CN1821268A

CN1821268A - 抗肿瘤化合物哥纳香环肽乙和异构体及其制备方法

Info

Publication number: CN1821268A
Application number: CN 200510023956
Authority: CN
Inventors: 穆青; 陈道峰; 胡昌奇
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2005-02-18
Filing date: 2005-02-18
Publication date: 2006-08-23
Anticipated expiration: 2025-02-18
Also published as: CN100391968C

Abstract

本发明属于化学和医药领域，涉及新的肽类抗肿瘤活性环状肽类化合物。所述化合物结构为分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，或分子量为974。其中代表性化合物为哥纳香环肽乙(grifficyclocin B)，结构简要表示为：环－(缬¹－脯－异－甘¹－亮¹－甘²－亮²－缬²－亮³－亮⁴)。实验表明哥纳香环肽乙对人鼻咽癌，乳腺癌，脑癌，前列腺癌的实验细胞株表现出较强抑制活性，半数抑制浓度在1.9至5.7微克/毫升之间。本发明涉及的化合物来源于番荔枝科植物的提取分离，亦可来源于有机合成方法。哥纳香环肽乙可单独应用于抗癌药物的制备，也可与其他药物辅料组成抗癌药物的多种制剂类型以及抗癌药物组合物。

Description

抗肿瘤化合物哥纳香环肽乙和异构体及其制备方法

技术领域

本发明属化学领域，涉及化合物哥纳香环肽乙和异构体及其制备方法，和在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

天然环肽类化合物主要来源于微生物代谢产物(Harada，2004)如放线菌肽(Stern，1968；Schwyzer，1968)、真菌如环孢菌素(Traber，1968)和海洋生物(Bewley，1996)。近年来，有报道从高等植物中分离到环肽类化合物(Gournelis，1997)。环肽由氨基酸组成，从这方面看环肽类成分与肽类药物具有结构上的相似性；另一方面，环肽中的氨基酸残基连接成环，分子中羧基和氨基等亲水基团消失，造成了使得这类成分的水溶性大大减小，它在溶剂中的极性接近于有机小分子药物或经典生物碱等化合物。与链状肽类相比，环肽在溶液中的构象因为环的存在受到了一定的限制(Salvatella，2003)，因此从结构上分析，环肽类化合物作为药物，与肽类和有机小分子药物都有所不同，具有其独特性，是独特的一类药物作用分子(Schwyzer，1958；Gibbons，1970，)。

发明内容

本发明的目的是提供一组新的肽类抗肿瘤活性环状肽类化合物哥纳香环肽乙和异构体，及其制备方法。

本发明的进一步目的是提供所述化合物哥纳香环肽乙和异构体的抗肿瘤的用途。

本发明所述的抗肿瘤活性化合物哥纳香环肽乙(grifficyclocin B)来源于抗肿瘤活性植物的化学成分提取分离，亦可来源于有机合成方法。其结构类型属于环状肽类化合物，又称为环肽。具有如下特征：

1、化合物的波谱学性质特征：

分子量为974，其快原子轰击正离子质谱(FAB+)中分子离子峰显示为975(100)；同时质谱图中具有862(7)，749(5)，650(2)，537(3)，480(0.2)，310(12)，126(27)一系列碎片峰信号。其快原子轰击负离子质谱(FAB^-)中分子离子峰显示为973。

2、化合物的氨基酸组成特征(其中3和4所指组成化合物的“氨基酸”均为氨基酸残基，即一端脱去氨基中的一个质子，另一端脱去羧基上的羟基)：

准确称量干燥的化合物样品置于安瓿瓶中，加12当量浓度盐酸，充氮气密封水解后，在日立835-50型氨基酸自动分析仪上分析，标准样品对照。环肽化合物GG-8由以下类型氨基酸组成：亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)，缬氨酸(Val)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)。

3、化合物的氨基酸构成和顺序及分子式：即本发明化合物哥纳香环肽乙的可能结构由质谱裂解碎片推断如下：环-(缬氨酸¹-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸¹-亮氨酸¹-甘氨酸²-亮氨酸²-缬氨酸²-亮氨酸³-亮氨酸⁴)，又可写为：环-(缬¹-脯-异-甘¹-亮¹-甘²-亮²-缬²-亮³-亮⁴)，其英文表达式为：cyclo-(Val¹-Pro-Ile-Gly¹-Leu¹-Gly²-Leu²-Val²-Leu³-Leu⁴)，其中异亮氨酸的顺序由核磁共振二维谱中相应的远程偶合(HMBC)和TOCSY等信号确定。由质谱数据并结合核磁共振氢谱和碳谱，推断化合物分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，分子量确证为974。

4、化合物的化学性质特征：

在盐酸介质中110摄氏度水解1小时，产物对水合茚三酮的5％丙溶液显桃红色；未经水解的化合物与上述茚三酮溶液混合，不发生颜色变化。

5、化合物的色谱特征：

上述哥纳香环肽乙在硅胶层析板上，在氯仿-甲醇(95-5)、乙酸乙酯-甲醇(95-5)等溶剂展开系统中，比移值(Rf)在0.4-0.6之间；反相硅胶层析板(RP-18)上，甲醇-水(85-15)展开系统中，比移值(Rf)为0.4。所用层析板商业来源不同，展开溶剂不同，实验室环境条件不同，对上述比移值均有不同程度的影响。

哥纳香环肽乙在反相高效液相色谱层析中，在甲醇-醋酸-水或乙腈-醋酸-水多种不同配比的层析系统中，紫外光200至400纳米范围内的多个波长检测下，均显示一对称尖锐的峰。其中在其中一个条件下的保留时间为8.47分，所采用的仪器为Agilent-1100系列高效液相色谱仪系统，G1315B DAD紫外光检测器，G1311A四极泵；色谱柱型号：phenomenex Luna C18，4.6毫米/150mm毫米，检测波210纳米；层析溶剂：甲醇-1％醋酸水溶液(85-15)，流速1.0毫升/分钟。

6、抗肿瘤药理活性特征：所述化合物对人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7和人鼻咽癌KB等多种细胞显示出较强的抑制活性。

本发明所述的化合物哥纳香环肽乙可单独应用于抗癌药物的制备，也可以与其他药物辅料组成抗癌药物的多种制剂类型以及抗癌药物组合物。

本发明所述的化合物哥纳香环肽乙可以从番荔枝科(Annonaceae)植物的种子、枝叶、根茎等部位，或植物组织培养产物，用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂或二氧化碳超临界提取，经反复层析分离的方法制备。所述的番荔枝科植物包括哥纳香属(Goniothalamus)植物大花哥纳香(G.griffithii)、金平哥纳香(G.leocarpus)、景洪哥纳香(G.cheliensis)、番荔枝属植物(Annona)、紫玉盘属(Uvaria)植物。

上述的化合物层析方法有如下几种，

(1)硅胶柱层析硅胶为柱层析硅胶，孔径通常为150-300目，或0.043-0.060mm。相应的层析洗脱溶剂为氯仿-甲醇(97∶3-92∶8)，或氯仿-丙酮(9∶1-8∶2)或乙酸乙酯-甲醇(95∶5-90∶10)，或石油醚-丙酮(3∶7-5∶5)或石油醚-乙酸乙酯(3∶7-4∶6)。

(2)反相硅胶柱层析层析材料为硅胶键合碳十八凝胶(RP-18)，相应的层析洗脱剂为甲醇-水(6∶4-9∶1)或丙酮-水(5∶5-9∶1)。

(3)葡聚糖凝胶LH-20相应层析洗脱溶剂为甲醇或甲醇-水(9∶1)。

(4)MCI凝胶CHP20P相应层析洗脱溶剂为甲醇、甲醇-水(9∶1)或丙酮、丙酮-水(9∶1-8∶2)。

通过Fmoc保护基(9-fuorenylmethyloxycarbonyl)固相合成法化学合成制备化合物哥纳香环肽乙及其衍生物：

(1)接树脂：将ClTrt-Cl(2-chlorotrityl chlororide)在DMF(N，N-dimethylformamide)中溶涨1小时，然后用4A分子筛处理过的二氯甲烷(DCM)溶剂洗涤2次。将带有Fomc保护基的氨基酸(HO-AA-Fomc)与DIEA(N，N-diisopropytethlamine)以1∶4的当量比加入2.5mL干燥过的二氯甲烷，混合物在氮气保护下搅拌2小时后除去混合物。树脂用二氯甲烷/甲醇/二异丙胺(17∶2∶1)混合溶剂洗涤3次，再依次用二氯甲烷、DMF、二氯甲烷洗涤，每次洗用2-3毫升洗涤3分钟。树脂上所接氨基酸为带Fmoc保护基的缬氨酸(HO-Val-N-Fmoc)，其立体构型是D-型或L-型。

检测氨基酸与树脂的连接：树脂的接载利用Fmoc-Piperidine加成物的紫外光谱定量确定。上述接载Fmoc保护氨基酸的树脂约3毫克在25毫升容量瓶中与0.4ml Piperidine，0.4ml二氯甲烷在室温下反应30分钟，然后加入1.6ml甲醇最后用二氯甲烷稀释至25毫升。参比溶液为0.4ml Piperidine，0.4ml二氯甲烷，1.6ml甲醇最后用二氯甲烷稀释至25ml，检测波长为301nm。接载度表示为每克树脂中接载氨基酸的毫摩尔数，即：毫摩尔氨基酸/克树脂(AA mmol/g resin)。计算方法为：mmol·g^-1＝(A₃₀₁/7800)×25ml·g^-1。

(2)Fmoc去保护：对已接载氨基酸的树脂用3毫升20％ piperidine DMF溶液洗涤1分钟，10分钟；再依次用3毫升DMF、二氯甲烷、DMF洗涤，各2次。

(3)形成肽键：3-4倍过量的Fmoc保护的氨基酸，活化试剂HOBt/HBTU，NMM在3ml DMF中氮气保护下搅拌2小时。键合反应完成后依次用3ml DMF和3ml二氯甲烷各洗三次。制备目标产物为哥纳香环肽乙时，其步聚中使用的带Fmoc保护基的氨基酸依次为：脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、亮氨酸；制备目标为哥纳香环肽乙的同分异构体时，由于目标化合物中所需的氨基酸顺序不同，则在带Fmoc保护基的缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸中选择不同的次序形成肽键。

本发明合成所选用的Fmoc保护基的氨基酸原料(表示为AA1至AA10)还可以包括任何可以构成分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，或分子量为974环状肽化合物的氨基酸。所述氨基酸的结构可以是α-氨基酸、β-氨基酸或γ-氨基酸；所述氨基酸的立体化学构型可以是D-型或L-型。所选用的氨基酸原料也可以带有叔丁基氧羰基(Boc)保护基。

所说的活化剂：HOBt，N-hydroxybenzotriazole；HBTU，O-(benzotriazol-1)-1，1，3，3-tetrame-thyluronium hexafluorophosphate；NMM，N-methylmorpholine。

用所需的Fmoc保护基氨基酸重复步骤(2)，(3)得到目标化合物的直链肽。

(4)脱树脂：干燥过的接有目标直链肽的树脂，在混合溶剂AcOH/TEF/DCM(1∶1∶3，每毫克树脂10微升)中搅拌处理2小时。将树脂过滤并用上述混合溶剂3ml洗涤3次。加入15倍的正己烷作为共沸剂除去醋酸后，将滤液浓缩后冻干。所述的混合溶剂其中，AcOH，Acetic acid(醋酸)；TEF，2，2，2-trifluoroethanol(三氟乙醇)；DCM，dimethylmthane(二氯甲烷)。

(5)肽链合环：在浓度为7.7×10^-4M，HATU(2.0eq)和DIEA(2.5eq)存在下二氯甲烷中进行。上述反应物溶液在4摄氏度下搅拌1小时后，室温下放置过夜。减压蒸干。所说的HATU，N-[(dimethylamino)-1H-1，2，3-triazolo-[4，5-b]pyridin-1-yl-methylene]-N-methylmethanaminium hexafluoroposphate N-oxide；DIEA，N，N-diisopropylethylamine。

(6)Boc去保护：合环后的目标化合物粗品在TFA/H₂O(95∶5，100ml×1mg树脂)中搅拌1小时，粗产物用柱层析分离。化合物结构用质谱和核磁共振方法检测，确证结构。

附图说明

图1是哥纳香环肽乙的结构示意图。

图2是哥纳香环肽乙及其异构体固相合成法示意图，

其中，AA₁至AA₁₀依次为Val、Pro、Ile、Gly、Leu、Gly、Leu、Val、Leu、Leu时，目标产物为实施例中化合物哥纳香环肽乙(grifficyclocinB)；

AA₁至AA₁₀包括任何可以构成分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，或者分子量为974环肽化合物的氨基酸，可以是L-构型或D-构型；

(1)为接树脂，(2)为Fmoc去保护，(3)为形成肽键，(4)为脱树脂，(5)为肽链环合，(6)为Boc去保护。

具体实施方式

实施例1从番荔枝科哥纳香属植物大花哥纳香茎中分离得到化合物哥纳香环肽乙

番荔枝科哥纳香属植物大花哥纳香茎干样5公斤，粉碎，用5升95％乙醇在45摄氏度以下浸泡提取五次，提取液减压浓缩至乙醇全部挥发完毕。加水800毫升至浸膏使其混悬，依次用石油醚，氯仿，乙酸乙酯萃取。其中，氯仿部分萃取液浓缩至干40克，溶于100毫升甲醇后加入80克60目硅胶拌样，并挥发除去溶剂。样品用硅胶柱层析，200-300目硅胶(中国青岛海洋化工厂)800克，石油醚-乙酸乙酯(8∶2～2∶8)梯度洗脱，每流分为75毫升，硅胶薄层色谱检测。合并83至112流分并蒸干，重新上硅胶柱层析，200-300目硅胶200克置于4×40厘米的层析柱中，石油醚-丙酮(7∶3)为洗脱剂，得到略带棕色固体化合物。再用反相硅胶RP-18柱层析(2×15厘米)，甲醇-水(8∶2)洗脱。得到白色固体化合物25毫克，经硅脱薄层色谱和反相RP-18高效液相色谱分析，为一纯化合物。

用酸水解和水合茚三酮试剂显色方法确定为一环肽化合物，并全水解样品在全自动氨基酸分析仪上得到化合氨基酸组成为：缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和亮氨酸。用质谱快原子轰击正离子(FABMS⁺)方法测定，存在质核比975处出现丰度为100％的[MH]⁺峰；负离子方法FABMS^-出现973，因此推定化合物GG-8的分子量为974。根椐FABMS⁺图谱中碎片离子峰，分析推断出环肽化合物GG-8具有如下结构：环-(缬氨酸¹-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸¹-亮氨酸¹-甘氨酸²-亮氨酸²-缬氨酸²-亮氨酸³-亮氨酸⁴)，又可写为：环-(缬¹-脯-异-甘¹-亮¹-甘²-亮²-缬²-亮³-亮⁴)，其英文表达式为：cyclo-(Val¹-Pro-Ile-Gly¹-Leu¹-Gly²-Leu²-Val²-Leu³-Leu⁴)。所述化合物结构得到核磁共振谱的佐证。

实施例2由Fmoc保护基固相合成法化学合成制备化合物哥纳香环肽乙

(1)接树脂：将树脂ClTrt-Cl(2-chlorotrityl chlororide)500毫克在3毫升DMF(N，N-dimethylformamide)中溶涨1小时，然后用4A分子筛处理过的二氯甲烷3毫升(DCM)溶剂洗涤2次。将带有Fomc保护基的α-L-缬氨酸(HO-L-Val-N-α-Fomc)80毫克(0.25摩尔)与170微升(1.0摩尔)DIEA(N，N-diisopropytethlamine)以1∶4的当量比加入2.5mL干燥过的二氯甲烷，混合物在氮气保护下搅拌2小时后除去混合物。树脂用二氯甲烷/甲醇/二异丙胺(17∶2∶1)混合溶剂洗涤3次，再依次用3毫升二氯甲烷、3毫升DMF、3毫升二氯甲烷依次洗涤，每种溶剂2次，各为3分钟。

检测氨基酸与树脂的连接：树脂的接载利用Fmoc-Piperidine加成物的紫外光谱定量确定。上述接载Fmoc保护缬氨酸的树脂(ClTrt-L-Val-N-α-Fomc)约3毫克在25毫升容量瓶中与0.4毫升Piperidine，0.4毫升二氯甲烷在室温下反应30分钟，然后加入1.6毫升甲醇最后用二氯甲烷稀释至25毫升。参比溶液为0.4mlPiperidine，0.4ml二氯甲烷，1.6毫升甲醇最后用二氯甲烷稀释至25毫升，检测波长为301纳米。接载度表示为每克树脂中接载氨基酸的毫摩尔数，即：毫摩尔氨基酸/克树脂(AA mmol/g resin)。计算方法为：mmol·g^-1＝(A₃₀₁/7800)×25ml·g^-1。测得ClTrt-Val-Fomc树脂接载度为1.0毫摩尔每克。

(2)Fmoc去保护：对已接载氨基酸的树脂用3毫升20％piperidine DMF溶液洗涤1分钟，10分钟；再依次用3毫升DMF、二氯甲烷、DMF洗涤，各2次。

(3)肽键形成：3-4倍过量的Fmoc保护基-L-脯氨酸(HO-Pro-Fomc)180毫克(0.5毫摩尔)，活化试剂HOBt(80毫克，0.5毫摩尔)/HBTU(200毫克，0.5毫摩尔)，NMM在3ml DMF中氮气保护下搅拌2小时。键合反应完成后依次用3ml DMF和3ml二氯甲烷各洗三次，得到ClTrt--Val-Pro-Fomc。制备目标产物为哥纳香环肽乙时，这一步聚中使用的带Fmoc保护基的氨基酸依次为：脯氨酸(175毫克，0.5摩尔)、异亮氨酸(185毫克，0.5摩尔)、甘氨酸(150毫克，0.5毫摩尔)、亮氨酸(180毫克，0.5摩尔)、甘氨酸(150毫克，0.5毫摩尔)、亮氨酸(180毫克，0.5摩尔)、缬氨酸(155毫克，0.5毫摩尔)、亮氨酸(180毫克，0.5摩尔)、亮氨酸(180毫克，0.5摩尔)。活化剂：HOBt，N-hydroxybenzotriazole(80毫克，0.5毫摩尔)；HBTU，O-(benzotriazol-1)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(200毫克，0.5毫摩尔)；NMM，N-methylmorpholine(70微升，0.65毫摩尔)。

(4)脱树脂：干燥的过的接有直链肽的树脂ClTrt-缬¹-脯-异-甘¹-亮¹-甘²-亮²-缬²-亮³-亮⁴，(ClTrt-Val¹-Pro-Ile-Gly¹-Leu¹-Gly²-Leu²-Val²-Leu³-Leu⁴-Fomc)，在混合溶剂AcOH/TEF/DCM(1∶1∶3，每毫克树脂10微升)5毫升中搅拌处理2小时。将树脂过滤并用上述混合溶剂3ml洗涤3次。加入15倍的正己烷作为共沸剂除去醋酸后，将滤液浓缩后冻干。所述AcOH，Acetic acid(醋酸)；TEF，2，2，2-trifluoroethanol(三氟乙醇)；DCM，dimethylmthane(二氯甲烷)。

(5)肽链合环：这一步骤在浓度为7.7×10^-4M，HATU(260毫克，0.65毫摩尔，1.9当量)和DIEA(150微升，0.85毫摩尔，2.4当量)存在下二氯甲烷中进行。上述反应物溶液在4摄氏度下搅拌1小时后在室温下放置过夜。减压蒸干。所述HATU，N-[(dimethylamino)-1H-1，2，3-triazolo-[4，5-b]pyridin-1-yl-methylene]-N-methylmethanaminium hexafluoroposphate N-oxide；DIEA，N，N-diisopro pylethyla-mine。

(6)最后去保护：合环后的目标化合物如果含有带叔丁基氧羰基(Boc)保护基时，产物粗品在TFA/H₂O(95∶5，100ml×1mg树脂)中搅拌1小时，粗产物用柱层析分离，得到白色固体10毫克。化合物结构用质谱和核磁共振方法检测，确证结构为哥纳香环肽乙，构成它的氨基酸顺序为：环-(缬¹-脯-异-甘¹-亮¹-甘²-亮²-缬²-亮³-亮⁴)，其英文表达式为：cyclo-(Val¹-Pro-Ile-Gly¹-Leu¹-Gly²-Leu²-Val²-Leu³-Leu⁴)。

实施例3

采用常规方法，进行人肺癌，人乳腺癌和人鼻咽癌等实验细胞株体外实验，结果表明所述化合物对人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7和人鼻咽癌KB等多种细胞显示出较强的抑制活性。半数抑制浓度(ED50)在5.4-1.9μg/mL(微克/毫升)之间。表1是化合物哥纳香环肽乙对肿瘤细胞的半数抑制浓度(μg/mL)。

表1.

Cell lines	ED₅₀ Value mcg/ml	备注
Cell lines	ED₅₀ Value mcg/ml	备注	A549MCF-7MDA-MB-2311A9CAKI-1U-87-MGPC-3KBKB-VINSK-MEL-2HCT-8	5.42.42.11.9＞102.35.71.9＞10NA＞10	Lung cancer(人肺癌)Breast(人乳腺)Breast(人乳腺)Ovarian(人卵巢癌)(J.B.C.272：17118)Renal(人肾癌)Glioblastoma(脑瘤)Prostate(前列腺癌)人鼻咽癌人鼻咽癌Melanoma(黑色素瘤)直肠癌

Claims

1、化合物哥纳香环肽乙及其异构体，其特征是所述化合物为环状肽类化合物，其结构分子式为C₄₅H₇₈N₁₀O₁₀，或分子量为974。

2、按权利要求1所述的化合物哥纳香环肽乙及其异构体，其特征是所述化合物包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，甘氨酸残基通过肽键以任意连接顺序构成的环状肽类化合物。

3、按权利要求2所述的化合物哥纳香环肽乙及其异构体，其特征是其中所述氨基酸残基包括α-氨基酸、或β-氨基酸、γ-氨基酸、或δ-氨基酸或ε-氨基酸，其立体化学构型是L-构型或D-构型。

4、权利要求1或2或3所述的化合物哥纳香环肽乙及其异构体在制备抑制肿瘤细胞药物中的用途。

5、权利要求1的化合物哥纳香环肽乙及其异构体的制备方法，其特征是通过从番荔枝科植物的化学成分提取分离法或通过有机合成方法制备。

6、按权利要求5的方法，其中所述的番荔枝科植物包括哥纳香属(Goniothalamus)植物大花哥纳香(G.griffithii)、金平哥纳香(G.leocarpus)、景洪哥纳香(G.cheliensis)、番荔枝属植物(Annona)和紫玉盘属(Uvaria)植物其种子、枝叶、根茎，或植物组织培养产物。

7、按权利要求5的方法，其中化学成分提取分离用有机溶剂或二氧化碳超临界提取，进行层析分离，所述的层析分离的材料选自层析硅胶，反相硅胶，MCI，葡聚糖凝胶及其相应的层析洗脱溶剂。

8、按权利要求5的方法，其中所述的有机合成方法是固相合成的化学合成方法。