KR20060029770A - Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents
Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20060029770A KR20060029770A KR1020040078605A KR20040078605A KR20060029770A KR 20060029770 A KR20060029770 A KR 20060029770A KR 1020040078605 A KR1020040078605 A KR 1020040078605A KR 20040078605 A KR20040078605 A KR 20040078605A KR 20060029770 A KR20060029770 A KR 20060029770A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- glp
- peg
- lys
- amine
- amide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- 101100337060 Caenorhabditis elegans glp-1 gene Proteins 0.000 title 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 claims abstract 7
- -1 1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene) -3-methylbutyl Chemical group 0.000 claims description 22
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000006242 amine protecting group Chemical group 0.000 claims description 9
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 claims description 6
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 77
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 64
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 53
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 33
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 27
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 27
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 108010063245 glucagon-like peptide 1 (7-36)amide Proteins 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 9
- NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N (4S)-5-[[2-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[2-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-carboxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 8
- 101800004295 Glucagon-like peptide 1(7-36) Proteins 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 6
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035554 Proglucagon Human genes 0.000 description 3
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 3
- KFVKXITVKCDKBU-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl 4-amino-2-carbamoyl-4-oxobutanoate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)C(C(N)=O)CC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 KFVKXITVKCDKBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 2
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 description 2
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 description 2
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RROBIDXNTUAHFW-UHFFFAOYSA-N benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphanium Chemical compound C1=CC=C2N(O[P+](N(C)C)(N(C)C)N(C)C)N=NC2=C1 RROBIDXNTUAHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical group ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYIUTBKFKIBAFP-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-3-(2-methylpropyl)-5,7-dihydro-1H-indazol-4-one Chemical compound CC1(CC(C=2C(=NNC2C1)CC(C)C)=O)C TYIUTBKFKIBAFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100335894 Caenorhabditis elegans gly-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical group [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- WGNZRLMOMHJUSP-UHFFFAOYSA-N benzotriazol-1-yloxy(tripyrrolidin-1-yl)phosphanium Chemical compound C1CCCN1[P+](N1CCCC1)(N1CCCC1)ON1C2=CC=CC=C2N=N1 WGNZRLMOMHJUSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- LFKDJXLFVYVEFG-UHFFFAOYSA-N tert-butyl carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(N)=O LFKDJXLFVYVEFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 GLP-1의 Lys26 또는 Lys34 측쇄 아민에 선택적으로 PEG가 접합된 선택적 GLP-1-PEG 접합체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 의약조성물에 관한 것이다.
GLP-1, PEG, 선택적 PEG접합체
Description
도 1은 실시예 7 (Lys26-PEG2K-GLP-1(7-36)아미드)의 HPLC 크로마토그람을 나타낸다.
도 2는 실시예 7 (Lys26-PEG2K-GLP-1(7-36)아미드)의 말디-토프(Maldi-Tof) 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 당뇨병 유발 db/db 마우스에 GLP-1(7-36)아미드, 실시예 7 (Lys26-PEG2K-GLP-1(7-36)아미드) 및 실시예 8 (Lys34-PEG2K-GLP-1(7-36)아미드)을 복강내 주사한 후 15분에 포도당 용액을 경구투여했을 때 포도당 용액 투여 후 3시간까지의 혈당농도 곡선하 면적(AUC)을 나타낸다.
본 발명은 GLP-1의 Lys26 또는 Lys34 측쇄 아민에 선택적으로 PEG가 접합된 선택적 GLP-1-PEG 접합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
글루카곤-유사-펩타이드-1(Glucagon-like-peptide-1, 이하 'GLP-1"이라 한다)은 음식물을 섭취했을 때 장점막에서 분비되는 펩타이드 호르몬으로서 전구 펩타이드인 프로-글루카곤(pro-glucagon)으로부터 생성된다. 생리활성을 갖는 GLP-1(7-36)아미드와 GLP-1(7-37)은 각각 프로글루카곤(proglucagon)(78-107)아미드와 프로글루카곤(proglucagon) (78-108)에 대응하며 이 두 펩타이드는 모두 혈장 중에 존재하나 인체에서는 GLP-1(7-36)아미드가 훨씬 많은 양으로 존재한다(C. Orskov et al., Diabetes 42:658-661, 1993). GLP-1은 췌장의 베타-세포에서 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 증가시키고 알파-세포에서 글루카곤의 분비를 억제하며(C. Orskov, Diabetologica 35:701-711, 1992, H.-C. Fehmann and J. F. Habener, TEM 3: 158-163, 1992), 인슐린의 생합성을 촉진한다(H.-C. Fehmann and J. F. Habener, Endocrinology 130:159-166, 1992). GLP-1은 인슐린 비의존성인 제2형 당뇨병 환자에서도 효과적인 인슐린 분비작용을 나타내어 혈당상승을 억제하며(M. A. Nauck et al., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 105:187-195, 1997) 저혈당에서는 작용하지 않기 때문에 제2형 당뇨병의 치료제로 기대되고 있다. 그러나, GLP-1(7-36)아미드 및 GLP-1(7-37)은 수종의 포유동물의 조직 및 장기에 편재하는 특이적 아미노펩티다제인 디펩티딜 펩티다제 IV(Dipeptidyl peptidase IV, 이하 'DPP IV'라 한다; EC.3.4.14.5)에 의해 빠르게 분해되며 생체내 반감기는 3~5분에 불과하기 때문에(T. J. Kieffer et al., Endocrinology 136:3583-3596, 1995, C. Orskov et al., Diabetes 42:658-661, 1993) 생체내에서 충분한 효과를 나타내기 어렵다.
GLP-1의 이러한 단점을 개선하기 위하여 생체내 혈당상승 억제작용이 증강된 GLP-1 유도체 개발연구가 다수 진행되고 있다. PCT 출원 제PCT/US87/01005호에는 자연 발생되는 서열에는 존재할 수 없는 하나 이상의 아미노산을 함유하거나 또는 없는 폴리펩타이드를 포함하는 인슐리노트로핀 유도체가 개시되어 있다. PCT 출원 제PCT/US89/01121호에는 GLP-1(7-36), GLP-1(7-35) 및 GLP-1(7-34)를 포함하는 인슐리노트로핀 활성을 갖는 폴리펩타이드 유도체가 개시되어 있으며 여기에는 운반 단백질에 대한 커플링을 증진시키거나 또는 인슐리노트로프 효과를 증진시키는데 중요하지 않은 아미노산의 치환체 또는 추가의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 에르하르드 지. 시에겔(Erhard G. Siegel) 등의 문헌(Regulatory Peptides 79:93-102, 1999)에는, GLP-1(7-36)의 8- 위치, 8- 과 14- 위치, 8- 과 15- 위치, 14- 와 15- 위치를 변환시켰을 때, 14- 위치 또는 15- 위치를 변환시킨 유도체는 생리활성이 소실되었으며 8- 위치를 변환시킨 유도체는 GLP-1(7-36)과 유사하거나 증강된 효력을 나타내었다고 보고되어 있다. 레미 부르셀린(Remy Burcelin) 등의 문헌(Metabolism 48:252-258, 1999)에는, GLP-1(7-36)의 8- 위치 알라닌(Ala)을 글리신(Gly)으로 치환한 GLP-1-Gly8과 GLP-1(7-36) 자체를 당뇨병 마우스에 투여하여 포도당 내성시험(Glucose Tolerence Test)을 실시한 결과 GLP-1-Gly8이 GLP-1 자체에 비해 우수한 혈당상승 억제작용을 나타내었다고 보고되어 있다. 피. 엠. 핀바르(P. M. Finbarr) 등의 문헌(Biochimica et Biophysica Acta 1474:13-22, 2000)에는 7- 위치의 히스티딘(His)에 글루시톨(glucitol)을 결합시킨 His7-글루시톨-GLP-1을 랫드에 투여하여 시험한 결과 우수한 혈당상승 억제효과를 나타내었으며 DPP-IV 대사에 대하여 높은 안정성을 나타내었다고 보고되어 있다. 그 외에도 국제공개특허공보 WO 1998/08871(PCT/DK1997/00340), 국제공개특허공보 WO 2000/34331 (PCT/EP1999/009660), 국제공개특허공보 WO 2000/34332(PCT/US1999/28929), 국제공개특허공보 WO 2001/98331(PCT/US2001/16474), 국제공개특허공보 WO 2003/018516 (PCT/US2002/021325) 등의 많은 GLP-1 유도체에 대한 국제출원이 공개되어 있다.
펩타이드 및 단백질에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 'PEG'라 한다)을 접합하는 기술은 데이비스(Davis)와 아부코프스키(Abuchowski)의 연구(Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3571-3581, 1977; Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3582-3586, 1977)에 기초한다. PEG는 친수성이고 생체적합성이며 무독성인 고분자로서 H(OCH2CH2)nOH의 구조를 가지며 펩타이드 및 단백질에 접합될 경우 당단백질의 당쇄처럼 효소대사를 입체적으로 방해하여 억제하고 분자 크기를 증가시켜 신사구체 여과를 감소시킴으로써 생리활성의 지속시간을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 폴리펩타이드와 PEG의 공유결합에 관해서는 미국특허 제 4179337호에 공개되어 있으며, 여기에서는 단백질과 효소를 PEG로 수식할 경우 수식하지 않은 경우에 비해 면역원성과 항원성이 감소하고 혈중 반감기가 연장된다고 보고하였다.
펩타이드에 PEG를 접합시켜 활성을 증강시키거나 지속시킨 예로는 국제공개특허공보 WO 1999/27897(PCT/EP1998/07748)에 개시된 PEG 접합 인성장호르몬분비인자(hGRF-PEG, human Growth hormone Releasing Factor-PEG conjugate)가 있다.
그러나 GLP-1의 특정 위치에 PEG를 선택적으로 접합시킴으로써 GLP-1의 생체내 혈당상승 억제효과를 증강시킨 예는 보고되어 있지 않다.
이에 본 발명자는 GLP-1의 특정 위치에 PEG를 선택적으로 접합시킴으로써 생체내 혈당상승 억제효과가 증강된 GLP-1-PEG 접합체를 개발하고자 하였다. 본 발명은 GLP-1에 비하여 생체내 혈당상승 억제효과가 월등히 우수한 GLP-1의 선택적 PEG 접합체 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명은 GLP-1의 Lys26 또는 Lys34 측쇄 아민에 선택적으로 PEG가 접합된 선택적 GLP-1-PEG 접합체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 의약조성물에 관한 것이다.
본 발명은 GLP-1의 Lys26 또는 Lys34 측쇄아민에 하나의 PEG단위가 공유결합된 선택적 GLP-1-PEG 접합체에 관한 것이다.
여기에서 GLP-1은 GLP-1, 절단된 GLP-1, 인슐리노트로핀 및 인슐리노트로핀 유도체, 그리고 GLP-1의 C-말단성 염, 에스테르 및 아미드를 포함한다.
GLP-1에 접합되는 PEG는 필요에 따라 분자량 2,000~40,000의 PEG가 다양하게 사용될 수 있으며 메톡시화 PEG 및 측쇄화 PEG(branched PEG) 등이 사용될 수 있다. 측쇄화 PEG는 R(-PEG-OH)m의 구조로 나타낼 수 있으며 여기에서 R은 펜타에리트리톨이나 글리세롤과 같은 중심 부위(central core moiety)를, 그리고 m은 3~100의 측쇄(branching arm)의 수를 나타낸다. 하이드록실기는 화학적 수식에 이용될 수 있다. 다른 측쇄화 PEG로서는 (CH3O-PEG-)pR-X의 구조가 사용되고 있으며(WO96/21469), 여기에서 p는 2~3, R은 라이신, 글리세롤과 같은 중심 부위, X는 카복실과 같이 활성화에 사용되는 관능기를 나타낸다. 또 다른 측쇄화 PEG로 사용되는 펜던트 PEG(pendant PEG)는 PEG 쇄의 말단이 아닌 골격에 카복실기와 같은 활성기를 갖는다.
이들 PEG는 유리 아민과 결합시키기 위해 모두 "활성화 PEG"의 형태로 사용된다. "활성화 PEG(activated PEG)"로는 PEG 알데히드, PEG 에폭시드, PEG 트레실레이트(tresylate)와 같은 알킬화 시약(alkylating reagent)과 PEG 에스테르와 같은 아실화 시약(acylating agent) 등이 있으며 그 대표적인 예로는 PEG-N-숙신이미딜 숙시네이트, PEG-N-숙신이미딜 카보네이트, PEG-N-숙신이미딜 프로피오네이트 등이 있다.
본 발명은 또한 PEG를 GLP-1의 Lys26 또는 Lys34의 측쇄아민에 선택적으로 결합시키기 위해 사용되는, Nα 아민과 Lys34의 측쇄아민이 선택적으로 보호된 GLP-1 및 Nα 아민과 Lys26의 측쇄아민이 선택적으로 보호된 GLP-1에 관한 것이다. Nα
아민과 목표부위 이외의 라이신 측쇄아민이 선택적으로 보호된 GLP-1은 대한민국 특허출원공개 제2004-0066454에 개시된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어 Lys26- PEG-GLP-1(7-36)아미드를 제조하기 위해 사용되는 Nα, Lys34-diFmoc-GLP-1(7-36)아미드를 제조할 경우에는, 레진에 Nα 아민이 9-플루오렌일메톡시카보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl, 이하 'Fmoc'라 한다)로 보호된 C-말단 아미노산을 결합시키고 염기성 조건에서 탈보호한 후 세척하고 다음 서열의 Nα 아민이 Fmoc으로 보호된 아미노산을 결합시키는 반응을 반복하여 N-말단 아미노산까지 합성할 수 있다. 이때 PEG 접합 목표 부위가 아닌 34번 서열의 라이신을 도입하는 단계에서는 Nα 아민이 Fmoc으로, 측쇄 아민이 ivDde로 보호된 라이신을 반응시키며 다음 단계의 반응을 위해 Nα 아민의 보호기 Fmoc을 탈보호하는 조건, 예를 들어 1% 1,8-디아자비시클[5,4,0]운데스-7엔(이하, 'DBU'라 한다)-20% 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드(DMF) 조건에서 측쇄 아민의 보호기 ivDde는 탈보호되지 않는다. PEG 접합 목표 부위인 26번 서열의 라이신을 도입하는 단계에서는 Nα 아민이 Fmoc으로, 측쇄 아민이 tert-부톡시카보닐(이하, 'Boc'이라 한다)으로 보호된 아미노산을 반응시키며 다음 단계의 반응을 위해 Nα 아민의 보호기 Fmoc을 탈보호하는 염기성 조건에서 측쇄 아민의 보호기 Boc은 탈보호되지 않는다. GLP-1(7-36)의 N-말단인 7번 서열의 히스티딘까지 합성을 완료한 후 펩타이드-레진을 강한 염기성 조건, 예를 들어 2% 히드라진 용액으로 처리하면 His7의 Fmoc과 Lys34의 ivDde는 모두 탈보호되며 여기에 9-플루오렌일메톡시카보닐-숙신아미드(이하, 'Fmoc-OSu'라 한다)를 반응시켜 탈 보호된 7-, 34- 아민을 다시 Fmoc으로 보호한다. 이 펩타이드-레진을 절단용액, 예를 들어 트리이소프로필실란(TIS) : 물 : 트리플루오로아세트산(TFA) 혼액(2.5 : 2.5 : 95)으로 처리하면 레진과 펩타이드가 분리됨과 동시에 목표부위인 Lys26의 측쇄 아민 보호기 Boc이 탈보호되므로 목표 부위 이외의 아민들이 Fmoc으로 보호된 His7-, Lys34-diFmoc-GLP-1(7-36)아미드를 얻을 수 있다.
상기 방법 이외에, 하기에 기재된 방법에 의하여 다양한 아민보호기로 선택적으로 보호된 GLP-1을 제조할 수 있다. 예를 들어 보호된 펩타이드의 합성 과정에서 아미노산의 아민 보호기로 Fmoc과 4-니트로페닐술포닐에톡시카보닐(이하, 'Nsc'라 한다)을 자유롭게 선택하여 사용할 수 있으며, 목표부위 라이신 아민의 보호에는 Boc 이외에도 Fmoc 또는 Nsc의 탈보호 조건에서 탈보호되지 않는 아민 보호기를 제한없이 사용할 수 있다. 또한 목표부위 라이신 아민의 보호에는 Fmoc 또는 Nsc의 탈보호 조건과 펩타이드-레진의 절단조건 및 목표부위 이외의 라이신 아민의 보호기의 탈보호조건에서 탈보호되지 않는 보호기를 임의로 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 목표부위 라이신 아민을 Boc으로 목표부위 이외의 라이신 아민과 His7의 Nα-아민을 카보벤즈옥시(이하, 'Cbz'이라 한다)로 보호하여 펩타이드-레진을 합성하고 보호된 펩타이드를 분리하여 PEG를 접합한 후 cbz를 탈보호하는 것도 가능하다. 또한 펩타이드-레진을 분리하기 직전의 목표 부위 이외의 아민을 보호하는 과정에서, PEG 접합반응 조건에 적합하고 절단용액 조건에서 탈보호되지 않으며 보호 기의 탈보호 조건에서 펩타이드의 안정성이 유지되는 다양한 보호기로 치환하는 것도 가능하다.
선택적으로 보호된 GLP-1의 아민의 보호기로는 본 발명의 실시예에서 예시되는 ivDde(1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸)외에도, Fmoc(9-플루오렌일메톡시카보닐), Nsc(4-니트로페닐술포닐에톡시카보닐), Boc(tert-부톡시카보닐), Alloc(알릴옥시카보닐), Dde(1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸), Adpoc(1-(1'-아다만틸)-1-메틸-에톡시카보닐), 2-Cl-Z(2-클로로벤질옥시카보닐), Cbz(카보벤즈옥시) 등의 보호기가 다양하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 1) 목표부위 이외의 아민들이 선택적으로 보호된 GLP-1과 활성화 PEG를 반응하는 단계 및 2) 상기 얻어진 화합물의 아민 보호기를 탈보호하는 단계를 포함하는, 목표 부위의 아민, 즉 Lys26 또는 Lys 34의 측쇄아민에 PEG가 선택적으로 접합된 Lys26-PEG-GLP-1 또는 Lys34-PEG-GLP-1의 제조방법이다. 예를 들어, Lys26-PEG-GLP-1(7-36)아미드를 제조할 경우, His7, Lys34-diFmoc-GLP-1(7-36)아미드를 0.3% 트리에틸아민(triethylamine, TEA)을 함유한 디메틸포름아미드에 녹이고 PEG-숙신이미딜프로피오네이트 6 당량을 가하여 상온에서 60 분간 반응시킨다. 반응이 완료되면 소량의 피페리딘을 가하여 탈보호한 다음 10% 트리플루오로 아세트산 수용액 동량을 가하여 pH를 조정하고 0.1% 트리플루오로 아세트산 수용액으로 10 배 희석한다. 이 액을 이온교환크로마토그라프법으로 정제하여 미반응 GLP-1(7-36)과 결합되지 않은 PEG 및 유리된 보호기 등을 제거한다. 용출액을 역상 레진, 예를 들어 C-18 셉-팍(Sep-Pak) 카트리지에 흡착시키고 증류수로 세척한 다음 물-아세토니트릴 혼액으로 탈착시키고 아세토니트릴을 증발시킨 후 동결건조함으로써 고순도의 Lys26-PEG-GLP-1(7-36)아미드를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조방법은 선택적 GLP-1-PEG 접합체를 역상크로마토그라프법을 이용하여 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 태양은, 선택적 GLP-1-PEG 접합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 의약조성물에 관한 것이다.
본 발명의 선택적 PEG 접합 GLP-1은 치료학적으로 유용한 양을 함유하는 약제학적 복용형으로 제형화 할 수 있다. 우선적으로 고려되는 제형은 주사제, 점적주사제, 주사용 데포제, 이식정, 흡입제 등이며 완충제, 등장화제, 안정화제, 계면활성제, 점증제, 보존제, 착색제, 방향제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기의 복용형을 포함하는 다양한 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물을 1일 0.0001 ~ 10 mg/체중 kg으로 투여한다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있고 수일에 1회 투여 할 수도 있으며 주사용 데포제 또는 이식정으로 제형화 하는 경우에는 주 1회 내지 6개월 또는 그 이상의 기간에 1회 투여할 수도 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 99.9 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
이하 실시예에서 본 발명을 구체적으로 예시한다. 그러나 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
본 명세서에서 사용하는 약어는 다음을 의미한다.
Ac2O = 무수 아세트산
Boc = tert-부톡시카보닐
Bop = 벤조트리아졸-1-일옥시 트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플루오로포스
페이트
CLTR = 2-클로로트리틸 레진
DCM = 디클로로메탄
DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민
DMF = N,N-디메틸포름아미드
Fmoc = 9-플루오렌일메톡시카보닐
HOBt = 1-히드록시벤조트리아졸
ivDde = 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸
Nsc = 4-니트로페닐술포닐에톡시카보닐
Pbf= : 2,2,3,6,7-펜타메틸디히드로벤조퓨란-5-술포닐
PyBop = 벤조트리아졸-1-일-옥시트리스(피롤리디노)포스포니움 헥사플루오로포스
페이트
tBu = tert-부틸
TFA = 트리플루오로아세트산
Trt = 트리틸
클로라닐(chloranil) 테스트
클로라닐 테스트는 Nsc 또는 Fmoc 관련 부가물 및 잔류 피페리딘의 제거가 완결되었는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 클로라닐 테스트 용액은 톨루엔 중 클포라닐 포화용액 1방울을 1 ml의 아세톤에 가하여 제조할 수 있다. 디메틸포름아미드 세척은 세척액 1방울을 클로라닐 테스트 용액에 가하여 시험할 수 있다. 2차 아민의 존재하면 블루 또는 바이올렛색을 띤다.
카이저(Kaiser) 테스트
정성적 닌히드린 테스트를 사용하여 반응의 완결을 체크하기 위하여 2~10 mg의 레진 샘플을 취하여 에탄올로 깨끗이 세척한다. 80% 페놀용액 2 방울, 피리딘 중의 0.02 mM 시안화칼륨 용액 2 방울 및 에탄올 중의 5% 닌히드린 2 방울을 상기 샘플에 첨가한다. 상기 샘플을 120 ℃의 열 블럭(heat block)에 4~6분간 방치한다. 유리 아민이 존재하면 레진이나 용액이 블루 또는 바이올렛 색상을 띤다.
HPLC 분석 조건
기구 : 워터스 알리안스(Waters Alliance)
유속 : 1.0 ml/분
구배 : A 0 - 100% 45분 내 B (A : 물 중의 0.1% 트리플루오로 아세트산,
B : 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로 아세트산)
칼럼 : 노바-팍-C18(Nova-Pak-C18), 3.9 mm x 150 mm, 5 ㎛, 100A
Mass 분석 조건
기구 : 보이저(Voyager) DE-STR 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석
(페르셉티브(Perseptive))
작동 모드 : 반사체(reflector)
추출 모드 : 지연형(delayed)
극성 : 양성
매트릭스 : 알파-시아노-4-히드록시신남산
실시예 1. GLP-1 관련 펩타이드 부착 레진-I(GLP-1 related Peptide Attached Resin-I: GPAR-I)의 합성
GPAR-I의 구조 :
확인물질
(Lys34(ivDde))-GLP-1(7-36) 아미드 (human)
표 1에 하기 실험에 사용된 물질의 사용량 및 사용순서를 나타내었다.
1.5 g의 링크 에이엠(Rink AM) 레진(Nova biochem사 제품)을 50 ml 펩타이드 반응 용기(레진류의 담체를 쉽게 여과를 쉽게 할 수 있도록 유리 필터(glass filter)를 응용한 반응기)에 넣고, 20 ml 디클로로메탄을 부었다. 30 분 정도 유지하여 레진이 충분히 부풀도록 한 다음 용액은 여과하여 제거하였다. 3 x 20 ml 탈보호용액(디메틸포름아미드 중의 25% 피페리딘)으로 각 5 분씩 반응시켜 Fmoc을 제거한 다음 5 x 20 ml 디메틸포름아미드로 세척하였다. 남아있는 피페리딘의 제거를 확인하기 위하여 클로라닐 시험법으로 확인하였다.
GLP-1(7-36)의 C-말단 아미노산인 아르기닌(Arg)을 도입하기 위하여 Nsc-Arg(Pbf)-OH(2.0 eq, 1.37g), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(2.0 eq, 270 mg)와 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(4.0 eq, 690 ㎕)를 10 ml 50% 디클로로메탄/디메틸포름아미드에 녹여 위의 레진이 담겨 있는 반응기에 부었다. 벤조트리아졸-1-일옥시 트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bop) (2.0 eq, 885 mg, 10 ml의 5 % 디클로로메탄/디메틸포름아미드 중)를 가한 다음 35oC - 40oC 온도에서 적당한 혼합기로 1 시간 가량 골고루 섞어 반응을 진행시켰다. 반응이 완료되었으면 반응액을 여과하여 제거하고 3 x 20 ml 디메틸포름아미드로 세척하고 3 x 20 ml 탈보호용액(디메틸포름아미드 중의 25 % 피페리딘)으로 각 5 분씩 반응시킨 후 5 x 20 ml 디메틸포름아미드로 충분히 세척하였다. 반복적인 아미노산의 도입과 Nsc 또는 Fmoc의 제거는 위의 아르기닌(Arg) 도입 방법에 의해서 실시하고 그 반응 순서는 GLP-1의 C 말단에서부터 Arg37 이후로 표2의 순서에 따라 차례로 진행하였다.
아미노산 도입 반응의 진행은 카이저 시험법으로 판단하였으며, 반응이 완료되지 않았으면 반응시간을 추가로 30 분 내지 1 시간 가량 늘려 반응을 진행시켰다. 시간을 늘려서 반응하였을 때도 진행이 완료되지 않았을 경우에는 새로 만든 반응액으로 재반응을 진행하였다. 재반응은 기존의 반응액을 제거하고 3 x 20 ml 디메틸포름아미드로 세척한 다음 새로 준비한 반응액을 넣어 추가의 1 시간 동안 진행시켰다. 재반응에서도 진척이 없으면 50% 무수아세트산 / 디메틸포름아미드 용액을 사용하여 아세틸화를 유도하여 다른 부반응의 가능성을 배제하고 반응시켰다.
각 단계별 축합 반응과 탈보호반응을 표 2의 순서에 따라 진행하여 펩타이드를 제조하였다. 제조된 GPAR-I을 5 x 50 ml 디클로로메탄으로 잘 세척한 다음 질소 조건에서 잘 건조하였으며, 건조 무게는 6.8 g 이었다. 펩타이드 합성 상태를 분석하기 위하여 GPAR-I의 일부(5 - 10 mg)를 채취하였다. 채취한 레진을 질소 조건에서 좀 더 건조한 다음 1.5 ml 원심분리기 용기로 옮겨 놓았다. 트리플루오로아세트산을 기반으로 하는 200 ㎕ 탈루용액(트리플루오로아세트산 중의 2.5% TIS - 2.5% 물)을 사용하여 레진에서 물질을 분리해 내고 아미노산의 활성기를 보호하는 용도로 도입된 tBu, trt, Boc, Pbf 등을 제거하였다. 에테르 침전법을 통하여 얻어진 물질은 HPLC 및 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통하여 (Lys34(ivDde))-GLP-1(7-36)아미드(human)) 임을 확인할 수 있었다. HPLC 분석 결과 주피크는 70-75 % 였으며 주피크로부터 확인물질의 분자량(M+1= 3505)을 관측할 수 있었다.
실시예 2. GLP-1 관련 펩타이드 부착 레진-II(GLP-1 related Peptide Attached Resin-II)(GPAR-II)의 제조 : GPAR-I의 Lys34 측쇄아민의 ivDde 탈보호
GPAR-II의 구조 :
확인물질 :
GLP-1(7-36) 아미드 (human)
표 3에 하기 실험에 사용된 물질의 사용량 및 사용순서를 나타내었다.
실시예 1 에서 제조한 GPAR-I을 3 x 20ml 디메틸포름아미드로 세척하였다. 20 ml 2% 히드라진 / 디메틸포름아미드를 넣어 20 분간 레진과 혼합하여 섞어 주었다. 처음 넣어 주었던 2% 히드라진 용액을 제거하고 5 x 20 ml 2% 히드라진 / 디메 틸포름아미드로 각 20 분씩 레진과 혼합하여 교반하였다. IvDde가 펩타이드로부터 분리되어 만들어지는 물질인 6,6-디메틸-3-(2-메틸프로필)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1H-인다졸을 박층 크로마토그래피(TLC)로 관측하여 반응 진행을 확인하였다. 표준용액으로 2% 히드라진/ 디메틸포름아미드용액을 사용하였고 반응액을 박층 크로마토그래피(TLC)에 점적하여 UV 254 nm에서 비교 관측하여 반응의 종결점을 결정하였다. 반응이 완결되지 않으면 2% 히드라진 / 디메틸포름아미드 용액을 추가로 처리하였다.
반응의 종결을 확인한 다음 반응액을 제거하고 5 x 20 ml 디메틸포름아미드, 5 x 20 ml 디클로로메탄, 5 x 20 ml 디메틸포름아미드, 그리고 5 x 20 ml 디클로로메탄으로 세척하였다. 질소하에서 레진을 건조시켜 5.8 g의 GPAR-II를 얻을 수 있었다. IvDde의 제거를 확인하기 위하여 GPAR-II 일부를 취하고, 채취한 레진을 질소 조건에서 좀 더 건조시킨 다음 1.5 ml 원심분리용 용기로 옮겨 놓았다. 200 ㎕ 탈루용액( 트리플루오로아세트산 중의 2.5% TIS-2.5% 물)을 사용하여 레진에서 물질을 분리해 내고 아미노산의 활성기를 보호하는 용도로 도입된 tBu, Trt, Boc, Pbf등을 제거하였다. 에테르 침전법을 통하여 얻어진 물질은 HPLC 및 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통하여 GLP-1(7-36) 아미드(human)임을 확인할 수 있었다. HPLC 분석 결과 주피크는 50-60% 였으며 그 주피크로부터 확인물질의 분자량(M+1= 3298)을 관측할 수 있었다.
실시예 3. GLP-1 관련 펩타이드 부착 레진-III (GLP-1 related Peptide Attached Resin-III)(GPAR-III)의 제조 : GPAR-II의 His7, Lys34 측쇄아민의 Fmoc 보호
GPAR-III의 구조 :
확인물질 :
(Fmoc-His7, Lys(Fmoc)34)-GLP-1(7-36)아미드(human)
표 4에 하기 실험에 사용된 물질의 사용량 및 사용순서를 나타내었다.
실시예 2 에서 제조한 GPAR-II를 20 ml 디클로로메탄으로 잘 불린 다음 3 x 20 ml 디메틸포름아미드로 세척하였다. 9-플루오렌일메톡시카보닐-숙신아미드(Fmoc-OSu) / 디메틸포름아미드(3.4 g Fmoc-OSu / 20 ml 디메틸포름아미드)를 넣어 1 시간 동안 레진과 혼합하여 섞어 주었다. 반응의 진척은 카이저 시험법을 통하여 확인하였고 반응이 완료된 것으로 확인되면 반응액을 여과하여 제거하였다. 레진을 5 x 20 ml 디메틸포름아미드와 5 x 20 ml 디클로로메탄으로 세척한 다음 질소 환경에서 건조하여 5.3 g의 GPAR-III를 얻을 수 있었다. Fmoc의 도입을 확인하기 위하여 GPAR-III일부를 취하고, 채취한 레진을 질소 조건에서 좀 더 건조한 다음 1.5 ml 원심분리기 용기로 옮겨 놓았다. 200 ㎕의 탈루용액 (트리플루오로아세트산 중의 2.5% TIS - 2.5% 물)을 사용하여 레진에서 물질을 분리해 내었고 아미노산의 활성기를 보호하는 용도로 도입된 tBu, Trt, Boc, Pbf등을 제거하였다. 에테르 침전법을 통하여 얻어진 물질은 HPLC 및 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통하여 (Fmoc-His7, Lys(Fmoc)34)GLP-1(7-36) 아미드(human)임이 확인되었다. HPLC 분석 결과 주피크는 약 50 % 였으며 그 주피크로부터 확인물질의 분자량(M+1= 3743)을 관측할 수 있었다.
실시예 4. (Fmoc-His7, Lys(Fmoc)34)GLP-1(7-36)아미드 (human)의 제조 : GPAR-III의 탈루 및 정제
(Fmoc-His7, Lys(Fmoc)34)GLP-1(7-36)아미드 (human)의 구조 :
표 5에 하기 실험에 사용된 물질의 사용량 및 사용순서를 나타내었다.
GPAR-III 1.0 g에 20 ml 절단 용액을 붓고 잘 섞어서 2 시간 가량 상온에서 혼합하여 섞어 주었다. 레진과 용액을 분리하여 용액은 따로 모으고, 10 ml 트리플루오로 아세트산로 세척하여 용액과 합쳤다. 모은 트리플루오로 아세트산 용액을 300 ml 냉-에테르에 붓고 생성된 침전을 원심분리기로 분리해 냈다. 백색 침전을 2 x 100 ml의 디에틸에테르로 세척한 다음 질소 기류하에서 1 차 건조하였다. 얻은 백색 침전을 진공에서 10 시간 가량 건조하여 295 mg의 물질을 혼합물 형태로 얻을 수 있었다. 혼합물의 HPLC분석 결과 목적물질의 함량은 실시예 3에서와 같이 약 50% 였으며 물질은 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통해서 확인할 수 있었다.
물질의 정제는 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 수행하였다. 컬럼은 엑스트라(Xtera)(RP18, 7 ㎛, 19 x 300 mm)을 사용하였고 이동상은 0.1% 트리플루오로 아세트산를 함유한 증류수와 아세토니트릴의 순차적 혼합액을 사용하여 정제하였다. 200 mg의 혼합물질을 10 ml의 물-아세트니트릴-트리플루오로 아세트산 혼액에 녹여 1 회에 1.0 ml씩 주입하였다. 이동상은 0.1% 트리플루오로 아세트산를 함유한 30 - 60 % 아세토니트릴 수용액을 유속 10 ml/분으로 사용하였다. 목적물질의 피크 영역을 모아서 증발농축하여 아세토니트릴을 제거한 다음 동결 건조하였다. 200 mg의 펩타이드 혼합물을 1차 정제하여 함량 85% 이상의 목적물질 87.5 mg을 얻었으며 이를 다시 2차 정제하여 함량 95% 이상의 목적물질 28 mg을 얻었다. 수득한 목적물질은 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통해 확인하였다 (M+1=3298).
실시예 5. (Fmoc-His7, Lys(Fmoc)26)GLP-1(7-36) 아미드 (human)의 제조
(Fmoc-His7, Lys(Fmoc)26)GLP-1(7-36) 아미드 (human)의 구조 :
실시예 1 부터 실시예 4 에 예시된 방법에 따라 아미노산 골격 합성, ivDde 탈보호, Fmoc 보호 및 탈루와 정제과정을 거쳐 합성하였다. 아미노산 골격의 합성은 표 6의 도입순서에 맞추어 실시예 1에 따라 진행하였으며 다만 실시예 1과는 달리 26 위치에 Fmoc-Lys(ivDde)을 34 위치에 Nsc-Lys(Boc)을 각각 도입하였다. 합성한 펩타이드-레진, GPAR-IV 의 구조는 아래와 같다.
반응의 진행을 확인하기 위하여 일부의 시료을 탈루시켜 (Lys26(ivDde))-GLP-1(7-36)아미드(human)로 물질을 확인하였다. 합성된 GPAR-IV는 6.5 g이었고 확인물질의 HPLC 순도는 75 - 80 % 정도였으며 주피크의 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통하여 확인물질의 분자량(M+1=3505)을 확인할 수 있었다.
GRAP-IV를 실시예 2의 방법에 따라 ivDde를 제거한 GPAR-V의 구조는 아래와 같다.
반응의 진행을 확인하기 위하여 일부의 샘플을 탈루시켜 GLP-1(7-36)아미드 (human)로 물질을 확인하였다. 합성된 GPAR-V의 양은 5.4 g이었고 확인물질의 HPLC 순도는 68 % 정도였으며 주피크의 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통하여 확인물 질의 분자량(M+1 = 3298)을 확인할 수 있었다.
GPAR-V에 실시예 3의 방법에 따라 Fmoc을 도입한 GPAR-VI의 구조는 아래와 같다.
반응의 진행을 확인하기위하여 일부의 시료를 탈루시켜 (Lys26(ivDde))-GLP-1(7-36)아미드(human)로 물질을 확인하였다. 합성된 GPAR-VI의 양은 4.9 g이었고 확인물질의 순도는 60% 정도였으며 주피크의 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통하여 확인물질의 분자량(M+1=3743)을 확인할 수 있었다.
GPAR-VI 1 g을 취하여 실시예 4에 따라 탈루하였으며 GPAR-VI 1 g 으로부터 펩타이드 혼합물 320 mg을 얻을 수 있었다. 물질의 정제는 고성능 액체 크로마토그라피를 이용하여 수행하였다. 컬럼은 엑스테라 (Xtera)(RP18, 7 ㎛, 19x300 mm)을 사용하였고 이동상은 0.1 % 트리플루오로 아세트산를 함유한 증류수와 아세토니트릴의 순차적 혼합액을 사용하여 정제하였다. 200 mg의 혼합물질을 10 ml의 물-아세트니트릴-트리플루오로 아세트산 혼액에 녹여 1 회에 1.0 ml씩 주입하였다. 이동상은 0.1% 트리플루오로 아세트산를 함유한 30 - 60% 아세토니트릴 수용액을 유속 10 ml/분으로 사용하였다. 목적물질의 피크 영역을 모아서 증발농축하여 아세토니트릴을 제거한 다음 동결 건조하였다. 200 mg의 펩타이드 혼합 물질을 1차 정제하 여 함량 90% 이상의 목표물질 110 mg을 얻었으며 이를 다시 2차 정제하여 함량 95% 이상의 목표물질 58 mg을 얻었다. 수득한 목표물질은 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석을 통해 확인하였다 (M+1 = 3298).
실시예 6. Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드의 제조
실시예 4의 (Fmoc-His7, Lys(Fmoc)34)GLP-1(7-36)아미드 10 mg 과 PEG2k(PEG 2000)숙신이미딜프로피오네이트 32 mg을 유리용기에 넣고 트리플루오로 아세트산 0.3%를 함유한 디메틸포름아미드 5 ml를 가하여 녹인 후 상온에서 60분간 반응시킨다. 반응이 완료되면 피페리딘 0.25 ml를 가하여 반응을 정지하고 Fmoc을 탈보호 한다. 여기에 10% 트리플루오로 아세트산 수용액 5 ml를 가하여 pH를 조정하고 다시 0.1% 트리플루오로 아세트산 수용액 40 ml를 가하여 희석한 후 이온교환크로마토그라프법으로 정제한다.
[이온교환크로마토그라프법 조건]
칼럼 : TSK SP-5PW(21.5 mm ID x 150 mm L)
이동상 : A : 50 mM 초산나트륨 완충액 (pH 4.0)
B : 0.5 M 염화나트륨 함유 50 mM 초산나트륨 완충액(pH 4.0)
0 분 : A, 100% / B, 0 % → 40 분 : A, 40% / B, 60%
유속 : 6 ml/분
검출 : UV 280 nm
모은 용리액을 활성화한 셉-팍(Sep-Pak) 카트리지에 천천히 통과시켜 펩타이드를 흡착시킨 다음 증류수 100 ml로 세척하고 0.1% 트리플루오로 아세트산을 함유한 80% 아세토니트릴 25 ml로 용리시켰다. 이 액을 질소기류하에서 증발시켜 아세토니트릴을 제거하고 동결건조하여 수득물 7.6 mg을 얻었다.
수득한 Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드은 아래 조건의 역상 크로마토그라프 분석에서 99% 이상의 순도를 나타내었으며(도 1) 말디-토프(Maldi-Tof) 질량분석에서 중심분자량 5551의 모노-PEG접합체 피크를 나타내었다(도 2).
[역상 크로마토그라프법 조건]
칼럼 : 리히크로스피어(Lichrosphere) 100 RP-8(4 mm ID x 250 mm L, 5 ㎛, Merck)
이동상 A : 0.1 % 트리플루오로 아세트산/증류수
B : 0.1 % 트리플루오로 아세트산/아세토니트릴
0 분 : A, 64% / B, 36% → 30 분 : A, 56% / B, 44%
유속 : 1 ml/분
검출 : UV 215 nm
실시예 7. Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드의 제조
실시예 5의 (Fmoc-His7, Lys(Fmoc)26)GLP-1(7-36)아미드 10 mg을 가지고 실시예 6과 동일한 방법에 따라 제조하여 Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드 8.9 mg을 얻었다.
실험예 1. Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드와 Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드의 혈당상승 억제효과
당뇨병이 유발된 db/db 마우스를 4군(n=5)으로 분리하고 16시간 절식시켰다. 생리식염수, GLP-1(7-36)아미드 100 ㎍/kg, Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드 100 ㎍ eq/kg 및 Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드 100 ㎍ eq/kg 을 각각 복강내 주사한 다음 10분 후에 포도당 용액 1 g/kg을 경구투여하고 -10, 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180분에 각각 채혈하여 혈당농도를 측정하였다. 0 - 180분의 시간(min)-혈당농도(mg/dl) 곡선하 면적을 계산하여 GLP-1(7-36)아미드와 Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드 및 Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드의 혈당상승 억제효과를 비교하였다(도3). GLP-1(7-36)아미드투여군의 AUC는 25165±4463 mg.min/dl로 생리식염수 투여군의 34864±4774 mg.min/dl에 비하여 27.8% 감소하였으나 Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드와 Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드는 각각 14470±5700 mg.min/dl와 17520±2484 mg.min/dl로 58.5%와 49.7%가 감소하였다. 이러한 결과는 Lys26-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드와 Lys34-PEG2k-GLP-1(7-36)아미드의 생체내 혈당상승 억제효과가 GLP-1(7-36)아미드에 비해 크게 증강되었음을 나타낸다.
본 발명에 의해 GLP-1의 Lys26 또는 Lys34 측쇄아민에 PEG가 선택적으로 접합된 선택적 GLP-1-PEG 접합체를 제조할 수 있다.
선택적 GLP-1-PEG 접합체는 당뇨병 마우스를 이용한 생체내 포도당 내성시험에서 GLP-1 자체에 비하여 월등히 우수한 혈당상승 억제효과를 나타낸다.
Claims (8)
- GLP-1의 Lys26 또는 Lys34 측쇄아민에 하나의 PEG단위가 공유결합된 선택적 GLP-1-PEG 접합체.
- 제1항에 있어서, GLP-1의 C-말단이 약학적으로 허용되는 염, 아미드, 에스테르인 선택적 GLP-1-PEG 접합체.
- Nα 아민과 Lys34의 측쇄아민, 또는 Nα 아민과 Lys26의 측쇄아민이 아민보호기를 사용하여 선택적으로 보호된 GLP-1.
- 제3항에 있어서, 아민 보호기가 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸, 9-플루오렌일메톡시카보닐, 4-니트로페닐술포닐에톡시카보닐, tert-부톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸, 1-(1'-아다만틸)-1-메틸-에톡시카보닐, 2-클로로벤질옥시카보닐, 카보벤즈옥시로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 보호기인 것을 특징으로 하는 선택적으로 보호된 GLP-1.
- 제3항의 선택적으로 보호된 GLP-1과 활성화 PEG를 반응시키고 아민 보호기를 탈보호하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 선택적 GLP-1-PEG 접합체의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 활성화 PEG가 알킬화(alkylating) 또는 아실화(acylating) PEG인 것을 특징으로 하는 선택적 GLP-1-PEG 접합체의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 선택적 GLP-1-PEG 접합체를 크로마토그라프법을 이용하여 반응물로부터 정제하는 단계를 추가로 포함하는 선택적 GLP-1-PEG 접합체의 제조방법.
- 제1항의 선택적 GLP-1-PEG 접합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 의약조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040078605A KR20060029770A (ko) | 2004-10-04 | 2004-10-04 | Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040078605A KR20060029770A (ko) | 2004-10-04 | 2004-10-04 | Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060029770A true KR20060029770A (ko) | 2006-04-07 |
Family
ID=37139979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020040078605A KR20060029770A (ko) | 2004-10-04 | 2004-10-04 | Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20060029770A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10046058B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-08-14 | Rezolute, Inc. | Use of hydrophobic organic acids to increase hydrophobicity of proteins and protein conjugates |
| US10220075B2 (en) | 2015-06-04 | 2019-03-05 | Rezolute, Inc. | Amine pegylation methods for the preparation of site-specific protein conjugates |
-
2004
- 2004-10-04 KR KR1020040078605A patent/KR20060029770A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10046058B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-08-14 | Rezolute, Inc. | Use of hydrophobic organic acids to increase hydrophobicity of proteins and protein conjugates |
| US10702611B2 (en) | 2014-12-02 | 2020-07-07 | Rezolute, Inc. | Use of hydrophobic organic acids to increase hydrophobicity of proteins and protein conjugates |
| US10220075B2 (en) | 2015-06-04 | 2019-03-05 | Rezolute, Inc. | Amine pegylation methods for the preparation of site-specific protein conjugates |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI254641B (en) | Solution-phase site-specific preparation of GRE-PEG conjugates, and composition of the conjugate | |
| KR102011924B1 (ko) | 인슐린 저항성에 대한 개선된 펩티드 제약 | |
| JP5907999B2 (ja) | 長期間作用性ペプチド類似体のための組成物 | |
| KR101205272B1 (ko) | 아실화된 ｇｌｐ-1 화합물 | |
| CN102827284B (zh) | 带有聚乙二醇基团的Exendin或其类似物及其制剂和用途 | |
| CN106928341B (zh) | 定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法 | |
| EP2611825B1 (en) | Solid phase synthesis of h(gly2)glp-2 | |
| PT1231219E (pt) | Análogos do péptido semelhante a glucagon-2 | |
| AU2013347975A1 (en) | Improved peptide pharmaceuticals for insulin resistance | |
| KR20080065622A (ko) | 안정화된 혈액내 전달을 위한 생리활성 기질 전달체, 이를포함하는 복합체 및 이를 이용한 생리활성 기질의 혈액내전달 방법 | |
| US6610825B2 (en) | Method for alleviating pain or providing an analgesic effect in a patient | |
| WO2012158962A2 (en) | Improved peptide pharmaceuticals | |
| KR20200141469A (ko) | 신규한 glp-1 유사체 | |
| KR20130127985A (ko) | 글루코스-의존 인슐린 친화성 펩티드 유사체 | |
| EP0270376A2 (en) | Calcitonin gene-related peptide derivatives | |
| WO2013086786A1 (zh) | 具有降血糖作用的化合物、组合物及其用途 | |
| CN113429471B (zh) | 长效glp-1多肽类似物及其制备方法和应用 | |
| KR20060029770A (ko) | Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 | |
| WO2007061148A1 (en) | Site-specific peg conjugates of glp-1 and methods for production thereof | |
| KR100359713B1 (ko) | 펩신방출을억제하기위한펩티드 | |
| JPS6120560B2 (ko) | ||
| KR100936536B1 (ko) | 목표 부위 이외의 아민이 보호된 펩타이드, 그 제조방법및 이를 이용한 ｐｅｇ가 선택적으로 접합된 펩타이드의제조방법 | |
| CN117756913A (zh) | 一种新型长效多肽化合物、组合物及其应用 | |
| EP1167383B1 (en) | Novel conjugates of opioids and endogenous carriers | |
| JPS6223258B2 (ko) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Withdrawal due to no request for examination |