載體及該生理活性多肽。
本發明之一特定具體例係提供該製備方法,其中,該生理活性載體係選自下列者所組成之群組:白蛋白、免疫球蛋白Fc區、運鐵蛋白、適體、毒素、明膠、膠原蛋白、葡聚糖、多醣、脂肪酸、以及纖維蛋白原。
本發明之另一特定具體例係提供該製備方法,其中,該生理活性載體為免疫球蛋白Fc區。
本發明之製備方法係藉由透過選擇性沉澱之二步驟反應而用於以高產率製造非肽基聚合物-生理活性多肽接合物以及生理活性多肽-生理活性載體接合物,因此,該方法可用於開發以相對高水平維持活體內活性且具有明顯增加的血中半衰期之各種胜肽藥物之長效調配物。
第1圖係已知的聚乙二醇化以及應用選擇性沉澱而增進聚乙二醇化之示意圖;第2圖係藉由使用SOURCE S管柱純化聚乙二醇化產物所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該聚乙二醇化產物係藉由於15mg/mL之濃度使咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4進行聚乙二醇化3小時而製備;第3圖係藉由使用SP-HP管柱純化聚乙二
醇化產物所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該聚乙二醇化產物係藉由於5mg/mL之濃度使胰島素類似物進行聚乙二醇化2小時而製備;第4圖係顯示藉由以異丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮及乙腈處理聚乙二醇化產物而進行選擇性沉澱所獲得之含有水溶液及沉澱物的混合物之SDS-PAGE分析之結果,其中,該聚乙二醇化產物係藉由於15mg/mL之濃度使咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4進行聚乙二醇化3小時而製備;第5圖係顯示藉由以異丙醇、乙醇、1-丙醇、丙酮及乙腈處理聚乙二醇化產物而進行選擇性沉澱所獲得之含有水溶液及沉澱物的混合物之SDS-PAGE分析之結果,其中,該聚乙二醇化產物係藉由於5mg/mL之濃度使胰島素類似物進行聚乙二醇化2小時而製備;第6圖係藉由使用SOURCE S(LRC,15×161mm,28mL,PALL)管柱純化水溶液所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該水溶液係藉由在以異丙醇處理聚乙二醇化產物後去除沉澱物而獲得,且該聚乙二醇化產物係藉由於15mg/mL之濃度使咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4進行聚乙二醇化3小時而獲得;第7圖係藉由使用SOURCE S管柱純化沉澱物聚乙二醇化產物所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該沉澱物係藉由以異丙醇處理聚乙二醇化產物而製備,且該聚乙二醇化產物係藉由於15mg/mL之濃度使咪
唑-乙醯基-艾塞那肽-4進行聚乙二醇化3小時而獲得;第8圖係藉由使用SOURCE S管柱純化聚乙二醇化產物及沉澱物之聚乙二醇化之產物所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該沉澱物係藉由選擇性沉澱而製備;第9圖係以SP-HP(Hitrap,各5mL×4,20mL,GE Healthcare)管柱自以異丙醇處理聚乙二醇化產物後去除沉澱物而得之水溶液所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該聚乙二醇化產物係藉由於5mg/mL之濃度使胰島素類似物進行聚乙二醇化2小時而獲得;第10圖係藉由使用SP-HP管柱純化沉澱物聚乙二醇化產物所獲得之位置異構物之純化圖譜,其中,該沉澱物係藉由以異丙醇處理聚乙二醇化產物而製備,且該聚乙二醇化產物係藉由於5mg/mL之濃度使胰島素類似物進行聚乙二醇化2小時而獲得;第11圖係顯示應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所增進的產率之圖表,其係以已知的聚乙二醇化方法之百分率表示;第12圖係使用逆相管柱分析實施例1之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(CA-艾塞那肽-4-PEG)接合物的純度之結果;第13圖係使用逆相管柱分析實施例7之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG接合物的純度之結果;第14圖係藉由胜肽定位之實施例1之咪
唑-乙醯基-艾塞那肽-4之Lys27-經聚乙二醇化之位置異構物之分析圖譜;第15圖係藉由胜肽定位之實施例7之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之Lys27-經聚乙二醇化之位置異構物之分析圖譜;第16圖係使用逆相管柱分析實施例1之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG-免疫球蛋白Fc接合物的純度之結果;第17圖係使用逆相管柱分析實施例7之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG-免疫球蛋白Fc接合物的純度之結果;第18圖係顯示藉由應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG-免疫球蛋白Fc(免疫球蛋白Fc-CA-艾塞那肽-4-PEG(Lys27))接合物與藉由已知的聚乙二醇化方法所製備之接合物間之產率比較之圖表;第19圖係顯示檢驗應用選擇性沉澱(異丙醇處理)前之狀態之胜肽定位之結果;第20圖係顯示檢驗應用選擇性沉澱(異丙醇處理)後之狀態之胜肽定位之結果;第21圖係顯示在應用選擇性沉澱(異丙醇處理)(IPA:異丙醇)前後之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4在一級結構序列上之變化;第22圖係顯示在應用選擇性沉澱(異丙醇
處理)(IPA:異丙醇)前後之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4在二級結構上之變化;以及第23圖係顯示在應用選擇性沉澱(異丙醇處理)(IPA:異丙醇)前後藉由cAMP試驗測定咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的活體內活性之結果。
本發明之一態樣係提供一種製備生理活性多肽接合物的方法,該方法係包括:
1)自反應混合物中選擇性沉澱未接合至非肽基聚合物之生理活性多肽,該反應係將該非肽基聚合物接合至該生理活性多肽之胺基酸殘基;以及2)使自沉澱物中回收之該生理活性多肽在步驟1)之接合反應下與該非肽基聚合物進行反應。
在本文中使用時,術語「生理活性多肽接合物」係指其中生理活性多肽係共價連接至非肽基聚合物一端之物質。在本發明中,生理活性多肽接合物可與非肽基聚合物-生理活性多肽接合物交換使用。
本發明之步驟1)之特徵係在於自(第一次)接合反應混合物中選擇性沉澱未結合有非肽基聚合物之生理活性多肽。此(第一次)接合反應較佳係選擇性地,更佳係區位特異性地將非肽基聚合物接合至生理活性多肽。在本發明中,「未結合有非肽基聚合物之生理活性多肽」可與「未反應之生理活性多肽」或「未接合之生理活性多肽」交換使用。
在本文中使用時,術語「區位特異性」意指非肽基聚合物特異性鍵結至所欲之胺基酸位置,具體而言,係鍵結至生理活性多肽之胺基酸位置中離胺酸殘基或N-端殘基之胺。當區位特異性地連接非肽基聚合物時,可保護所製備之長效調配物之生理活性達到最大,並免於可歸因於其他較不欲之接合物(例如其中非肽基聚合物鍵結至對生理活性而言重要的胺基酸殘基者)的存在之生理活性上之降低。舉例而言,在艾塞那肽-4之情況,當非肽基聚合物鍵結至生理活性多肽之N-端時,活體外活性係降低。相反地,當非肽基聚合物鍵結至其離胺酸殘基時,活體外活性係受到維持。具體而言,在艾塞那肽-4之位置12及27之離胺酸殘基中,當非肽基聚合物鍵結至在位置27之離胺酸殘基時,所得之接合物係顯示出較高的活體外活性。
故而,在本發明之一具體例中,其中,生理活性多肽為艾塞那肽或艾塞那肽衍生物,非肽基聚合物可區位特異性地鍵結至在艾塞那肽或艾塞那肽衍生物之位置12或27之離胺酸,具體而言,係位置27之離胺酸,但本發明並不限定於此。艾塞那肽之聚乙二醇化方法係詳述於韓國專利公開案第10-2010-0105494號,其係以參考資料之方式併入本文中。
在本文中使用時,術語「選擇性沉澱」意指非肽基聚合物及生理活性多肽的混合物之接合反應所得之非肽基聚合物-生理活性多肽接合物係保留在水溶液
中,但未反應之生理活性多肽則係選擇性沉澱。
在本發明中,選擇性沉澱可為任意方法,並無限定,只要其能夠使反應混合物中之未反應之生理活性多肽發生沉澱即可。為了例示目的,廣知的多肽沉澱方法之若干實例係如下:1. 鹽析;2. 等離子沉澱;3. 二碳(C2)有機共溶劑沉澱;4. C4及C5有機共溶劑沉澱、分相、以及多肽之萃取;5. 多肽排除及擁擠劑(中性聚合物)以及滲透物;6. 合成及半合成聚電解質沉澱;7. 金屬及多酚雜多陰離子沉澱;8. 疏水離子配對(HIP)絡合配位體;9. 基質堆積配位體共沉澱;10. 二及三價金屬陽離子沉澱。
選擇性沉澱可使用各種所列之方法或其適當組合。
特定而言,可藉由將有機溶劑添加至反應混合物中而對未反應之生理活性多肽進行選擇性沉澱,但不限定於此。再者,特定而言,有機溶劑可為醇、酮、腈或其組合,更特定而言,乙醇、異丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈、或其組合,但不限定於此。再者,反應混合物可以反應混合物體積之2體積或更多,特定而言2至7體積,更特定而言3至7、4至7、或5至7體積,再
更特定而言3至7體積的有機溶劑進行處理以便對未反應之生理活性多肽進行選擇性沉澱,但不限定於此。
在本發明中,用於選擇性沉澱之反應混合物可包括以該反應混合物的總重量為基準計,10重量%或更多,特定而言20重量%或更多的未反應之或未接合之生理活性多肽,但不限定於此。
在本文中使用時,術語「生理活性胜肽」係指意圖在人體中顯現出生理活性之物質。在本發明中,生理活性胜肽可為任何能夠顯現出生理活性之胜肽。舉例而言,生理活性胜肽可選自下列者所組成之群組:胰島素分泌肽、凝血因子、消化促進激素、升糖素、胰島素、調酸素、腎上腺皮質激素、甲狀腺激素、腸激素、細胞介素、酵素、生長因子、神經肽、腦下垂體激素、下視丘激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、以及具生理活性之非天然胜肽衍生物,但不限定於此。
再者,生理活性胜肽可選自下列者所組成之群組:紅血球生成素、顆粒球-群落刺激因子、澱粉素、體抑素、肽YY(PYY)、神經肽Y(NPY)、血管收縮素、緩激肽、抑鈣素、促皮質素、章魚涎肽、胃泌素、瘦素、催產素、血管加壓素、黃體成長激素、黃體分泌激素、濾泡刺激激素、副甲狀腺激素、胰泌素、舍莫瑞林、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放肽、顆粒球群落刺激因子(GCSF)、干擾素(IFN)、介白素、泌乳素釋放肽、食慾素、甲狀腺釋放肽、膽囊收縮素、胃泌素抑制肽、調鈣素、胃泌素釋放
肽、腸動素、血管活性腸肽、心房利尿鈉肽(ANP)、腦部利尿鈉肽(BNP)、C型利尿鈉肽(CNP)、神經激肽A、神經介素、腎素、內皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、強啡肽、腦內啡、腦啡肽、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、尿激酶受體、腫瘤抑制物、膠原蛋白酶抑制劑、促胸腺生成素、胸腺九肽、胸腺五肽、胸腺肽、胸腺體液因子、腎上腺髓質素、咽側體抑制素、澱粉樣β-蛋白片段、抗細菌肽、抗氧化肽、鈴蟾素、骨鈣素、CART肽、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、白細胞激肽、Kringle-5、層黏連蛋白、抑制素、甘丙胺素、纖維黏連蛋白、胰抑素、以及恩夫韋肽,但不限定於此。
生理活性多肽亦可包括具有多肽的生理活性之多肽的前驅物、衍生物、片段、及變異體。
再者,特定而言,生理活性多肽可為艾塞那肽、GLP-1、胰島素、調酸素、升糖素、及其衍生物、或抑鈣素,但不限定於此。在本發明中,艾塞那肽衍生物可藉由例如對胺基酸殘基上之任意基團進行化學取代(例如α-甲基化或α-羥基化)、缺失(例如去胺化)、或修飾(例如N-甲基化)、或其組合而製備,且艾塞那肽衍生物係詳述於韓國專利公開案第10-2009-0008151號。再者,特定而言,艾塞那肽衍生物可選自下列者所組成之群組:去-胺基-組胺醯基(DA)-艾塞那肽-4、β-羥基-咪唑-丙醯基(HY)-艾塞那肽-4、咪唑-乙醯基(CA)-艾塞那肽-4、以及二甲基-組胺醯基(DM)-艾塞那肽-4,但
不限定於此。
在本文中使用時,術語「非肽基聚合物」係指包括一或多種藉由共價鍵(胜肽鍵除外)彼此連接之重複單元之生物相容性聚合物。
可用於本發明之非肽基聚合物可選自下列者所組成之群組:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、諸如PLA(聚(乳酸))、PVP(聚乙烯吡咯啶酮)、及PLGA(聚乳酸-乙醇酸)之生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、及其組合,特定而言,聚乙二醇,但不限定於此。又,在該項技術中為人所熟知且在該項技術之技能內可輕易製備之其衍生物係含括在本發明之範疇中。
任何非肽基聚合物皆可使用,並無限定,只要其為具有針對活體內蛋白水解酵素之耐受性,因而不會輕易受蛋白水解酵素所裂解而得以使生理活性多肽顯現出充分的活性之聚合物即可。非肽基聚合物具有在0.5kDa至100kDa,特定而言,0.5kDa至20kDa之範圍內之分子量。又,連接至生理活性多肽之本發明之非肽基聚合物可為一種聚合物或不同類型聚合物之組合。
再者,本發明中所使用之非肽基聚合物可在其一端或在其兩端具有反應性基團。在其兩端具有反應性基團之非肽基聚合物可結合至有助於作用為長效調配物之生理活性載體及蛋白質藥物。
特定而言,非肽基聚合物在兩端具有選自下列者所組成之群組之反應性基團:醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基、以及琥珀醯亞胺衍生物,更特定而言,醛基,再更特定而言,丙醛基,但不限定於此。琥珀醯亞胺衍生物可為丙酸琥珀醯亞胺酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺羧甲基、或碳酸琥珀醯亞胺酯。具體而言,當非肽基聚合物在兩端具有反應性醛基時,其係有效的在兩端以最小的非特異性反應與生理活性多肽及生理活性載體進行連接。藉由醛鍵之還原性烷基化所生成之最終產物較以醯胺鍵進行連接者係更加安定。醛反應性基團係於低pH值下,例如於2.0至7.0之pH值,特定而言,於3.0至6.0之pH值,更特定而言,於4.0至6.0之pH值選擇性地結合至胺基N-端。又,醛反應性基團可於高pH值,例如於6.5至9.0之pH值,特定而言,於6.5至8.0之pH值,更特定而言,於6.5至7.5之pH值結合至離胺酸殘基以形成共價鍵。
在本發明中,非肽基聚合物之在兩端之反應性基團可彼此相同或不同。當使用在其兩端具有反應性羥基之聚乙二醇作為非肽基聚合物時,可藉由已知的化學反應將羥基活化成各種反應性基團,或者可使用市面上可取得之具有經修飾之反應性基團之聚乙二醇。
在本發明之具體實例中,非肽基聚合物為具醛端基之聚乙二醇且步驟1)之接合反應為區位特異性聚乙二醇化。此區位特異性聚乙二醇化可藉由該項技術中已
知的方法,例如對胺基(諸如生理活性多肽之離胺酸之ε-胺基或N-端)進行還原性胺化而施行。
在本文中使用時,術語「生理活性多肽接合物」係指其中生理活性多肽係共價連接至非肽基聚合物之一端之物質。在本發明中,生理活性多肽接合物可與非肽基聚合物-生理活性多肽接合物交換使用。
再者,在本發明之生理活性多肽及非肽基聚合物之反應中,反應莫耳比並無限定,只要生理活性多肽及非肽基聚合物形成共價鍵即可,生理活性多肽:非肽基聚合物之反應莫耳比可適宜地在1:1至1:30之範圍內。
再者,在本發明之生理活性多肽及非肽基聚合物之反應中,反應時間並無限定,只要生理活性多肽及非肽基聚合物形成共價鍵即可,特定而言,反應時間可為0.5小時至4.0小時,更特定而言,0.5小時至2.0小時,但不限定於此。
再者,在本發明之生理活性多肽及非肽基聚合物之反應中,反應溫度並無限定,只要生理活性多肽及非肽基聚合物形成共價鍵即可,特定而言,反應溫度可為0℃至14℃或15℃至30℃,更特定而言,4℃至8℃或20℃至25℃,但不限定於此。
再者,在本發明之生理活性多肽及非肽基聚合物之反應中,生理活性多肽的濃度並無限定,只要生理活性多肽及非肽基聚合物形成共價鍵即可,特定而言,濃度可為1mg/mL至25mg/mL,更特定而言,5mg/
mL至18mg/mL,但不限定於此。
在一具體例中,本發明係提供一種製備生理活性多肽接合物的方法,其中,經修飾之艾塞那肽-4係連接至聚乙二醇(PEG)。在本發明之更特定具體例中,此經修飾之艾塞那肽-4為咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4)且其可於4℃至8℃及20℃至25℃在6.5至7.5之pH值下含有20mM氰基硼氫化鈉(SCB,NaCNBH3)作為還原劑之100mM HEPES緩衝溶液中,使用兩端具醛官能性之3.4kDa聚乙二醇(例如3.4K ALD(2)PEG)以約1:7.5之胜肽及PEG之莫耳比及約5mg/mL至18mg/mL之胜肽濃度,在其Lys位置進行聚乙二醇化0.5小時至4.0小時。特定而言,可將15mg/mL的胜肽於4℃至8℃進行反應3小時,接著可使用SOURCE 15S管柱以KCl之線性濃度梯度在pH 2.0之檸檬酸緩衝溶液中,自各反應混合物分離咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG。舉例而言,本發明者等人能夠確認該種反應混合物包括約10%至40%的(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)、40%至50%的咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG、以及約20%至50%的未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(表1及2)。
在另一具體例中,本發明係提供一種製備生理活性多肽接合物的方法,其中,胰島素類似物係連接至聚乙二醇(PEG)。該胰島素類似物可於4℃至8℃及20℃至25℃在pH值為4.0至6.0的含有3至5mM SCB(NaCNBH3)
作為還原劑之50mM檸檬酸鈉緩衝溶液中,使用3.4K ALD(2)PEG以約1:4之胜肽及PEG之莫耳比及約5mg/mL至18mg/mL之胜肽濃度在其β鏈之N-端進行聚乙二醇化0.5小時至4.0小時。特定而言,可將5mg/mL的胜肽於4℃至8℃進行反應2小時,接著可使用SP-HP管柱以KCl之線性濃度梯度在pH 3.0之檸檬酸緩衝溶液中,自各反應混合物中分離胰島素類似物。舉例而言,本發明者等人能夠確認該種反應混合物包括約10%至20%的(PEG)n-胰島素類似物、50%至60%的胰島素類似物-PEG、以及約5%至20%的未反應之胰島素類似物。
在本發明之再一特定具體例中,用於上述CA-艾塞那肽-4或該胰島素類似物之經聚乙二醇化接合物之反應混合物係與(相對於反應混合物體積而言)2或更多體積,特定而言,3至7體積的異丙醇進行反應。接著將此經異丙醇處理之反應混合物分成包含(咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4或該胰島素類似物之)經聚乙二醇化接合物之水溶液以及未接合之生理活性多肽之沉澱物,即,未經聚乙二醇化之未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4或未反應之胰島素類似物(第4及5圖)。舉例而言,該水溶液係經純化(第6及9圖),就結果而言,本發明者等人能夠確認該水溶液包括約10%至40%的(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)、約40%至50%的咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG、以及約5%至15%的未反應之咪唑-乙醯基-艾塞
那肽-4。在胰島素類似物之情況,該水溶液包括約10%至20%的(PEG)n-胰島素類似物、50%至60%的胰島素類似物-PEG、以及約5%至15%的未反應之胰島素類似物。
經分離之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物的含量為15%至30%(表3)。
在本發明之一特定具體例中,係在異丙醇處理之前後觀察咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之變化。就結果而言,在異丙醇處理之前後在所有態樣中皆無變化(第19及20圖),且在一級結構(第21圖)、二級結構的含量(第22圖及表7)、及活性(第23圖及表8)上皆無變化。此等結果表明藉由以異丙醇處理之選擇性沉澱不會對生理活性多肽咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4造成不良影響。
在本發明中,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG可與咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys27)、咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(Lys27)-PEG、CA-艾塞那肽-4-PEG、及CA-艾塞那肽-4-PEG(Lys27)交換使用。
本發明之步驟2)之特徵係使用在步驟1)中自沉澱物中回收之該生理活性多肽,使第二次反應混合物將生理活性多肽及非肽基聚合物進行接合以製備非肽基聚合物-生理活性多肽接合物。特定而言,可將經沉澱之生理活性多肽進行溶解,接著較佳係選擇性地,更佳係區位特異性地接合至非肽基聚合物,但不限定於此。藉由對第二次反應混合物及第一次反應混合物應用選擇性沉澱所製備之水溶液係含括所製備之非肽基聚合物-生理活性多肽
接合物。
在本發明中,經沉澱之生理活性多肽及非肽基聚合物之反應條件並無限定,只要其能夠形成共價形式即可,特定而言,反應可在步驟1)之反應條件下施行。
具體而言,經沉澱之生理活性多肽及非肽基聚合物之反應時間特定而言可為,0.5小時至4.0小時,更特定而言,0.5小時至2.0小時,但不限定於此。
在本發明之一特定具體例中,係將在實施例3中經異丙醇處理之選擇性沉澱所分離之約20%至30%的咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物進行回收再利用並施行聚乙二醇化。就結果而言,當將未聚乙二醇化之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物之再聚乙二醇化溶液進行純化時,在反應溶液中包括約15%至40%的(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)、40%至50%的咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG、以及約10%至40%的未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(第7圖)。
本發明之製備方法可進一步包括在步驟2)後分離生理活性多肽接合物。此程序可使用該項技術中已知的各種分離方法(諸如層析)施行。特定而言,可使用離子交換層析,更特定而言,高壓離子交換層析,但不限定於此。
在本發明中,可自第一次反應混合物、藉由對第一次反應混合物應用選擇性沉澱所製備之水溶液、
第二次反應混合物、或其組合中分離生理活性多肽接合物。
具體而言,當自對第一次反應混合物應用選擇性沉澱所製備之水溶液及使用經沉澱之生理活性多肽所製備之第二次反應混合物的混合物中分離生理活性多肽接合物時,生理活性多肽接合物的產率相較於自第一次反應混合物中進行分離者係明顯增加。
在本發明之一特定具體例中,係將對第一次反應混合物應用選擇性沉澱所製備之水溶液與藉由再溶解含有未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4或胰島素類似物之沉澱物所製備之第二次反應混合物加以混合並施行聚乙二醇化,接著使用SOURCE 15S管柱或SP-HP管柱以KCl之線性濃度梯度在pH 2.0至pH 3.0之檸檬酸緩衝液中施行分離。就結果而言,應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之接合物的產率係遠高於已知的聚乙二醇化方法(第11圖及表4)。
在本發明之一特定具體例中,藉由已知的聚乙二醇化方法以及應用使用異丙醇之選擇性沉澱之聚乙二醇化方法,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4皆具有97%之純度,且經聚乙二醇化之位置異構物具有相似純度(表5)。
再者,本發明之另一態樣係提供製備生理活性多肽-生理活性載體接合物的方法,該方法包括藉由在上述之生理活性多肽接合物的製備方法所製備之生理活性多肽接合物中以共價鍵連結非肽基聚合物及生理活性載體以製備接合物,其中,非肽基聚合物之兩端係分別接合
至生理活性載體及生理活性多肽。
在本發明之一特定具體例中,藉由透過選擇性沉澱之二步驟區位特異性聚乙二醇化所製備之生理活性多肽接合物係以高產率及高純度製造生理活性多肽-生理活性載體接合物(多肽-載體接合物)。該種生理活性多肽-生理活性載體接合物相較於其所衍生出之生理活性多肽接合物而言係顯示出完全不同的活性,即,卓越的生理活性(諸如優異且長期持續的生理活性多肽之藥理作用)、對特異性區位(諸如所欲治療之病灶)的靶向、或誘發壞死。
在本發明中,在生理活性多肽-生理活性載體接合物中之非肽基聚合物應為具有兩端之非肽基聚合物,以便結合至生理活性多肽及生理活性載體。亦即,生理活性載體可共價連接至未結合有生理活性多肽接合物之非肽基聚合物之端。就結果而言,係製備其中非肽基聚合物之兩端分別連接至生理活性多肽及生理活性載體之生理活性多肽-生理活性載體接合物。
在本文中使用時,術語「生理活性載體」係指顯示出有別於生理活性多肽的生理活性之額外活性之生理活性物質,其可藉由結合至與生理活性多肽連在一起之非肽基多肽而保持生理活性多肽的生理活性(諸如藥理作用)、或誘發對特異性區位的靶向或壞死。
在本發明中所使用之生理活性載體可包括具有前述活性之物質,並無任何限定,例如白蛋白、免疫球蛋白Fc區、運鐵蛋白、適體、毒素、明膠、膠原蛋白、
葡聚糖、多醣、脂肪酸、纖維蛋白原等。特定而言,生理活性載體可為白蛋白、免疫球蛋白Fc區、或運鐵蛋白,更特定而言,免疫球蛋白Fc區,但不限定於此。
本發明之免疫球蛋白Fc區係指免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3),排除重鏈及輕鏈之可變區、重鏈恆定區1(CH1)、及輕鏈恆定區1(CL1)。其可進一步包括在重鏈恆定區之鉸鏈區。又,本發明之免疫球蛋白Fc區可為含有部分或所有Fc區並包括重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1),且重鏈及輕鏈之可變區除外之延伸型,只要其具有實質上類似於或優於天然的免疫球蛋白Fc之生理功能即可,且可包括經磷酸化、硫酸化、丙烯醯化、醣化、甲基化、法尼基化(famesylation)、乙醯化、醯胺化等修飾之免疫球蛋白Fc區。免疫球蛋白Fc之範圍、其製備方法、及將免疫球蛋白Fc共價連接至非肽基聚合物-生理活性多肽接合物的方法係詳細揭示於韓國專利第10-775343、10-725314、10-725315、及10-824505號,其係以參考資料之方式併入本文中。
在本發明之一具體例中,其中,在多肽接合物中非肽基聚合物係區位特異性地連接至生理活性多肽之特定胺基酸,非為該生理活性多肽接合物之其他接合物的生成係減到最低。此係有益於生理活性及增加具有藥理價值之生理活性多肽接合物的產率。
在本發明之一特定具體例中,係將藉由已知的聚乙二醇化方法以及包括使用異丙醇之選擇性沉澱之
聚乙二醇化方法所製備之各咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(Lys27)-PEG接合物連接至人類免疫球蛋白Fc片段,並分析咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc的純度及產率。就結果而言,兩種接合物皆具有27.6%之相同純度(表5),但藉由包括選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物相較於藉由已知的方法所製備之接合物係顯示出較高的產率。
在本發明中,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白FC可與CA-艾塞那肽-4-PEG-免疫球蛋白Fc或免疫球蛋白FC-CA-艾塞那肽-4-PEG(Lys27)交換使用。
下文中,將參照下列實施例更詳細說明本發明。
然而,此等實施例僅用於例示目的,本發明並未意圖受此等實施例所限定。
實施例1. 咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的聚乙二醇化及位置異構物的分離
使用3.4K ALD(2)PEG(具有二個醛基之3.4kDa PEG,NOF,Japan)施行對咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4,Bachem,美國)之Lys之聚乙二醇化。
為了使用3.4K ALD(2)PEG對咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之Lys位置進行聚乙二醇化,使該胜肽及PEG依約
1:3至1:30之莫耳比以約5mg/mL至18mg/mL之胜肽濃度於4℃至8℃及20℃至25℃進行反應0.5小時至4.0小時。就此方面而言,使反應在6.5至7.5之pH值且添加有還原劑SCB(NaCNBH3)20至30mM之100mM HEPES緩衝溶液中進行。特定反應條件及藉由下列方法之分離結果係示於下列表1及2。詳細而言,使其以約15mg/mL之胜肽濃度於4℃至8℃進行反應3小時,並將藉由下列方法之分離結果示於第2圖。
使用SOURCE 15S管柱以KCl之線性濃度梯度在pH 2.0至4.0之檸檬酸緩衝溶液中,自各反應溶液中之製程相關雜質(諸如多重聚乙二醇化形式及未反應之形式(在下表中表示為(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4))中分離咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG。
就結果而言,較早洗提出(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4及咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)之尖峰,接著洗提出Lys27-經聚乙二醇化之尖峰,並在最後部分洗提出未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之尖峰(第2圖)。再者,(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)的含量為約10%至40%,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG的含量為約40%至50%,未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的含量為約10%至50%。
實施例2. 胰島素類似物的聚乙二醇化位置異構物的分離
使用3.4K ALD(2)PEG施行在胰島素類似物(WO2014-133324,Hanmi Pharmaceutical Co.,Ltd,韓國)β鏈之N-端之聚乙二醇化。
為了使用3.4K ALD(2)PEG對胰島素類似物之N-端位置進行聚乙二醇化,使該胜肽及PEG依約1:4之莫耳比於約5mg/mL至18mg/mL之胜肽濃度於4℃至8℃及20℃至25℃進行反應0.5小時至4.0小時。就此方面而言,使反應在pH值為4.0至6.0之添加有還原劑SCB(NaCNBH3)3至5mM之50mM檸檬酸鈉緩衝溶液中進行。詳細而言,使其以約5mg/mL之胜肽濃度於4℃至8℃進行反應2小時,並將藉由下列方法之分離結果示於第3圖。
使用SP-HP管柱以KCl之線性濃度梯度於pH 2.0至4.0之檸檬酸緩衝溶液中自各反應溶液中分離胰島素類似物-PEG。
就結果而言,較早洗提出(PEG)n-胰島素類似物之尖峰,接著洗提出N-端經聚乙二醇化之尖峰,並在最後部分洗提出未反應之胰島素類似物之尖峰(第3圖)。再者,(PEG)n-胰島素類似物的含量為約10%至20%,胰島素類似物-PEG的含量為約50%至60%,未反應之胰島素類似物的含量為約5%至20%。
實施例3. 咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的聚乙二醇化及使用有機溶劑之選擇性沉澱之未經聚乙二醇化之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的分離
使用3.4K ALD(2)PEG施行在咪唑-乙醯基-艾塞那
肽-4(CA-艾塞那肽-4,Bachem,美國)之Lys位置之聚乙二醇化。
反應條件係與在實施例1中相同。將聚乙二醇化溶液以反應溶液體積之2體積或更多,特定而言,3至7體積的異丙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈進行處理。自經有機溶劑處理之反應溶液中,分離經聚乙二醇化之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4水溶液及未經聚乙二醇化之未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物(第4圖)。此等之中,該水溶液係以與實施例1中相同之方式進行純化(第6圖),並將各經純化部分的含量示於下表3。
在該水溶液中,(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)的含量為約10%至40%,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG的含量為約40%至50%,未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的含量為約5%至15%。再者,經分離之咪唑-乙醯基-
艾塞那肽-4沉澱物的含量為15%至30%(表3)。
實施例4. 胰島素類似物的聚乙二醇化及使用有機溶劑之選擇性沉澱之未經聚乙二醇化之胰島素類似物的分離
使用3.4K ALD(2)PEG(具有二個醛基之PEG,NOF,日本)施行在胰島素類似物(Hanmi Pharmaceutical Co.,Ltd,韓國)β鏈之N-端之聚乙二醇化。
反應條件係與在實施例2中相同。將聚乙二醇化溶液以反應溶液體積之2體積或更多,特定而言,3至7體積的異丙醇、乙醇、1-丙醇、丙酮、乙腈進行處理。自經有機溶劑處理之反應溶液中,分離經聚乙二醇化之胰島素類似物溶液及未經聚乙二醇化之未反應之胰島素類似物沉澱物(第5圖)。此等之中,該水溶液係以與實施例2中相同之方式進行純化(第9圖)。
實施例5. 未經聚乙二醇化之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之選擇性沉澱物的再聚乙二醇化及位置異構物的分離
使用3.4K ALD(2)PEG(具有二個醛基之PEG,NOF,日本)施行在咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4,Bachem,美國)之Lys位置之聚乙二醇化,並以與實施例3中相同之方式對使用異丙醇之選擇性沉澱所分離之約20%至30%的咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物進行回收再利用並進行聚乙二醇化。
為了使用3.4K ALD(2)PEG對咪唑-乙醯基-艾塞那
肽-4沉澱物之Lys進行聚乙二醇化,使咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物及PEG依1:7.5之莫耳比於20℃至25℃於再溶解咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物之溶液約15mg/mL之濃度進行反應0.5小時至2.0小時。就此方面而言,使反應於pH值為7.5之添加有還原劑SCB(NaCNBH3)20mM之100mM HEPES緩衝溶液中進行。以與實施例1中相同之方式施行純化。純化未經聚乙二醇化之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4沉澱物之再聚乙二醇化溶液之結果係顯示出(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG(Lys12)的含量為約15%至40%,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG的含量為40%至50%,未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的含量為約10%至40%(第7圖),其係與初次聚乙二醇化結果相似(表2)。
實施例6. 未經聚乙二醇化之胰島素類似物之選擇性沉澱物的再聚乙二醇化及位置異構物的分離
使用3.4K ALD(2)PEG施行在胰島素類似物(Hanmi Pharmaceutical Co.,Ltd,韓國)β鏈之N-端之聚乙二醇化,並以與實施例4中相同之方式對使用異丙醇之選擇性沉澱所分離之約0.5%至10%的沉澱物進行回收再利用並進行聚乙二醇化。
為了使用3.4K ALD(2)PEG對胰島素類似物沉澱物之N-端進行聚乙二醇化,使胰島素類似物沉澱物及PEG依1:4之莫耳比於4℃至8℃於再溶解胰島素類似物沉澱物
之溶液約5至18mg/mL之濃度進行反應0.5小時至4.0小時。就此方面而言,使反應於pH值為4.0至6.0之添加有還原劑SCB(NaCNBH3)3至5mM之50mM檸檬酸鈉緩衝溶液中進行。以與實施例2中相同之方式施行純化。純化未經聚乙二醇化之沉澱物之再聚乙二醇化溶液之結果係顯示出(PEG)n-胰島素類似物的含量為約0%至15%,胰島素類似物-PEG的含量為20%至40%,未反應之胰島素類似物的含量為約30%至45%(第10圖)。
實施例7. 自經聚乙二醇化之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4水溶液及經再聚乙二醇化之沉澱物的混合物中分離位置異構物後之產率
使用3.4K ALD(2)PEG施行在咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4,Bachem,美國)之Lys位置之聚乙二醇化。以與實施例1中相同之方式施行反應,並以與實施例3中相同之方式使反應溶液進行以異丙醇處理之選擇性沉澱。以與實施例5中相同之方式使所得之沉澱物進行再聚乙二醇化。將經異丙醇處理之水溶液及經再聚乙二醇化之沉澱物進行混合並以與實施例1中相同之方式進行純化而分離位置異構物(第8圖)。
就結果而言,(PEG)n-咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4+咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(Lys12)-PEG的含量為約25%至30%,咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG的含量為約50%至60%,未反應之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的含量為10%至20%。
再者,將應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG接合物的產率與已知的聚乙二醇化方法進行比較之結果示於第11圖及下述表4。就結果而言,應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG接合物的產率係遠高於已知的聚乙二醇化方法。
實施例8. 分離咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4經聚乙二醇化之位置異構物後之純度
為了檢驗已知的聚乙二醇化方法與包括使用異丙醇之選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4接合物間純度上之差異,使用實施例1及7之經洗提溶液施行逆相(RP)HPLC(第12及13圖)。
就結果而言,根據已知的方法之實施例1及根據應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法之實施例7之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4接合物係顯示出97%之相同純度(表5)。
實施例9. 分離咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4經聚乙二醇化之位置異構物後之Lys-C胜肽定位
為了檢驗PEG在咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之接合部位,將咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4以蛋白酶離胺酸-C進行切割,並藉由逆相層析進行分析。試驗係施行如下:將實施例1及7中所純化之PEG接合物以及咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4以1mg/mL之濃度溶解於三乙胺-HCl緩衝溶液(10mmol/L;pH 7.5)中,接著添加10μL的酵素(0.1mg/mL)而使其於37℃進行反應4小時。在反應結束後,將反應混合物藉由逆相層析進行分析(第14及15圖)。
就結果而言,將根據各反應之經聚乙二醇化之位置異構物的純度示於表5,且實施例1及7之經純化之PEG接合物分別具有相似的純度(表5)。
實施例10. 咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物的製備
為了製備咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物,將實施例1中所獲得之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG接合物與購自Hanmi Pharmaceutical Co.,Ltd之人類免疫球蛋白Fc片段進行接合。使咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(Lys27)-PEG接合物及免疫球蛋白Fc依1:2.5之莫耳比以約10mg/mL之總蛋白質濃度於4℃至8℃進行反應12小時至16小時。反應溶液為pH 8.2之100mM HEPES,且經3% Triton X-100及還原劑NaCNBH3 50mM進行處理。在偶合反應後,偶合反應溶液之逆相HPLC分析之結果(第16圖)係顯示出咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物的純度為27.6%(表5)。
實施例11. 應用選擇性沉澱之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物的製備
將實施例7中所獲得之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4(Lys27)-PEG接合物與購自Hanmi Pharmaceutical Co.,Ltd(韓國)之人類免疫球蛋白Fc片段進行接合。以與實施例10中相同之方式施行偶合,並分析純度。反應溶液之逆相HPLC分析之結果(第17圖)係顯示出其純度為27.6%(表5)。將實施例7之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物之產率增進效果與實施例1之產率進行比較,並將結果示於第18圖及下述表6。就結果而言,藉由應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG接合物的產率係高於已知的方法。故而,可見到當使用應用選擇性沉澱之聚乙二醇化方法所製備之
咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-PEG接合物來製備咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc接合物時,產率係高於已知的聚乙二醇化方法。
實施例12. 用於分析根據應用選擇性沉澱(使用異丙醇)之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的純度之離胺酸-C胜肽定位
為了檢驗經異丙醇處理前後之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4在狀態上之變化,施行離胺酸-C胜肽定位。第19圖係示出在經異丙醇處理前對咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4進行定位之結果,第20圖係示出在應用選擇性沉澱(經異丙醇處理)後對咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4進行定位之結果。就結果而言,在經處理前後並無變化。分析係以與實施例9中相同之方式施行。
實施例13. 用於分析根據應用沉澱(藉由使用異丙醇)之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4的純度之液相層析質譜術(LC-Mass)
為了檢驗在經異丙醇處理前後咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4就一級結構而言之蛋白質序列,施行液相層析質譜
術。就結果而言,在應用選擇性沉澱(異丙醇處理)前後在一級結構上並無變化(第21圖)。
實施例14. 用於分析根據應用沉澱(藉由使用異丙醇)之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之二級結構之圓二色光譜術(CD spectroscopy)
為了檢驗在經異丙醇(IPA)處理前後咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4在二級結構上之變化,施行圓二色光譜術。就結果而言,在應用選擇性沉澱(異丙醇處理)前後在二級結構的含量上並無變化(第22圖及表7)。
實施例15. 在應用選擇性沉澱前後之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之活體外活性的測定
為了測定在經異丙醇處理前後之咪唑-乙醯基-艾塞
那肽-4之長效調配物的功效,測定活體外細胞活性。測定GLP-1之活體外細胞活性的方法係藉由以GLP-1對經選殖GLP-1受體之CHO細胞進行處理來測定細胞內cAMP之增加。
在此試驗中所使用之測定活體外細胞活性的方法係藉由以艾塞那肽-4及測試物質依其不同的濃度對CHO/GLP-1進行處理並接著測定cAMP水平以比較EC50值而施行。作為經異丙醇處理後之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4之對照組,係使用經異丙醇處理前之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4。將測定活體外活性之結果示於第23圖及表8。就結果而言,在經異丙醇處理前後之咪唑-乙醯基-艾塞那肽-4接合物間在活性上並無差異。
基於上述說明,熟習該項技術者將瞭解本
發明可在不改變其技術精神或必要特徵之情形下以不同的特定形式實施。故而,應瞭解上述具體例在所有方面皆並非限制性,而是例示性。本發明之範疇係由所附之申請專利範圍所界定,而並非由在其前之說明內容所界定,因此落入申請專利範圍之界限及範圍內之所有變更及修飾、或該等界限及範圍之等價物皆因而意圖涵蓋於申請專利範圍中。
由於本案的圖僅為實驗數據,並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。
Claims (26)
- 一種製備生理活性多肽接合物的方法,包含:1)自反應混合物中選擇性沉澱未接合至非肽基聚合物之生理活性多肽,該反應係將該非肽基聚合物接合至該生理活性多肽之胺基酸殘基;以及2)使自沉澱物中回收之該生理活性多肽在步驟1)之接合反應下與該非肽基聚合物進行反應。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,步驟2)包含將該經沉澱之生理活性多肽溶解並接著將該多肽接合至該非肽基聚合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,在步驟1)中之該反應混合物包含以該反應混合物的總重量為基準計,10重量%或更多的未接合之生理活性多肽。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,在步驟1)中之選擇性沉澱係使用有機溶劑施行。
- 如申請專利範圍第4項所述之方法,其中,該有機溶劑為異丙醇、乙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈、或其組合。
- 如申請專利範圍第5項所述之方法,其中,在步驟1)中之該反應混合物係以2至7體積的異丙醇進行處理。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中,在步驟1)中之該反應混合物係以3至7體積的異丙醇進行處理。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,在步驟2)中,該經回收之生理活性多肽係與該非肽基聚合物進 行反應0.5小時至4小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該生理活性多肽係選自下列者所組成之群組:胰島素分泌肽、凝血因子、消化促進激素、胰島素、調酸素(oxyntomodulin)、升糖素、腎上腺皮質激素、甲狀腺激素、腸激素、細胞介素、酵素、生長因子、神經肽、腦下垂體激素、下視丘激素、抗肥胖肽、抗病毒肽、以及具生理活性之非天然胜肽衍生物。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該生理活性多肽係選自下列者所組成之群組:紅血球生成素、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、澱粉素(amylin)、體抑素(somatostatin)、肽YY(PYY)、神經肽Y(NPY)、血管收縮素、緩激肽、抑鈣素、促皮質素、章魚涎肽(elcdoisin)、胃泌素、瘦素(leptin)、催產素、血管加壓素、黃體成長激素、黃體分泌激素、濾泡刺激激素、副甲狀腺激素、胰泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、人類生長激素(hGH)、生長激素釋放肽、顆粒球群落刺激因子(GCSF)、干擾素(IFN)、介白素、泌乳素釋放肽、食慾素、甲狀腺釋放肽、膽囊收縮素、胃泌素抑制肽、調鈣素、胃泌素釋放肽、腸動素(motilin)、血管活性腸肽、心房利尿鈉肽(ANP)、腦部利尿鈉肽(BNP)、C型利尿鈉肽(CNP)、神經激肽A、神經介素(neuromedin)、腎素、內皮素、角蝰毒素肽(sarafotoxin peptide)、酪啡肽、皮啡肽(dermorphin)、強 啡肽(dynorphin)、腦內啡、腦啡肽、T細胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、尿激酶受體、腫瘤抑制物、膠原蛋白酶抑制劑、促胸腺生成素(thymopoietin)、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺肽(tymosin)、胸腺體液因子、腎上腺髓質素(adrenomodullin)、咽側體抑制素(allatostatin)、澱粉樣β-蛋白片段、抗細菌肽、抗氧化肽、鈴蟾素(bombesin)、骨鈣素(osteocalcin)、CART肽、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、白細胞激肽、Kringle-5、層黏連蛋白、抑制素、甘丙胺素(galanin)、纖維黏連蛋白、胰抑素、以及恩夫韋肽(fuzeon)。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該生理活性多肽為艾塞那肽(exendin)、艾塞那肽衍生物、胰島素、胰島素衍生物或其組合。
- 如申請專利範圍第11項所述之方法,其中,該艾塞那肽衍生物係選自下列者所組成之群組:去-胺基-組胺醯基(DA)-艾塞那肽-4、β-羥基-咪唑-丙醯基(HY)-艾塞那肽-4、咪唑-乙醯基(CA)-艾塞那肽-4、以及二甲基-組胺醯基(DM)-艾塞那肽-4。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該非肽基聚合物係接合至艾塞那肽或其衍生物之Lys27。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該非肽基聚合物係接合至作為生理活性多肽之胰島素或胰島素類似物β鏈或其衍生物之N-端。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該非肽基聚合物係選自下列者所組成之群組:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、以及其組合。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法,其中,該非肽基聚合物為聚乙二醇。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該非肽基聚合物包含至少一種選自下列者所組成之群組之反應性基團:醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基、以及琥珀醯亞胺衍生物。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法,其中,該非肽基聚合物具有醛基作為反應性基團。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法,其中,該醛基為丙醛基。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該非肽基聚合物具有500Da至100,000Da之分子量。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,進一步包含在步驟2)後分離該生理活性多肽接合物。
- 如申請專利範圍第21項所述之方法,其中,該分離係使用離子交換層析施行。
- 如申請專利範圍第22項所述之方法,其中,該離子交換層析為高壓離子交換層析。
- 一種製備生理活性多肽及生理活性載體之接合物的方法,該方法係包含經由共價鍵將根據申請專利範圍第1至23項中任一項所述之方法所製備之生理活性多肽接合物與生理活性載體進行接合以製備多肽-載體接合物,其中,在該多肽-載體接合物中,該非肽基聚合物之兩端係分別接合至該生理活性載體及該生理活性多肽。
- 如申請專利範圍第24項所述之方法,其中,該生理活性載體係選自下列者所組成之群組:白蛋白、免疫球蛋白Fc區、運鐵蛋白、適體、毒素、明膠、膠原蛋白、葡聚糖、多醣、脂肪酸、以及纖維蛋白原。
- 如申請專利範圍第25項所述之方法,其中,該生理活性載體為免疫球蛋白Fc區。
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