KR20080065622A - 안정화된 혈액내 전달을 위한 생리활성 기질 전달체, 이를포함하는 복합체 및 이를 이용한 생리활성 기질의 혈액내전달 방법 - Google Patents

안정화된 혈액내 전달을 위한 생리활성 기질 전달체, 이를포함하는 복합체 및 이를 이용한 생리활성 기질의 혈액내전달 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형 생리활성 기질 화합물(modified substances)의 설계된 disulfanyl group이 혈장 단백질, 특히 serum albumin의 free thiol group(Cys34)과 혈액 내에서 conjugation되어 '새롭고 안정한 disulfide (S-S) 공유결합'을 이루어 약물의 체내 반감기(half-life) 및 안정성(stability)을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 설계된 disulfanyl group 혈장 단백질과 conjugation된다는 것을 실험관내 (in vitro) 방법을 통해 정성 및 정량 할 수 있는 효과적인 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 혈액 내에서 생리활성 기질 화합물과 혈장 단백질간의 disulfide 공유결합이 효과적으로 conjugation될 수 있도록 생리활성 기질 화합물을 적합하게 분자 설계하여 제조할 수 있는 이의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 변형 설계된 생리활성 기질 화합물들의 약리학적인 치료 효과 및 치료 방법을 구체적으로 제공한다.

Description

안정화된 혈액내 전달을 위한 생리활성 기질 전달체, 이를 포함하는 복합체 및 이를 이용한 생리활성 기질의 혈액내 전달 방법{BIOACTIVE SUBSTANCE CARRIER FOR IN VIVO STABLE DELIVERY THEREOF, CONJUGATE CONTAINING THE SAME, AND METHOD OF IN VIVO STABLE DELIVERY OF THE BIOACTIVE SUBSTANCE}
본 발명은 생체내 반감기가 짧고 안정성이 낮은 저분자량 생리활성 기질의 안정화되고 효과적인 혈액내 전달을 위하여 생리활성 기질을 변형 설계하는 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게, 본 발명은 생리활성 기질을 혈액내 단백질 상의 관능기(functional group)과 연결(conjugation)시켜 안정화되고 바람직한 약물동력학적 성질(pharmacokinetic properties)을 갖도록 하는 생리활성 기질 전달체; 인간을 포함하는 포유류에 대하여 치료 또는 예방 목적의 약물(drug)로서 이용 가능한 천연물, 합성 유기 화합물, 천연 유래 펩타이드 및 합성 펩타이드로 이루어진 군 중에서 선택된 저분자량 생리활성 기질과 상기 생리활성 기질 전달체를 포함하는 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체; 및 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 이용하여 상기 저분자량 생리활성 기질을 안정하고 효율적으로 혈액내 (in vivo) 전달하는 방법에 관한 것이다.
인슐린 도입을 시작으로 소개된 바이오 의약품(biopharmaceutics)은 생명공 학의 발달과 인간 게놈 유전자 해석의 완성으로 급속히 발전되고 있으며 2000 년대 들어서 500 개 이상의 바이오 의약품이 임상 중에 있고 매년 10 여개의 치료제가 FDA 로부터 승인을 받고 있다. 바이오 의약품 중 특히 펩타이드 계열 의약품은 강력한 치료 및 예방 효과와 생체친화적 (biocompatible) 특성으로 갖고 있으므로 많은 병증에 대한 치료 및 예방 영역에서 새로운 치료제 또는 대체 치료제로서 연구 되고 있다.
그러나, 이들과 같은 펩타이드 약물 및 불안정한 저분자량 약물들은 생체 내 존재하는 protease 와 같은 다양한 효소들에 의해 쉽게 생분해되기 때문에 일반적으로 반감기(half-life)가 짧다. 또한, 펩타이드 계열 약물의 경우에는 다른 저분자량 약물에 비하여 유효 혈중 농도의 유지가 특히 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들은 대부분 거대분자(macromolecule)이기 때문에 생체막 투과가 용이하지 않고, 면역원성(immunogenicity)을 유발시킬 수도 있으며, 일반적으로 용해도가 낮아 제형화 하는데 많은 제한점들을 갖고 있다. 특히, 이상의 단점들 중에서 짧은 반감기(half-life), 생체 내 낮은 안정성(in vivo stability) 및 낮은 생체 이용률 (bioavailability: BA) 등은 예방 및 치료제 개발에서 개선되어야 하는 부분들로 인식되고 있다.
일반적으로 대부분의 많은 약품들은 경구 또는 주사 형태로 체내에 약리 성분이 공급되며 일정 농도 이상으로 혈액 내에 존재하여야 치료 및 예방 효과를 나타낼 수 있다. 많은 경우 치료 효과를 높이기 위하여 투약량을 높여 공급하지만, 이에 따른 다양한 부작용들이 빈번하게 나타나기 때문에 사용상 제한이 따른다.
이러한 문제점들을 개선하기 위한 서방형 캡슐(slow-release capsule), depot, pump 등과 같은 다양한 약물 전달 시스템(drug delivery system: DDS)을 이용한 투약 방법들이 제안되어 왔다. 그러나, 이와 같은 접근 방식들은 장기간 동안 치료 약물의 농도를 유지시키기 위하여 일반적으로 응용하기에는 많은 단점들을 갖고 있다. 예를 들어, 피부 부착형 제형의 경우, 피부에 부착되어 적합한 속도로 약물이 피부조직을 투과할 수 있는 성질을 보유하고 있어야 하며, 서방성 제형에서 제형 particle 들은 방출되는데 시간상 제한적이고, 또한 혈관 내로 유입되어도 대식 세포들에 의해 빠르게 제거된다. 또한, 주사를 통해 치료 약물을 투여해야 하는 경우는 특히 반복적이며 지속적으로 주사 처방을 받아야 하는 많은 경우는 바람직하지 못하다. 특히, 자가 투여(self administration)의 경우는 그로 인한 부작용 발생의 원인이 되기도 하며 많은 경우 투여 방법에 대하여 개인적으로 많은 훈련이 필요하다.
이상과 같이 약품 자체에 대한 단점들 즉, 짧은 반감기(half-life), 낮은 생체 내 안정성(in vivo stability) 및 생체 이용률(bioavailability: BA)과 장기간 반복적인 주사 투여 방법을 효과적으로 개선할 수 있는 약물 전달 시스템 기술의 개발이 절실히 요구된다.
본 발명의 목적은 생체에 유용한 저분자량 생리활성 기질을 혈액 내 단백질 상의 관능기와 결합시켜 안정하고 바람직한 약물 동력학적 성질을 갖도록 하는 생리활성 기질 전달체(substance carrier)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생리활성 기질 전달체를 포함하는, 체내 반감기(half-life) 및 체내 안정성(stability)이 증진된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체(substance-substance carrier complex)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 사용하여 생리활성 기질과 혈액 단백질 상의 특정 관능기와 결합시킴으로써 생리활성 기질의 체내 반감기(half-life) 및 체내 안정성(stability)를 증진시키는 것을 특징으로 하는 생리활성 기질의 혈액내 (in vivo) 전달 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈액 단백질 상의 특정 관능기와 생리활성 기질 복합체 간의 안정한 결합을 실험관내 (in vitro) 방법을 통하여 정성 및 정량할 수 있는 간편하고 효과적인 분석 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 oral glucose tolerance test (OGTT)를 통하여 Native GLP-1과 본 발명의 화합물 1의 각 투여량 별 혈당 저하 효과를 시험한 결과를 보여주는 그래프이다:
● control: saline 투여군
● 각 sample: 15분 전에 Native GLP-1 또는 화합물 1을 복강 내 투여
● 모든 군에 대하여 0분에 glucose를 1회 경구투여
● 각 군의 마우스 개체수: 각 4마리.
도 2는 본 발명의 화합물 1과 Native GLP-1의 혈당 저하 효과의 long-acting 정도를 비교하여 보여주는 그래프이다.
● control: saline 투여군
● 각 sample: 15분 전에 Native GLP-1 또는 화합물 1을 1회 복강 내 투여
● 모든 군에 대하여 glucose를 0분 및 180분에 각각 경구 투여
● 각 군의 마우스 개체수: 각 4마리.
도 3는 Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)를 통하여 본 발명의 화합물 1이 Native GLP-1 및 d-ala-GLP-1과 비교하여 혈당 저하 효과의 long-acting 정도를 비교하여 보여주는 그래프이다.
● control: Phosphate buffer saline 투여군
● 각 sample: 4시간 전에 Native GLP-1, d-ala-GLP-1 또는 화합물 1을 1회 피하 투여
● 모든 군에 대하여 glucose를 0분에 각각 복강 내 투여
● 각 군의 마우스 개체 수: 각 6∼8마리
도 4는 Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)를 통하여 본 발명의 화합물 7 및 화합물 8이 Exendin-4와 비교하여 혈당 저하 효과의 long-acting 정도를 비교하여 보여주는 그래프이다.
● control: Phosphate buffer saline 투여군
● 각 sample: 9시간 전에 Exendin-4, 화합물 7, 화합물 8을 각각 1회 피하 투여
● 모든 군에 대하여 glucose를 0분에 각각 복강 내 투여
● 각 군의 마우스 개체 수: 각 8마리
Mode for the Invention
A more complete appreciation of the invention, and many of the attendant advantages thereof, will be readily apparent as the same becomes better understood by reference to the following detailed description.
본 발명은 생체내 반감기가 짧고 안정성이 낮은 저분자량 생리활성 기질의 안정화되고 효과적인 혈액내 전달을 위하여 적절하게 변형된 생리활성 기질(modified substances)을 설계하는 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게, 본 발명은 생리활성 기질을 혈액내 단백질 상의 관능기에 연결(conjugation)시켜 안정화되고 바람직한 약물 동력학적 성질(pharmacokinetic properties)을 갖도록 하는 생리활성 기질 전달체(substance carrier); 인간을 포함하는 포유류에 대하여 치료 또는 예방 목적의 약물(drug)로서 이용 가능한 천연물, 합성 유기 화합물, 천연 유래 펩타이드 및 합성 펩타이드로 이루어진 군 중에서 선택된 저분자량 생리활성 기질과 상기 생리활성 기질 전달체를 포함하는 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체(substance-substance carrier conjugate); 및 상기 생리활성 기질 전달체를 이용하여 상기 저분자량 생리활성 기질을 혈액내 안정하고 효율적으로 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성 기질 전달체는 링커를 통하여 생체 내에서 생리활성 기질과 결합할 수 있고, 혈액 성분 단백질 상의 공유 결합 가능한 free groups 와 안정한 공유 결합 형성이 가능한 reactive group을 포함하여, 혈액 내 투여 시 혈액 성분 단백질과 안정한 공유결합을 형성하여, 생리활성 기질의 생체 내 반감기를 증가시키고 안정성을 증진시키는 역할을 한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 생리활성 기질 전달체는 혈장 단백질인 serum albumin의 free thiol group (Cys34) 간의 안정한 disulfide (S-S) 공유결합의 형성을 가능하게 하여, 생리활성 기질의 생체내 안정성을 현저하게 증진시키고, 결합 여부의 측정이 용이하다는 이점을 갖는다.
일반적으로, 생체내 약리적 효과가 우수하지만 분자량이 100,000 이하인 저분자량 생리활성 기질은 짧은 생체 내 반감기, 생체 내에서 쉽게 분해되는 불안정성 등의 불리한 약물 동력학적 성질을 갖기 때문에 약물로서 개발하는데 어려움이 있어왔다. 그러나, 본 발명의 생리활성 기질 전달체와 복합체를 형성하는 경우, 생리활성 기질과 혈액 내 단백질 상의 특정 관능기와의 안정한 결합이 형성되어 생체 안정성과 반감기가 현저하게 증가되는 효과를 얻을 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 저분자량 생리활성 기질과 결합 가능한 linker group; 및 혈액 성분 단백질 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군중에서 선택된 관능기와 공유 결합 가능한 reactive group을 포함하는 생리활성 기질 전달체를 제공한다. 또 다른 측면에 있어서, 상기와 같이 생리활성 기질 전달체; 및 상기 생리활성 기질 전달체의 linker group을 통하여 생리활성 기질 전달체에 연결된 저분자량 생리활성 기질을 포함하는, 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 생리활성 기질 전달체를 저분자량 생리활성 기질과 결합시켜 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 형성시킴으로써 상기 저분자량 생리활성 기질의 반감기를 증가시키고 안정성을 향상시키는 단계, 및 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 투여 시, 혈액 성분 단백질과의 안정한 공유 결합 형성을 가능하게 하여 생리활성 기질의 혈액 내 안정성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질의 체내 전달 방법 및 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 함유하는 생리활성 기질의 체내 전달용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 함유하는, 상기 생리활성 기질이 치료적 활성을 갖는 질병에 대한 치료 또는 예방용 조성물, 및 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 상기 생리활성 기질이 치료적 활성을 갖는 질병에 대한 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:
1. 용어의 정의
1) 생리활성 기질 (Bioactive Substances): 본 발명에 있어서, "생리활성 기질(Bioactive substances)"은 포유류, 특히, 인간의 증상 또는 질병에 대하여 개선, 치료 및 예방 효과를 갖는 모든 천연 유래 또는 합성 유기 화합물 및 천연 유래 또는 합성 펩타이드로서, 특히, 분자량 100,000 이하의 저분자량 물질을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 생리활성 기질은 천연 유래의 천연물, 펩타이드, 호르몬, 합성 펩타이드, 합성 호르몬 및 의약 원료물질 등일 수 있다. 예를 들어, 포유류에 대하여 혈당 강하효과가 있는 glucagons like peptide-1(GLP-1)를 포함하는 insulinotropic peptide, exendin-3 또는 exendin-4 등과 같은 glucagon family peptide hormone, 또는 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone) 등이 이에 속할 수 있다. 본 발명에 따른 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 상기 생리활성 기질을 상기 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써 상기 생리활성 기질이 갖는 고유의 생체 활성 효과를 보다 효과적으로 발휘하도록 할 수 있다.
Glucagon like peptide-1 (GLP-1): GLP-1은 GI-tract의 L-세포에서 생성된 proglucagon으로부터 방출되며 31개의 아미노산으로 구성된 intestinal hormone peptide로서 혈중 glucose 농도에 의존적으로 인슐린을 자극하여 혈당을 저하시키며 위 공복감을 지연시키고 음식물 섭취를 감소시키며 특히 β-세포의 기능을 자극하는 기능을 갖는다. 따라서, 생리활성 기질로서 GLP-1이 결합된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 GLP-1를 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써, 우수한 혈당 저하 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여, 당뇨병 등과 같이 고혈당과 관련된 질환 또는 비만을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
Exendin-3 and Exendin-4 peptide: Exendin-3, Exendin-4 및 그의 유도체들은 도마뱀 (Heloderma suspectum)의 독 성분으로 혈당 강하 효과를 갖는 39개의 아미노산으로 구성된 천연 유래의 펩타이드이다. 또한 GLP-1과 53％ 정도의 동질성(homology)을 갖고 있다. 따라서, 생리활성 기질로서 Exendin-3, Exendin-4 또는 그의 유도체가 결합된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 Exendin-3, Exendin-4 또는 그의 유도체를 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써, 우수한 혈당 저하 효과를 얻을 수 있으며, 이로 인하여, 당뇨병 등과 같이 고혈당과 관련된 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone): LHRH는 시상하부에서 형성되는 황체호르몬 분비호르몬으로 뇌하수체 전엽에서 난포자극호르몬과 황체형성호르몬의 방출을 자극하는 역할을 한다. 아세트산염의 제제는 시상하부, 뇌하수체 및 생식기 기능의 부진 여부를 감별 진단하는데 효과적으로 이용되며 최근에는 전립선암, 자궁근종, 자궁내막증 등의 병증에 치료제로서 이용되고 있다. 따라서, 생리활성 기질로서 LHRH가 결합된 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체 또는 LHRH를 생리활성 기질 전달체와 함께 투여함으로써, 포유류의 배란시기 조절, 성호르몬 관련 질환 치료 또는 진단 효과를 얻을 수 있으며, 최근에는 전립선암, 자궁내막증, 자궁근종 등의 병증을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
2) Substance carrier: 본 발명에 있어서, "생리활성 기질 전달체(Substance carrier or substance delivery system)"는 linker group과 reactive group을 포함하며, 생리활성 기질을 혈액 내 단백질 상의 특정 작용기와 결합시켜 반감기와 체내 안정성을 증진시키는 역할을 하는 것이다. 본 발명의 있어서, reactive group과 linker group의 정의는 다음과 같다.
3) Reactive group: 본 발명에 있어서, "reactive group"은 혈액 내 존재하는 혈액 성분 단백질 상의 특정 관능기 (functional group), 예컨대, hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2)또는 carboxyl group(-CO2H)과 새롭고 안정한 공유결합, 바람직하게는 혈장 단백질(plasma protein) 상의 free thiol group (-SH group)과 "S-S 공유결합"을 형성할 수 있는 기능을 갖는 모든 chemical group를 지칭한다. 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 reactive group은 주로 혈장 단백질, 바람직하게는 albumin 단백질 상의 34번 cysteine 잔기인 free thiol group과 결합하여 새로운 "S-S 공유결합"을 형성할 수 있는 기능을 갖는 모든 chemical group를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명의 reactive group들은 일반적으로 수용액 환경에서 안정하며 혈장 단백질 상의 free thiol group(-SH group)과 반응하여 새로운 "S-S 공유결합"을 형성할 수 있다. 또한, 본 발명의 reactive group은 linker group 결합 부위, S-S 결합 형성 부위 및 안정한 S-S 결합 형성 후 유리되는 이탈기 (leaving group)를 갖는 것일 수 있다.
Reactive group은 disulfanyl groups 중에서 선택된 것일 수 있으며, 예를 들어, 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl- 1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 또는 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group등을 포함할 수 있고, 혈장 단백질 상의 free thiol group과 반응하여 안정한 S-S 결합을 형성한 후 유리되는 이탈기를 포함할 수 있다.
4) Linker group: Linker group은 생리활성 기질 전달체의 reactive group과 연결되거나 결합되어 있고 생리활성 기질과 연결될 수 있는 chemical moiety를 지칭한다. Linker group은 methyl, ethyl, propyl, butyl 등과 같은 하나 또는 그 이상으로 구성된 C1 내지 C6의 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group 또는 치환된 heterocyclic group 등을 포함하는 것일 수 있다. 또한, linker group은 AEA((2-amino) ethoxy acetic acid) 등을 포함하는 poly ethoxy amino acid를 포함할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 linker group은 에톡시기를 한 개 내지 세 개 포함하는 AE(E)nA (n=0∼2) ([2-(2-amino)-ethoxy](ethoxy)n acetic acid)일 수 있다. 특히 AEEE acetic acid (AEEEA)를 사용하는 경우 가용성이 증진되고, 생리활성 기질과 혈액성분 간의 안정한 공유 결합 형성에 유리한 효과가 있으며, AEEA 보다 더 좋은 혈당강하 효과를 나타낼 수 있다.
상기 linker group은 상기 substance의 말단에 결합하거나 substance 내부에 위치하여 substance와 reactive group을 연결시켜 주는 것 일 수 있다.
5) Modified substances 또는 Substance-substance carrier conjugate: 변형 생리활성 기질 화합물(modified substances)는 혈장 단백질의 관능기(functional group)들 중에서 바람직하게는 thiol group(-SH)과 결합(conjugation)될 수 있도록 바람직한 reactive group을 부착하여 변형된 모든 생리활성 기질 화합물을 총칭하는 것으로 사용된다. 변형 생리활성 기질 화합물은 생리활성 기질이 생리활성 기질 전달체의 linker group을 통하여 reactive group에 연결되어 있거나 (생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체; Substance-substance carrier conjugate), 또는 linker group 없이 reactive group에 직접 연결되어 있는 형태일 수 있다. 이와 같은 변형 생리활성 기질 화합물들은 peptidase에 안정하도록 설계되었으며 이는 혈장 단백질의 free thiol group과 conjugation이 용이함에 기인된다 할 수 있다.
본 발명에서 주로 다루어질 변형 생리활성 기질 화합물들로는 포유류 바람직하게는 인간에게 어떠한 치료 및 예방의 목적으로 사용할 수 있는 약리활성을 갖는 분자량 100,000 이하의 천연물, 합성 저 분자량 화합물, 천연 유래 펩타이드, 합성 펩타이드 등이 포함될 수 있다. 이들은 주로 linker group을 매개로 reactive group에 연결되어 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체을 형성할 수 있으며, 경우에 따라서는 linker group없이 직접 reactive group에 결합되어 변형된 것일 수도 있다. 또한, 본 발명에서는 주로 생체 내(in vivo)에 처리하여 혈장 단백질의 선택적인 'S-S 공유결합' 여부를 시험관 내(in vitro)의 간단한 정성 및 정량 방법을 통하여 직접 혹은 간접적으로 분석 가능하도록 생리활성 기질 화합물을 변형하였다.
6) Blood components: 본 발명의 생리활성 기질이 생체내 분해되지 아니하여 안정하고 반감기가 증가할 수 있도록 혈액내 단백질 (혈액 성분) 상의 특정 관능기와 안정한 결합을 형성하여야 하는데, 이 때의 혈액 성분(blood components)은 혈 액 내에서 유동성을 갖고 있거나 혹은 고정되어 존재할 수 있다. 고정형 혈액성분(fixed blood component)은 혈액 내에서 이동할 수 없는 tissues membrane receptors, interstitial proteins, fibrin proteins, collagens, platelets, en-dothelial cells 및 epithelial cells 등을 포함할 수 있다. 또한, 그들과 연관된 세포막, 세포막 수용체, somatic body cells, skeletal, smooth muscle cells, neuronal components, osteocytes 및 osteoclasts 등일 수도 있다. 이동성 혈액성분(mobile blood components)은 혈액 내에서 고정적이지 않고 지속적으로 이동하는 혈액성분이라 할 수 있다. 일반적으로 이들은 세포막과 연관성이 없으며 적어도 혈액 내에 0.1 g/ml이상 존재한다. 본 발명에 작용 대상이 될 수 있는 이동성 혈액성분으로서의 혈액내 단백질 성분으로는 serum albumin, transferrin, ferritin, celuroplasmin 그리고 IgM 및 IgG와 같은 immunoglobulin 등이 있다. 일반적으로 이들 이동성 혈액성분의 생체 내 반감기는 적어도 12시간 이상이다. 이 중에서도, serum albumin이 가장 바람직하며, serum albumin의 34번째 아미노산인 cysteine 상의 free thiol group과 안정한 disulfide 공유 결합을 형성하는 것이 가장 바람직하다.
7) Plasma protein: 혈장 단백질(plasma protein)은 혈장에 함유되어 있는 단백질이라 지칭할 수 있다. 혈액 내 존재하는 혈장 단백질의 대부분은 serum albumin과 globulin이 대부분을 차지하고 있다. 혈장 100 M 내에는 대략 7 g이 함유되어 있으며 그 중 albumin은 50∼70％ 정도, globulin이 대략 20∼50％ 정도 그리고 섬유소원(fibrinogen)이 10％ 이내로 포함되어 있다. 섬유소원이 포함되어 있 지 않은 혈액 단백질을 혈청 단백질(serum protein)이라 한다.
8) Functionality: Functionality는 변형 생리활성 기질 화합물(modified substances)의 reactive group들과 반응하여 새로운 'S-S 공유결합'을 형성할 수 있는 혈액 성분들 바람직하게는 혈장 단백질 상의 관능기(functional group)라 설명될 수 있다. 일반적으로 혈장 단백질 상에는 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)이 다양하게 존재한다. 하지만 본 발명에서는 주로 혈장 단백질 상의 free thiol group(-SH)과 변형된 생리활성 기질 화합물의 reactive group들이 반응하여 새로운 'S-S 공유결합'을 형성한다.
9) Protective group: 보호기(protective group)는 펩타이드 합성에서 아미노산들 간의 반응으로부터 유래된 화학적인 관능기(functional group)라 정의할 수 있으며, 대표적인 보호기들로는 acetyl(Ac), fluorenylmethyloxy-acrbonyl(Fmoc), t-butyloxycarbonyl(Boc), benzyloxycarbonyl(Cbz), t-butyl(t-Bu), tri-phenylmethyl(Trt), 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-S-sulfonyl(Pbf)등이 있다. 본 발명에서 사용된 일반적인 펩타이드의 보호기 및 그의 약어를 아래의 Table 1에 정리하였다.
Table 1. Natural amino acids and their abbreviations
Figure 112008029353431-PCT00001
2. 변형 생리활성 기질 화합물(Modified substances)의 구조적인 형태 및 구성
본 발명의 변형 생리활성 기질 화합물 (생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체)의 구조적 형태 및 구성은 다음과 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112008029353431-PCT00002
"X 1 , bioactive substances"은 100,000이하의 분자량을 갖는 생리활성을 갖는 반응 화합물로서 포유류에서 바람직하게는 인간에서 나타나는 병증에 대하여 예방 및 치료의 목적으로 사용 가능한 약리활성이 있는 천연 유래의 천연물, 펩타이 드, 호르몬, 합성 펩타이드, 합성 호르몬 및 의약 원료물질 등을 지칭한다. 예를 들어, 포유류에 대하여 혈당 강하효과가 있는 glucagons like peptide-1(GLP-1) 또는 exendin-3 또는 -4 등과 같은 펩타이드 등이 이에 속할 수 있다.
"X 2 , linker group"은 생리활성 기질 화합물과 reactive group사이에 위치하여 화학적인 결합으로 연결하는 linker group을 지칭한다. Linker group은 methyl, ethyl, propyl, butyl 등과 같은 하나 또는 그 이상으로 구성된 C1 내지 C6의 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group 또는 치환된 heterocyclic group등으로 구성될 수 있다. 또한, linker group은 AEA((2-amino) ethoxy acetic acid)등을 포함하는 poly ethoxy amino acid를 포함할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 linker group은 에톡시기를 한 개 내지 세 개 포함하는 AE(E)nA (n=0∼2)([2-(2-amino)-ethoxy](ethoxy)n acetic acid)일 수 있다. 특히 AEEE acetic acid(AEEEA)를 사용하는 경우 가용성이 증진되고, 생리활성 기질과 혈액성분 간의 안정한 공유 결합 형성에 유리한 효과가 있으며, AEEA 보다 더 좋은 혈당강하 효과를 나타낼 수 있다.
"X 3 , reactive group"은 상기한 바와 같이 혈액 내 존재하는 혈액 성분 단백질 상의 특정 관능기, 예컨대, hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 또는 carboxyl group(-CO2H)과 새롭고 안정한 공유결합, 바람직하게는 혈장 단백질 (plasma protein) 상의 free thiol group (-SH group)과 "S-S 공유결합"을 형성할 수 있는 기능을 갖는 모든 chemical group를 지칭한다. 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 reactive group들은 일반적으로 수용액 환경에서 안정하며 혈액 단백질, 바람직하게는 albumin 상의 free thiol group과 반응하여 새로운 "S-S 공유결합"을 형성할 수 있는 disulfanyl group일 수 있다. Reactive group은 예를 들어, 2-pyridyl disulfanyl group, N-alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxyl-benzyl disulfanyl group, 1-phenyl-1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group 또는 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group등을 포함할 수 있다. 상기에 언급된 reactive group의 화학구조를 아래에 정리할 수 있으며, 이들은 free thiol group과 반응하여 이탈기로 작용할 수 있는 leaving group을 포함하는 것일 수 있다.
화학식 1.,reactive group (X3)의 화학구조 예시
Figure 112008029353431-PCT00003
3. 생리활성 기질 화합물의 합성
(1) 일반적인 펩타이드의 명명 및 보호기
'D' 접두사에 의해 달리 특정되지 않는 경우(예를 들어, D-Ala 또는 NMe-D-Ile), 명세서 및 청구항에 기재된 펩타이드내 아미노산 및 아미노아실 잔기의 α-탄소의 입체화학은 천연 또는 'L' 배위이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 아미노산의 명명, 약어 및 실제 합성에서 사용된 아미노산은 상기 Table 1과 같이 표기한다. 또한, D-형의 아미노산 표기는 각각 D 접두사를 사용하여 세 자의 영문 약어를 이용하거나 또는 한 자의 소문자 영문 약어를 이용하여 표기할 수 있다. 예를 들어 D형 alanine의 약어 표기는 "D-Ala" 또는 "a"로 표기될 수 있다.
위에서 약어로서 표기되지 않은 경우, 명명법 및 약어는 문헌 [Calbiochem-Novabiochem Corp. 1999 Catalog and Peptide Synthesis Handbook or the Chem- Impex International, Inc. Tools for Peptide amp; Solid Phase Synthesis 1998-1999 Catalogue]을 참조하여 추가할 수 있다.
(2) 일반적인 펩타이드의 합성방법
본 발명에서 수행되는 연속적인 아미노산의 축합은 관련 기술 분야에서 널리 알려져 있는 자동 펩타이드 합성기 또는 본 출원인의 자동 펩타이드 합성기 [Peptron, Inc., Korea; see 대한민국 특허 출원 제2000-0049344호]로 수행할 수 있다. 바람직한 합성 반응의 조건으로는 Fmoc 그룹으로 보호된 α-아미노산을 2급 아민 용액, 바람직하게 piperidine으로 처리하여 탈 보호 시킨 후, 충분히 과량의 용매로 세척하고 coupling 반응을 원하는 또 다른 각각의 보호된 아미노산과 coupling 시약들을 약 5배 몰 과량 첨가하여 DMF 용매 중에서 반응을 진행할 수 있다. 본 발명에 주로 사용된 coupling 시약들로는 N, N'-dicyclohexylcarbodiimide(DCC), N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC), O -benzotri-azol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate(HBTU), ben-zotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate(PyBOP), benzo-triazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate(BOP), [O-(7-azabenzotri-azol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate](HATU), lH-hydroxy-benzotriazols(HOBt), lH-hydroxy-7-azabenzotriazole(HOAt) 등이 있으며, 경우에 따라 TFA, DIEA, NMM등과 같은 organic base를 첨가하여 반응을 진행할 수 있다.
본 발명에서 고체상 수지를 이용한 펩타이드의 합성 마지막 단계에서는 폴리펩타이드를 연속적으로 또는 1회 조작으로 수지로부터 얻고자 하는 펩타이드를 제거하고 각각 아미노산의 잔기를 보호하고 있는 보호 그룹들을 탈 보호 시킨다. 수지로부터 폴리펩타이드의 제거 및 잔기에 존재하는 보호기들의 탈 보호 조건으로는 일반적으로 수지-폴리펩타이드 간의 결합을 절단하는 절단 시약 칵테일, 예를 들어, trifluoroacetic acid(TFA), triisopropylsilane(TIS), thioanisole, 물 또는 ethanedithiol(EDT)등으로 구성된 디클로로메탄 혼합 칵테일 용액을 처리하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시킨다. 이상과 같이 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전 시키고 과량의 TFA, TIS, thioanisole, 물 및 EDT 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻는다.
완전히 탈 보호된 펩타이드 염은 물과 아세트나이트릴 용매로 구성된 혼합 용매를 흘리고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 정제한다. 분리 정제된 펩타이드 용액은 동결건조 시켜 완전히 농축 건조 시킴으로써 고형의 펩타이드를 얻는다.
4. 알부민과 생리활성 기질-복합체의 정량방법
본 발명에서는 in vivo에서 conjugation된 albumin 및 변형 생리활성 기질 화합물의 disulfide complex에 대하여 in vitro에서 conjugation complex의 효과적인 정량 방법을 제공할 수 있다.
기존의 albumin-생리활성 기질 화합물 conjugation complex의 존재 여부를 측정하기 위하여 별도로 albumin complex를 정제해서 LC-MS 및 MALDI-TOF을 이용하여 분석해야 하는 실험적 제한점 및 문제점들이 있었으나, 본 발명에서는 DTT(dithiothreitol; Cleland's reagent)의 처리를 통해 disulfide complex간 결합을 선택적으로 환원시켜 유리되어 방출되는 생리활성 기질 화합물의 양을 정량 할 수 있다. 상기 분석 방법은 albumin에 conjugation되어 있는 생리활성 기질 화합물을 실험관내(in vitro) 방법으로 HPLC 분석을 통해 효과적으로 정량 할 수 있다는 점에서 실험적 의미를 갖는다.
The present invention is further explained in more detail with reference to the following examples. These examples, however, should not be interpreted as limiting the scope of the present invention in any manner.
EXAMPLE
Example 1:
화합물 1: D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 -(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA. (SEQ ID NO: 1) (PDSP: propionic disufanyl pyridine, 이하 동일)
rink amide MBHA (Methylbenzhydrylamine) resin (Novabiochem Corporation) 0.6mmol/g을 100 mol을 측량하여 반응용기에 넣었다. 상기 Resin을 5 ml의 DMF로 용매화시키고, 5분간 충분히 swelling시켰다. Swelling된 수지에 20％ 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 shaking시키고 피페리딘 용액을 제거한 후, 다시 20％ 피페리딘 DMF 용액을 첨가하고 10분간 반응시켜, 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거한 후, 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test [E. Kaiser et al., Anal. Biochem. (1970) 34, 595]로 확인하였다.
Fmoc-Lys(Aloc)-OH(500 mol), HOBt(500 mol), HBTU(500 mol) 및 DIEA(1 mmol)를 5 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호 된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다.
다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다: (1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20％ piperidine DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) BMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척 시킨다.
Step 1: Coupling step
Fmoc으로 보호된 아미노산(5 당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링 시킨다: (1) Fmoc-Lys(Aloc)-OH; (2) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; (3) Fmoc-Gly-OH; (4) Fmoc-Lys(tBoc)-OH; (5) Fmoc-Val-OH; (6) FmocLeu-OH; (6) Fmoc-Trp-OH; (7) Fmoc-Ala-OH; (8) Fmoc-Ile-OH; (9) Fmoc-Phe-OH; (10) Fmoc- Glu(OtBu)-OH; (11) Fmoc-Lys(tBoc)-OH; (12) Fmoc-Ala-OH; (13) Fmoc-Ala-OH; (14) Fmoc-Gln(Trt)-OH; (15) Fmoc-Gly-OH; (16) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; (17) Fmoc-Leu-OH; (18) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; (19) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (20) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (21) Fmoc-Val-OH; (22) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; (23) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (24) Fmoc-Thr(tBu)-OH: (25) Fmoc-Phe-OH; (26) Fmoc-Thr(tBu)-OH; (27) Fmoc-Gly-OH; (28) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; (29) Fmoc-D-Ala-OH; (30) Boc-His(N-Trt)-OH.
Step 2: Selective deprotection step of Aloc group
Pd(PPh3)4(300 mol)을 5 ml의 CH3Cl:NMM:AcOH(18:1:0.5)에 녹인 후, step 1에서 합성된 resin에 첨가하여 실온에서 2시간 이상 shaking시켰다. 반응 레진은 CHCl3(10 ml X 6회); 20％ acetic acid CH2Cl2 solution(10 ml X 6회); CH2Cl2(10 ml X 6회); DMF(10 ml) 6회 이상 세척해 주었다. 선택적인 Aloc group에 대한 탈 보호 여부는 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 확인 하였다.
Step 3: Introduction step of linker group
Fmoc-(AEEA)-OH(Fmoc-miniPEG-OH, 3 mmol), HOBt(3 mmol), HBTU(3 mmol) 및 DIEA(6 mmol)를 10 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈 보호된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 이상 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 10회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다. 10 ml의 20％ piperidine DMF 용액을 처리하여 30분 이상 shaking하여 Fmoc 보호기를 제거한 후 10 ml의 DMF로 5회 이상 세척하였다.
Pierce Biotechnology로부터 구입한 N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate(SPDP, 2 mmol)를 5 ml의 CH2Cl2 용매에 녹이고 위에서 합성한 레진과 3시간 이상 shaking시켜 반응 시킨 후, CH2Cl2(10 ml) 6회 이상 세척해 주었다.
Step 4: Cleavage step
합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 레진을 3시간 동안 TFA/물(95:5)의 혼합물을 사용하여 레진으로부터 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 diethyl ether 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전시키고 과량의 TFA를 일차 제거하고 이상과 같은 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 펩타이드를 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 TFA 염 형태로 화합물 1, D-Ala8-GLP-1 (7-36)-Lys37-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA 을 얻었다:
화합물 1: D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 -(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA: Rt=23.63분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,769.
상기와 같은 화합물 1의 합성과정은 아래의 반응식 1과 같이 정리할 수 있 다.
반응식 1. D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 -(AEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA (화합물 1)의 합성 과정
Figure 112008029353431-PCT00004
이상과 동일한 합성 과정을 통하여 아래와 같은 펩타이드를 제조하였다.
화합물 2: D-Ala 8 -GLP-1 (7-36)-Lys 37 -(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 2). Rt=23.51분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,814.
화합물 3: D-Ala 8 -Lys 26 -(ε-AEEA-PDSP)-GLP-1 (7-36)-NH 2 .4TFA: His-D-Ala- Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 3). Rt=23.78분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,641.
화합물 4: D-Ala 8 -Lys 26 -(ε-AEEEA-PDSP)-GLP-1 (7-36)-NH 2 .4TFA: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH 2 .4TFA (SEQ ID NO: 4). Rt=23.66분(0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,686.
화합물 5: GLP-1 (7-36)-Lys 37 -(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA(SEQ ID NO: 5). Rt=23.61분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,769.
화합물 6: GLP-1 (7-36)-Lys 37 -(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .4TFA(SEQ ID NO: 6). Rt=23.49분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF= 3,814.
화합물 7: Exendin-4 (1-39)-Lys 40 -(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .5TFA: His-Gly-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 7). Rt=15.68분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,658.
화합물 8: Exendin-4 (1-39)-Lys 40 -(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 8). Rt=17.19분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,702.
화합물 9: Lys 27 -(ε-AEEA-PDSP)-Exendin-4(1-39)-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 9). Rt=21.81분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,533.
화합물 10: Lys 27 -(ε-AEEEA-PDSP)-Exendin-4 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 10). Rt=21.75분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,577.
화합물 11: Exendin-3 (1-39)-Lys 40 -(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 11). Rt=20.73분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,676,
화합물 12: Exendin-3 (1-39)-Lys 40 -(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 12). Rt=20.68분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,721.
화합물 13: Lys 27 -(ε-AEEA-PDSP)-Exendin-3 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 13). Rt=20.65분(0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF =4,547.
화합물 14: Lys 27 -(ε-AEEEA-PDSP)-Exendin-3 (1-39)-NH 2 .5TFA: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH 2 .5TFA (SEQ ID NO: 14). Rt=20.55분 (0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MALDI-TOF=4,592.
Example 2
화합물 15: Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 15). (Pyr=pyroglutamic acid, pE)
rink amide MBHA resin (Novabiochem Corporation) 0.6 mmol/g을 100 mol을 측량하여 반응용기에 넣었다. Resin을 5 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 swelling시켰다. Swelling된 수지에 20％ 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 shaking시키고 피페리딘 용액을 제거한 후 다시 20％ 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다.
Fmoc-Lys(Aloc)-OH(500 mol), HOBt(100 mol), HBTU(500 mol) 및 DIEA(1 mmol)를 5 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈 보호 된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다.
다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다: (1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20％ piperidine DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈 보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척하였다.
Step 1: Coupling step
Fmoc으로 보호된 아미노산(5 당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링 시킨다: (1) Fmoc-Lys(Aloc)-OH; (2) Fmoc-Gly-OH; (3) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (4) Fmoc-Gly-OH; (5) Fmoc-Pro-OH; (6) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; (6) Fmoc-Leu-OH; (7) Fmoc-D-Leu-OH; (8) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; (9) Fmoc-Ser(tBu)-OH; (10) Fmoc-Trp(Boc)-OH; (11) Fmoc-His(Trt)-OH; (12) Boc-Pyr(tBu)-OH.
Step 2: Selective deprotection step of Aloc group
Pd(PPh3)4(300 mol)을 5 ml의 CH3Cl:NMM:AcOH(18:1:0.5)에 녹인 후, Step 1에서 합성된 resin에 첨가하여 실온에서 2시간 이상 shaking시켰다. 반응 레진은 CHCl3(10 ml X 6회); 20％ acetic acid CH2Cl2 solution(10 ml X 6회); CH2Cl2(10 ml X 6회); DMF(10 ml) 6회 이상 세척해 주었다. 선택적인 Aloc group에 대한 탈 보호 여부는 Kaiser test를 실시예 1과 동일하게 실시하여 확인하였다.
Step 3: Introduction step of linker group
Fmoc-(AEEA)-OH(Fmoc-miniPEG-OH, 3 mmol), HOBt(3 mmol), HBTU(3 mmol) 및 DIEA(6 mmol)를 10 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈 보호된 수지에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 이상 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 10회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다. 10 ml의 20％ Piperidine DMF 용액을 처리하여 30분 이상 shaking하여 Fmoc 보호기를 제거한 후 10 ml의 DMF로 5회 이상 세척하였다.
Pierce Biotechnology로부터 구입한 N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate(SPDP, 2 mmol)를 5 ml의 CH2Cl2 용매에 녹이고 위에서 합성한 레진과 3시간 이상 shaking시켜 반응 시킨 후, CH2Cl2(10 ml) 6회 이상 세척해 주었다.
Step 4: Cleavage step
합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 레진을 3시간 동안 TFA/물(95:5)의 혼 합물을 사용하여 레진으로부터 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 diethyl ether 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전시키고 과량의 TFA를 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 펩타이드를 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 TFA 염 형태로 목적 생리활성 기질 화합물 15, Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA을 얻었다.
화합물 15: Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Rt=23.63분(0.01％ TFA를 함유하는 5％ 내지 100％의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1853.
상기과 같은 화합물 15의 합성과정은 아래의 반응식 2와 같이 정리할 수 있다.
반응식 2. Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA (화합물 15)의 합성 과정
Figure 112008029353431-PCT00005
이상과 동일한 합성 과정을 통하여 아래와 같은 펩타이드를 제조하였다.
화합물 16: Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA(SEQ ID NO: 16). (Pyr=pyroglutamic acid)
화합물 17: Leuprolide-GG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA(SEQ ID NO: 17). (Pyr=pyroglutamic acid)
화합물 18: Leuprolide-GG-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA(SEQ ID NO: 18). (Pyr=pyroglutamic acia)
화합물 19: Leuprolide-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 19). (Pyr=pyroglutamic acid)
화합물 20: Leuprolide-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH 2 .2TFA (SEQ ID NO: 20). (Pyr=pyroglutamic acid)
Example 3
3.1. Albumin Binding Test:
본 발명에서 상기의 Example 2에서 합성된 변형 생리활성 기질 화합물 15(Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA)가 HSA(human serum albumin) 상의 free thiol group(Cys34)에 conjugation되어 혈액 내 안정성이 증가함을 albumin 결합 정도를 측정함으로써 알 수 있다. 또한 본 실험 방법을 통하여 합성된 화합물 15가 변형되지 않은 Leuprolide에 비해 albumin에 보다 효과적으로 결합되어 안정성이 증가됨을 알 수 있으며 시험관내(in vitro)에서 간편한 HPLC의 분석을 통해 정량 및 결합여부를 측정할 수 있다.
기존의 albumin-생리활성 기질 화합물 conjugation complex의 존재 여부를 측정하기 위하여 별도로 albumin complex를 정제해서 LC-MS 및 MALDI-TOF을 이용하 여 분석해야 하는 실험적 제한점 및 문제점들이 있었다. 그러나, 본 발명에서 제시하는 albumin binding test는 간단한 sample 전처리 및 HPLC 분석을 통해 conjugation 여부를 in vitro에서 측정할 수 있다는 실험적인 의미를 갖는다.
(1) Stock solution의 제조:
human serum albumin(HSA, Sigma Aldrich) 66.5 mg을 PBS 완충 용액(pH 7.2, 1 ml)에 녹여 HSA(1 mM) solution을 제조하여 이용하였다. 동일한 방법으로 1 mM의 변형된 생리활성 기질 화합물 15(1.8 mg/ml) 및 Leuprolide(1.2 mg/ml) stock solution을 각각 제조하여 이용하였다.
(2) Albumin binding test:
상기 방법에 의해 제조된 stock solution을 하기의 Table 2와 같은 조성을 갖도록 PBS 완충용액으로 희석하여 측정 sample solution(100 ㎕)을 만들고, 각각의 reaction mixture를 혼합하여 37℃의 온도 조건을 유지시키며 배양기 내에서 30분간 천천히 shaking시켜 주었다. 배양 후, 각각의 sample vial에 methanol (150 ㎕)을 첨가하고 10분간 voltexing하여 HSA를 침전시켰다. 침전된 albumin을 원심분리기(12,000 rpm, 10℃, 10분)를 이용하여 spin down시키고 상층액 (50 ㎕)을 취하여 HPLC을 통하여 동일한 조건에서 분석하였다.
Table 2. Stock solution의 구성
Figure 112008029353431-PCT00006
(3) Result:
Albumin의 농도를 고정하고 생리활성 기질 화합물의 농도를 증가시키며 conjugation 정도를 조사한 결과, disulfide conjugation 정도는 실험에 사용된 albumin의 상태와 많이 밀접할 것으로 판단되며 특히, free thiol에 대한 content와 연관이 있을 것으로 생각된다. 생리활성 기질 화합물 15의 10 nmole 이하에서는 생리활성 기질 화합물이 모두 albumin에 conjugation되었음을 확인하였으며 20 nmole 농도부터는 conjugation 되지 않은 화합물 15가 관측되기 시작하고, 첨가한 양이 증가함에 따라 결합되지 않는 화합물 15가 증가하는 양의 상관관계를 볼 수 있었다. 이상의 결과는 하기의 Table 3에 정리하였으며, 실험결과에 따르면 사용한 HSA의 경우는 약 34％ 정도가 생리활성 기질 화합물과 반응하며, albumin의 34 번 위치의 free thiol group과 선택적으로 반응하는 것으로 보인다.
Table 3. Albumin binding test 결과
Figure 112008029353431-PCT00007
3.2. Albumin-생리활성 기질 화합물 Conjugation Complex의 정량방법:
상기 Example 3.1의 실험 방법을 통해 conjugation된 albumin 및 변형 생리활성 기질 화합물 15 (Leuprolide-GSG-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA)의 disulfide 복합체 (complex)에 대하여 DTT(dithiothreitol; Cleland's reagent)의 처리를 통해 disulfide complex간 결합을 선택적으로 환원시켜 유리되어 방출되는 생리활성 기질 화합물 15을 정량 할 수 있다. 상기 분석 방법은 albumin에 conjugation되어 있는 생리활성 기질 화합물을 실험관내(in vitro) 방법으로 HPLC 분석을 통해 효과적으로 정량할 수 있는 실험적 의미를 갖는다.
(1) Stock solution의 제조:
human serum albumin(Sigma Aldrich) 66.5 mg을 PBS 완충 용액(pH 7.2, 1 ml)에 녹여 HSA(1 mM) solution을 제조하여 이용하였다. 동일한 방법으로 1 mM의 생리활성 기질 화합물 15(1.8 mg/ml)및 100 mM의 DTT(15.4 mg/ml) stock solution을 각각 제조하여 이용하였다.
(2) Conjugation complex (albumin-생리활성 기질 화합물 15)의 정량:
상기 방법에 의해 제조된 stock solution을 이용하여 Example 2의 albumin binding test 방법과 동일한 조건으로 10개의 tube에 각각 albumin solution(50 ㎕) 및 생리활성 기질 화합물 15 solution(10 ㎕)를 혼합한 후 37℃의 온도 조건에서 30분간 천천히 shaking하며 incubation시켰다.
배양 후, DTT를 0 nmole, 100 nmole(2X), 200 nmole(4X), 500 nmole(10X), 및 1,000 nmole씩 각각 첨가하여 혼합하고 37℃ 온도조건에서 1시간 가량 반응시켰다. 1시간 경과 후, 각각의 sample에서 25 l씩을 취하여 50 l의 MeOH을 첨가하고 10분간 voltexing하여 HSA를 침전시켰다. 침전된 albumin을 원심분리기(12,000 rpm, 10 ℃, 10 분)를 이용하여 spin down시키고 상층액(50 ㎕)을 취하여 HPLC을 통하여 동일한 조건에서 분석하였다.
본 발명에서는 albumin-생리활성 기질 화합물간의 disulfide conjugation 여부를 측정하기 위하여 DTT 처리를 통하여 정량 분석을 실시하는데 DTT의 처리 과정 및 정량 분석 과정을 아래의 반응식 3과 같이 나타낼 수 있다.
반응식 3. Albumin-생리활성 기질 화합물 conjugation complex의 DTT 처리 정량방법
Figure 112008029353431-PCT00008
Albumin과 생리활성 기질 화합물 15와의 결합 실험에서 1mmole의 albumin에 대하여 0.34 mmole의 화합물 15이 결합한다는 것이 관측되었다. Albumin의 특성과 실험 결과를 미루어 볼 때 화합물 15는 albumin 34 위치의 Cys과 disulfide conjugation을 이루고 있는 것으로 추정된다. 이상과 같이 albumin과 화합물 15가 disulfide 결합을 하고 있다면 적절한 농도의 DTT 시약의 처리를 통해 free thiol group 형태를 갖는 화합물 15-1이 disulfide conjugation으로부터 방출될 것으로 추론 할 수 있다. 이러한 목적을 가지고 우선 albumin과 화합물 15를 30 분간 incubation시켜 disulfide conjugation을 형성 시키고, 100 nmole부터 1,000 nmole까지 네 가지의 각기 다른 양의 DTT를 첨가한 후 1시간 동안 incubation하였다. 1,000 nmole이상의 고농도로 DTT를 처리할 경우, albumin 단백질이 DTT에 의해 변성되어 많은 양의 albumin 침전이 형성되었으며 이로 인해 분석 및 관측이 용이하 지 않았다. 상기 시험결과를 아래의 표 3에 나타내었다. Table 4에서 정리된 바와 같이 모든 DTT 처리 농도에서 방출될 것으로 예상되었던 화합물 15-1이 HPLC 분석을 통해 관측되었으며, 저농도로 처리했을 때 보다 고농도로 처리했을 경우에 방출 예상 화합물 15-1이 용이하게 관측되었다.
Table 4. DTT 처리 결과
Figure 112008029353431-PCT00009
Example 4: Animal Test
4.1. 혈당 강하 활성 측정 실험(OGTT: oral glucose tolerance test):
4.1.1. 실험 방법
본 발명에서는 화합물 1의 혈당강하 활성을 측정하기 위한 실험으로 급성 혈당저하 효과와 활성의 지속 여부를 측정하기 위하여 본 실시예를 수행하였다. 혈당강하 활성 및 활성 지속 여부를 측정하기 위한 대조샘플로 native glucagon-like peptide-1(GLP-1, 7-36)를 사용하였으며, oral glucose tolerance test(OGTT)에 의해 각 펩타이드 샘플의 활성을 측정하였다.
실험동물로 ICR female mouse (6 weeks old, Hanlim Experimental Animal Inc., Seoul, Korea)를 7일간 실험실에서 적응기간을 거치고, 실험 전에 18 시간 동안 절식시킨 후 사용하였다. 미리 정해진 양의 펩타이드 샘플을 복강 투여하고, 15분 후에 glucose (1.5 g/kg of mouse in 10 mM phosphate buffered saline, pH 7.4)를 경구 투여하였다 (glucose 투여시점을 0분으로 하였다.). 각 정해진 시간에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 glucometer (Accucheck Sensor, Roche)로 혈당을 측정하였다. 혈당강하 활성 및 활성 지속 여부의 측정을 위한 실험은 앞서 나타낸 Table 5와 같이 정리할 수 있다.
Table 5. 혈당강하 활성 측정 샘플
Figure 112008029353431-PCT00010
4.1.2. Result: Hypoglycemic effect
본 발명에서는 화합물 1의 혈당강하 활성을 측정하기 위한 실험으로 급성 혈당저하 효과와 활성의 지속 여부를 측정하기 위해 대조샘플로 native glucagon-like peptide-1(GLP-1, 7-36)을 사용하여 oral glucose tolerance test(OGTT) 측정 방법을 통해 각 peptide 샘플의 활성이 측정되었다.
먼저, oral glucose tolerance test(OGTT)를 통해 측정한 본 발명의 화합물 1과 native GLP-1을 10및 100 nmol/kg 씩 mouse에 투여했을 때의 급성 혈당 강하 효과에 대한 동물 실험 결과를 Fig. 1에 나타내었다. Fig. 1에서 화합물 1 또는 native GLP-1 대신에 saline을 투여한 군을 control group으로 하고, 각 sample은 15분 전에 시험 화합물을 복강 투여하였으며, glucose는 0분에 1회 각 sample에 경구 투여하였고, 각 군의 mouse 수는 4마리로 하였다. Native GLP-1(10 nmol)을 투여한 군은 saline만을 투여한 control군에 비해 혈당저하 곡선에서 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. Native GLP-1(100 nmol)을 투여한 군은 control군과 뚜렷한 차이를 보였으며, glucose 투여 20분 후 피크정점에서의 혈당이 control 군에 비해 약 40％ 낮아짐을 보였다. 반면, 화합물 1은 10 nmol을 투여한 군이 native GLP-1(100 nmol)을 투여한 군과 비슷한 혈당저하 효과를 보였으며, 화합물 1(100 nmol) 투여군은 혈당이 glucose 투여전의 basal level에서 120분 동안 크게 변하지 않음을 보였다. 따라서 화합물 1은 투여량 100 nmol 기준에서 native GLP-1에 비해 월등히 우수한 혈당조절 효과를 보임을 확인할 수 있다.
이상의 결과로 미루어 볼 때, native GLP-1에 비하여 화합물 1이 월등한 혈당조절 효과를 나타내는 것은 반감기가 극히 짧아 생체 내 안정성이 좋지 않은 native GLP-1에 비하여 동량 투여된 화합물 1의 2-pyridyl disulfanyl group이 혈액 내 존재하는 albumin의 free thiol group(Cys34)과 생체 내(in vivo)에서 새로운 'disulfide 공유결합'으로 conjugation됨으로써 생체 내 안정성이 현저히 증진되었음에 기인된 것으로 판단된다.
또한, 화합물 1의 혈당강하에 대한 지속 효과 (long-acting)를 native GLT-1과 비교하여 Fig. 2에 나타내었다. Fig. 2에 있어서, 각 sample은 15분 전에 1회 투여하였으며, glucose는 0분과 180분에 각각 투여하였고, 각 군의 mouse 수는 4마리로 하였다. Native GLP-1 투여군은 180분에 재차 glucose를 투여하였을 때 control군과 비슷한 혈당 수준을 보였음에 반해, 화합물 1 투여 군은 혈당 저하 효과에서 control군과 뚜렷한 차이를 보였다. 따라서 화합물 1은 체내에서 native GLP-1에 비해 활성을 더 오랜 시간 동안 유지시킴을 확인할 수 있었다. 이 결과는 native GLP-1이 짧은 반감기로 인해 체내에서 빠르게 소실되거나 작용을 상실함에 비해 화합물 1은 체내에서 보다 장시간의 반감기를 유지하며 혈당 저하 효과를 지속시킴을 보여준다. 이와 같은 결과 또한 앞서 마찬가지로 화합물 1의 2-pyridyl disulfanyl group이 혈액 내 존재하는 albumin의 free thiol group(Cys34)과 생체 내(in vivo)에서 새로운 'disulfide 공유결합'으로 conjugation됨으로써 생체 내 안정성이 현저히 증진되었음에 기인된 것으로 판단된다.
4.2. 혈당 강하 활성 측정 실험(IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test):
4.2.1. 실험 방법
본 발명에서는 화합물 1, 7, 8의 혈당강하 활성을 측정하기 위한 실험으로 혈당저하 효과의 지속성 여부를 측정하기 위하여 본 실시예를 수행하였다. 혈당강하 활성 및 활성 지속 여부를 측정하기 위한 대조샘플로 native GLP-1, d-ala-GLP-1, Exendin-4를 사용하였으며, Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)에 의해 각 펩타이드 샘플의 활성을 측정하였다.
실험동물로 ICR female mouse (6 weeks old, DaehanBioLink, Korea)를 7일간 실험실에서 적응기간을 거친 후 사용하였다. 실험 전에 group당 8마리씩을 선별한 후 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈중 glucose 농도를 glucometer (Accucheck Sensor, Roche)로 측정한 후 15시간에서 18시간 가량 절식을 시켰다. 이후 미리 정해진 양의 펩타이드 샘플을 피하주사로 투여하고 4시간 혹은 9시간 후에 glucose(2g/kg of mouser in PBS, pH 7.2)를 복강 투여하고, (glucose 투여시점을 0분으로 하였다.) 각 정해진 시간에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 glucometer로 혈당을 측정하였다. 혈당강하 활성 및 활성 지속 여부의 측정을 위한 실험은 앞서 나타낸 Table 6와 같이 정리할 수 있다.
Table 6. 혈당강하 활성 측정 샘플
Figure 112008029353431-PCT00011
4.2.2. Result: Hypoglycemie effect
본 발명에서는 화합물 1, 7, 8의 혈당강하 활성을 측정하기 위한 실험으로 혈당강하 활성의 지속 여부를 측정하기 위한 대조샘플로 Native GLP-1, d-ala-GLP-1, Exendin-4를 사용하였으며 intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT) 측정 방법을 통해 각 peptide 샘플의 활성이 측정되었다.
Intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT)를 통해 측정한 본 발명의 화합물 1과 native GLP-1, d-ala-GLP-1을 100nmol/kg 씩 mouse에 투여했을 때의 혈당 강하 효과의 지속성에 대한 동물 실험 결과를 Fig. 3 에 나타내었다. Fig. 3 에서 화합물 PDD1001, native GLP-1, d-ala-GLP-1 대신에 saline을 투여한 군을 control group으로 하고, 각 sample은 4시간 전에 시험 화합물을 피하 투여하였으며, glucose는 0분에 1회 각 sample에 복강 투여하였고, 각 군의 mouse 수는 8마리로 하였다. Native GLP-1과 d-ala-GLP-1(100 nmol)를 투여한 군은 saline만을 투여한 control군에 비해 혈당저하 곡선에서 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 반면, 화합물 1을 100 nmol 투여한 군의 경우에는 4시간 후에도 뚜렷한 혈당 저하 곡선을 보여주었다. 따라서 화합물 1은 투여량 100 nmol 기준에서 native GLP-1 및 d-ala-GLP-1에 비해 월등히 우수한 혈당조절 효과를 보임을 확인할 수 있다.
다음으로 화합물 7, 8과 Exendin-4를 10nmol/kg 씩 mouse에 투여했을 때의 혈당 강하 효과의 지속성에 대한 동물 실험 결과를 Fig.4 에 나타내었다. Fig.4 에서 화합물 7, 8 및 exendin-4 대신에 saline을 투여한 군을control group으로 하고, 각 sample은 9시간 전에 시험 화합물을 피하 투여하였으며, glucose는 0분에 1회 각 sample에 복강 투여하였고, 각 군의 mouse 수는 8마리로 하였다. Exendin-4를 투여한 군은 saline만을 투여한 control군에 비해 혈당저하 곡선에서 약간의 감소 효과를 확인할 수 있었을 뿐, 통계학적으로 유의한 차이를 발견할 수 없었다. 반면에, 화합물 7, 8을 10 nmol 투여한 군의 경우에는 9시간 후에도 뚜렷한 혈당 저하 곡선을 보여주었으며, 특히 linker의 길이에 따른 약효의 증가를 보여주었다. 따라서 화합물 7, 8은 투여량 10 nmol 기준에서 exendin-4에 비해 월등히 우수한 혈당조절 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로 미루어 볼 때, native GLP-1 및 Exendin-4에 비하여 화합물 1, 7, 8이 월등한 혈당 조절 효과를 나타내는 것은 반감기가 짧아 생체 내 안정성이 좋지 않은 native GLP-1 및 Exendin-4에 비하여 동량 투여된 화합물 1, 7, 8의 2-pyridyl disulfanyl group이 혈액 내 존재하는 albumin의 free thiol group(Cys34)과 생체 내(in vivo)에서 새로운 'disulfide 공유결합'으로 conjugation됨으로써 생체 내 안정성이 현저히 증진되었음에 기인된 것으로 판단된다.

Claims (36)

  1. 천연 또는 합성 펩타이드, 천연 또는 합성 호르몬 및 의약 원료 물질로 이루어진 군 중에서 선택된 분자량 100,000 이하의 저분자량 생리활성 기질과 결합 가능한 linker group; 및
    혈액 성분 단백질 상의 hydroxyl group(-OH), thiol group(-SH), amino group(-NH2) 및 carboxyl group(-CO2H)로 이루어진 군중에서 선택된 관능기와 공유 결합 가능한 reactive group을 포함하는 생리활성 기질 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액 성분 단백질이 혈청 알부민, transfferin, celuroplasmin 또는 immunoglobulin이고, 상기 reactive group이 상기 혈액 성분 단백질의 상의 cysteine 잔기 상의 free thiol group(-SH)과의 disulfide 공유결합 (S-S)을 형성하는 것을 특징으로 하는 생리활성 기질 전달체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혈액 성분 단백질이 혈청 알부민이고, reactive group이 상기 혈청 알부민의 34번째 cysteine 상의 free thiol group과 안정한 disulfide 공유결합(S-S)을 형성하는 것을 특징으로 하는 생리활성 기질 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 reactive group이 linker group과의 결합 부위; 혈액 성분 단백질과의 공유 결합 형성 부위; 및 안정한 공유 결합 형성 후 유리되는 이탈기 (leaving group)를 포함하는 것인 생리활성 기질 전달체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 reactive group은 disulfanyl group인 생리활성 기질 전달체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 disulfanyl group은 2-pyridyl disulfanyl group, N - alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl- 1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 및 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질 전달체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 linker group은 C1 내지 C6의 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group, 치환된 heterocyclic group 및 AE(E)nA([2-(2-amino)-ethoxy] (ethoxy)n acetic acid) (n is 0, 1 or 2)로 이루어 진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질 전달체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 linker group은 AEEA 또는 AEEEA인 생리활성 기질 전달체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 생리활성 기질 전달체; 및
    상기 생리활성 기질 전달체의 linker group을 통하여 생리활성 기질 전달체에 연결된, 천연 또는 합성 펩타이드, 천연 또는 합성 호르몬 및 의약 원료 물질로 이루어진 군 중에서 선택된 분자량 100,000 이하의 저분자량 생리활성 기질을 포함하는, 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생리활성 기질이 insulinotropic peptide, glucagon family peptide hormone, 및 LHRH (Luteinzing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생리활성 기질이 glucagons like peptide-1(GLP-1), exendin-3, exendin-4, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 다음 의 화합물 1 내지 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체:
    화합물 1: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 2: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 3: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 4: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 5: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 6: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 7: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 8: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 9: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 10: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 11: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 12: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 13: His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-
    Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 14: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 15: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid, PE);
    화합물 16: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 17: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 18: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (whercin Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 19: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid); and
    화합물 20: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid).
  13. 제1항에 따른 생리활성 기질 전달체와 분자량이 100,000 이하인 저분자량 생리활성 기질을 결합시켜 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 형성시킴으로써 상기 저분자량 생리활성 기질의 반감기를 증가시키고 안정성을 향상시키는 단계, 및 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 투여하는 단계를 포함 하며,
    상기 생리활성 기질 전달체는 linker group과 reactive group을 포함하고,
    상기 linker group은 생리활성 기질과 결합하는 작용기이고,
    상기 reactive group은 linker group과의 결합 부위, 및 혈액 성분 단백질과 안정한 공유 결합을 형성할 수 있는 공유 결합 형성 부위를 포함하는 것이며,
    투여 시, 혈액 성분 단백질과의 안정한 공유 결합이 형성되어 생리활성 기질의 혈액 내 안정성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생리활성 기질 전달체의 reactive group이 혈액 성분 단백질과 안정한 공유 결합을 형성한 후, 상기 reactive group으로부터 이탈기 (leaving group)가 유리되는 단계를 추가로 포함하는 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 혈액 성분 단백질이 혈청 알부민, transfferin, celuroplasmin, 및 immunoglobulin으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 상기 공유 결합이 disulfide (S-S) 공유 결합이며, 상기 reactive group이 상기 혈액 성분 단백질의 상의 cysteine 잔기 상의 free thiol group(-SH)과 안정한 S-S 공유 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 혈액 성분 단백질이 혈청 알부민이고, reactive group이 상기 혈청 알부민의 34번째 cysteine 상의 free thiol group과 안정한 S-S 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 reactive group은 disulfanyl group인 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 disulfanyl group은 2-pyridyl disulfanyl group, N - alkylpyridinium disulfanyl group, 5-nitro-2-pyridyl disulfanyl group, 3-nitro-thiophenyl disulfanyl, 1-piperido disulfanyl group, 3-cyano-propyl disulfanyl group, 2-thiouredyl disulfanyl group, 4-carboxylbenzyl disulfanyl group, 1-phenyl- 1H-tetrazolyl disulfanyl group, 1-amino-2-naphthyl disulfanyl group, 3-carboxyl-6-pyridyl disulfanyl group, 2-benzothiazolyl disulfanyl group, 및 4-nitro-thiophenyl disulfanyl group으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 linker group은 C1 내지 C6의 alkyl group, alkoxy group, cycloalkyl group, polycyclic group, aryl group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group, 치환된 heterocyclic group 및 AE(E)n A ([2-(2-amino)-ethoxy] (ethoxy)n acetic acid) (n is an integer between 0 to 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 생리활성 기질이 insulinotropic peptide, glucagon family peptide hormone, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 생리활성 기질이 glucagons like peptide-1(GLP-1), exendin-3, exendin-4, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질의 체내 전달 방법.
  22. 제9항에 따른 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체를 포함하고, 혈액 성분 단백질과 안정한 공유 결합 형성이 가능하여, 생리활성 기질의 혈액 내 안정성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 생리활성 기질 전달용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 생리활성 기질이 insulinotropic peptide, glucagon family peptide hormone, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질 전달용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 생리활성 기질이 glucagons like peptide-1(GLP-1), exendin-3, exendin-4, 및 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 생리활성 기질 전달용 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 다음의 화합물 1 내지 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 생리활성 기질 전달용 조성물:
    화합물 1: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 2: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gll-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 3: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 4: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 5: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 6: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 7: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 8: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 9: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 10: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 11: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 12: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 13: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 14: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser- Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 15: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=ptroglutamic acid, pE);
    화합물 16: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 17: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 18: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 19: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid); and
    화합물 20: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid).
  26. 유효성분으로 제9항에 따른 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체의 유효량을 함유하고, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 생리활성 기질로서 insulinotropic peptide를 함유하는 것인, 인슐린 분비 촉진, 혈당 강하 또는 당뇨병 치료를 위한 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 다음의 화합물 1 내지 14로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 인슐린 분비 촉진, 혈당 강하 또는 당뇨병 치료를 위한 약학 조성물:
    화합물 1: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 2: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 3: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 4: His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-
    Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile- Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 5: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 6: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 7: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 8: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 9: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser- Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 10: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 11: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 12: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 13: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA; and
    화합물 14: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA.
  28. 유효성분으로 제9항에 따른 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체의 유효량을 함유하고, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 생리활성 기질로서 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)을 함유하는 것인, 포유류의 배란시기 조절, 성호르몬 관련 질환 치료 또는 진단을 위한 약학 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 성호르몬 관련 질환이 전립선암, 자궁내막증 또는 자궁근종인 약학 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 다음의 화합물 15 내지 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 약학 조성물:
    화합물 15: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA(wherein Pyr=pyroglutamic acid, pE);
    화합물 16: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)- NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 17: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 18: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 19: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid); and
    화합물 20: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid).
  31. 제9항에 따른 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체의 유효량을 그 투여를 필요로 하는 인간을 포함하는 포유류 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 병적 증상 또는 질병의 진단, 완화, 개선 또는 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 생리활성 기질로서 insulinotropic peptide를 함유하는 것인, 인슐린 분비 촉진, 혈당 강하 또는 당뇨병 치료 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 아래의 화합물 1 내지 14로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인, 인슐린 분비 촉진, 혈당 강하 또는 당뇨병 치료 방법:
    화합물 1: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 2: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 3: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ilc-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 4: His-
    D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2.4TFA;
    화합물 5: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 6: His-
    Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.4TFA;
    화합물 7: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 8: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 9: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 10: His-
    Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thl-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA;
    화합물 11: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEA-PDSP)NH2.5TFA;
    화합물 12: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.5TFA;
    화합물 13: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA; and
    화합물 14: His-
    Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-(ε-AEEEA-PDSP)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2.5TFA.
  34. 제31항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 생리활성 기질로서 LHRH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone)을 함유하는 것인, 포유류의 배란시기 조절, 성호르몬 관련 질환의 진단 또는 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 성호르몬 관련 질환이 전립선암, 자궁내막증 또는 자궁근종인 진단 또는 치료 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 생리활성 기질-생리활성 기질 전달체 복합체가 다음의 화합물 15 내지 20으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인, 진단 또는 치료 방법:
    화합물 15: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA(whersin Pyr=pyroglutamic acid, pE);
    화합물 16: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 17: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 18: Pyr-
    His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid);
    화합물 19: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid); and
    화합물 20: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Lys(ε-AEEEA-PDSP)-NH2.2TFA (wherein Pyr=pyroglutamic acid).
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