CN104628826A - 利那洛肽的制备方法 - Google Patents

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吴君臣
刘奔
邹荣峰
王�琦
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Abstract

本发明提供利那洛肽的制备方法，利用标准的Fmoc技术，将侧链保护的氨基酸与WANG树脂相连，加入缩合剂HBTU和碱DIPEA，在DMF溶剂中发生缩合反应，采用含20%六氢哌啶的DMF溶液进行脱Fmoc保护,然后从固相树脂上切下来。在磷酸钠缓冲溶液中加入碘单质进行氧化Cysteine，获得利那洛肽。本发明提供的利那洛肽的制备方法是高产率的合成利那洛肽的工艺，简化了环化过程，提升了环化产率，最终产品收率达到30%-60%；该制备方法简便、反应条件温和、收率较高、得到产品纯度高，是利那洛肽产业化可行的制备方法，为工业生产提供了良好的前景。

Description

利那洛肽的制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及利那洛肽的制备方法。
背景技术
利那洛肽是在成年中治疗便秘肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)的药物(鸟苷酸环化酶－C(GC-C)的激动剂)。利那洛肽与肠道GC-C结合后，导致细胞内外环鸟苷酸（cGMP）浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增加排便频率。细胞外cGMP浓度升高可以降低痛觉神经的灵敏度，可减低肠道疼痛。此外，利那洛肽也可用于治疗和预防结肠癌、直肠癌和机体炎症。利那洛肽序列为SEQ ID NO：1所示的序列：CysCysGluTyrCysCysAsnProAlaCysThrGlyCysTyr。在1位和6位、2位和10位以及5位和13位的半胱氨酸残基之间通过氧化形成二硫键成环，到目前为止，利那洛肽及其相关肽的合成制备仅得到10-25%的产物，例如文献Optimized Fmoc Solid-PhaseSynthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide,Published online4August2010in Wiley OnlineLibrary,报道的制备方法。中国专利公开号CN102875655A，其氧化步骤进一步简化，产率也有所提高，但是其收率仍然不理想，环化过程复杂且环化产率低，需要消耗大量的溶剂和原料，且需要大量的时间分离提纯，给工业化生产带来不便。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利那洛肽的制备方法，简化环化过程，提升环化产率，使产品收率提高。
本发明的技术方案是：具有如下结构的利那洛肽的制备方法，
其特征在于：包括如下步骤：
（1）采用固相Fmoc技术，将羧基树脂和侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸置于反应瓶中，加入有机碱和偶合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团，得到与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂；
（2）将步骤（1）得到的与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂直接和侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸置于反应瓶中，加入有机碱及偶合剂，在DMF溶液中反应后,脱除Fmoc保护基团，得到进一步与侧连带有保护基的半胱氨酸偶联的树脂；
（3）依次重复步骤（2），其中原料氨基酸依次替换为Fmoc甘氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、Fmoc丙氨酸、Fmoc脯氨酸、侧连带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸，最终得到脱除Fmoc保护基团的与上述氨基酸依次偶联的树脂；
（4）切割步骤（3）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到化合物：
HO-Tyr-Cys-Gly-Thr-Cys-Ala-Pro-Asn-Cys-Cys–Tyr-Glu-Cys-Cys-H；
（5）将步骤（4）所得化合物用单质碘在pH=6-13的磷酸钠缓冲溶液中氧化,形成三个二硫键得到利那洛肽产品：
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸依次为叔丁基保护的Fmoc酪氨酸、三苯甲基保护的Fmoc半胱氨酸、Trt保护的Fmoc苏氨酸、Trt保护的Fmoc天冬酰胺、tBu保护的Fmoc谷氨酸。
本发明所述的利那洛肽的制备方法的切割过程中，同时去掉氨基酸的侧连保护基团。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，进一步优选的是，所述步骤（5）中磷酸钠缓冲溶液pH=9-12。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述羧基树脂为王树脂。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述有机碱为二异丙基乙基氨。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述偶合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述各种侧连带有保护基的Fmoc氨基酸与羧基树脂的摩尔比均为2～8/1。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述偶合剂与羧基树脂摩尔比2～8/1。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述碱与各种侧连带有保护基的Fmoc氨基酸摩尔比均为2～6/1。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述脱除Fmoc保护基团的体系是六氢哌啶/DMF混合液。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述六氢哌啶/DMF混合液的体积比1/4。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述六氢哌啶/DMF的混合液加入量为10-30mL/g树脂，即每g王树脂加入10-30mL六氢哌啶/DMF混合液体。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述步骤（5）中氧化的时间为6-12h，氧化的温度为15-30℃。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，进一步优选的是，所述步骤（5）中氧化的时间为7-10h。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，进一步优选的是，所述步骤（5）中氧化的温度为20-25℃
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述步骤（5）中磷酸钠缓冲溶液中单质碘的含量2-15%。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，进一步优选的是，所述步骤（5）中磷酸钠缓冲溶液中单质碘的含量5-12%。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，所述氧化二硫键反应位置发生在按N端到C端的顺序：1位和6位、5位和13位、2位和10位半胱氨酸双硫键。
根据能量最低和构象优势原理，本申请氧化方法形成1位和6位、5位和13位、2位和10位双硫键的可能性要大于其他位置形成双硫键，利那洛肽产品是主产物。
根据本发明提供的利那洛肽的制备方法，优选的是，本发明中的活化体系HBTU、DIPEA和DMF。
本发明氧化反应在pH=6-13的磷酸钠缓冲溶液可以更好的保持多肽的稳定性。
本发明氧化反应中在磷酸钠缓冲溶液中单质碘的含量2-15%，能够提供适合本发明的氧化能力，提高产率和效率。
本发明利用标准的(芴甲氧羰基)Fmoc技术，将侧链保护的氨基酸与WANG树脂相连，使用常规缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU),加入有机碱二异丙基乙基氨(DIPEA)，在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中发生缩合反应，采用常规的含20%六氢哌啶的DMF溶液进行脱Fmoc保护,然后从固相树脂上切割下来。为提升氧化环化效率及产率，采用在pH＝6～13磷酸钠缓冲溶液中加入2-15%碘单质进行氧化Cysteine，获得利那洛肽。产物经高效液相色谱(HPLC)(流动相为水和乙腈)分离得利那洛肽。产品质量达到药用标准。
本发明采用WANG树脂合成直链多肽并氧化制备具有特定空间构型的含三个二硫键的利那洛肽。本发明反应条件温和，操作简便，副产物少，总收率高且质佳，易于工业化生产。本发明所述特定空间构型为多肽折叠形成的特定的分子形态，多肽具有生物活性主要原因之一是由于它的特定的分子形态。
有益的技术效果：
本发明提供的利那洛肽的制备方法是高产率的合成利那洛肽的工艺，简化了环化过程，提升了环化产率，最终产品收率达到30%-60%；该制备方法简便、反应条件温和、收率较高、得到产品纯度高，是利那洛肽产业化可行的制备方法，为工业生产提供了良好的前景。
附图说明
图1为本发明制备利那洛肽产品的HPLC图谱；
图2为本发明制备利那洛肽产品的MADLI-TOF质谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本发明所用试剂和仪器：
试剂 生产厂家 规格
DIPEA 吉尔生化 ≥99%
HBTU 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Tyr(tBU)-OH 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Gly-OH 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Thr(Trt)-OH 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Ala-OH 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Pro-OH 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Asn(Trt)-OH 吉尔生化 ≥99%
Fmoc-Glu(tBU)-OH 吉尔生化 ≥99%
WANG树脂 吉尔生化 ≥99%
DMF 国药 AR
六氢哌啶 国药 AR
三氟乙酸 国药 AR
三甲基硅油 国药 AR
碘 国药 AR
磷酸钠 国药 AR
HPLC GE,AKTA
MALDI-TOF AB SCIE,4800Plus
本发明提供具有如下结构的利那洛肽的制备方法，
实施例1：
步骤1将WANG树脂(1.28mmol/g,640mg),叔丁基(tBu)保护的Fmoc酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBU)-OH)(689.33mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟,其它的氨基酸的合成方法参照同一步骤进行实施。
步骤2将与酪氨酸反应后的WANG树脂直接与三苯甲基(Trt)保护的Fmoc半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(v/v=1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤3将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)(445.98mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤4将与甘氨酸反应后的WANG树脂直接与Trt保护的Fmoc苏氨酸(Fmoc-Thr(Trt)-OH)(875.55mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤5将与苏氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤6将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)(467.01mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤7将与丙氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)(506.07mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤8将与脯氨酸反应后的WANG树脂直接与Trt保护的Fmoc天冬酰胺(Fmoc-Asn(Trt)-OH)(895.02mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤9将与天冬氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤10将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤11将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接Fmoc-Tyr(tBU)-OH(689.33mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤12将与酪氨酸反应后的WANG树脂直接与tBu保护的Fmoc谷氨酸(Fmoc-Glu(tBU)-OH)(638.24mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤13将与谷氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤14将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤15采用三氟乙酸/三甲基硅烷/水以体积比95/2.5/2.5为混合切割3小时，得粗品。
步骤16粗品在pH=6的磷酸钠缓冲溶液中，加入5%的单质碘进行氧化反应,氧化的时间为10h，氧化的温度为20℃得粗产物，经HPLC分离得利那洛肽，纯度为97.5%。理论产量2.288g，实际产量0.801g，产率35%.分子C59H79N15O21S6,分子量为1525.3899;（在MADLI-TOF中显示为1526.3900[M+H]+（见附图）。其中HPLC分离条件：分离溶剂为乙腈和水，乙腈从0%-90%，水从100%-10%。色谱柱填料为C18，柱温25℃。质谱测定条件：用甲醇溶解，配置利那洛肽含量为1%。
实施例2：
步骤1将WANG树脂(1.28mmol/g,640mg),叔丁基(tBu)保护的Fmoc酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBU)-OH)(689.33mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟,其它的氨基酸的合成方法参照同一步骤进行实施。
步骤2将与酪氨酸反应后的WANG树脂直接与三苯甲基(Trt)保护的Fmoc半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(v/v=1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤3将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)(445.98mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤4将与甘氨酸反应后的WANG树脂直接与Trt保护的Fmoc苏氨酸(Fmoc-Thr(Trt)-OH)(875.55mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤5将与苏氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤6将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)(467.01mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤7将与丙氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)(506.07mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤8将与脯氨酸反应后的WANG树脂直接与Trt保护的Fmoc天冬酰胺(Fmoc-Asn(Trt)-OH)(895.02mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤9将与天冬氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤10将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤11将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接Fmoc-Tyr(tBU)-OH(689.33mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤12将与酪氨酸反应后的WANG树脂直接与tBu保护的Fmoc谷氨酸(Fmoc-Glu(tBU)-OH)(638.24mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤13将与谷氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤14将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤15采用三氟乙酸/三甲基硅烷/水以体积比95/2.5/2.5为混合切割5小时，得粗品。
步骤16粗品在pH=9的磷酸钠缓冲溶液中，加入10%的单质碘进行氧化反应,，氧化的时间为7h，氧化的温度为20℃得粗产物，经HPLC分离得利那洛肽，纯度为97.5%。理论产量2.288g，实际产量0.781g，产率34%.分子C59H79N15O21S6,分子量为1525.3899;（在MADLI-TOF中显示为1526.3900[M+H]+。其中HPLC分离条件：分离溶剂为乙腈和水，乙腈从0%-90%，水从100%-10%。色谱柱填料为C18，柱温25℃。质谱测定条件：用甲醇溶解，配置利那洛肽含量为1%。
实施例3：
步骤1将WANG树脂(1.28mmol/g,640mg),叔丁基(tBu)保护的Fmoc酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBU)-OH)(689.33mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟,其它的氨基酸的合成方法参照同一步骤进行实施。
步骤2将与酪氨酸反应后的WANG树脂直接与三苯甲基(Trt)保护的Fmoc半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(v/v=1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤3将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)(445.98mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤4将与甘氨酸反应后的WANG树脂直接与Trt保护的Fmoc苏氨酸(Fmoc-Thr(Trt)-OH)(875.55mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤5将与苏氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤6将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)(467.01mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤7将与丙氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)(506.07mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤8将与脯氨酸反应后的WANG树脂直接与Trt保护的Fmoc天冬酰胺(Fmoc-Asn(Trt)-OH)(895.02mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤9将与天冬氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤10将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤11将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接Fmoc-Tyr(tBU)-OH(689.33mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤12将与酪氨酸反应后的WANG树脂直接与tBu保护的Fmoc谷氨酸(Fmoc-Glu(tBU)-OH)(638.24mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤13将与谷氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤14将与半胱氨酸反应后的WANG树脂直接与Fmoc-Cys(Trt)-OH(878.58mg,1.5mmol)及DIPEA(414μL,5mmol)，HBTU(113.77mg,3mmol)置于反应瓶中，加入DMF(20mL)溶解,搅拌6-12小时。反应完毕，静置，抽干DMF，用DMF清洗树脂，得黄色树脂，然后用六氢哌啶－DMF(1/4;20mL)脱除保护基团，反应20-40分钟。
步骤15采用三氟乙酸/三甲基硅烷/水以体积比95/2.5/2.5为混合切割4小时，得粗品。
步骤16粗品在pH=12的磷酸钠缓冲溶液中，加入12%的单质碘进行氧化反应,氧化的时间为6h，氧化的温度为15℃得粗产物，经HPLC分离得利那洛肽，纯度为97.5%。理论产量2.288g，实际产量0.952g，产率41%.分子C59H79N15O21S6,分子量为1525.3899;（在MADLI-TOF中显示为1526.3900[M+H]+。其中HPLC分离条件：分离溶剂为乙腈和水，乙腈从0%-90%，水从100%-10%。色谱柱填料为C18，柱温25℃。质谱测定条件：用甲醇溶解，配置利那洛肽含量为1%。
本发明提供的利那洛肽的制备方法是高产率的合成利那洛肽的工艺，简化了环化过程，提升了环化产率，最终产品收率达到30%-60%；该制备方法简便、反应条件温和、收率较高、得到产品纯度高，是利那洛肽产业化可行的制备方法，为工业生产提供了良好的前景。
上述的描述或以下权利要求中公开的、以它们特定的形式或根据执行公开功能的手段或用于达到公开结果的方法或工艺表示的特征，如果合适，可单独地或以这些特征的任何组合，用于以其各种不同的形式实现本发明。
为了清楚和理解的目的，上述发明已通过说明和实施例被详细地描述。在所附权利要求的范围内可以实施的变化和修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的。因此，应当理解，以上描述意欲是示例性的而不是限制性的。因此，本发明的范围不应参考以上描述确定，而应参考所附权利要求以及这些权利要求赋予的等同物的全部范围而确定。

Claims (10)

1.具有如下结构的利那洛肽的制备方法，
其特征在于：包括如下步骤：
（1）采用固相Fmoc技术，将羧基树脂和侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸置于反应瓶中，加入有机碱和偶合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团，得到与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂；
（2）将步骤（1）得到的与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂直接和侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸置于反应瓶中，加入有机碱及偶合剂，在DMF溶液中反应后,脱除Fmoc保护基团，得到进一步与侧连带有保护基的半胱氨酸偶联的树脂；
（3）依次重复步骤（2），其中原料氨基酸依次替换为Fmoc甘氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、Fmoc丙氨酸、Fmoc脯氨酸、侧连带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸，最终得到脱除Fmoc保护基团、且与上述氨基酸依次偶联的树脂；
（4）切割步骤（3）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到化合物：
HO-Tyr-Cys-Gly-Thr-Cys-Ala-Pro-Asn-Cys-Cys–Tyr-Glu-Cys-Cys-H；
（5）将步骤（4）所得化合物用单质碘在pH=6-13的磷酸钠缓冲溶液中氧化,形成三个二硫键得到利那洛肽产品：
2.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸依次为叔丁基保护的Fmoc酪氨酸、三苯甲基保护的Fmoc半胱氨酸、Trt保护的Fmoc苏氨酸、Trt保护的Fmoc天冬酰胺、tBu保护的Fmoc谷氨酸。
3.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述羧基树脂为王树脂；所述有机碱为二异丙基乙基氨；所述偶合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐。
4.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述各种侧连带有保护基的Fmoc氨基酸与羧基树脂的摩尔比均为2～8/1。
5.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述偶合剂与羧基树脂摩尔比2～8/1。
6.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述碱与各种侧连带有保护基的Fmoc氨基酸摩尔比均为2～6/1。
7.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述脱除Fmoc保护基团的体系是六氢哌啶/DMF混合液；所述六氢哌啶/DMF混合液的体积比1/4，所述六氢哌啶/DMF混合液加入量为10-30mL/g树脂。
8.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中磷酸钠缓冲溶液中单质碘的含量2-15%。
9.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中氧化的时间为6-12h，氧化的温度为15-30℃。
10.根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述氧化二硫键反应位置发生在按N端到C端的顺序：1位和6位、5位和13位、2位和10位半胱氨酸双硫键。
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