CN107936094A - 一种利拉洛肽的固液相相结合的合成方法 - Google Patents

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CN107936094A CN201711493147.9A CN201711493147A CN107936094A CN 107936094 A CN107936094 A CN 107936094A CN 201711493147 A CN201711493147 A CN 201711493147A CN 107936094 A CN107936094 A CN 107936094A
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Abstract

本发明涉及医药领域产品利拉洛肽的合成方法。该方法采用固液相相结合的方法合成利拉洛肽产品。采用6+8的合成方式，先合成6肽片段，之后将片段偶联到固相树脂上，通过对Cys不同位置的保护基，在固相树脂上完成了三个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化，大大提高了合成效率及合成收率，同时极大的减少了三废的产生，同时大大降低了生产成本。

Description

一种利拉洛肽的固液相相结合的合成方法
技术领域
本发明为多肽合成制备领域，特别涉及利拉洛肽的合成制备方法。
技术背景：
利拉洛肽结构式如下：
L-cysteinyl-L-cysteinyl-L-glutamyl-L-tyrosyl-L-cysteinyl-L-cysteinyl-Lasparaginyl-L-prolyl-L-alanyl-L-cysteinyl-L-threonyl-glycyl-L-cysteinyl-L-tyrosine，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)。
利那洛肽于2012年8月和2012年11月分别获得了美国FDA和欧盟EMEA批准上市。它是一种含有14个氨基酸的鸟苷酸环化酶C激动剂，它与肠道GC-C结合后，导致细胞内和细胞外鸟苷酸(cGMP)浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增加排便频率，细胞外cGMP浓度升高会降低痛觉神经的灵敏度、降低肠道疼痛。主要用于治疗便秘肠易激综合症(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，它是首个具有此种作用机制的治疗便秘的药物。原研专利US7304036未对利那洛肽的合成进行描述，当前专利主要有中国文专利文献CN201310223243.7，该发明直接用wang树脂进行线性肽合成，之后直接全部一次性切割并一次性氧化，导致错配的二硫键大量存在，收率低且不易纯化；专利CN201310556661.8描述的方法与专利文献CN201310223243.7相似，仅对侧链保护剂和环化条件予以改变和细化，同样存在错配二硫键和收率低的问题，纯化极其困难，工业化生产困难；专利文献CN201410357720.3对合成进行了较为详细的描述，采用了酯交换的方法获得线性肽，直接一步氧化合成三个二硫环，同样存在错配二硫键和收率低的问题，纯化极其困难，由于分子内成环需要极度稀释的溶液，因此产生大量的废水对环境不友好。有文献报道显示对利那洛肽进行合成，Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-richpeptide linaclotide，Peptide Science， 2011 , 96 (1) :69–80。该文献采用了ACM、Trt、PMeOBzl、Mmt等侧链保护剂，分别氧化二硫键的方法，但是仍然采用了在液相中二硫键的方法，同时采用了多种氧化剂，不利于纯化，废水问题未能得到解决。文献Solid-PhaseSynthesis of the Cys-rich Peptide Linaclotide，Journal of Peptide Science ,2008 , 14 (8) :56-56，提到了2Trt、2PMeOBzl、2StBu的二硫键全选择性合成策略、用6个Trt策略一次性氧化三个二硫键、用4个Trt策略一次性氧化两个二硫键策略，同样存在最终液相合成二硫键的方法，同时采用了多种氧化剂，不利于纯化且操作繁琐，废水问题未能得到解决。利那洛肽的现有合成方法存在操作繁琐，废液多，杂质多，不利于环保，需花费大量乙腈，成本高昂以及不利于大规模生产的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，该方法合成效率高，物料成本大大降低，并且适用于工业化生产。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，该方法采用6+8的合成方式，先合成6肽片段，之后将片段偶联到固相树脂上，通过对Cys不同位置的保护基，在固相树脂上完成了三个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
本发明中的相关名词解释见下表：
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特点是：其具体步骤如下：
A、片段缩合成各类利拉洛肽中间体，氨基酸保护基在下面赋予种类：
（1）R-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（2）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（3）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（4）R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（5）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3的合成;
（6）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3的合成;
（7）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（8）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（9）R-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成;
（10）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly- Cys(R1)-Tyr(R4)-R3;
（11）R-Cys(-S-S-)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly- Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(12)R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，2号位和10号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
(13)R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，2号位和10号位的两个半胱氨酸再成第二个硫醚环，5号位和13号位的两个半胱氨酸形成第三个硫醚环；
以上所述的各种保护氨基酸片段缩合后，形成的利拉洛肽各种中间体片段；
其中：
R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；
R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；
R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；
R3为H、OMe、OEt、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；
R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；
B、全保护利拉洛肽的去保护；得到L-Cys-L-Cys-L-Glu-L-Tyr-L-Cys-L-Cys-L-Asn-L-Pro-L-Ala-
L-Cys-L-Thr-Gly-L-Cys-L-Tyr，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)；
C、利拉洛肽的纯化和冻干。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特点是：
（1）单一缩合剂：DIC、DCC、EDC、氯乙酰氯、叠氮化物、TBTU、PyBOP、HBTU
（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、DCC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、DCC/ HOSu、EDC/ HOSu
（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特点是：所述的R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成方法如下：
（1）、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成
采用纯液相合成，包含多种片段合成方法，具体片段如下：
R-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)- Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；
（2）、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成
采用NH2-Cys(R1)-OH与R-Cys(R1)-OH的活泼酯或者混合酸酐法、酰氯法进行反应得到R-Cys(R1)-Cys(R1)-OH；以此类推获得R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；
或者，采用活泼酯法或者混合酸酐法、酰氯法使NH2-Cys(R1)-R3与R-Cys(R1)-OH进行反应得到R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3，然后脱除保护基R，与R-Tyr(R4)-OH氨基酸反应获得R-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；以此类推获得R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；合成中用到的单一缩合剂及缩合剂复方选自：DIC、DCC、EDC、TBTU、PyBOP、HBTU、DIC/HOBT、DCC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、DCC/ HOSu、EDC/ HOSu；
合成中酸酐法采用氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯；或者采用硫苄酯先与羧酸成硫酯，之后与氨基组分进行酯交换反应，得到产品；或者采用羧酸组分形成叠氮化物，之后与氨基组分形成产品。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特点是：L-Cys-L-Cys-L-Glu-L-Tyr-L-Cys-L-Cys-L-Asn-L-Pro-L-Ala-
L-Cys-L-Thr-Gly-L-Cys-L-Tyr，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)的合成方法如下：
（1）R-Cys(-S-S-)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-
Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(Fm)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(Fm)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3在10%-50%哌啶/DMF溶液中自动脱除Fm保护基并在1号位和6号位形成-S-S-键；
（2）、R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(-S-S-)-Cys(Mmt)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3先在1%的TFA/DCM中脱除Mmt保护基，然后在H2O2/DMF溶液中反应，在2号位和10号位形成第二组-S-S-键；
（3）R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(-S-S-)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(Trt)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(R4)-R3在I2/DMF溶液中反应，直接在5号位和13号位形成第三组-S-S-键；
或者先用TFA切割获得NH2-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu-Tyr-Cys-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH，再通过双氧水或者空气或者碘进行氧化，得到目标化合物。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特点是：各片段缩合法具体特性：采用活化酯法、混合酸酐法、酰氯法、叠氮化合物法、酶催化法或者硫苄酯交换法。
与现有技术相比，本发明方法大大提高了合成效率及合成收率，同时极大的减少了三废的产生，同时大大降低了生产成本。
附图说明
图1为实施例所制得利拉洛肽粗品HPLC图；
图2为实施例所制得的利拉洛肽高纯产品HPLC图；
图3为实施例所制得的利拉洛肽高纯产品质谱图。
具体实施方式
以下参照附图，以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，该方法采用6+8的合成方式，先合成6肽片段，之后将片段偶联到固相树脂上，通过对Cys不同位置的保护基，在固相树脂上完成了三个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
其具体步骤如下：
A、片段缩合成各类利拉洛肽中间体，氨基酸保护基在下面赋予种类：
（1）R-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（2）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（3）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（4）R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（5）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3的合成;
（6）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3的合成;
（7）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（8）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（9）R-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成;
（10）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly- Cys(R1)-Tyr(R4)-R3;
（11）R-Cys(-S-S-)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly- Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(12)R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，2号位和10号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
(13)R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，2号位和10号位的两个半胱氨酸再成第二个硫醚环，5号位和13号位的两个半胱氨酸形成第三个硫醚环；
以上所述的各种保护氨基酸片段缩合后，形成的利拉洛肽各种中间体片段；
其中：
R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；
R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；
R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；
R3为H、OMe、OEt、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；
R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；
B、全保护利拉洛肽的去保护；得到L-Cys-L-Cys-L-Glu-L-Tyr-L-Cys-L-Cys-L-Asn-L-Pro-L-Ala-
L-Cys-L-Thr-Gly-L-Cys-L-Tyr，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)；
C、利拉洛肽的纯化和冻干。
8个多肽片段的合成过程中用到的偶联体系是：
（1）单一缩合剂：DIC、DCC、EDC、氯乙酰氯、叠氮化物、TBTU、PyBOP、HBTU
（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、DCC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、DCC/ HOSu、EDC/ HOSu
（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O。
所述的R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成方法如下：
（1）、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成
采用纯液相合成，包含多种片段合成方法，具体片段如下：
R-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)- Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；
（2）、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成
采用NH2-Cys(R1)-OH与R-Cys(R1)-OH的活泼酯或者混合酸酐法、酰氯法进行反应得到R-Cys(R1)-Cys(R1)-OH；以此类推获得R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；
或者，采用活泼酯法或者混合酸酐法、酰氯法使NH2-Cys(R1)-R3与R-Cys(R1)-OH进行反应得到R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3，然后脱除保护基R，与R-Tyr(R4)-OH氨基酸反应获得R-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；以此类推获得R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；合成中用到的单一缩合剂及缩合剂复方选自：DIC、DCC、EDC、TBTU、PyBOP、HBTU、DIC/HOBT、DCC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、DCC/ HOSu、EDC/ HOSu；
合成中酸酐法采用氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯；或者采用硫苄酯先与羧酸成硫酯，之后与氨基组分进行酯交换反应，得到产品；或者采用羧酸组分形成叠氮化物，之后与氨基组分形成产品。
L-Cys-L-Cys-L-Glu-L-Tyr-L-Cys-L-Cys-L-Asn-L-Pro-L-Ala-
L-Cys-L-Thr-Gly-L-Cys-L-Tyr，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)的合成方法如下：
（1）R-Cys(-S-S-)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-
Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(Fm)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(Fm)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3在10%-50%哌啶/DMF溶液中自动脱除Fm保护基并在1号位和6号位形成-S-S-键；
（2）、R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(-S-S-)-Cys(Mmt)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3先在1%的TFA/DCM中脱除Mmt保护基，然后在H2O2/DMF溶液中反应，在2号位和10号位形成第二组-S-S-键；
（3）R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(-S-S-)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(Trt)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(R4)-R3在I2/DMF溶液中反应，直接在5号位和13号位形成第三组-S-S-键；
或者先用TFA切割获得NH2-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu-Tyr-Cys-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH，再通过双氧水或者空气或者碘进行氧化，得到目标化合物。
各片段缩合法：采用活化酯法、混合酸酐法、酰氯法、叠氮化合物法、酶催化法或者硫苄酯交换法。
实施例2：
一、Boc-Cys(Fm)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Fm)-OH的合成
(1)、Fmoc-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Fmoc-Cys(Mmt)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Glu(OtBu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.1%
(2)、Fmoc-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Fmoc-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Tyr(Trt)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：98.7%。
(3)、Fmoc-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Fmoc-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Cys(Trt)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：98.5%。
(4)、Boc-Cys(Fm)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Cys(Fm)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取105毫摩的Fmoc-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-OH，室温下机械搅拌下溶于200ml的20%的DCM/哌啶溶液中，搅拌反应30分钟，点板跟踪至反应结束。旋蒸除去大部分DCM溶液后，慢慢滴加到大量的冰无水乙醚中，产生大量的白色沉淀，过滤后用冰无水乙醚打浆洗涤2次。抽滤后水浴烘干，固体溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到2-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：98.2%。
(5)、Boc-Cys(Fm)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Fm)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Cys(Fm)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取110毫摩的NH2-Cys(Fm)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀盐酸调pH值到2-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀盐酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：98.3%。
二、Fmoc-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂的合成
2.1、第一个氨基酸偶联
2.1.1向反应釜中，加入200mmol的wang树脂和6L DMF，搅拌10-15分钟，抽滤除去液体；再加入6L DCM，氮气保护下搅拌溶胀25~35分钟，抽滤除去液体。
2.1.2称取400mmol Fmoc-Tyr(Trt)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。加入甲醇进行封端，封端结束后，抽滤除去反应液，洗涤树脂，检测树脂的替代度，按照替代度进行下一步投料。
2.2、第二个氨基酸偶联
2.2.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.2.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.3、第三个氨基酸偶联
2.3.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.3.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Gly-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.4、第四个氨基酸偶联
2.4.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.4.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Thr(tbu)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.5、第五个氨基酸偶联
2.5.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.5.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Cys(Mmt)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.6、第六个氨基酸偶联
2.6.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.6.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Ala-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.7、第七个氨基酸偶联
2.7.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.7.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Pro-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.8、第八个氨基酸偶联
2.8.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.8.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Asn-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
三、Boc-Cys(Fm)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Fm)-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-
Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂的合成
3.1去保护
称取Fmoc-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂100mmol，向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
3.2偶联
称取250mmol Boc-Cys(Fm)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Fm)-OH，250mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入55mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应4h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
四、Boc-Cys-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-
Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂cyclic (1-6) disulfide的合成
称取Boc-Cys-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂100毫摩，向计量罐中加入30%哌啶/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应40分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤1次，再次向计量罐中加入30%哌啶/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应60分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤3次，反应结束，得到目标产物。
五、Boc-Cys-Cys-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂cyclic (1-6)，(2-10) di-disulfide的合成
称取Boc-Cys-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂cyclic (1-6) disulfide化合物100毫摩，向计量罐中加入1-5%的TFA/DCM溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应40分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤1次，再次向计量罐中加入30%哌啶/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应60分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤3次，反应结束，得到目标产物。
六、Boc-Cys-Cys-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys-Tyr(Trt)-wang树脂cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13) tri-disulfide的合成
称取Boc-Cys-Cys-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys(Trt)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-wang树脂cyclic (1-6)，(2-10)di-disulfide化合物100毫摩，向计量罐中加入I2/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃，反应30分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤1次，再次向计量罐中加入I2/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃，反应60分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤3次，反应结束，得到目标产物。
七、NH2-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH，cyclic(1-6)，(2-10)，(5-13) tri-disulfide的制备
将100毫摩的Boc-Cys-Cys-Glu(OtBu)-Tyr(Trt)-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys-Tyr(Trt)-wang树脂cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13) tri-disulfide置于1000毫升的反应瓶中，用EDT：H2O：TFA=2:3:95比例的裂解液500毫升进行裂解，室温下裂解2-4小时，过滤除去树脂得到肽溶液，将其倒入到5升的冰无水乙醚中，产生大量白色沉淀，离心分离，冰无水乙醚洗涤3-6次，获得固体。粗品色谱图参照图1，之后，用醋酸水溶液和乙腈做纯化体系，pH为4.5-7之间，用C18柱做纯化设备，旋蒸冻干后获得纯度为99.86%的高纯产品65.95g，总收率达到43.24%。纯品色谱图参照图2，质谱确认分子量为1526.73，做质谱之前用乙腈和水做除盐，甲醇做溶剂进行质谱确认。质普图参照图3。

Claims (6)

1.一种利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特征在于：该方法采用6+8的合成方式，先合成6肽片段，之后将片段偶联到固相树脂上，通过对Cys不同位置的保护基，在固相树脂上完成了三个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
2.根据权利要求1所述的一种采利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特征在于：其具体步骤如下：
A、片段缩合成各类利拉洛肽中间体，氨基酸保护基在下面赋予种类：
（1）R-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（2）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（3）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（4）R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（5）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3的合成;
（6）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3的合成;
（7）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3的合成;
（8）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成;
（9）R-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成;
（10）R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly- Cys(R1)-Tyr(R4)-R3;
（11）R-Cys(-S-S-)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly- Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(12)R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，2号位和10号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
(13)R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成，1号位和6号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，2号位和10号位的两个半胱氨酸再成第二个硫醚环，5号位和13号位的两个半胱氨酸形成第三个硫醚环；
以上所述的各种保护氨基酸片段缩合后，形成的利拉洛肽各种中间体片段；
其中：
R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；
R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；
R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；
R3为H、OMe、OEt、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；
R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；
B、全保护利拉洛肽的去保护；得到L-Cys-L-Cys-L-Glu-L-Tyr-L-Cys-L-Cys-L-Asn-L-Pro-L-Ala-
L-Cys-L-Thr-Gly-L-Cys-L-Tyr，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)；
C、利拉洛肽的纯化和冻干。
3.根据权利要求2所述的利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特征在于，8个多肽片段的合成过程中用到的偶联体系是：
（1）单一缩合剂：DIC、DCC、EDC、氯乙酰氯、叠氮化物、TBTU、PyBOP、HBTU
（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、DCC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、DCC/ HOSu、EDC/ HOSu
（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O。
4.根据权利要求2所述的利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特征在于，所述的R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成方法如下：
（1）、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成
采用纯液相合成，包含多种片段合成方法，具体片段如下：
R-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)- Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-R3、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；
（2）、R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3的合成
采用NH2-Cys(R1)-OH与R-Cys(R1)-OH的活泼酯或者混合酸酐法、酰氯法进行反应得到R-Cys(R1)-Cys(R1)-OH；以此类推获得R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；
或者，采用活泼酯法或者混合酸酐法、酰氯法使NH2-Cys(R1)-R3与R-Cys(R1)-OH进行反应得到R-Cys(R1)-Cys(R1)-R3，然后脱除保护基R，与R-Tyr(R4)-OH氨基酸反应获得R-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；以此类推获得R-Cys(R1)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(R1)-R3；合成中用到的单一缩合剂及缩合剂复方选自：DIC、DCC、EDC、TBTU、PyBOP、HBTU、DIC/HOBT、DCC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、DCC/ HOSu、EDC/ HOSu；
合成中酸酐法采用氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯；或者采用硫苄酯先与羧酸成硫酯，之后与氨基组分进行酯交换反应，得到产品；或者采用羧酸组分形成叠氮化物，之后与氨基组分形成产品。
5.根据权利要求2所述的利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特征在于：L-Cys-L-Cys-L-Glu-L-Tyr-L-Cys-L-Cys-L-Asn-L-Pro-L-Ala-L-Cys-L-Thr-Gly-L-Cys-L-Tyr，cyclic (1-6)，(2-10)，(5-13)-tris (disulfide)；的合成方法如下：
（1）R-Cys(-S-S-)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-
Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(Fm)-Cys(R1)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(Fm)-Asn-Pro-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3在10%-50%哌啶/DMF溶液中自动脱除Fm保护基并在1号位和6号位形成-S-S-键；
（2）、R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(-S-S-)-Cys(Mmt)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(R1)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Tyr(R4)-R3先在1%的TFA/DCM中脱除Mmt保护基，然后在H2O2/DMF溶液中反应，在2号位和10号位形成第二组-S-S-键；
（3）R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-
Gly-Cys(-S-S-)-Tyr(R4)-R3的合成
R-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu(R2)-Tyr(R4)-Cys(Trt)-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(R4)-R3在I2/DMF溶液中反应，直接在5号位和13号位形成第三组-S-S-键；
或者先用TFA切割获得NH2-Cys(-S-S-)-Cys(-S-S-)-Glu-Tyr-Cys-Cys(-S-S-)-Asn-Pro-Ala-Cys(-S-S-)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH，再通过双氧水或者空气或者碘进行氧化，得到目标化合物。
6.根据权利要求2所述的利拉洛肽的固液相相结合的合成方法，其特征在于，各片段缩合法具体特性：采用活化酯法、混合酸酐法、酰氯法、叠氮化合物法、酶催化法或者硫苄酯交换法。
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