JP2009544688A - 虚血性疾患の緩和及び治療のための医薬組成物並びにそれを伝達するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の医薬組成物は、ホスホリパーゼ(PL)ポリペプチド及びタンパク質導入ドメイン(PTD)の結合体を含んでいる。PCL−δは、細胞質内カルシウムのレベル調節において主要な役割を果たす。心筋虚血時に、細胞質内カルシウムの蓄積は、病原性の変化を媒介する。本発明によれば、心臓及び脳のような組織で低酸素症を惹起する虚血性疾患又は疾病が、PTD−PL結合体の投与によって予防又は緩和され得る。
Description
Bolli,R.,et al.,Physiol.Rev.,79:609−634,1999 Moraru,I.I.,et al.,Biochim.Biophys.Acta,1268:1−8,1995 Javadov,S.A.et al.,J.Physiol.,549:513−524,2003 Hansen,C.A.,et al.,J.Mol.Cell.Cardiol.,27:471−484,1995;and Schnabel,P.,et al.,J.Mol.Cell.Cardiol.,28:2419−2427,1996 Hwang,K.C.,et al.,J.Steroid Biochem.,91:131−138,2004 Rhee,S.G.,et al.,Annu.Rev.Biochm.,70:281−312,2001 Viehl C.T.,et al.,Ann Surg.Oncol.,12:517−525,2005;Noguchi H.,et al.,Nat.Med.,10:305−309,2004; and Fu A.L.,et al.,Neurosci.Lett.,368:258−262,2004
PTDは、全身又は局所投与によって、生体内および試験管内で、細胞内への問題のタンパク質、ペプチド及び重要な科学的化合物の伝達又は吸収を効果的に可能にする。投与経路には、特に筋肉内、腹腔内、静脈内,経口,鼻、皮下、皮内、粘膜及び吸入経路が含まれる。従ってPTDがタンパク質、ペプチド及び/又は化合物との結合体として提供される場合、PTDはタンパク質、ペプチド及び/又は化合物を局所部位、たとえば皮膚、眼球又は気道に伝達することができる。
上記目的を達成するため、本発明は、PTD及びポリペプチド、例えば酵素ホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼC(PLC)の結合体を提供する。PLC酵素の4つの主要タイプが存在する:PLC−β(ベータ)、PLC−γ(ガンマ)、PLC−δ(デルタ)、PLC−ε(イプシロン)及びPLC−ζ(ゼータ)。各々のPLCタイプはまた、様々なサブタイプ、例えばβ1、β3、β4、δ1、δ3から構成されている。
配列番号:11(PLC−δ1)の630乃至755番目のアミノ酸(配列番号:25)、
配列番号:13(PLC−δ3)の661乃至787番目のアミノ酸(配列番号:26)、
配列番号:15(PLC−δ4)の628乃至754番目のアミノ酸(配列番号:27)、
配列番号:16(PLC−β1)の677乃至794番目のアミノ酸(配列番号:28)、
配列番号:17(PLC−β2)の679乃至797番目のアミノ酸(配列番号:29)、
配列番号:18(PLC−β3)の728乃至843番目のアミノ酸(配列番号:30)、
配列番号:19(PLC−β4)の702乃至818番目のアミノ酸(配列番号:31)、
配列番号:20(PLC−γ1)の1092乃至1212番目のアミノ酸(配列番号:32)、
配列番号:21(PLC−γ2)の1062乃至1187番目のアミノ酸(配列番号:33)、
配列番号:22(PLC−ε1a)の734乃至855番目のアミノ酸(配列番号:34)、
配列番号:23(PLC−ε1b)の734乃至855番目のアミノ酸(配列番号:35)、及び
配列番号:24(PLC−ζ)の483乃至606番目のアミノ酸(配列番号:36)。C2以外に、PLの他のカルシウム結合領域もやはり考慮される。
便宜上、明細書、実施例及び添付の請求の範囲に用いる特定の用語をここに集める。特に断りのない限り、本願で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明に関連する分野において通常の技術を有する者によって、通常の周知のものと同じ意味を有する。
本発明のポリペプチドは、ホスホリパーゼC(PLC)ポリペプチドを含むが、これに限定されることのないホスホリパーゼタンパク質(PL)である。PLCは、広範囲に4種類:β,γ、δ及びεに分類され、総11個の同位酵素として存在している。PLC−δ1は、
ミトコンドリア透過転移細孔(mPTP)の開放、カルシウムイオンによって活性化されたプロテアーゼの標的化、及び細胞内カルシウムのホメオスタシスを調節することによって、虚血及びアポトーシスにおいて主な役割を果たしている。
また、本発明は、融合タンパク質又はキメラタンパク質、組み換え発現ベクター,プラスミド及びこれを含有する他のポリヌクレオチド構造物(総称として“発現ベクター”と称す)を暗号化するポリヌクレオチド、これら発現ベクターに形質転換された微生物、及びこれらポリヌクレオチドを獲得する方法、及び上記ベクターを用いて形質転換された細胞に関するものである。適合する宿主を発現ベクターによって形質転換することができる。
同様に、多様な翻訳調節要素が、当該分野で通常の技術を持つ者達に公知されている。これらにはリボソーム結合部位、並びに翻訳開始及び終止コドンが含まれるが、これに限定されない。
“コドンの最適化”は、天然の配列の一つ以上、或いは一つより多いか又は相当数のコドンを、対象の遺伝子において、より頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンに置き換えることによって、問題の対象、例えばヒトの細胞で増大した発現のために核酸配列を調節するものとして定義される。多様な種が、特定アミノ酸の特定コドンに対して特別な偏りを示す。
本発明は又、特定の共通配列を持つ治療融合タンパク質、並びにその断片、誘導体及び変異体を発現するキメラ遺伝子を含有する発現プラスミドに関する。“共通配列”は、例えば互いに比較される2個以上の配列の各々の位置で最も多く存在するアミノ酸を示す理想化された配列である。共通配列は、各々のアミノ酸が、自然に存在する異なる配列のその部位において最も頻繁に存在するアミノ酸である、理論上の代表的なアミノ酸配列である。上記用語はまた、理論上の共通配列と近い実際の配列を言う。共通配列は、例えば共有している機能的または構造的目的を持つ配列からも誘導され得る。上記配列は、相同性を最大化するため、特定の構造的または機能的領域の公知の例を、できるだけ多く整列させることによって定義され得る。配列は、一般的に各々の特定アミノ酸がその位置で合理的に優勢である場合に共通配列として認められ、比較基準を構成する配列のほとんどはむしろ若干の置換、例えば0乃至約100個の置換による共通配列と関連している。一般的に、野生型の比較配列は、共通配列と約50%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上同じである。従って、本発明のポリペプチドは、共通配列と約50%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同じである。
虚血性疾患又は疾病及び/又は神経損傷の緩和及び治療のための薬剤の調製において、上述した治療融合タンパク質の用途が含まれる。心臓及び脳において低酸素症を誘発する虚血性疾患又は疾病はPTD−PLC融合タンパク質の投与によって効果的に緩和され得る。
本発明は、一つ以上の薬理学的に許容される担体或いは賦形剤と共に治療融合ポリペプチド、又はその断片、変異体或いは誘導体を伝達するための方法を提供する。治療融合ポリペプチドは、本願に記述したような組成物の投与時、対象において治療反応が惹起されるよう、本願記述の一つ以上の組成物を対象に投与することを含む、組み替えタンパク質、特に融合タンパク質、又は精製されたサブユニットとして提供される。上記伝達は、例えば皮膚、鼻、目を通して筋肉、脳、又は心臓に、或いは静脈内注射によって起こりうる。
下記の実施例は、本質的に例示に過ぎず、本発明の請求の範囲の制限を意図するものではない。実施例で引用される全ての参考文献は、本願でそのまま参考引用される。
PTD−PLC−δ1を含有している発現ベクターの調製
HSP−70を暗号化する塩基配列を、ヒト転写因子Hph−1(ジーンバンク(GenBank)受託番号:U63386)のN−末端から858番目のアミノ酸チロシンから868番目のアミノ酸までのペプチド領域を暗号化する塩基配列と結合させるため、下記の塩基配列を持つプライマーを合成した:
Hph−1のN−末端から858番目のアミノ酸チロシンから868番目のアミノ酸アルギニンまでの塩基配列を持つpET28B(+)ベクター内へクローニングするための制限酵素BamHIに相応する塩基配列;及び上記塩基配列の5`−末端及びPTD−PLC−δ1の3`−末端に相応する配列を用いクローニングするための制限酵素HindIIIに相応する塩基配列。PCRは、上記プライマー、鋳型としてPTD−PLC−δ1タンパク質の全体遺伝子を含有するpRSベクター(インビトロジェン(Invitrogen)社)、及びpfuターボDNAポリメラーゼ(ストラタジーン(Stratagene), cat.#600252−51)を用い、行った。
大腸菌(E.coli)形質転換剤の調製並びに融合タンパク質の発現及び精製
大腸菌BL21−DE3(ATCC No.53863)を、熱ショックによる形質転換により上記実施例1で調製した発現ベクター(pPTD−PLC−δ1)に形質転換し、形質転換した大腸菌の菌主を4mlのLB培地に接種して37℃で14時間攪拌しながら予備培養した。次いで、予備培養の培地を250mlのLB培地(10gのカゼイン膵液消化物、5gの酵母抽出物、10gの塩化ナトリウム)に接種し、37℃で3時間培養した。次に、1mMのIPTG(イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド;ギブコ(Gibco)BRL cat.# 15529−019)を培養培地に加え、上記混合物を22℃で8時間培養して融合タンパク質の発現を誘導した。培養培地を4℃及び6,000rpmで20分間遠心分離し、上澄液を除去してペレットを獲得した。上記により獲得したペレットを10mlの緩衝液1(50mMのNaH2PO4, 300mMのNaCl, 10mMのイミダゾール, pH 8.0)に溶解し、氷上にて300Wの強度で超音波処理機(ヒートシステムズ、超音波処理機XL)により6秒間超音波処理後、冷却した。全体の超音波処理時間が8分に達するように超音波処理及び冷却段階を繰り返した。溶解物を、4℃及び12,000rpmで10分間遠心分離し、破砕した大腸菌の細胞を除去して純粋な溶解物だけを回収した。回収した溶解物に、0.5mlの50% Ni2+−NTAアガロースのスラリー(キアゲン、cat.#30230)を加え、上記懸濁液を4℃及び200rpmで1時間攪拌し、融合タンパク質及びNi2+−NTAアガロースを互いに結合させた。混合物を0.8×4cmのクロマトグラフィーカラム(バイオラッド(BioRad)cat.#731−1550)に通過させた。生成物質を4mlの緩衝液2(20mLのトリス−HCl, 500mMのNaCl, 20mMのイミダゾール, pH 7.9)で2回洗浄し、1mlの緩衝液3(50mMのNaH2PO4, 300mMのNaCl, 250mMのイミダゾール、pH8.0)及び1mlの緩衝液4(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 500mM イミダゾール、pH8.0)で処理し、融合タンパク質を獲得した。上記分画をPD−10脱塩カラム(アメルシャムファーマシアバイオテック(Amersham−Pharmacia Biotech) cat.#17−0851−01)を用い、脱塩した。分離及び精製されたpPTD−PLC−δ1融合タンパク質をSDS−PAGEに適用した後、クマシーブルー染色で分析した結果を図1に示した。
pPTD−PLC−δ1は心筋細胞における虚血を防止する
1乃至3日経ったシロネズミ各々の心臓を分離してPBSに加え、左心室だけ分離した後マイクロ切開用はさみを用い約1mm3の大きさに切断し、ここに5mlのコラーゲナーゼII(0.8mg/ml, 262単位/mg, ギブコBRL)を添加した。上記懸濁液を37℃で5%のCO2培養器に5分間放置し、浮遊するコラーゲナーゼIIを除去した。5mlの新しいコラーゲナーゼIIを加えて懸濁し、上記懸濁液を5分間更に放置した後、上澄液を新しいチューブに移した。5mlの細胞培養培地(10% FBS−含有 α−MEM, ギブコBRL)を加え、細胞溶液を1200rpmで4分間遠心分離して細胞を回収した。上記処置を、ほとんど組織が残らなくなるまで7乃至9回繰り返し、単一細胞として分離した細胞の懸濁液を一つのチューブに回収した。細胞を100mmの組織培養プレート上で1乃至3時間培養して繊維芽細胞だけがプレートに付着されるようにし、プレートに付着されない細胞を回収して5×105細胞/mlの濃度で接種して培養した。4乃至6時間後、新しい培地に交換した後、0.1mMのBrdUを加えて繊維芽細胞の成長を抑制すると同時に多様な濃度(対照群の場合は0μM、及び試験群の場合は0.1μM, 0.5μM及び 1.0μM)のPTD−PLC−δ1タンパク質を、培養した心筋細胞に加えた。次いで、細胞を低酸素条件で、12時間培養した。上記低酸素条件での培養は、密閉加湿チャンバー(嫌気性環境、サーモフォーマ(ThermoForma)、米国オハイオ州マリエッタ)で行われ、37度で維持し、10%のCO2, 5%のH2 85%のN2の混合ガスを継続的に供給した。培養段階で培地として、1%のウシ胎児の血清だけを含有する培地を使用した。培養された細胞は、抗−PTD−PLC−δ1抗体を用い、ウエスタンブロット(Western blot)で分析を行った。
PTD−PLC−δ1は虚血性心筋細胞においてカルシウムの過負荷を抑制する
細胞質内のフリーCa2+の濃度測定は、共焦点顕微鏡分析によって行なわれた。低酸素条件下で心筋細胞に精製されたPTD−PLC−δ1を1μMの濃度で加えた後、細胞を12時間培養してカルシウム濃度を測定した。このため、ラミニン(5g/cm2)でコーティングされた薄いガラス片の上で、新しく生まれたシロネズミの心筋細胞を0.1mMのBrdU含有の細胞培養培地で(10%のFBS−含有−MEM, ギブコ BRL)一日中培養した。培養完了後、細胞を0.265g/lのCaCl2, 0.214g/lのMgCl2, 0.2g/lのKCl, 8.0g/lのNaCl, 1g/lのグルコース、0.05 g/lのNaH2PO4及び1.0 g/lのNaHCO3からなる変形したタイロード(Tyrode)溶液で洗浄した。上記変形タイロード溶液を、暗室において室温で2μMのフルオ−4アセトキシメチルエステル(フルオ(Fluo)−4 AM、分子プローブ(Molecular Probes)、オレゴン州、ユージーン)と共に20分間負荷させる。アルゴンレーザー共焦点顕微鏡(ライカ(Leica),ドイツ、solms)を用い、蛍光映像を獲得した。488nmで逆転するアルゴンレーザーを用い、蛍光色素を励起させ、510乃至560nm帯域の通過フィルターを通して蛍光放出を回収した。また、細胞内のフリーCa2+の相対的変化を蛍光強度測定によって測定した。
心筋梗塞の動物モデルにおいて心臓虚血部位治療時のPTD−PLC−δの効果
左前下行冠状動脈縫合後の再灌流によって、シロネズミにおいて心筋梗塞を誘導した。一般的な麻酔下で、8週目のスプラーグドーリー(Sprague−Dawley)、雄のラット(各々約205g計量)を、気管内チューブを用い挿管した後、陽の圧力(180m/l分)で通気し、ハーバード(Harvard)通風器を用い、酸素含有 (2L/分)の室内空気に通気を維持した。ラットの心臓を左側開胸術により露出させ、左前下行冠状動脈を5−0シルクの縫合糸で縫合後、1時間放置した。左前下行冠状動脈を1時間縫合した後、100nMのPTD−PLC−δ1をラットに静脈注射すると同時に縫合を解除した。
Claims (72)
- タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチド。
- 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、配列番号:11のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、配列番号:13のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、配列番号:15のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、下記からなる群より選択されたアミノ酸配列を含んでいる融合タンパク質:
(i)配列番号:1、
(ii)配列番号:2、
(iii)配列番号:3、
(iv)配列番号:4、
(v)配列番号:5、
(vi)配列番号:6、
(vii)配列番号:7、
(viii) 配列番号:8、及び
(ix)配列番号:9。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記PTD及びホスホリパーゼCポリペプチドは、直接共有結合、ペプチド結合又はリンカーによって互いに結合されている融合タンパク質。 - 請求項6に記載の融合タンパク質において、
前記リンカーは、1個乃至5個のアミノ酸を含んでいる非切断リンカーである融合タンパク質。 - 請求項7に記載の融合タンパク質において、
前記リンカーは、Gly−Gly−Glyを含んでいる融合タンパク質。 - 請求項6に記載の融合タンパク質において、
前記リンカーは切断リンカーである融合タンパク質。 - 請求項1に記載の融合タンパク質と、一つ以上の薬理学的に許容されている賦形剤とを混合して含んでいる医薬組成物。
- 請求項10に記載の医薬組成物において、
前記医薬組成物は、一つ以上の抗血小板薬物、抗凝固薬物又は抗血栓薬物を更に含んでいる医薬組成物。 - タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドと90%以上同じアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。
- タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象においてカルシウムの過負荷を減少又は防ぐ方法。
- 請求項13に記載の方法において、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、ホスホリパーゼC−δポリペプチドである方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記カルシウムの過負荷は、低酸素症、虚血、心血管疾患、心血管損傷、神経学的疾患又は神経学的損傷によって惹起される、方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記低酸素症又は虚血は、血液供給不足の結果である方法。 - 請求項16に記載の方法において、
前記血液供給の不足は、血管閉塞の結果である方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記カルシウムの過負荷は、心臓又は脳において起こる方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記低酸素症は、心筋梗塞によって惹起される方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記方法は、神経細胞の死滅を減少又は抑制する方法。 - 請求項20に記載の方法において、
前記神経細胞はニューロンである方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記神経学的疾患は、虚血性又は出血性の脳卒中である方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記方法は、心血管細胞の低酸素症誘導の細胞死を減少又は抑制する方法。 - 請求項23に記載の方法において、
前記心血管細胞は、心臓の筋細胞,心室の筋細胞、心房の筋細胞、心臓の幹細胞、内皮細胞、血管の平滑筋細胞、ペースメーカー細胞、筋繊維芽細胞又は繊維芽細胞である方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記心血管の疾患又は損傷は、心臓の低酸素症、心臓の低酸素症の再酸素化、心臓の虚血後再灌流、虚血性心疾患、心不全、心肥大、心臓手術、冠動脈造影術、血管欠損、先天性心臓欠陥、鬱血性心不全、心筋細胞再生、化学療法誘導の心筋症、心筋梗塞、心臓麻痺、心臓毒性、寄生虫感染による心臓損傷、突発性心臓アミロイド症、心臓移植、及び外傷性心臓損傷からなる群より選択される方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記融合ポリペプチドは、虚血後再灌流より前、虚血後再灌流の開始時、又は虚血後再灌流中に投与される方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記心血管損傷は心筋梗塞である方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記心臓毒性は、ドキソルビシンによって惹起される方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記寄生虫感染による心臓損傷は、梅毒又は慢性のクルーズトリパノソーマ感染によるものである方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記外傷性心臓損傷は、貫通性若しくは鈍的心臓損傷又は大動脈弁破裂によるものである方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記心不全を患っている対象において、脳卒中の開始を予防する方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記カルシウムの過負荷は、前記対象の身体部位に限定される方法。 - 請求項32に記載の方法において、
前記身体部位は、脳、脊髄、心臓、又は移植された臓器又は四肢である、方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記融合ポリペプチドは、ピコモル濃度が適用される方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記融合ポリペプチドは、静脈内に投与される方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記投与は、心臓を標的とする方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記融合ポリペプチドは、注射によって投与される方法。 - 請求項37に記載の方法において、
前記注射は、心臓又は筋組織に直接行われる方法。 - 請求項13に記載の方法において、
前記融合ポリペプチドは、経皮的に投与される方法。 - 請求項20に記載の方法において、
前記細胞死は、壊死性又は自滅性である方法。 - タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチドの治療有効量によって予め対象を治療することを含む、低体温症を患っている対象において虚血再灌流障害を予防する方法。
- 請求項41に記載の方法において、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、ホスホリパーゼC−δポリペプチドである方法。 - タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチドの有効量を細胞に投与することを含む、細胞においてフリーカルシウムイオンの濃度を減少させる方法。
- 請求項43に記載の方法において、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、ホスホリパーゼC−δポリペプチドである方法。 - タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチドを、一つ以上の臓器又は組織と、再灌流の前、再灌流時又は再灌流後に接触させることを含む、臓器又は組織移植時の臓器或いは組織の損傷を予防する方法。
- 請求項45に記載の方法において、
前記ホスホリパーゼCポリペプチドは、ホスホリパーゼC−δポリペプチドである方法。 - 請求項45に記載の方法において、
前記接触は、タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチドを、臓器を除去する前又はそれと同時に臓器提供者に投与することによって行われる、方法。 - 請求項45に記載の方法において、
前記臓器が提供者の心臓である方法。 - タンパク質導入ドメイン(PTD)及びホスホリパーゼCポリペプチドを含んでいる融合ポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする対象に静脈内投与することを含む、心血管細胞の低酸素症誘導の細胞死を減少又は抑制する方法であり、この時、低酸素症が心筋梗塞によって惹起され、前記投与が、虚血後再灌流の前、虚血後再灌流の開始時又は虚血後再灌流中に行われる、方法。
- 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:16のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:17のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:18のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:19のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:20のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:21のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:22のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:23のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項1に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記ホスホリパーゼポリペプチドは、配列番号:24のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - タンパク質導入ドメイン(PTD)、及びホスホリパーゼCポリペプチドのカルシウム結合の領域(C2)を含んでいる融合ポリペプチド。
- 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:25のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:26のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:27のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:28のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:29のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:30のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:31のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:32のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:33のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:34のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:35のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項59に記載の融合ポリペプチドにおいて、
前記カルシウム結合の領域(C2)は、配列番号:36のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。 - 請求項9に記載の融合タンパク質において、
前記リンカーは、配列番号:37のアミノ酸配列を含んでいる融合ポリペプチド。
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