CN113274485B - 蝎毒多肽Smp24在制备抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，公开了埃及金蝎蝎毒来源多肽Smp24在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌，且没有明显的毒副作用。所述抗肿瘤药物的给药方式为注射。本发明首次公开了蝎毒多肽Smp24的新的医药用途，即可用于制备抗肿瘤药物，给治疗肿瘤提供了一种新的途径和手段。蝎毒多肽Smp24既可破坏细胞骨架又可以直接穿透细胞膜进入细胞导致肿瘤细胞周期阻滞并诱导凋亡发生来发挥抗肿瘤作用，有效降低了耐药性。蝎毒多肽Smp24不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

Description

蝎毒多肽Smp24在制备抗肿瘤药物的应用
技术领域
本发明涉及一种多肽在制备抗肿瘤药物的应用，属于生物医药领域，特别涉及蝎毒多肽Smp24在制备抗肿瘤药物的应用。
背景技术
人类肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。肺癌患者中以非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)为主，约占75％-85％，且临床确诊患者大多数已到中晚期阶段，其五年生存率低于40％。近年来，虽然以铂为基础的化疗和放疗为主的治疗方案，对于早期非小细胞肺癌治疗有所改善，但会造成严重的副作用。肿瘤细胞是一类快速分裂增殖的细胞，其生长过程并不受正常生长过程调控；化学治疗的主要目的是干扰这类非正常细胞的分裂过程。然而，很多抗肿瘤药物缺乏特异性，在其抗肿瘤过程中对快速增殖的正常细胞亦有杀伤作用，同时容易使肿瘤细胞产生耐药性，导致绝大多数的患者预后不理想。因此，不断开发新型抗肿瘤药物来控制这些非正常细胞分裂是很有必要的。
蝎子的生活踪迹可以追溯到几亿年前，在中国、印度、希腊及中东地区等，将蝎毒作为治病之用已有几千年的历史。蝎毒是由蛋白质(酶和肽)和非蛋白质(无机盐，脂质，核苷酸，游离氨基酸和水)产生的混合物由毒腺进行防御和捕获猎物。目前研究表明，蝎毒具有抗菌、降血压、降血糖等活性。
Smp24是从埃及蝎(Scorpio maurus palmatus)的毒液中鉴定出来的一种新颖的阳离子抗菌肽，其对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌均具有显著的抑制活性。目前为止，多肽Smp24在抗肿瘤，尤其是实体肿瘤方面的研究鲜有报道。因此，针对现有技术的不足，提供蝎毒多肽Smp24在制备抑制多种癌细胞增殖作用的应用甚为必要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供蝎毒多肽Smp24在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用，研制和寻求新型高效低毒的抗肿瘤药物。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供蝎毒多肽Smp24在制备抑制抗肿瘤药物中的应用，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述抗癌肽Smp24由24个氨基酸组成的线性肽，分子量2578.3道尔顿，等电点10.80，其序列为：Ile Trp Ser Phe Leu Ile Lys Ala Ala Thr Lys Leu Leu Pro SerLeu Phe Gly Gly Gly Lys Lys Asp Ser(IWSFLIKAATKLLPSLFGGGKKDS)。
本发明提供了所述蝎毒多肽Smp24可以采用本领域技术人员已知的方法(例如固相合成方法)制备得到，以及可以采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。
本发明提供蝎毒多肽Smp24在制备抑制肿瘤细胞系增殖活力的药物中的应用，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述肿瘤细胞为肺癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌。
采用MTT法，检测多肽Smp24体外抑制肿瘤细胞增殖能力的作用，随着Smp24浓度的升高，抑制了A549、HepG2、H460、H3122、PC-9、MCF-7、PANC-1、Kyse-150和B16-F10细胞，半数抑制浓度IC50值分别为4.41μM/L、5.31μM/L、4.77μM/L、4.64μM/L、3.24μM/L、13.32μM/L、9.55μM/L、24.05μM/L和8.86μM/L。
本发明提供蝎毒多肽Smp24的在制备干扰肿瘤细胞周期阻滞药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
采用PI染色的流式细胞仪检测细胞周期阻滞的DNA含量，Smp24刺激后S期的细胞比例(23.71％)与对照组(11.78％)相比显著增加，而G2/M期的细胞比例(27.04％)与对照组(8.23％)相比也显著增加，G0/G1期的细胞比例则减少，说明Smp24能够诱导A549细胞发生S期及G2/M期阻滞。
本发明提供蝎毒多肽Smp24的在制备干扰肿瘤细胞凋亡药物中的应用，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒来检测各组细胞的凋亡率，结果显示Smp24可以诱导A549细胞凋亡。从结果中可见，与对照组(6.35％)比较，药物处理组细胞凋亡率显著增加(33.87％)，说明Smp24药物对细胞凋亡具有诱导作用。
本发明提供蝎毒多肽Smp24的在制备干扰肿瘤细胞膜稳定性药物中的应用，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
采用扫描电子显微镜仪器在15kv下观察药物处理后的A549细胞，结果显示Smp24处理后的A549细胞出现明显的孔形成。这种显著的形态学变化意味着细胞骨架的改变或损伤，表明多肽破坏了细胞膜的稳定性。
本发明提供蝎毒多肽Smp24的在制备辅助抗肿瘤药物穿膜药物中的应用，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过扫描电子显微镜观察蝎毒多肽Smp24处理后细胞膜的完整性。未经处理的A549细胞表面光滑，细胞扩散形态正常，而Smp24处理的A549细胞细胞膜粗糙或不均一，细胞膜上形成的孔，说明Smp24发挥穿膜作用。
本发明提供蝎毒多肽Smp24的在制备抑制体内肿瘤生长药物中的应用，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
利用裸鼠移植瘤模型研究发现，Smp24在2mg/kg剂量下有效抑制了肿瘤生长，与对照组相比，Smp24从给药第10天开始显著地抑制了肿瘤的生长，给药18d后，肿瘤体积和肿瘤重量分别减少了65.4％和64.3％％，且对于小鼠体重及各重要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾脏)无显著影响。体内实验结果表明Smp24具有很强的抗癌作用。
进一步地，如上所属应用，所述肿瘤为肺癌。
更进一步地，如上所属应用，所述肿瘤为人肺腺癌A549。
本发明所述蝎毒多肽Smp24其既可以通过穿膜作用诱导肿瘤发生周期阻滞并诱发凋亡，又可以直接破膜发挥抗肿瘤作用，同时具有体内抗肿瘤作用。
进一步地，如上所述应用，所述抗肿瘤药物的给药方式为注射、粘膜给药、或腔道给药。
更进一步地，经注射给药，包括静脉注射、皮下注射、腔内注射等；粘膜给药，如鼻腔给药；腔道给药，如经直肠给药，局部起效或经吸收全身发挥作用。上述给药途径优选的是经静脉给药。
如上所述应用，所述蝎毒多肽Smp24包括蝎毒多肽Smp24的多肽物、截断物、类似物、组合物和药学上可接受的载体。
抗癌肽发挥抗癌作用的机制一般为选择性膜破坏机制和非膜溶解机制，前者包括“桶板模型”、“毡毯模型”和“环孔模型”三种模式，后者主要是通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抗血管生成、破坏溶酶体、促进肿瘤细胞自噬等方式。所述蝎毒多肽Smp24通过靶向肺癌A549细胞，破坏癌细胞膜通透性并且与细胞内源靶标相互作用诱导细胞发生周期阻滞及凋亡，进而发挥体内外抗癌作用。根据蝎毒多肽Smp24的作用机制，其对肺癌A549具有抗癌作用，对其他肿瘤也能够发挥类似的抗癌作用，因此本发明蝎毒多肽Smp24能够起到抑制肺癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌的作用。
蝎毒及其某些纯化的蛋白及多肽在体内和体外均能够减弱癌细胞的增殖、阻滞细胞周期正常运行、诱导细胞调亡和抑制细胞转移。蝎毒的抗癌效果已经在神经胶质瘤、神经母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和前列腺癌中有一定的研究进展。其分子量小、易于吸收，可广泛应用于保健品和药物的开发。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用人肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌细细胞进行体外肿瘤细胞和荷瘤裸鼠试验，结果表明蝎毒多肽Smp24具有良好的抗肿瘤效果，可抑制多种类型的肿瘤细胞的增殖和迁移作用，并且抑制了荷瘤小鼠肿瘤的生长，且没有明显的毒副作用。蝎毒多肽Smp24既可破坏细胞骨架又可以直接穿透细胞膜进入细胞导致肿瘤细胞周期阻滞并诱导凋亡发生来发挥抗肿瘤作用，有效降低了耐药性。该蝎毒多肽Smp24具有结构简单、人工合成方便、活性强且对正常细胞选择性的有益特点。蝎毒多肽Smp24不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。
附图说明
图1为本发明实施例1蝎毒多肽Smp24的HPLC纯化鉴定结果；
图2为实施例1蝎毒多肽Smp24的质谱鉴定结果；
图3为实施例2蝎毒多肽Smp24对A549(人肺腺癌细胞)、H3122(人非小细胞肺癌细胞)、H460(人大细胞肺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、PC-9(人非小细胞肺癌细胞)、PANC-1(人胰腺癌细胞)、Kyse-150(人食管癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)和B16-F10(黑色素瘤细胞)细胞增殖活性影响的统计图；
图4为实施例2蝎毒多肽Smp24孵育肺癌A549后的细胞形态学的照片；
图5为实施例2蝎毒多肽Smp24干扰肺癌A549细胞的周期阻滞；
图6为实施例2蝎毒多肽Smp24干扰肺癌A549细胞的凋亡；
图7为实施例2蝎毒多肽Smp24干扰肺癌A549细胞的细胞膜的扫描电镜照片；
图8为实施例3蝎毒多肽Smp24对肺癌A549细胞接种的荷瘤裸鼠皮下肿瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
本发明所述的一种埃及蝎抗癌肽Smp24由24个氨基酸组成的线性肽，分子量2578.3道尔顿，等电点10.80。其氨基酸序列为：Ile Trp Ser Phe Leu Ile Lys Ala AlaThr Lys Leu Leu Pro Ser Leu Phe Gly Gly Gly Lys Lys Asp Ser(IWSFLIKAATKLLPSLFGGGKKDS)。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1蝎毒多肽Smp24的制备：
1、蝎毒多肽Smp24的制备方法：根据蝎毒多肽Smp24氨基酸序列用自动多肽合成仪合成多肽。二硫键的形成采用空气氧化法，具体为在烧瓶中将多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氢氧化铵滴定成pH 7.8，然后室温搅拌过夜。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。纯化时A液体为0.1％TFA+100％CH3CN，B液为0.1％TFA+100％H2O，B液浓度梯度为25min 28-53％，检测波长为220nm。结果如图1所示，多肽出峰时间为第9.8分钟，峰面积为3314210，峰高为231961。
2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。结果如图2所示，在多肽的多电荷峰质谱图中，观察到三个较为明显的质峰分别为645.45[M+4H]4+，860.45[M+3H]3+，1290.15[M+2H]2+，运用公式n电荷峰＝[分子量+n·H]/n，预测分子量分别为2577.8，2578.35，2578.3道尔顿，而多肽实际分子量为2578.3道尔顿。
3、纯化的抗癌肽Smp24用高效液相色谱(HPLC)方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
抗癌肽Smp24是埃及蝎蝎毒中鉴定到的一种线性多肽，分子量2578.3道尔顿，等电点10.80。其氨基酸序列为：Ile Trp Ser Phe Leu Ile Lys Ala Ala Thr Lys Leu LeuPro Ser Leu Phe Gly Gly Gly Lys Lys Asp Ser(IWSFLIKAATKLLPSLFGGGKKDS)。
实施例2蝎毒多肽Smp24的体外抗肿瘤实验：
1、体外抑制多种肿瘤细胞增殖能力(MTT法)
取对数生长期的9种肿瘤细胞(包括A549、HepG2、H460、H3122、PC-9、MCF-7、PANC-1、Kyse-150和B16-F10细胞)，用0.25％的胰酶消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，计数并调整细胞悬液的浓度至10×104个/ml，然后加入96孔板中，每孔100μL。将培养板置于恒温37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。培养12小时后，细胞完全贴壁，弃掉培养液，用不同浓度的抗癌肽Smp24分别处理肿瘤细胞24h后，每孔加入10μL MTT溶液，于37℃，CO2含量为5％的细胞培养箱孵育4h，弃去含有MTT的培养液，加入200μL DMSO后于微型振荡器上振荡15分钟。使用多功能酶标仪在490nm波长下读取吸光度值(OD)，并计算细胞存活率[存活率＝(给药组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％]和IC50值。
如图3所示，随着Smp24浓度的升高，抑制了A549、HepG2、H460、H3122、PC-9、MCF-7、PANC-1、Kyse-150和B16-F10细胞，半数抑制浓度IC50值分别为4.41μM/L(A549)、4.64μM/L(H3122)、5.31μM/L(H460)、4.77μM/L(HepG2)、3.24μM/L(PC-9)、9.55μM/L(PANC-1)、13.32μM/L(MCF-7)、8.86μM/L(B16-F10)和24.05μM/L(Kyse-150)。
2、对肺癌细胞A549的细胞形态学影响
取对数生长期的A549细胞，用0.25％的胰酶消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，计数并调整细胞悬液的浓度至10×104个/ml，然后加入6孔板中，每孔20×104个细胞。不同浓度Smp24作用24h后，观察A549细胞形态及数量在显微镜(×100倍)的改变。镜下结果显示(见图4)，不同浓度Smp24处理后，A549细胞随着药物浓度增加，存活细胞数量逐渐减少。可明显观察到，空白对照组，细胞增殖旺盛，细胞间隙小，无漂浮细胞，贴壁牢固；而Smp24处理组随着浓度的递增，细胞形态发生改变，细胞触角逐渐消失，细胞皱缩、破碎，间距变大，贴壁能力下降，脱落细胞逐渐增加，细胞数量逐渐减少，出现坏死细胞及细胞碎片。因此通过镜下观察可得知，Smp24对A549细胞具有很好的增殖抑制作用，并且呈浓度依赖。
3、流式细胞技术测定细胞周期影响
为了检测Smp24在A549细胞中抗增殖作用的潜在机制，采用PI染色的流式细胞仪检测细胞周期阻滞的DNA含量。将A549细胞以2×105细胞/mL的密度接种在6孔板上，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养12小时后，将不同浓度的Smp24刺激A549细胞，24h后检测细胞分布情况。结果如图5所示，Smp24刺激后S期的细胞比例(23.71％)与对照组(11.78％)相比显著增加，而G2/M期的细胞比例(27.04％)与对照组(8.23％)相比也显著增加，G0/G1期的细胞比例则减少，说明Smp24能够诱导A549细胞发生S期及G2/M期阻滞。
4、流式细胞技术测定细胞凋亡影响
取对数生长期的A549细胞，用0.25％的胰酶消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，计数并调整细胞悬液的浓度至10×104个/ml，然后加入6孔板中，每孔20×104个细胞。药物处理24h后，收集细胞。Annexin V可以识别并标记处于凋亡早期的细胞膜，碘化丙啶(PI)只能通过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此为了验证Smp24是否诱导A549细胞发生凋亡，利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒来检测各组细胞的凋亡率。Smp24作用A549细胞24h后，流式细胞仪检测结果显示Smp24可以诱导A549细胞凋亡。从结果中可见，与对照组(6.35％)比较，药物处理组细胞凋亡率显著增加(33.87％)说明Smp24药物对细胞凋亡具有诱导作用(见图6)。
5、扫描电子显微镜测定穿膜能力
将A549细胞以1.2×105细胞/mL的密度接种在含爬片的12孔板上，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养12小时。然后将Smp24添加到培养板中，然后再培养24小时。弃掉上清，PBS洗2次，用4％戊二醛室温固定2h，再用2.5％戊二醛4℃固定6-8h，用PBS洗涤后并用一系列分级乙醇/水溶液脱水。经冷冻干燥和镀金后，用扫描电子显微镜仪器在15kv下观察样品。研究通过扫描电子显微镜(SEM)观察抗癌肽Smp24处理后细胞膜的完整性。Smp24的功能像是破坏膜中的裂解肽，其中大多数表现出明显的孔形成。如图7所示，未经处理的A549细胞表面光滑，细胞扩散形态正常，而Smp24处理的A549细胞细胞膜粗糙或不均一。细胞膜上形成的孔。这种显著的形态学变化意味着细胞骨架的改变或损伤。
实施例3蝎毒多肽Smp24的体内抗肿瘤实验：
所有的动物研究均在南方医科大学校内伦理委员对实验动物进行人道治疗的指导下进行的。麻醉后6～8周龄裸鼠，经侧腹皮下注射含5×106个A549细胞的PBS。植入约2～3周后待小鼠肿瘤体积达到100mm3时，进行抗癌肽Smp24干预，每天测量肿瘤体积和小鼠体重，18天后处死小鼠，并从小鼠体内解剖肿瘤并称重。肿瘤体积按0.5×长×宽2的公式计算。如图所示裸鼠移植瘤模型研究发现：药物处理组通过裸鼠连续18天进行皮下注射Smp24(2mg/kg/d)处理，而空白对照组注射生理盐水，给药期间每天均要观察裸鼠生活精神状态，每2天测量裸鼠体重及肿瘤体积，给药结束后，处死裸鼠并剥离瘤块。如图8A-D所示，Smp24在2mg/kg剂量下有效抑制了肿瘤生长，与对照组相比，Smp24从给药第10天开始显著地抑制了肿瘤的生长，给药18d后，肿瘤体积和肿瘤重量分别减少了65.4％和64.3％，且对于小鼠体重及各重要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾脏)无显著影响。体内实验结果表明Smp24具有很强的抗癌作用。
综上所述，通过化学合成法获得的蝎毒多肽Smp24具有良好的抗肿瘤效果，其能够抑制多种类型的肿瘤细胞的增殖，并且抑制了荷瘤小鼠肿瘤的生长，且没有明显的毒副作用。蝎毒多肽Smp24通过靶向肺癌A549细胞，既可以通过穿膜作用诱导肿瘤细胞发生周期阻滞并诱发凋亡，又可以直接破膜发挥抗肿瘤作用，同时具有体内抗肿瘤活性。根据蝎毒多肽Smp24的作用机制，其对肺癌A549具有抗癌作用，且对其他肿瘤也能够发挥类似的抗癌作用，因此本发明蝎毒多肽Smp24能够起到抑制肺癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌的作用。蝎毒多肽Smp24具有结构简单、人工合成方便、活性强且对正常细胞具有选择性的有益特点。其不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗药物或治疗方式来发挥抗肿瘤作用。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 蝎毒多肽Smp24在制备抗肿瘤药物的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Trp Ser Phe Leu Ile Lys Ala Ala Thr Lys Leu Leu Pro Ser Leu
1               5                   10                  15
Phe Gly Gly Gly Lys Lys Asp Ser
            20

Claims (8)

1.蝎毒多肽Smp24在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
2.蝎毒多肽Smp24在制备抑制肿瘤细胞系增殖活力的药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
3.蝎毒多肽Smp24在制备干扰肿瘤细胞周期的阻滞药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
4.蝎毒多肽Smp24的在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
5.蝎毒多肽Smp24的在制备干扰肿瘤细胞膜稳定性药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
6.蝎毒多肽Smp24的在制备辅助抗肿瘤药物穿膜药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
7.蝎毒多肽Smp24的在制备抑制体内肿瘤生长药物中的应用，其特征在于，所述蝎毒多肽Smp24氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述肿瘤为肺癌。
8.权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括蝎毒多肽Smp24的多肽物和药学上可接受的载体。
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