CN116120427A - 一种司美格鲁肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种司美格鲁肽的合成方法。包括按司美格鲁肽的氨基酸序列，通过固相合成方法，从C端到N端依次偶联氨基酸或肽段，得到司美格鲁肽全保护树脂，经裂解、纯化得到司美格鲁肽；所述肽段包括第20‑21位氨基酸形成的二肽S20‑S21，所述S20‑S21为R1‑Lys(Fmoc)‑Glu(OtBu)‑OH，其中，R1为Dde或ivDde，Fmoc为侧链保护基团，R1为主链保护基团。本发明生产的司美格鲁肽粗品的总收率达57.07％，HPLC纯度达77.71％，减少了杂质的生产，合成及纯化工艺简单，选用物料价廉易得，综合生产成本低，更利于工业化生产。

Description

一种司美格鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种司美格鲁肽的合成方法。
背景技术
GLP-1(Glucagon-like peptide-1)，又叫胰高血糖素样肽-1，最早由科学家在上世纪70年代从肠道提取物中分离出来。GLP-1是以葡萄糖依赖的方式起作用，降糖效果优良温和，不易引发低血糖。此外，GLP-1还保护胰岛β细胞，促进增殖、抑制凋亡，抑制高血糖素的合成释放，延缓胃排空、抑制食欲、帮助减重，对糖尿病慢性并发症中的大小血管病变、神经病变均有改善。但GLP-1不稳定、易降解，极易被DPP-4(二肽基肽酶-4)降解。为了增加GLP-1的“续航能力”，对GLP-1分子结构进行人工修饰，由此产生了GLP-1类似物。与GLP-1相比，GLP-1类似物有更长的半衰期、更强的生物活性和更低的免疫原性，药效更好、安全性更好，患者用药次数更少、依从性更高。
司美格鲁肽(曾暂用名：索马鲁肽；英文名：Semaglutide)，是诺和诺德公司研发的一款长效GLP-1类似物，半衰期长达7天，适合每周注射一次且血药浓度平稳，能够有效降低糖化血红蛋白和降低体重；除了开发作为一种皮下注射药物，诺和诺德也正在开发司美格鲁肽的口服版本，每日口服一次。
司美格鲁肽的肽序列如下：
H-His1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH。
分子式：C187H291N45O59，Exact Mass:4111.1154，Molecular Weight:4113.6410，结构式如下：
Figure BDA0004073976820000011
从肽序来看，主链有31个氨基酸，2位氨基酸为非天然α-氨基异丁酸(Aib)，肽序20位氨基酸赖氨酸接上两个AEEA、γ-谷氨酸和十八烷二酸脂肪链形成侧链。
2017年12月，美国食品与药物管理局(FDA)批准司美格鲁肽注射液上市(Ozempic)，用于成人2型糖尿病患者的血糖控制；2019年9月，司美格鲁肽口服制剂(Rybelsus)获FDA批准，用于结合饮食和运动改善2型糖尿病患者的血糖控制；2021年6月，FDA进一步批准司美格鲁肽皮下注射制剂(Wegovy)用于肥胖或超重成人的慢性体重管理。2021年4月，获国家食品药品监督管理局(NMPA)批，用于治疗成人2型糖尿病及降低T2DM合并心血管疾病患者的心血管不良事件风险。并于2021年12月3日，被纳入《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录(2021年)》。2020年，司美格鲁肽注射剂已在全球43个国家上市，上半年销售额持续增长高达151％，约15亿美元。预计到2024年，司美格鲁肽注射制剂的全球企业销售额将会达到52.8亿美元，司美格鲁肽口服制剂可达到32.3亿美元，未来年销售额将超过100亿美元。司美格鲁肽有着无比广阔的市场前景。
目前，国内外见诸报道的司美格鲁肽化学固相合成方法，生产中一般可以选用CTCResin(2-三苯基氯树脂)(CN106928343 A)和Wang Resin(王树脂)(CN112250755 A)作为固相反应载体，但这两种树脂均有不足之处。CTC Resin作为固相反应载体时，在弱酸条件既可以使Linker脱落，多肽片段被切除；Wang Resin作为固相反应载体时，依次偶联至Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin，脱保护后，Arg30残基的α-氨基处于游离状态，它可能对树脂与肽链结合部的苄酯键进行分子内成环，生成六元环二酮哌嗪衍生物从载体上释放出来导致反应终止(DKPS)。该反应非常迅速，会使收率大大降低，并导致生产成本增加，经济效益下降。
从氨基酸的偶联顺序分类，司美格鲁肽化学固相合成方法一般分为两种合成策略。一是逐步偶联主链，然后脱除Lys20侧链保护基，再逐步偶联侧链(CN113402598 A；CN11212590B；CN101133082 B)；二是逐步偶联至主链的Lys20后，优先偶联侧链，再完成主链的偶联(CN112028986 A；CN 113880935 B)。为了得到更优的合成效果，上述两种合成策略一般还会结合特殊肽段、特殊氨基酸保护策略、O-异酰二肽等技术使用。CN112028986 A以Fmoc-Gly-Wang resin为固相载体，2022年10月，CDE发布了《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则(征求意见稿)》中表述，由于缺乏有效的表征手段和针对性的质控方法，不推荐与C端氨基酸相连的树脂作为起始物料；并且反应产物中还存在一定量的杂质，纯度有待进一步提高。
CN113444164B公开了一种合成司美格鲁肽的方法，CN111217901 A公开了一种合成司美格鲁肽的方法。上述两种司美格鲁肽的制备方法简且能够得到纯度较高的司美格鲁肽粗品；但是合成工艺中tBuOC-C16H32-CONH-γ-Glu(α-OtBu)-AEEA-AEEA-OSu或Fmoc-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic Acid-18(tert-butoxy)]-OH价格高，大大提高了生产成本。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种司美格鲁肽的合成方法，其解决了现有技术中存在的司美格鲁肽合成收率低、成本高、含有杂质的问题。
本发明一方面，提供一种司美格鲁肽的合成方法，按司美格鲁肽的氨基酸序列，通过固相合成方法，从C端到N端依次偶联氨基酸或肽段，得到司美格鲁肽全保护树脂，经裂解、纯化得到司美格鲁肽；所述肽段包括第20-21位氨基酸形成的二肽S20-S21，所述S20-S21为R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH，其中，R1为Dde或ivDde，Fmoc为侧链保护基团，R1为主链保护基团。
进一步地，所述肽段还包括第1-2位氨基酸形成的二肽S1-S2、第3-4位氨基酸形成的二肽S3-S4、第15-16位氨基酸形成的二肽S15-S16、第29-30位氨基酸形成的二肽S29-S30，其中，S1-S2为R2-His(Trt)-Aib-OH，R2为Fmoc或Boc；S3-S4或S15-S16为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH；S29-S30为Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH。
进一步地，包括以下步骤：
S1：采用Wang树脂为固相合成载体，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH和R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH，得到R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin；
S2：脱除S20-S21中的侧链保护基团Fmoc，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和HOOC-C16H32-COOtBu，得到R1-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic
Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin；
S3：脱除S20-S21中的主链保护基团R1，依次偶联Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和R2-His(Trt)-Aib-OH，得到司美格鲁肽全保护树脂；
S4：将司美格鲁肽全保护树脂，经过裂解、沉降、离心和干燥，得到司美格鲁肽。
进一步地，步骤S1中，所述Wang树脂的取代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.1-0.4mmol/g。
进一步地，步骤S2中，Fmoc的脱保护剂为哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，浓度为20％～50％，优选20％。
进一步地，步骤S3中，R1的脱保护剂为水合肼的N,N-二甲基甲酰胺溶液，浓度为1％～5％，优选2％～3％。
进一步地，步骤S1-S3中还包括以下特征中的一种或多种：
(1)所述偶联采用的缩合试剂为A、B、C、D中任意一种或几种，
其中，A选自DIC、DCC、EDCI中的任意一种，B选自HOOBT、HOBT、BOAT中的任意一种，C选自DIPEA、NMM中的任意一种，D选自DMAP、HBTU、HATU、TBTU、PyBOP中的任意一种；
(2)所述偶联的反应介质为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜中的一种或多种，优选N,N-二甲基甲酰胺；
(3)所述偶联及脱保护的温度为25-45℃，优选30-40℃。
进一步地，按质量比计，Wang树脂:氨基酸或肽段:缩合试剂＝1:2:2～1:4:4，优选Wang树脂:氨基酸或肽段:缩合试剂＝1:3:3。
进一步地，步骤S4中，所述裂解用到的裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇、苯酚和水的混合物，优选，按质量比计，三氟乙酸:1，2-乙二硫醇:三异丙基硅烷:苯酚:水＝87.5:5:2.5:2.5:2.5。
进一步地，步骤S4中，所述沉降用到的沉降液为正己烷、乙醚和甲基叔丁基醚中的一种或多种，优选甲基叔丁基醚。
本发明一实施例中，制备方法包括以下步骤：(1)以Wang Resin为固相合成载体，合成得到Fmoc-Gly-Wang Resin起始树脂。(2)按照司美格鲁肽的序列，由C端至N端依次进行氨基酸或肽段的偶联至Lys20，其中S29-S30片段为Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH；S20-S21片段为R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH，R1为Dde或ivDde。(3)脱除Lys20ε-氨基保护基，依次进行侧链上氨基酸或化合物的偶联。(4)脱除Lys20α-氨基保护基，依次进行主链上氨基酸或化合物的偶联，其中S3-S4和S15-S16片段为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH；S1-S2片段为R2-His(Trt)-Aib-OH，R2为Fmoc或Boc。(5)司美格鲁肽全保护肽树脂经裂解液裂解、沉淀，得到司美格鲁肽粗肽。
本发明中司美格鲁肽全保护树脂序列为：
H-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin。
或
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-V al-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEE A-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin。
司美格鲁肽序列为：
H-His1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-G ly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH。
本发明的技术原理为：在司美格鲁肽的生产中，发明人发现H-Arg(Pbf)-Gly-WangResin,有较显著的发生二酮哌嗪成环副反应的趋势；进一步，发明人还发现Dde-Lys(Fmoc)-OH较普通氨基酸偶联困难，造成司美格鲁肽粗品中有较多杂质HOOC-C16H32-CONH-γ-Glu-AEEA-AEEA-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-O H。因此，发明人尝试将第20和21位氨基酸形成二肽R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH，同时，将第1-2位氨基酸形成二肽R2-His(Trt)-Aib-OH、第29-30位氨基酸形成的二肽Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH、第3-4位氨基酸、第15-16位氨基酸形成二肽Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH，结果发现：不仅减少了HOOC-C16H32-CONH-γ-Glu-AEEA-AEEA-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-O H等杂质的生成，提高了产品纯度，而且提高了产品的收率。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明产品的收率高、纯度高，司美格鲁肽粗品的总收率达57.07％，司美格鲁肽粗品的HPLC纯度达77.71％，
(2)在肽链延长的过程中，Lys20-Glu21选择以S20-S21片段Dde-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH或ivDde-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH的形式接入，可以解决Dde-Lys(Fmoc)-OH或ivDde-Lys(Fmoc)-OH偶联困难的问题，提高合成收率；并且当接入Lys20后，采用先偶联侧链，再偶联主链的策略，侧链的接入可以解决司美格鲁肽自身序列由于β-折叠，造成的残基偶联困难，收率低的问题；进一步，还减少了杂质HOOC-C16H32-CONH-γ-Glu-AEEA-AEEA-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-O H的生成。
(3)本发明采用Wang树脂为固相合成载体，对比采用CTC Resin(2-三苯基氯树脂)，可以有效避免弱酸条件下Linker脱落，多肽片段被切除，进而有效提高合成收率。
(4)在肽链延长的过程中，Gly29-Arg30选择以S29-S30片段Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH的形式接入，可以显著抑制二酮哌嗪成环副反应的发生，提高合成收率。
(5)在肽链延长的过程中，Glu3-Gly4和Glu15-Gly16选择以S3-S4和S15-S16片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的形式接入，可以减少副反应，降低加Gly或缺Gly杂质的形成，提高产品的纯度，更利于粗品的纯化。
(6)在肽链延长的过程中，His1-Aib2选择以S1-S2片段Fmoc-His(Trt)-Aib-OH或Boc-His(Trt)-Aib-OH的形式接入，可以减少缺His杂质的形成，并抑制氨基酸His消旋的风险，提高产品的纯度，更利于粗品的纯化。
附图说明
图1为本发明中司美格鲁肽的合成路线图；
图2为本发明实施例6中司美格鲁肽粗品的HPLC图谱；
图3为本发明实施例6中司美格鲁肽纯品的HPLC图谱；
图4为本发明实施例6中司美格鲁肽纯品的LC-MS图谱。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。本申请中所用试剂及仪器的名称及英文缩写如表1所示。
表1所用试剂及仪器
Figure BDA0004073976820000061
Figure BDA0004073976820000071
Figure BDA0004073976820000081
实施例1合成司美格鲁肽起始树脂Fmoc-Gly-Wang Resin
第一个氨基酸加载：于1000ml反应烧瓶中，加入27.1g Wang Resin(取代度0.37mmol/g，10mmol)和200ml DMF，搅拌均匀，水浴加热，定温T内＝35±3℃；另于250ml活化瓶中，加入8.9g Fmoc-Gly-OH(30mmol)、4.2g HOBt(30mmol)和100ml DMF，搅拌溶清，冰水浴控温至T内＝5±5℃，继续加入4.7ml DIC(30mmol)，维持温度，活化5-10min。活化完成后，将活化液加入到反应烧瓶中，并加入0.4g DMAP(3mmol)，搅拌反应。反应5h后，停止反应，将反应液转移到合适的固相反应器中，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干。
肽树脂封端：量取252ml DMF、30ml醋酸酐和18ml DIPEA共300ml，混匀，加入到固相反应器中，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝35±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干，得到Fmoc-Gly-Wang Resin。司美格鲁肽的合成路线图如图1所示。
实施例2司美格鲁肽侧链延长反应
肽树脂N端氨基去保护：向固相反应器中加入300ml去保护液(20％ PIP in DMF)，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝35±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤6次，每次抽干。取样做NT检测，检测结果为阳性。
偶联氨基酸或肽段：预活化：称取氨基酸或肽段(30mmol)和HOBt(30mmol)，加入到活化瓶中，并加入300ml DMF，搅拌溶清。冰水浴控温T内＝5±5℃，继续加入DIC(30mmol)，维持温度，活化5-10min。偶联：活化完成后，将活化液加入到固相反应器中，打开N2阀门，开始反应。反应2h取样进行NT检测，NT检测呈阴性后，停止反应，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干。司美格鲁肽肽树脂延长反应得到：
Dde-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin。各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量，见表2。
表2各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量
偶联顺序 氨基酸或肽段名称 MW. 摩尔数/mmol 质量/g
1 Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH 705.82 30 21.2
2 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648.77 30 19.5
3 Fmoc-Val-OH 339.39 30 10.2
4 Fmoc-Leu-OH 353.41 30 10.6
5 Fmoc-Trp(Boc)-OH 526.58 30 15.8
6 <![CDATA[Fmoc-Ala-OH H<sub>2</sub>O]]> 329.33 30 9.8
7 Fmoc-Ile-OH 353.41 30 10.6
8 Fmoc-Phe-OH 387.43 30 11.6
9 Dde-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH 717.86 30 21.5
实施例3司美格鲁肽侧链延长反应
肽树脂N端氨基去保护：向固相反应器中加入300ml去保护液(20％PIP in DMF)，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝35±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤6次，每次抽干。取样做NT检测，检测结果为阳性。
偶联氨基酸或肽段：预活化：称取氨基酸或肽段(30mmol)和HOBt(30mmol)，加入到活化瓶中，并加入300ml DMF，搅拌溶清。冰水浴控温T内＝5±5℃，继续加入DIC(30mmol)，维持温度，活化5-10min。偶联：活化完成后，将活化液加入到固相反应器中，打开N2阀门，开始反应。反应2h取样进行NT检测，NT检测呈阴性后，停止反应，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干。
司美格鲁肽侧链延长反应合成得到Dde-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin。各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量，见表3。
表3各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量
偶联顺序 氨基酸或肽段名称 MW. 摩尔数/mmol 质量/g
1 Fmoc-AEEA-OH 385.41 30 11.6
2 Fmoc-AEEA-OH 385.41 30 11.6
3 Fmoc-Glu-OtBu 425.47 30 12.8
4 <![CDATA[HOOC-C<sub>16</sub>H<sub>32</sub>-COOtBu]]> 370.57 30 11.1
实施例4司美格鲁肽Lys20氨基酸主链氨基脱Dde保护
司美格鲁肽Lys20氨基酸主链氨基脱Dde保护：向固相反应器中加入300ml去保护液(2％N2H4·H2O in DMF)，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝35±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤6次，每次抽干。取样做NT检测，检测结果为阳性。合成得到树脂序列为：
H-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin。
实施例5司美格鲁肽主链延长反应
肽树脂N端氨基去保护：向固相反应器中加入300ml去保护液(20％ PIP in DMF)，打开N2阀门，开始反应，反应温度T内＝35±3℃，反应0.5h。反应结束后，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤6次，每次抽干。取样做NT检测，检测结果为阳性。
偶联氨基酸或肽段：预活化：称取氨基酸或肽段(30mmol)和HOBt(30mmol)，加入到活化瓶中，并加入300ml DMF，搅拌溶清。冰水浴控温T内＝5±5℃，继续加入DIC(30mmol)，维持温度，活化5-10min。偶联：活化完成后，将活化液加入到固相反应器中，打开N2阀门，开始反应。反应2h取样进行NT检测，NT检测呈阴性后，停止反应，抽滤，肽树脂用300ml DMF洗涤4次，每次抽干。得到肽树脂60.35g，收率71.8％。合成肽树脂序列为Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-S er(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin。各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量，见表4。
表4各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量
Figure BDA0004073976820000101
Figure BDA0004073976820000111
实施例6裂解得到司美格鲁肽粗品
依次量取87.5ml TFA、5ml EDT、2.5ml TIS、2.5ml PhOH和2.5ml纯化水，加入到裂解瓶中，混合均匀，预冷至T内＝0-10℃。搅拌条件下，将10g司美格鲁肽全保护树脂缓慢加入到裂解瓶中，开始裂解。反应温度T内＝35±3℃，反应2-3h。裂解完成后，过滤，滤饼用10mlTFA淋洗2，每次抽干。合并滤液，于搅拌条件下，缓慢加入到1000ml冷的MTBE中，有白色固体析出。
离心，除去上清液，固体继续用500ml冷的MTBE打浆、洗涤、离心，完成洗涤依次。共洗涤3次，得到司美格鲁肽粗品3.9g，粗品总收率57.07％，粗品HPLC纯度77.71％。司美格鲁肽粗品的HPLC检测图谱如图2所示。司美格鲁肽纯品的HPLC检测图谱如图3所示。司美格鲁肽纯品的LC-MS检测图谱如图4所示。
对比例1
1、合成司美格鲁肽起始树脂Fmoc-Gly-Wang Resin。
按照实施例1的方法，合成得到得到Fmoc-Gly-Wang Resin，反应规模4mmol，得到起始肽树脂11.2g。
2、氨基酸依次偶联，完成司美格鲁肽片段一肽树脂延伸
按照实施例2的方法，取步骤1的起始肽树脂Fmoc-Gly-Wang Resin 5.5g，合成得到司美格鲁肽片段全保护肽树脂H-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin 7.2g；裂解后得到肽段H-Arg-Gly-Arg-Gly-OH粗品798mg，粗品收率89.76％。
各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量，见表5。
表5各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量
偶联顺序 氨基酸或肽段名称 MW. 摩尔数/mmol 质量/g
1 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648.77 6 3.9
2 Fmoc-Gly--OH 297.31 6 1.8
3 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648.77 6 3.9
3、使用S29-S30片段，完成司美格鲁肽片段一肽树脂延伸
按照实施例2的方法，取步骤1的起始肽树脂Fmoc-Gly-Wang Resin 5.5g，合成得到司美格鲁肽片段全保护肽树脂H-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin 7.7g，裂解后得到肽段H-Arg-Gly-Arg-Gly-OH粗品903mg，粗品收率101.57％。
各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量，见表6。
表6各氨基酸或肽段的偶联顺序及用量
偶联顺序 氨基酸或肽段名称 MW. 摩尔数/mmol 质量/g
1 Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH 705.82 6 4.2
2 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648.77 6 3.9
由此可见，通过步骤2(氨基酸依次偶联，完成司美格鲁肽片段一肽树脂延伸)和步骤3(使用S29-S30片段，完成司美格鲁肽片段一肽树脂延伸)的对比，证明S29-S30片段Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH的使用，能够有效抑制DKPS副反应，提高合成收率。
对比例2
按照实施例1至实施例6方法合成司美格鲁肽，其中氨基酸残基Lys20和Glu21分别以Dde-Lys(Fmoc)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH的形式接入。得到司美格鲁肽粗品的HPLC纯度为58.85％，较实施例6得到的司美格鲁肽粗品，新增一个HPLC纯度为23.33％(RT＝21.98min、RRT＝1.22)的主要杂质。该杂质的结构鉴定为：
HOOC-C16H32-CONH-γ-Glu-AEEA-AEEA-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
对比例3
按照实施例1至实施例6方法合成司美格鲁肽，其中氨基酸残基His1和Aib2分别以Boc-His(Trt)-OH和Fmoc-Aib-OH的形式接入。得到司美格鲁肽粗品的HPLC纯度为69.57％，较实施例6得到的司美格鲁肽粗品，新增一个HPLC纯度为10.13％(RT＝17.59min、RRT＝0.98)的主要杂质。该杂质的结构鉴定为：
H-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
对比例4
按照实施例1至实施例6方法合成司美格鲁肽，其中氨基酸残基Glu3、Glu15、Gly4和Gly16分别以Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Gly-OH的形式接入。得到司美格鲁肽粗品的HPLC纯度为72.53％，LC-MS谱图显示，有若干加Gly和缺Gly的新杂质生成，且这些杂质为后续的纯化工序增加了很多困难。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：按司美格鲁肽的氨基酸序列，通过固相合成方法，从C端到N端依次偶联氨基酸或肽段，得到司美格鲁肽全保护树脂，经裂解、纯化得到司美格鲁肽；所述肽段包括第20-21位氨基酸形成的二肽S20-S21，所述S20-S21为R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH，
其中，R1为Dde或ivDde，Fmoc为侧链保护基团，R1为主链保护基团。
2.如权利要求1所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：所述肽段还包括第1-2位氨基酸形成的二肽S1-S2、第3-4位氨基酸形成的二肽S3-S4、第15-16位氨基酸形成的二肽S15-S16、第29-30位氨基酸形成的二肽S29-S30，
其中，S1-S2为R2-His(Trt)-Aib-OH，R2为Fmoc或Boc；S3-S4或S15-S16为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH；S29-S30为Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH。
3.如权利要求1或2所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：采用Wang树脂为固相合成载体，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH和R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-OH，得到R1-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin；
S2：脱除S20-S21中的侧链保护基团Fmoc，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和HOOC-C16H32-COOtBu，得到R1-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Octadecanedioic
Acid-18(tert-butoxy)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin；
S3：脱除S20-S21中的主链保护基团R1，依次偶联Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Ala-OH.H2O、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和R2-His(Trt)-Aib-OH，得到司美格鲁肽全保护树脂；
S4：将司美格鲁肽全保护树脂，经过裂解、沉降、离心和干燥，得到司美格鲁肽。
4.如权利要求3所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤S1中，所述Wang树脂的取代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.1-0.4mmol/g。
5.如权利要求3所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤S2中，Fmoc的脱保护剂为哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，浓度为20％～50％，优选20％。
6.如权利要求3所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤S3中，R1的脱保护剂为水合肼的N,N-二甲基甲酰胺溶液，浓度为1％～5％，优选2％～3％。
7.如权利要求3所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤S1-S3中还包括以下特征中的一种或多种：
(1)所述偶联采用的缩合试剂为A、B、C、D中任意一种或几种，
其中，A选自DIC、DCC、EDCI中的任意一种，B选自HOOBT、HOBT、BOAT中的任意一种，C选自DIPEA、NMM中的任意一种，D选自DMAP、HBTU、HATU、TBTU、PyBOP中的任意一种；
(2)所述偶联的反应介质为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜中的一种或多种，优选N,N-二甲基甲酰胺；
(3)所述偶联及脱保护的温度为25-45℃，优选30-40℃。
8.如权利要求7所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：按质量比计，Wang树脂:氨基酸或肽段:缩合试剂＝1:2:2～1:4:4，优选Wang树脂:氨基酸或肽段:缩合试剂＝1:3:3。
9.如权利要求3所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤S4中，所述裂解用到的裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇、苯酚和水的混合物，优选，按质量比计，三氟乙酸:1，2-乙二硫醇:三异丙基硅烷:苯酚:水＝87.5:5:2.5:2.5:2.5。
10.如权利要求3所述的一种司美格鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤S4中，所述沉降用到的沉降液为正己烷、乙醚和甲基叔丁基醚中的一种或多种，优选甲基叔丁基醚。
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