CN107208102B - 重组hbv cccdna、其产生方法及其用途 - Google Patents

重组hbv cccdna、其产生方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN107208102B
CN107208102B CN201680007347.6A CN201680007347A CN107208102B CN 107208102 B CN107208102 B CN 107208102B CN 201680007347 A CN201680007347 A CN 201680007347A CN 107208102 B CN107208102 B CN 107208102B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hbv
cccdna
recombinant
genome
days
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680007347.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107208102A (zh
Inventor
高璐
胡慧
阎志鹏
向昆仑
于有军
曾晶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN107208102A publication Critical patent/CN107208102A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107208102B publication Critical patent/CN107208102B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/05—Animals modified by non-integrating nucleic acids, e.g. antisense, RNAi, morpholino, episomal vector, for non-therapeutic purpose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50—Vectors for producing vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Abstract

本发明涉及包含HBV基因组，或其片段或变体；和位点杂交插入片段的重组HBV cccDNA，产生该重组HBV cccDNA的方法，用于通过使用本发明的重组HBV cccDNA建立体外或体内基于cccDNA的模型进行永久地乙型肝炎病毒复制的方法，以及抗HBV药品评估方法。

Description

重组HBV CCCDNA、其产生方法及其用途
技术领域
本发明涉及包含HBV基因组，或其片段或变体；以及位点杂交插入片段的重组HBVcccDNA；产生所述重组HBV cccDNA的方法，用于建立通过使用本发明的重组HBV cccDNA来进行持续性乙型肝炎病毒复制的体外或体内基于cccDNA的模型的方法，以及抗HBV药品评估方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是最危险的人类病原体之一。尽管安全有效的疫苗已经出现了二十多年，但全世界约有20亿人感染HBV，并且超过3.5亿人被长期感染(Liaw等人，2009，Lancet，373：582-92)。慢性乙型肝炎(CHB)感染易引起严重的肝脏疾病，包括肝硬化和肝细胞癌。根据2010年“全球疾病负担研究”(Lozano等人，2012，Lancet，380：2095-128)，HBV感染在世界卫生重点领域居首位，是第十大死因(每年死亡78.6万人)。目前批准的药物在治疗CHB方面取得了实质性进展，但治愈率仍然低于10％(Kwon等人，2011，Nat RevGastroenterol Hepatol，8：275-84)。
HBV是部分双链DNA病毒。在感染人肝细胞后，将形成共价闭合的环状DNA(cccDNA)并保持在受感染的细胞核中，在细胞核中它作为稳定的附加体持续存在，并用作转录所有病毒基因的模板(Levrero等人，2009，J Hepatol，51：581-92)。目前治疗的主要限制是无法消除预先存在的cccDNA池。因此，迫切需要开发直接靶向cccDNA的新型治疗剂(Fletcher等人，2013，Semin Liver Dis，33：130-7)。
以前尝试建立基于HBV cccDNA的体外和体内模型未能产生令人满意的结果。例如，PCR产生的单体线性HBV基因组的转染可以在肝细胞中产生cccDNA(Gunther等人，1995，J Virol，69：5437-44，Pollicino等人，2006，Gastroenterology，130：823-37)，但效率低并且可能形成低聚物。为了改进这种方法，可以将PCR产生的单体线性HBV基因组在转染前循环，但由于过程复杂且产量低，因此很难扩大用于体内研究的DNA生产(Cavallone等人，2013，J Virol Methods，189：110-7，Qin等人，2011，J Clin Microbiol，49：1226-33)。
最近，基于位点特异性分子内重组方法的小环(minicircle)技术已经得到很好的建立，可以有效地生产出高产率和可重现的高品质的小环DNA(Kobelt等人，2013，MolBiotechnol，53：80-9)。然而，这种技术从未成功地用于生产重组HBV cccDNA。
因此，需要一种有效的重组HBV cccDNA，其可以用于建立体外或体内基于cccDNA的模型，以及有效产生大量所述重组HBV cccDNA的方法。
此外，抗HBV药品发现受到缺乏便利性和生理相关的体外和体内模型的阻碍。尽管有几种体外HBV天然感染系统可用，例如原代人肝细胞(PHH)，分化的HepaRG细胞和具有稳定的NTCP蛋白表达的HepG2细胞，但用这些系统对抗HBV分子进行高通量筛选(HTS)是非常具有挑战性的。例如，新鲜PHH代表HBV药物发现的最生理相关的体外模型，但PHH在分离时很快失去对HBV感染的易感性(Yan等人，2012，Elife，1：e00049)。此外，有限的供应、高代谢水平和供体到供体变异使得该系统效率低下。HepaRG是首个可以支持HBV感染的细胞系，但长期的分化和测定时间限制了其对HTS的使用(Gripon等人，2002，Proc Natl Acad Sci US A，99：15655-60)。随着NTCP作为HBV进入受体的发现，稳定表达NTCP的遗传工程化HepG2细胞系易感染HBV，并迅速成为HBV研究和药物发现的非常有用的工具(Yan等人，2012，Elife，1：e00049)。然而，如HepG2.2.15，HepAD38，HepDE19和HepDES19，所有HepG2来源的细胞系在干扰素(IFN)介导的抗HBV应答中都有缺陷，其不适合于鉴定和测试IFN途径相关免疫调节剂(Marozin等人，2008，Mol Ther，16：1789-97，Keskinen等人，1999，Virology，263：364-75)。
HBV的宿主范围非常窄，只有人类、黑猩猩和树鼠(Tupaia belangeri)是易感的。基因和免疫学上良好表征的实验动物都不允许HBV感染，这不仅大大限制了对HBV免疫发病机制和持续性机制的研究，而且还极大地限制了抗HBV药品开发。为了克服这个限制，通过引入人肝细胞产生具有人源化肝脏的嵌合小鼠或通过转基因、转导或流体动力注射(HDI)将HBV DNA引入小鼠肝脏中，建立了几种小鼠模型(Dandri等人，2014，J ImmunolMethods)。虽然嵌合小鼠模型(如uPA-SCID小鼠和FRG小鼠)支持整个HBV生命周期，包括进入、cccDNA形成和扩散，但它们在遗传上是免疫缺陷型的，并不适合研究适应性免疫应答(Dandri等人，2001，Hepatology，33：981-8，Azuma等人，2007，Nat Biotechnol，25：903-10)。将HBV DNA直接引入小鼠肝脏可以绕过进入步骤，从而在免疫活性背景下允许小鼠肝脏中持续的HBV复制。然而，这些模型的主要限制是HBV复制不是由cccDNA驱动的，使得它们与生理相关性较小。最近，Qi等人开发了一种创新的基于HDI的重组cccDNA小鼠模型，其中通过Cre/loxP介导的DNA重组在体内产生cccDNA(Qi等人，2014，J Virol，88：8045-56)。但病毒复制水平较低，体内持续时间短(Qi等人，2014，J Virol，88：8045-56)。
总之，目前现有的HBV细胞培养模型有很大的局限性。例如，PHH具有供体和供体-供体变异问题，HepaRG具有长期的分化和测定时间问题，HepG2-NTCP细胞在干扰素(IFN)介导的抗HBV反应中具有缺陷。目前现有的HBV动物模型也有很大的局限性。例如，人源化肝脏嵌合小鼠模型不具有功能性适应性免疫。在转导和HDI小鼠模型中，HBV复制不是由cccDNA驱动，使得它们的生理学相关性较差。为了改善这些限制，有必要开发基于cccDNA的模型，特别是可以支持cccDNA驱动的HBV持续复制的免疫活性小鼠模型，用于抗HBV药品发现和解决HBV cccDNA相关的生物学问题。
发明内容
本发明提供重组HBV cccDNA，以及产生重组HBV cccDNA的方法。重组HBV cccDNA可以含有各种核苷酸序列，例如任何基因型的HBV基因组或其片段或变体。此外，使用该方法大量生成重组HBV cccDNA也是本发明的目的之一。
当将本发明的重组HBV cccDNA转染到培养细胞中时，其表现与天然HBV cccDNA相同，并且可以以支持HBV复制的附加体形式在细胞核中存在。通过这种细胞培养模型，可以绕过诸如进入和cccDNA形成的限制步骤，通过简单的转染过程方便地将HBV cccDNA引入所有原代细胞和细胞系。
当将本发明的重组HBV cccDNA递送到小鼠中并转染被注射小鼠的肝细胞时，其表现与天然HBV cccDNA相同，并且可以以小鼠的肝细胞中的附加体形式在肝细胞中存在至少30天，特别是至少37天、44天或51天，并且可以用作生产在被注射小鼠的血液中释放的病毒抗原、复制中间体和成熟病毒粒子的HBV转录模板。本发明的重组HBV cccDNA可用于评估和阐明慢性肝炎和抗病毒药物发现研究的机制。
此外，本发明还涉及包含所述cccDNA的组合物和包含所述cccDNA的试剂盒，其可用于建立体外或体内基于cccDNA的HBV模型。
在另一个实施方案中，本发明还涉及建立体外或体内基于cccDNA的HBV模型的方法，其包括：
(i)使用小环技术产生重组HBV cccDNA；和
(ii)将重组HBV cccDNA递送到细胞系或原代细胞或动物，特别是将重组HBVcccDNA递送到小鼠中。
在另一个实施方案中，本发明还涉及本发明的重组HBV cccDNA在建立体外或体内基于cccDNA的HBV模型中的用途，或还涉及本发明的重组HBV cccDNA在制备用于建立体外或体内基于cccDNA的HBV模型的方法中使用的试剂盒或组合物中的用途。
在另一个实施方案中，本发明还涉及本发明的重组HBV cccDNA的抗HBV药品评估或用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物的评估。
在另一个实施方案中，本发明还涉及用于抗HBV药品评估的方法，或用于评估治疗乙型肝炎病毒感染的药物的方法。
具体而言，本发明涉及以下项目：
1.一种重组HBV cccDNA，包含HBV基因组，或其片段或变体；和位点杂交插入片段。
2.项目1的重组HBV cccDNA，其中位点杂交插入片段为attR位点。
3.项目1或2的重组HBV cccDNA，其中attR位点位于紧邻preS1基因的起始密码子前，并且在聚合酶基因的末端蛋白质结构域和间隔区之间。
4.项目1-3中任一项的重组HBV cccDNA，其中attR位点位于SEQ ID NO：3的2847位和2848位之间。
5.项目1-4中任一项的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是全长基因组，特别是基因型B或基因型D基因组，特别是GeneBank JN664917.1，X02496，AY217370，AY220698，GQ205440或HPBHBVAA中评述的基因组，最特别是由SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：23表示的基因组；或者是超长度基因组，例如基因型D的1.1单位或1.3单位基因组(例如，由SEQ ID NO：9表示的1.3单位基因组)。
6.项目1-5中任一项的重组HBV cccDNA，其中重组HBV cccDNA中HBV基因组的片段可以复制或表达编码HBV的包膜蛋白、核心/前核蛋白，x蛋白和/或聚合酶蛋白的基因。
7.项目1的重组HBV cccDNA，其序列列于SEQ ID NO：2。
8.项目1-6中任一项的重组HBV cccDNA，用于转染细胞系或原代细胞。
9.项目8的重组HBV cccDNA，其中细胞系是来自肝性(hepatic)细胞的细胞系，特别是来自肝细胞的细胞系，更特别是HepG2或HepaRG，或原代细胞是原代肝性细胞，特别是原代肝细胞。
10.项目1-9中任一项重组HBV cccDNA，用于抗HBV药品评估。
11.项目9的重组HBV cccDNA，其中抗HBV药品为ETV、HAP 12、HAP 2、Pegasys或R848。
12.项目1-11中任一项的重组HBV cccDNA，用于建立基于cccDNA的HBV动物模型的方法中，其中所述方法包括将所述重组HBV cccDNA递送到动物中。
13.权利要求1-12中任一项的重组HBV cccDNA，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少30天，特别是在肝细胞中表达HBV抗原至少37天、42天、44天、49天、51天、56天、70天、104天、120天或134天。
14.权利要求1-13中任一项的重组HBV cccDNA，其中动物具有功能先天和适应性免疫的免疫活性。
15.权利要求1-14中任一项的重组HBV cccDNA，其中动物是小鼠，特别是小鼠是C3H/HeN或CBA/J小鼠。
16.权利要求1-15中任一项的重组HBV cccDNA，其中重组HBV cccDNA通过流体动力注射递送至动物。
17.包含权利要求1-16中任一项的重组HBV cccDNA的组合物或试剂盒。
18.一种制备项目1-7中任一项的重组HBV cccDNA的方法，包括以下步骤：
a)将HBV基因组或其片段或变体插入生产小环DNA的亲本载体的重组底物位点并以其为侧翼，以形成亲本HBVcircle构建体；
b)将亲本HBVcircle构建体转化到小环生产者中，通过位点特异性重组产生重组HBV cccDNA。
19.项目18的方法，其中小环生产者是微生物，优选细菌，更特别是埃希氏菌属，最特别是大肠杆菌。
20.项目19的方法，其中大肠杆菌是菌株ZYCY10P3S2T。
21.项目18-20中任一项的方法，其中生产小环DNA的亲本载体包含重组底物位点，特别是重组酶特异性的重组底物位点，更特别针对整合酶特异性，所述重组酶例如是ΦC31、R4、TP901-1、ΦBT1、Bxb1、RV-1、AA118、U153、ΦFC1的整合酶。
22.项目18-21中任一项的方法，其中重组底物位点是attP和attB。
23.项目18-22中任一项的方法，其中生产小环DNA的亲本载体为pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。
24.项目18-23中任一项的方法，其中亲本HBVcircle构建体的DNA序列列为SEQ IDNO：1。
25.项目18-24中任一项的方法，其中HBV基因组或其片段或变体位于重组底物位点之间。
26.包含项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA的组合物或试剂盒，其可以任选地进一步包含生物相容性和非免疫原性溶液，例如磷酸盐缓冲溶液、盐水。
27.根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒在转染细胞系或原代细胞中的用途。
28.项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或项目26的组合物或试剂盒，用于转染细胞系或原代细胞。
29.项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA在制备用于转染细胞系或原代细胞的试剂盒或组合物中的用途。
30.一种使用根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒在体外表达HBV抗原和DNA的方法，包括将所述重组HBV cccDNA递送，特别是转染至细胞系或原代细胞的步骤。
31.一种建立体外基于cccDNA的HBV模型的方法，包括：
(i)产生项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA，或根据项目18-25中任一项的方法制备重组HBV cccDNA；
(ii)将重组HBV cccDNA递送至细胞系或原代细胞。
32.根据项目27或29的用途，或根据项目28的重组HBV cccDNA，组合物或试剂盒，或根据项目30或31的方法，其中所述细胞系是来自肝性细胞的细胞系，特别是来自肝细胞，特别是来自HepG2或HepaRG，或原代细胞是原发性肝性细胞，特别是来自原发性肝细胞。
33.根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒在评估用于治疗乙型肝炎病毒感染或抗HBV药品评估的药物中的用途。
34.根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA在制备用于评估治疗乙型肝炎病毒感染的药物或用于抗HBV药品评估的组合物或试剂盒中的用途。
35.根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒，用于评估治疗乙型肝炎病毒感染的药物或用于抗HBV药品评估。
36.根据项目33或34的用途，或根据项目26的重组HBV cccDNA或组合物或试剂盒，其中所述药物或药品包括但不限于核苷类似物，HBV衣壳抑制剂，干扰素或TLR7/8激动剂例如ETV、HAP 12、HAP 2、Pegasys或R848。
37.根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒，在建立基于cccDNA的HBV动物模型的方法中的用途，其中所述方法包括将所述重组HBVcccDNA递送至动物。
38.一种使用根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒在体内表达HBV抗原和DNA的方法，包括将重组HBV cccDNA递送至动物中的步骤。
39.一种建立基于cccDNA的HBV模型的方法，包括：
(i)产生项目1-17任一项的重组HBV cccDNA，或根据项目18-25中任一项的方法制备重组HBV cccDNA；
(ii)将重组HBV cccDNA递送到动物体内。
40.项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA在制备用于建立基于cccDNA的HBV动物模型的方法中使用的试剂盒或组合物中的用途，其中所述方法包括将所述重组HBV cccDNA递送到动物中。
41.根据项目1-17中任一项的重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒在建立基于cccDNA的HBV动物模型的方法中的用途，其中所述方法包括将所述重组HBVcccDNA递送至动物。
42.重组HBV cccDNA或根据项目26的组合物或试剂盒，或根据项目38或39的方法或根据项目40或41的用途，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少30天，特别是在肝细胞中表达HBV抗原至少37天、42天、44天、49天、51天、56天、70天、104天、120天或134天。
43.重组HBV cccDNA或根据项目26或42的组合物或试剂盒，或根据项目38或39或42的方法或根据项目40或41或42的用途，其中所述动物具有功能性先天和适应性免疫的免疫活性。
44.重组HBV cccDNA或根据项目26或42或43的组合物或试剂盒，或根据项目38或39或42或43的方法或根据项目40至43中任一项的用途，其中所述动物是小鼠，特别是小鼠是C3H/HeN或CBA/J小鼠。
45.重组HBV cccDNA或根据项目26或42或43或44的组合物或试剂盒，或根据项目38或39或42或43或44的方法或根据项目40至44中任一项的用途，其中重组HBV cccDNA通过流体动力注射递送到动物体内。
在下面的实施方案的说明和实施例中进一步说明本发明。然而，下面的那些不应被认为限制本发明的范围，但是预期本领域技术人员将容易想到修改，这些修改将在本发明的精神和所附权利要求的范围内。
附图说明
图1示出了HBVcircle构建体设计和生产。(A)使用小环技术生产HBVcircle的过程。将以attB和attP位点为侧翼的HBV序列克隆到小环亲本质粒载体中。然后将重组亲本HBVcircle构建体转化到小环生产者大肠杆菌菌株ZYCY10P3S2T中。当通过添加阿拉伯糖，ΦC31整合酶和I-SceI归巢内切核酸酶表达时，attB和attP位点之间的ΦC31整合酶催化重组，导致产生携带小attR位点的HBVcircle以及质粒骨架环。I-SceI归巢内切核酸酶通过消化I-SceI识别位点引发亲本未重组的DNA以及质粒骨架环的破坏。然后从小环生产者大肠杆菌中提取HBVcircle DNA。(B)HBVcircle设计。attR位点的序列位于紧邻preS1基因的起始密码子子之前的2847和2848位置之间，以及在聚合酶基因的TP结构域和间隔区之间。(C)HBVcircle-CMV-HBV1.1，HBVcircle-HBV1.3和HBVcircle的设计和生产。这三种HBVcircle构建体的设计如上图所示。小分子生产后，通过限制酶消化使亲本DNA和小环DNA线性化，并进行电泳分析。
图2示出了HBVcircle支持转染细胞中高水平的HBV复制。将亲本和HBVcircle DNA瞬时转染到HepG2细胞中，并使用ELISA和qRT-PCR测定上清的(A)HBeAg(B)HBsAg和(C)HBVDNA。(D)裂解细胞，提取cccDNA并使用RT-PCR定量。(E)HBVcircle DNA转染后，将HepG2细胞固定并用抗-HBsAg和抗HBeAg抗体进行免疫荧光分析染色。用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色观察细胞核。
图3-1示出了HBVcircle野生型和HBc(-)突变体在体外的表征。将存在或不存在HBc表达质粒的野生型或突变体HBVcircle DNA瞬时转染到HepG2细胞中，并用ELISA测定上清来进行(A)HBsAg和(B)HBeAg定量。(C)裂解细胞，对细胞裂解物进行Southern印迹分析以进行封装的HBV DNA检测，以及用特异性抗体进行Western印迹分析以检测HBV衣壳、HBc和β-肌动蛋白。
图3-2示出了HBVcircle野生型和突变体在体外的表征。将野生型或突变型HBVcircle DNA瞬时转染入HepG2细胞。上清使用ELSA测定来进行(A)HBsAg和(B)HBeAg定量。(C)裂解细胞，并用特异性抗体对细胞裂解物进行western印迹分析以检测HBV衣壳、HBc、HBs和β-肌动蛋白。
图4示出了HBVcircle是天然HBV cccDNA的替代品。(A)将亲本和HBVcircle DNA瞬时转染HepG2细胞，裂解细胞，用Hirt法制备cccDNA，并用Southern blot检测。(B)通过CHIP检测来自HBVcircle转染的HepG2细胞的cccDNA或(C)RL30相关组蛋白H3，H3K9me3和H3K27ac。
图5示出了HBVcircle体外抗HBV药品评估。(A)首先用HBVcircle转染HepG2细胞，然后用指定浓度的ETV或HAP 12处理6天。收集上清，并进行HBsAg、HBeAg和白蛋白ELISA。将细胞裂解，细胞裂解物进行Southern印迹分析以进行封装的HBV DNA检测，以及用特异性抗体进行Western印迹分析以检测HBV衣壳、HBc和β-肌动蛋白。(B)用HBVcircle转染增殖HepaRG细胞，并用不同浓度的Pegasys处理6天。收集上清，并进行HBsAg、HBeAg和白蛋白ELISA。
图6示出了具有HBVcircle的持续性HDI小鼠模型的建立。将指示的DNA构建体流体动力注射到C3H/HeN小鼠的尾静脉。在HDI后的指定时间点，收集血液样品进行HBV标记物检测，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。(D)在指定的时间点测量小鼠体重。
图7示出了在体内cccDNA驱动的HBV持续性。将不同量的HBVcircle DNA或10μg的pBR322-HBV1.3DNA流体动力注射到C3H/HeN小鼠中。监测小鼠51天，并在指定时间点收集血清样品并测试HBV标记物，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。(D)在第3天和第30天，每次随机选择2只来自HBVcircle 10μg组的小鼠并处死。通过Southern印迹检测小鼠肝脏中的cccDNA。
图8示出了通过肝IHC染色cccDNA在体内驱动的HBV持续性。在HDI注射后的第120天，用抗HBc抗体染色来自所示小鼠的肝切片。实心箭头显示出HBc阳性染色细胞，空箭头显示出HBc阴性染色细胞。
图9示出了体内抗HBV药品疗效评估。(A)在第0天，将10μg的HBVcircle流体动力注射到C3H/HeN小鼠中。根据第21天血清HBsAg水平对小鼠进行分组，并且在HDI后第23天至第51天口服给予抗病毒化合物治疗。在指定时间点，收集血清样品并测试HBV标记物，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。
图10示出了在CBA/J小鼠中持续性HDI小鼠模型的建立。将指示的DNA构建体流体动力注射到CBA/J小鼠的尾静脉中。在HDI后的指定时间点，收集血液样品进行HBV标记物检测，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。(D)在指定的时间点测量小鼠体重。(E)根据血清HBsAg检测结果绘制HBsAg阳性小鼠的百分比。
图11示出了使用具有其他基因型序列的HBVcircle的持续性HDI小鼠模型的建立。将指示的DNA构建体流体动力注射到C3H/HeN小鼠的尾静脉。在HDI后的指定时间点，收集血液样品进行HBV标记物检测，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。(D)在指定的时间点测量小鼠体重。
图12示出了使用HBVcircle突变体评估体内HBV复制。将指示的DNA构建体流体动力注射到C3H/HeN小鼠的尾静脉。在HDI后的指定时间点，收集血液样品进行HBV标记物检测，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。(D)在指定的时间点测量小鼠体重。
图13示出了通过肝脏IHC染色评估体内HBV复制。(A)在HDI注射后第56天，用抗HBc抗体染色来自所示小鼠的肝切片。实心箭头显示出HBc阳性染色细胞，空箭头显示出HBc阴性染色细胞。(B)绘制来自表4的累积染色评分。
图14示出了使用HBVcircle突变体评估体内HBV复制。将指示的DNA构建体流体动力注射到C3H/HeN小鼠的尾静脉。在HDI后的指定时间点，收集血液样品进行HBV标记物检测，包括(A)HBsAg，(B)HBeAg和(C)HBV DNA。(D)在指定的时间点测量小鼠体重。(E)根据血清HBsAg检测结果绘制HBsAg阳性小鼠的百分比。(F)对于野生型小组和HBe(-)突变组，绘制单个HBsAg水平。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管基本上与本文所述类似的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是仅描述了示例性的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
如本文所用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”是指具有大约3200个碱基对的小双链DNA基因组和肝细胞向性的Hepadnaviridae家族的成员。“HBV”包括感染多种哺乳动物(例如人类、非人类灵长类动物等)和禽类(鸭等)宿主中的任何一种的乙型肝炎病毒。“HBV”包括任何已知的HBV基因型，例如血清型A、B、C、D、E、F和G；任何HBV血清型或HBV亚型；任何HBV分离株；HBV突变体，例如HBeAg阴性变体，耐药性HBV变体(例如拉米夫定(lamivudine)抗性变体；阿德福韦(adefovir)抗性突变体；替诺福韦(tenofovir)抗性突变体；恩替卡韦(entecavir)抗性突变体等)；等等。
如本文所用，“HBV基因组”不仅指全长基因组(1个单位基因组)，而且指全长HBV基因组(>1个单位基因组，换句话说，长度超过HBV基因组)。HBV基因组包含构建和维持HBV复制所需的所有信息。这些基因组序列可获自文章和GeneBank中的每种基因型。“超过全长的HBV基因组”是指包含全长基因组和部分基因组的序列。“超过全长HBV基因组”的序列根据所需的基因组单位和特定的HBV株变化。此外，在现有技术文献中描述了获得大于全长HBV基因组并确定所述基因组序列的方法，例如在欧洲专利EP1543168中。
如本文所用，“HBV基因组的片段”或“HBV基因组片段”可以互换使用，并且是指HBV基因组的一部分。该片段可以是HBV基因组的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2000、2 2300、2400、2500、2600、300、2800、2900、3000、3100或3200个连续核苷酸。该片段还可以是含有HBV基因组中所含的一个或多个基因的部分基因组，例如，该片段可以是编码包膜蛋白、核心/前核蛋白、x蛋白和/或HBV聚合酶蛋白的核酸。此外，该片段可以是编码HBV的包膜蛋白、核心/前核蛋白、x蛋白和/或聚合酶蛋白的一个或多个部分的核酸。
如本文所用，当提及HBV基因组的位置时，核苷酸的编号参考H.Norder等人发表的整个HBV基因组DNA序列。(Virology 1994,198,489-503，通过引用并入本文；此文的图1提供了代表基因型C、E和F的各种HBV克隆的基因组与3221个核苷酸长的克隆pHBV-3200的序列的比对)或在GenBank中以登录号JN664917.1公开的基因型D HBV的表型之一(通过引用并入本文)。各种HBV的基因组长度是可变的。也就是说，核苷酸的编号仅应被认为是说明性的实施方案。
如本文所用，术语“变体”或“突变体”可以互换使用，并且用于指代与亲本多肽序列或多核苷酸具有一定程度的氨基酸/核苷酸序列同一性的多肽或多核苷酸。变体类似于亲本序列，但在其氨基酸序列或核苷酸序列中具有至少一个或几个或多个取代、缺失或插入，使得它们与亲本多肽或亲本多核苷酸的序列不同。在一些情况下，变体已经被操作和/或工程化以在其氨基酸序列或核苷酸序列中包含至少一个取代、缺失或插入，这使得它们与亲本序列不同。另外，变体可以保留亲本多肽或亲本多核苷酸的功能特征或活性，例如，保持亲本多肽或亲本多核苷酸的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的生物活性。
如本文所用，术语“核酸构建体”是指已被构建为包含一个或多个在本质上不一起发现的功能单元的核酸序列。实例包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。
如本文所用，术语“载体”是指能够将核酸序列转移至靶细胞的载体。例如，载体可以包含能够在靶细胞中表达的编码序列。为了本发明的目的，“载体构建体”通常是指能够引导目的基因的表达并且可用于将目的基因转移到靶细胞中的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。
在本文中可互换使用的“小环载体”或“生产小环DNA的亲本载体”是指提供待引入的目的序列的持续高水平表达的小的双链环状DNA分子，该目的序列可以以至少基本上表达盒序列和方向独立的方式编码多肽、shRNA、反义RNA、siRNA等。目的序列与存在于小环载体上的调节序列有效连接，该调节序列控制其表达。这样的小环载体例如在公开的美国专利申请US20040214329中有描述，这些专利通过引用并入本文。
本发明的小环载体的总长度足以包括如下所述的所需要的元件，但不足以防止或基本上抑制载体在与细胞接触时进入靶细胞的能力，例如通过系统给予到包含该细胞的宿主。因此，小环载体通常至少约0.3kb长，通常至少约1.0kb长，其中载体可以长达10kb或更长，但在某些实施方案中不超过该长度。
小环载体与细菌质粒载体不同之处在于它们缺乏复制起点，并且缺少通常在细菌质粒中发现的药物选择标记，例如β-内酰胺酶，tet等。还发现例如在质粒骨架中不存在的表达沉默序列，例如，从其中切除小环载体的亲本质粒骨架核酸序列。小环可以基本上不含除重组酶杂交产物序列以外的载体序列，以及目的序列，即转录序列和表达所需的调节序列。
小环载体包含单向位点特异性重组酶的位点-杂交序列(也称为产物杂交序列)。如本文所用，“位点-杂交序列”或“位点-杂交插入片段”或“产物杂交序列”可以互换使用，并且是如在本领域中已知的两个重组底物位点的单向位点特异性重组酶介导的重组的结果，例如attB和attP底物序列(Smith等人，Nucleic Acid Research，2004,33：8：2607-2617)，并且可以是attR或attL位点-杂交序列。“位点-杂交序列”可以由本领域技术人员根据所使用的重组酶来确定。通常，位点-杂交序列的长度范围为约10至约30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp和500bp。本文使用的“重组酶”是遗传重组酶，其通常衍生自细菌和真菌，并且催化每种重组酶特异性的短(30-40个核苷酸)靶位点序列之间的定向敏感的DNA交换反应。重组酶的实例包括但不限于整合酶，例如野生型噬菌体整合酶或其突变体，其中目的特异代表性整合酶包括但不限于整合酶ΦC31、R4、TP901-1、ΦBT1、Bxb1、RV-1、AA118、U153、ΦFC1等。
如本文所用，术语“重组”DNA分子是指通过遗传重组(例如分子克隆)的实验室方法形成的DNA分子，以将来自多个来源的遗传物质汇集在一起，产生在生物有机体中不会发现的序列。重组DNA是可能的，因为来自所有生物体的DNA分子具有相同的化学结构。它们仅在该相同总体结构内的核苷酸序列上不同。
本文使用的术语“位点特异性重组”是指两个核苷酸序列之间的重组，其各自包含至少一个识别位点。“位点特异性”是指特定的核苷酸序列，其可以位于宿主细胞基因组中的特定位置。核苷酸序列可以是宿主细胞的内源性，其在宿主基因组中的天然位置或基因组中的某个其他位置，或者其可以是通过各种已知方法中的任何一种先前插入宿主细胞基因组中的异源核苷酸序列。
本文所用的“小环生产者”是指允许扩增产生小环DNA的亲本载体，以及允许在重组酶表达时生产小环DNA的微生物。现有技术中已知的小环生产者包括细菌，例如埃希氏菌属，例如大肠杆菌。本领域小环生产者的一个说明性实例是菌株ZYCY10P3S2T。
本文所用的“HBVcircle”或“重组HBV cccDNA”是指包含HBV基因组或其片段或变体的小环载体。
将重组HBV cccDNA递送到细胞中的方法是本领域已知的。例如，可以通过转染将重组cccDNA递送到细胞中。转染细胞的方法是本领域公知的。通过“转染”是指由于外来核酸(通常是DNA)的摄取而导致的细胞的改变。术语“转染”的使用并不旨在将外来核酸引入局限于任何特定方法。合适的方法包括病毒感染/转导、缀合、纳米颗粒递送、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接注射等。方法的选择通常取决于正在转染的细胞的类型和转染发生的环境(即在体外、离体或体内)。这些方法的总体讨论可以在Ausubel等人，ShortProtocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995中找到。
将重组HBV cccDNA递送到动物中的方法是本领域已知的。“递送”是指在质粒递送和转染肝脏领域中众所周知的任何方法，但不应被认为是限制本发明的范围。例如，作为已知技术之一的流体力学注射(由Zhang等人，Hum Gene Ther 1999,10(10)：1735-1737开发)可用于质粒递送。
如本文所用，“HBV标记物”是指可代表HBV病毒感染的任何标记物。本领域通常使用的已知的HBV标记物包括但不限于“HBV的DNA”或“HBV的蛋白质”，例如HBsAg和HBeAg等。确定HBV标记物水平的方法是本领域已知的，例如HBV蛋白水平的ELISA或HBV DNA水平的qRT-PCR分析。
发明详述
本发明提供了包含HBV基因组或其片段或变体和位点-杂交插入片段的重组HBVcccDNA，以及制备所述重组HBV cccDNA的方法。这种重组HBV cccDNA在位点特异性重组后包含位点-杂交插入片段和HBV基因组或其片段或变体。特别地，HBV基因组或其片段或变体的两侧是位点杂交插入片段。
在一个实施方案中，HBV基因组是任何基因型的全长基因组或任何基因型的超长度基因组。在优选的实施方案中，基因组的基因型为D。在更优选的实施方案中，基因型D的基因组的全长在GeneBank JN664917.1，X02496，AY217370或HPBHBVAA中规定。在另一个实施方案中，超长度基因组是1.1单位基因组或1.3单位基因组。在一个具体的实施方案中，用于本发明的HBV基因组具有SEQ ID NO：3所示的序列(GeneBank JN664917.1)或由其组成。
在一个实施方案中，HBV基因组的片段是HBV基因组的一部分。在优选的实施方案中，片段是任何基因型的HBV基因组的片段，特别是基因型D HBV基因组(例如在GeneBankJN664917.1，X02496，AY217370或HPBHBVAA中指定的那些)，更特别地是由SEQ ID NO：3表示的基因型D HBV基因组。特别地，HBV基因组片段可以复制或表达编码HBV的包膜蛋白、核心/前核蛋白、x蛋白和/或聚合酶蛋白的一个或多个基因。
在一个实施方案中，HBV基因组的变体可以是与亲本HBV基因组或其片段相比具有至少一个或几个或多个取代、缺失或插入的变体核苷酸序列。例如，本发明的HBV基因组的变体可以是在编码HBV核心蛋白的基因上具有一个或几个突变的变体，其使得变体不能复制或表达所述蛋白质，即HBV的变体基因组可以是没有编码HBV核心蛋白(HBc)的基因的HBV基因组。例如，突变可以在HBc的编码序列的起始密码子子上。在一个实施方案中，HBV基因组的变体可以由SEQ ID NO：14表示。
在另一个实施方案中，可以从任何商业上可获得的含有重组底物(如attP和attB位点)的生产小环DNA的亲本载体产生“位点杂交插入片段”。在一个实施方案中，重组底物对重组酶是特异的，特别是对整合酶，例如野生型噬菌体整合酶或其突变体，包括但不限于整合酶ΦC31、R4、TP901-1、ΦBT1、Bxb1、RV-1、AA118、U153、ΦFC1等。特别地，“位点杂交插入片段”是attR位点。最特别地，attR位点由SEQ ID NO：4表示。在另一个实施方案中，在重组HBV cccDNA中，attR位于紧邻preS1基因的起始密码子之前，并且位于聚合酶基因末端蛋白质结构域和间隔区之间，特别是attR位于SEQ ID NO：3的2847和2848位之间。
在另一个实施方案中，制备本发明的重组HBV cccDNA的方法包括
a)将HBV基因组或其片段或变体插入生产小环DNA的亲本载体的重组底物位点并以其为侧翼，以形成亲本HBVcircle构建体；
b)将亲本HBVcircle构建体转化到小环生产者中，通过位点特异性重组产生重组HBV cccDNA。
在一个实施方案中，小环生产者可以是允许扩增生产小环DNA的亲本载体以及在重组酶表达时生产小环DNA的微生物。特别地，微生物是细菌，更特别是埃希氏菌属，特别是大肠杆菌，例如菌株ZYCY10P3S2T。在一个实施方案中，小环生产者是微生物，其中重组酶可以内源表达。或者，小环生产者可以是其中引入重组酶或编码所述重组酶的基因并在其中表达的微生物。
在一个实施方案中，本发明的生产小环DNA的亲本载体可以是本领域已知的任何一种，例如来自System Biosciences Inc.的市售载体。特别地，本文使用的生产小环DNA的亲本载体包含重组底物，例如，特异于重组酶的重组底物，特别是整合酶，例如野生型噬菌体整合酶或其突变体，包括但不限于：整合酶ΦC31、R4、TP901-1、ΦBT1、Bxb1、RV-1、AA118、U153、ΦFC1等。更特别地，本文使用的生产小环DNA的亲本载体是可从System Biosciences(目录号MN501A1)购买的pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。
在另一个实施方案中，在亲本HBVcircle构建体中，HBV基因组或其片段或变体位于重组底物位点之间。在小环生产者(例如，大肠杆菌)中的位点特异性重组后，所获得的重组HBV cccDNA中的HBV基因组或其片段或变体仍然保持其复制或表达的能力。特别地，重组底物位点是特别选自attP或attB的重组酶或整合酶结合位点，更特别地，本文使用的attP由SEQ ID NO：5表示，和/或本文使用的attB由SEQ ID NO：6表示。
在最优选的实施方案中，将上述HBV基因组或其片段或变体插入pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体的attP和attB位点并以其为侧翼，以替代已经存在于质粒中的CMV-MCS-SV40polyA片段。将这样构建的重组质粒命名为亲本HBVcircle，该DNA序列列为SEQ ID NO：1。
为了使用上述亲本HBVcircle产生重组HBV cccDNA，将重组亲本构建体转化到小环生产者大肠杆菌菌株ZYCY10P3S2T(可从System bioscience Inc，商品名MN900A-1商购获得)。通过加入阿拉伯糖来表达ΦC31整合酶和I-SceI归巢核酸内切酶，ΦC31整合酶催化attB和attP位点之间的重组，导致产生携带小attR位点的HBVcDNA，以及质粒骨架环。I-SceI归巢内切核酸酶通过消化I-SceI识别位点引发亲本未重组的DNA以及质粒骨架环的破坏。然后从小环生产者大肠杆菌提取重组HBV cccDNA。因此产生的重组HBV cccDNA被命名为HBVcircle，该DNA序列列为SEQ ID NO：2。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在体外表达HBV抗原的方法或建立体外基于cccDNA的HBV模型的方法，包括将本发明的重组HBV cccDNA递送至细胞系(例如，来自肝性细胞的细胞系，特别是来自肝细胞的那些，更特别是HepG2或HepaRG)或原代细胞(例如，原代肝性细胞，特别是原代肝细胞)。
为了使用上述制备的重组HBV cccDNA在体外表达HBV抗原，可以使用本领域任何已知技术将重组HBV cccDNA递送到培养细胞中，因此通过所述重组HBV cccDNA引入(例如转染)培养的细胞。因此，通过简单的转染过程，可以绕过诸如进入和cccDNA形成的限制步骤，方便地将HBV cccDNA引入所有原代细胞和细胞系。建立的细胞培养模型可用于cccDNA研究和抗HBV药品评估，例如ETV、HAP 12、Pegasys或R848。
在一个实施方案中，本发明还涉及用于在体内表达HBV抗原和/或DNA的方法或建立基于cccDNA的HBV动物模型的方法，包括将本发明的重组HBV cccDNA递送到动物体内。
在一个实施方案中，建立基于cccDNA的HBV动物的方法包括将所述重组HBVcccDNA递送到动物中并转染动物的肝细胞的步骤。
使用上述重组HBV cccDNA在体内持续表达HBV抗原，可以使用本领域中任何已知技术将重组HBV cccDNA递送到动物(例如小鼠)中，因此被注射动物(例如，小鼠)的肝细胞是由所述重组HBV cccDNA转染。
在一个实施方案中，动物可以是哺乳动物或禽类，例如小鼠，特别是小鼠是C3H/HeN小鼠。更特别地，本发明中使用的小鼠具有功能先天和适应性免疫功能的免疫活性。
在重组HBV cccDNA的递送方法方面，在本发明中可以应用在肝细胞的质粒递送和转染领域中众所周知的任何方法，但是不应将其视为限制本发明的范围。在本发明中，例如，诸如流体动力注射等已知技术可以是质粒递送方法之一。更具体地，在本发明的实施例中，用重组质粒转染小鼠肝细胞是通过将重组质粒流体动力注射到小鼠的尾静脉中来完成。为了使重组质粒容易地注入小鼠的尾静脉，在生物相容性和非免疫原性溶液例如磷酸盐缓冲溶液中制备上述质粒，但不应被认为是限制本发明的范围。
在另一个实施方案中，一旦将本发明的重组HBV cccDNA递送到小鼠中并转染注射的小鼠的肝细胞，其表现与天然HBV cccDNA相同，并且可以以小鼠的肝细胞中的附加体形式在肝细胞中存在至少30天，特别是至少37天、44天或51天，其可以用作HBV转录模板以生产在被注射小鼠的血液中释放的病毒抗原、复制中间体和成熟病毒粒子。在另一个实施方案中，HBV抗原在肝细胞中持续至少30天，特别是在肝细胞中持续至少37天、44天或51天。由于HBV cccDNA的这种重组形式的特征和天然感染HBV的cccDNA的特征非常相似，因此本发明的重组HBV cccDNA可用于评估和阐明(慢性)肝炎和抗病毒药物发现研究的机制。特别地，本发明的动物模型可用于评估治疗乙型肝炎病毒感染的药物，特别是ETV、HAP 2和R848。
在另一个实施方案中，本发明的动物(例如，小鼠)模型基于具有功能性先天和适应性免疫的免疫活性动物，因此诱导的肝脏组织学和血清学状态与健康的HBV携带者相似。因此，本发明的动物模型是用于肝炎机制和药物评估的机械性慢性肝炎研究的理想模型。
此外，本发明还涉及包含本发明的重组HBV cccDNA的试剂盒或组合物。在另一个实施方案中，包含本发明的重组HBV ccc DNA的组合物或试剂盒可进一步含有生物相容性和非免疫原性溶液，例如磷酸盐缓冲溶液。
此外，本发明还涉及用于体外抗HBV药品评估或用于体外评估治疗细胞培养基中乙型肝炎病毒感染的药物的方法，包括
(1)将本发明的重组HBV cccDNA递送到细胞(例如，细胞系(例如，来自肝性细胞的细胞系，特别是来自肝细胞的细胞系，更特别是HepG2或HepaRG)或原代细胞(例如，原代肝性细胞，特别是原代肝细胞))，
(2)用待评估的药品或药物处理细胞1-30天，特别是2-10天，
(3)检测细胞中HBV标记物的水平，和
(4)由所述药品或药物处理的细胞中的HBV标记物的水平降低指示该药品是有效的抗HBV药品或该药物在治疗乙型肝炎病毒感染上是有效的。
此外，本发明还涉及用于体内抗HBV药品评估或用于体内评估治疗乙型肝炎病毒感染的药物的方法，包括
(1)将本发明的重组HBV cccDNA递送到动物(例如小鼠，特别是C3H/HeN小鼠)中，
(2)将待评估的药品或药物给予动物，
(3)检测动物血液(例如血清)中HBV标记物的水平，和
(4)在接受所述药品或药物的动物血液中的HBV标记物的水平降低指示该药品是有效的抗HBV药品或该药物在治疗乙型肝炎病毒感染上是有效的。
在一个实施方案中，乙型肝炎病毒感染是慢性乙型肝炎病毒感染。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述。实施例旨在是本发明的纯粹示例并且因此不应被认为以任何方式限制本发明，实施例还描述和详述了上述本发明的方面和实施方案。这些实施例并不意味着以下实验是所有或唯一的实验。
材料和方法
重组DNA技术
使用标准方法操纵DNA，如Sambrook，J.等人，Molecular cloning：A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989所述。分子生物试剂根据制造商的说明使用。
基因合成
所需的基因节段由通过化学合成制备的寡核苷酸制备。通过包括PCR扩增的寡核苷酸退火和连接组装侧翼为单个限制性内切核酸酶切割位点的100-600bp长的基因节段，随后通过A突出端克隆到pCR2.1-TOPO-TA克隆载体(Invitrogen公司，USA)。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。
细胞系
将人肝癌衍生细胞系HepG2(购自ATCC，
Figure BDA0001361150370000221
HB-8065)在补充有10％胎牛血清(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12(来自Invitrogen)中于37℃含5％CO2的加湿空气中培养。增殖的HepaRG细胞购自BiopredicInternational(Rennes，France)。HepaRG细胞按照制造商的方案扩增和分化。
动物研究
本研究中的所有程序均符合当地动物福利立法和适用指南。
C3H/HeN小鼠(雄性，4-6周龄)获自中国北京Vital River Laboratories Co.Ltd。CBA/J小鼠(雄性，4-6周龄)获自中国北京HFK Bioscience Co.,Ltd。小鼠在控制温度(21-25℃)，湿度(40-70％)和12小时光/12小时黑暗周期(上午7:00至晚上7:00)照明下放置在具有玉米芯垫料的聚碳酸酯笼中。小鼠随意获得正常饮食(Rodent Diet#5001，PMINutrition International，LLC，IN，USA)和无菌水。
根据第-1天的体重对动物进行分组。在第0天，所有动物在5秒内通过尾静脉在以相当于体重8％(g)的盐水的体积(mL)中进行流体动力学注射2.5-20μg DNA(Liu等人，1999，Gene Ther，6：1258-66，Zhang等人，1999，Hum Gene Ther，10：1735-7)。在第1天或第3天对由于流体动力学注射技术失败或低HBV标记物表达引起的动物排除后，保留剩余的小鼠进行长期评估。在HDI注射后的指定时间收集血液样品用于血清制备。
对于化合物治疗，在HDI后第20天(化合物治疗的第3天)，将C3H/HeN小鼠基于第20天的血清HBsAg水平和体重分为4组。在治疗日用储备溶液中的盐水将ETV和R848稀释。载体为RC591。所有测试化合物以指定剂量和频率口服给予。
瞬时转染
使用X-TREMEGENE HP DNA转染试剂(来自Roche)进行转染。转染前一天，将细胞进行胰蛋白酶消化并接种于平板上，对HepG2和增殖HepaRG细胞系，将细胞以0.8×105/孔接种于24孔板中，对于分化的HepaRG细胞系，以3×105/孔接种在24孔板中。
HBV抗原检测
根据制造商的指示，使用HBeAg或HBsAg ELISA试剂盒(来自Autobio)测量HBeAg或HBsAg。
HBV DNA检测
使用MagNA Pure 96System MagNA Pure 96System(来自Roche)提取细胞培养上清或小鼠血清中的HBV DNA。通过RT-PCR测定HBV DNA水平。引物和探针序列如下所示。
正向引物：5’-GCTGGATGTGTCTGCGGC-3’(372-389)；
反向引物：5’-GAGGACAAACGGGCAACATAC-3’(459-479)；
探针：5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTG-BHQ-2-3’(409-436)。
使用具有适当稀释度的质粒pBR322-HBV1.3(SEQ ID NO：7)作为RT-PCR的标准品。
细胞活力测定
使用Albumin AlphaLISA试剂盒(来自PerkinElimer)，通过分泌到上清中的白蛋白量来确定细胞活力。
DNase消化
根据制造商的指示，通过DNase I试剂盒(来自Sigma)消化细胞裂解物。
Hirt DNA提取
根据先前描述的程序，稍作修改(Cai等人，2013，Methods Mol Biol，1030：151-61)制备Hirt DNA。简言之，将HepG2细胞(1×106)或匀浆的肝组织(50mg)悬浮于含有10mMEDTA的500μl 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中。然后加入120μl 10％SDS，并加入100μl2.5M KCl并轻轻混合。在4℃离心10分钟后，分别用酚和苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)和苯酚提取上清。用乙醇沉淀DNA，将核酸溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中。
cccDNA实时PCR
HBV cccDNA特异性引物和探针组用于检测cccDNA：
cccDNA-F，5’-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3’(1545-1563)；
cccDNA-R：5’-GCCCCAAAGCCACCCAAG-3’(1883-1900)；
cccDNA探针：5’-TARMA+CGTCGCATGGARACCACCGTGAA CGCC+BHQ-2-3’(1602-1628)。
HBV核衣壳检测
使用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，1％CA-630，1×EDTA无蛋白酶抑制剂)裂解经转染的HepG2细胞。在4℃下搅拌孵育1小时后，通过离心清除细胞质裂解物。在1.5％琼脂糖凝胶中电泳分离裂解物，然后转移到PVDF膜(用于Western印迹)或带正电荷的尼龙膜(用于Southern印迹)上，分别检测衣壳蛋白和包被的DNA。
Western印迹
SDS-PAGE后，使用iblot系统(Invitrogen)将凝胶转移至PVDF膜。封闭后，将膜与一抗，兔抗HBV核心抗原(来自Dako)和小鼠单克隆抗肌动蛋白(来自Sigma)一起温育。经数次洗涤后，然后将膜与结合了辣根过氧化物酶(HRP)的适当的二级抗体(来自KangChen)孵育。洗涤后，使用Western Pico Super ECL试剂(Pierce)显现信号。
Southern杂交
将样品加载到1×TAE缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶电泳2-3小时。变性和中和后，将DNA在20×SSC上印迹到Hybond-N+膜(来自GE Healthcare)上，并与DIG标记的HBV DNA探针杂交。在用碱性磷酸酶缀合的抗DIG抗体孵育印迹后，以标准化学发光反应检测杂交信号。
免疫荧光
将细胞在腔室玻片(来自Permanoxox)上培养，用PBS中的4％多聚甲醛固定，并用透化缓冲液(PBS中5％BSA+0.5％triton)透化。用兔抗HBV核心抗原(来自Dako)和小鼠单克隆抗HBV表面抗原(来自Invitrogen)染色细胞。将抗体在含有5％FBS的PBS中稀释。用PBS洗涤后，用二级抗体Alexa Fluor 594nm山羊抗大鼠和Alexa Fluor 488nm驴抗兔(来自Invitrogen)标记结合的抗体。几次额外的洗涤后，用DAPI(来自Invitrogen)染色细胞，并在Nikon倒置的IF显微镜下观察。
染色质免疫沉淀
使用EpiTect Chip One-Day Kit(来自Qiagen)，遵循制造商提供的程序进行轻微修改来进行ChIP测定。将细胞在37℃，1％甲醛中固定10分钟。停止固定后，细胞在4℃下以800g沉淀10分钟，并通过加入补充有蛋白酶抑制剂混合物的免疫沉淀裂解缓冲液重新悬浮。将500微升的细胞裂解物用杯形喇叭(Sonicator XL2020，Misonix)以26W的设置超声处理，开2秒，关15秒，总时间16秒(每轮8次)，共9轮。已经显示这种超声处理条件将细胞DNA稳定地断裂成500-800bp片段。为了预先清除，免疫沉淀和DNA提取，严格按照EpiTect ChIPOne-Day Kit(Qiagen)提供的说明书，通过实时PCR与特定的cccDNA引物进行定量分析：
正向，5’-TGAATCCTGCGGACGACCC-3’(1441-1460nt)；
反向，5’CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3’(1889-1869nt)。
免疫组织化学染色
将切除的肝组织样品立即浸入4％福尔马林中并固定18至24小时并进行石蜡包埋。通过使用抗-HBc多克隆抗体(来自Dako)在组织切片上进行免疫组织化学染色以检测核心抗原表达。使用免疫反应评分(IRS)半定量评分系统来评估HBc阳性细胞的比例和染色强度。染色强度分为0(阴性)，1(弱)，2(中等)和3(强)；阳性细胞百分比为0(阴性)，1(<25％)，2(25％-50％)，3(50％-75％)，4(>75％)。两个得分相乘，并确定IRS。
实施例1
HBVcircle的设计和生产
含有1.3单位长度基因型D型HBV基因组(GeneBank JN664917.1)的质粒pBR322-HBV1.3和所述质粒的序列列为SEQ ID NO：7。亲本小环DNA载体质粒pMC.CMV-MCS-SV40polyA购自System Biosciences(目录号MN501A1，序列号为SEQ ID NO：13)。
对于亲本HBVcircle-CMV-HBV1.1构建体，从pBR322-HBV1.3通过PCR提取从基因型D HBV基因组的核苷酸1805到3182和1到1990开始的长度为1.1单位的HBV基因组，然后使用SalI和NheI位点克隆到pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。该亲本HBVcircle-CMV-HBV1.1构建体的序列列于SEQ ID NO：8。
对于亲本HBVcircle-HBV1.3构建体，用SmaI和KpnI(购自New England BiolabsLtd)消化pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。为了产生长度为1.3单位的HBV基因组插入片段(如SEQ ID NO：9所示)，使用含有正向引物的SmaI位点
5’-TGGGCTCCCCGGGCGCGCAATCTAAGCAGGCTTTCACT-3’，
和含有反向引物的KpnI位点
5’-ATGTGGTACCACATCATGATGCTGATTACCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGGATCTCGTACTGAAGGAA AGA-3’，
通过使用pBR322-HBV1.3作为模板的PCR产生4.2kb片段(列为SEQ ID NO：10)。用SmaI和KpnI限制PCR片段，并与已经用相同酶消化的pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体连接以产生亲本质粒。亲本HBVcircle-HBV1.3构建体的序列列于SEQ ID NO：11。
对于亲本HBVcircle构建体，用SmaI和KpnI消化pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。从侧翼为attB和attP位点以及SmaI和KpnI位点的基因型D HBV基因组的核苷酸2848至3182和1至2847开始的完整HBV基因组插入片段直接基因合成(序列如SEQ ID NO：12所示)、消化并与已经通过相同酶消化的pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体连接以产生亲本质粒。亲本HBVcircle构建体的序列列于SEQ ID NO：1。
使用MC-Easy Minicircle DNA Production Kit按照制造商的说明书(SystemBiosciences，MN925A-1)生产小环DNA。如上所述，在小环生产者大肠杆菌菌株ZYCY10P3S2T中，在开启ΦC31整合酶和I-SceI基因表达后，HBV Circle、HBV Circle-CMV-HBV1.1和HBVcircle-HBV1.3DNA分别从其相应的亲本质粒中分离产生(图1A)。对于HBVcircle DNA，HBVcircle中的39个核苷酸attR位点插入(SEQ ID NO：4)位于SEQ ID NO：3的紧邻preS1基因起始密码子前的2847和2848个位置之间，并且在TP(末端蛋白)结构域和间隔区之间(图1B)。HBVcircle的整个序列如SEQ ID NO：2所示。通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分别验证HBVcircle DNA的大小和顺序(图1C)。
实施例2
体外HBVcircle转染后HBV复制评估
HBVcircle、HBVcircle-CMV-HBV1.1和HBVcircle-HBV1.3及其亲本质粒瞬时转染HepG2细胞进行病毒复制检测。转染72小时后，收集细胞培养上清并进行ELISA和qRT-PCR分析。HBeAg、HBsAg和HBV DNA在上清中高度丰富，表明稳健的病毒复制(图2A、B和C)。裂解细胞并提取总DNA，使用具有cccDNA特异性引物和探针组的实时PCR定量cccDNA(图2D)。与携带传统1.3单位HBV基因组超长度设计的亲本HBVcircle-HBV1.3质粒相比，HBVcircle显示出至少相当或更高的HBV标记物表达。
此外，HBsAg和HBV核心(HBc)蛋白在免疫荧光染色的HBVcircle转染细胞中是易于检测到的(图2E)。为了确定HBc缺乏对HBV复制的影响，构建HBc(-)HBVcircle为SEQ ID NO：15，其中HBc的起始密码子子突变。当将这两种构建体转染到HepG2细胞中时，HBsAg和HBeAg表达被类似地表达(图3-1A和3-1B)。细胞内HBV衣壳和包膜的HBV DNA仅在野生型中检测到，而没有在HBc(-)HBVcircle转染的细胞中。当反式补充HBc时，缺陷被成功挽救(图3-1C)。还产生了额外的HBV突变体，并测试了HBV复制标记物，如图3-2A、3-2B和3-2C所示。这些突变体包括其中HBV聚合酶基因的起始密码子子突变的HBVcircle Pol(-)(SEQ ID NO：16)，导致病毒在聚合酶表达中缺陷并且不能包装病毒RNA(Nguyen等人，J Virol 2008；82：6852-6861)；HBVcircle Pol(Y63D)，其中HBV聚合酶携带Y63D突变(SEQ ID NO：17)，导致DNA合成中的病毒缺陷但在RNA包装中是完全功能的(Lanford等人，J Virol.1997；71：2996-3004)；HBVcircle HBs(-)，其中两个早熟终止密码子被引入preS2和S编码区(SEQ IDNO：18)中；将HBVcircle HBe(-)引入到前核基因(SEQ ID NO：19)中，其中过早终止密码子突变G1896A被引入前核基因。
这些数据清楚地表明，一旦引入肝细胞，HBVcircle完全有能力支持高水平的HBV复制。
实施例3
体外评估cccDNA标记物
细胞核中cccDNA的存在是HBV的一个独特特征。为了确定HBVcircle是否能够在肝性细胞核中形成cccDNA，进行Southern印迹和CHIP分析。对于Southern印迹分析，首先将亲本HBVcircle或HBVcircle转染到HepG2细胞中，然后制备Hirt DNA(Cai等人，2013，MethodsMol Biol，1030：151-61)。超螺旋耐热cccDNA条带仅出现在HBVcircle转染细胞的Southern印迹上，而不在亲代HBVcircle转染的细胞中。EcoRI线性化时，cccDNA条带消失(图4A，RC：松弛环；DSL：双链线性；CCC：cccDNA)。使用HBVcircle转染细胞进行CHIP分析。与以前的出版物一致，包括三甲基化赖氨酸9(H3K9me3)和乙酰化赖氨酸27(H3K27ac)的表观遗传修饰与cccDNA相关(Liu等人，2013，PLoS Pathog，9：e1003613)。同时，在HBV cccDNA和宿主RL30基因之间观察到相似水平的H3(Pan H3)(分别是图4B和C)。总之，这些数据表明，HBVcircle转染细胞中存在真正的cccDNA作为微染色体，进一步证明HBVcircle可以作为研究天然HBVcccDNA的替代品。
实施例4
使用HBVcircle的体外抗HBV药品评估
接下来，评估在细胞培养模型中使用HBVcircle系统评估抗HBV药品的可行性。用HBVcircle瞬时转染HepG2细胞或增殖的HepaRG细胞，然后用指定浓度的ETV、HAP 12(一种属于杂芳基二氢嘧啶(HAP)化学系列的HBV衣壳装配抑制剂，并在Bourne等人，JVirol.2008年10月；82(20)：10262-10270中以实施例12公开)或Pegasys处理6天。收集上清，并进行HBsAg、HBeAg和白蛋白ELISA。将细胞裂解，细胞裂解物进行Southern印迹分析以进行封装的HBV DNA检测，以及进行western印迹分析以分别用特异性抗体检测HBV衣壳、HBc和β-肌动蛋白。
在HBVcircle转染的HepG2细胞中，恩替卡韦(ETV)是批准用于治疗CHB的核苷类似物，以剂量依赖的方式有效阻断HBV DNA复制，而不影响其他病毒蛋白表达(图5A，左上图和右图)。另一方面，HAP 12阻断衣壳形成，导致HBV DNA复制的消除(Bourne等人，2008，JVirol，82：10262-70)。还观察到HAP 12以剂量依赖的方式特异性降低HBeAg分泌，但不影响HBsAg或白蛋白(图4A，左下图和右图)。
Pegasys(聚乙二醇化干扰素α-2a)是另一种批准用于治疗CHB的药物，可以激活多种宿主机制以抑制HBV复制。当用Pegasys处理HBVcircle转染的HepaRG细胞时，HBsAg和HBeAg的产生都是剂量依赖性地抑制(图5B)。这些结果表明，HBVcircle可用于在细胞培养模型中体外评估不同类型的抗HBV药品。
实施例5
具有HBVcircle的持续性HDI小鼠模型的建立
为了测试体内HBV复制和持续时间，将10μg的HBVcircle、HBVcircle-HBV1.3以及HBVcircle-HBV1.3的亲本质粒流体动力注射到C3H/HeN小鼠的尾静脉(雄性，4-6周龄)。在HDI后的指定时间点，收集血液样品进行HBV标记物检测，包括HBsAg，HBeAg和HBV DNA(图6)。图6指定时间点的动物数显示在表1中。注射HBVcircle的C3H/HeN小鼠与其他组相比显示出极高水平且稳定的HBV标记物表达。注射后7周内所有HBV标记物均持续存在。相比之下，具有按照在pBR322-HBV1.3构建体中的经典HBV1.3设计的亲本HBVcircle-HBV1.3构建体不能支持HBV持续性，因为HBsAg在第14天以后迅速下降，变得不可检测。同时，在整个实验过程中监测小鼠体重，各菌株各组间差异无统计学意义(图6D)。
为了了解HDI期间DNA量对HBV持续性的影响，将4种不同剂量的HBVcircle以及对照质粒pBR322-HBV1.3注射到C3H/HeN小鼠中。监测血清中HBV标记物51天。图7指定时间点的动物数显示在表2中。如图7所示，在2.5μg、5μg和10μg组中的所有小鼠保持高水平的病毒复制并持续至少51天，尽管观察到初始剂量依赖型的病毒标记物表达，但30天以后的时间点差异无统计学意义。携带不同质粒骨架和1.3倍长度的HBV基因组的pBR322-HBV1.3组未能有良好持续性。
接下来，为了检测小鼠肝脏中的cccDNA，在第3天和第30天从HBVcircle 10μg组中每次处死2只小鼠。收获小鼠肝脏，并制备Hirt DNA进行Southern印迹分析。如图7D所示，耐热cccDNA在HDI后第3天清楚可见。并且cccDNA水平降低，但在第30天仍然可检测到。当通过EcoRI消化线性化时，快速迁移的超螺旋cccDNA条带如预期消失。这些结果表明，持续表型是由小鼠肝脏中的真实cccDNA驱动的。
在HDI注射后第120天，还用选定的小鼠进行HBc的免疫组织化学(IHC)染色，如表3和图8所示。结果表明，HBV复制在这些小鼠中持续至少120天，并且HBc主要存在于HBV复制性肝细胞的核中，其表型与在免疫耐受期的HBV慢性感染患者中观察到的相似(Hsu等人，1987，J Hepatol.；5(1)：45-50)。
表1.图6在指定时间点的动物数
Figure BDA0001361150370000311
表2.图7在指定时间点的动物数
Figure BDA0001361150370000312
表3.图8的IHC结果定量
Figure BDA0001361150370000321
实施例6
使用HBVcircle的体内抗HBV药品评估
在免疫感受态小鼠中建立具有HBVcircle的持续高水平HBV复制可以允许评估具有不同作用机制(MoA)的抗HBV药品。为了测试这一点，首先用10μg HBVcircle注射C3H/HeN小鼠，并在抗病毒药物治疗开始之前等待22天。在第23天，将小鼠分为具有6-7只小鼠/组和载体的四个组，将ETV(0.03mg/kg，QD)、HAP 2(属于杂化二氢嘧啶(HAP)化学系列的HBV衣壳装配抑制剂，并且在专利WO2014/037480中公开为实施例2，10mg/kg，QD)和R848(Resiquimod，TLR7激动剂，该结构公开于Hemmi等人，Nature Immunology 3,196-2002(2002)，0.5mg/kg，QOD)口服给予每组小鼠29天。如图9所示，ETV、HAP 2和R848治疗有效地将血清中的HBV DNA降低到不可检测的水平。此外，R848还大大降低了HBsAg和HBeAg，使得从第44天(治疗22天)起不能检测到所有三种HBV血清标记物。该实施例的结果清楚地表明，本发明的重组HBV cccDNA建立的模型是用于药物评估的有效方法。
实施例7
用额外的小鼠品系和HBV基因型建立持续性HDI小鼠模型
除C3H/HeN小鼠外，还评估了另一种免疫感受态小鼠品系CBA/J支持持续性HBV复制的能力。在图10所示的实验中，将HBVcircle或pBR322-HBV1.3流体动力注射到CBA/J小鼠的尾静脉(雄性，4-6周龄)。在HDI后的指定时间点，收集血液样品用于HBV标记物检测，包括HBsAg，HBeAg和HBV DNA。在60％的HDI注射小鼠中HBV复制持续至少56天。
除了基因型D HBV序列外，还评估了两种具有基因型B型HBV序列的HBVcircle构建体。如图11所示，HBVcircle Gt B(源自GeneBank AY220698的SEQ ID No：22)以及HBVcircle Gt Bc(SEQ ID No：23，源自GeneBank GQ205440)都显示出与C3H/HeN小鼠中的原始HBVcircle相似的持续性。
实施例8
使用HBVcircle的HBV突变体的体内表征
产生一系列HBVcircle突变体并评估其在体内的持续性。HBc缺失导致病毒不能复制，从而导致血清中检测不到HBV DNA。然而，它并没有影响HBsAg和HBeAg的持续性。类似地，HBx缺失(起始密码子子突变，SEQ ID No：20)或R96E突变(DDB1结合缺陷，SEQ ID No：21)(Leupin等人，J Virol.2005Apr；79(7)：4238-4245)也不影响HBV持续性(图12)。观察到HBV复制水平降低，如通过与野生型组相比，血清HBV DNA水平和抗原水平降低来表示(图12)。与这一发现一致，小鼠肝脏IHC染色结果也显示肝细胞中HBc水平降低(表4和图13)。
在单独的实验中，测试了另外的HBV突变体，包括HBe(-)、HBs(-)、Pol(-)和Pol(Y63D)。如图14所示，HBe(-)突变体表现出HBsAg持续性降低。
表4.图13的IHC结果定量
Figure BDA0001361150370000341
Figure IDA0001361150420000011
Figure IDA0001361150420000021
Figure IDA0001361150420000031
Figure IDA0001361150420000041
Figure IDA0001361150420000051
Figure IDA0001361150420000061
Figure IDA0001361150420000071
Figure IDA0001361150420000081
Figure IDA0001361150420000091
Figure IDA0001361150420000101
Figure IDA0001361150420000111
Figure IDA0001361150420000121
Figure IDA0001361150420000131
Figure IDA0001361150420000141
Figure IDA0001361150420000151
Figure IDA0001361150420000161
Figure IDA0001361150420000171
Figure IDA0001361150420000181
Figure IDA0001361150420000191
Figure IDA0001361150420000201
Figure IDA0001361150420000211
Figure IDA0001361150420000221
Figure IDA0001361150420000231
Figure IDA0001361150420000241
Figure IDA0001361150420000251
Figure IDA0001361150420000261
Figure IDA0001361150420000271
Figure IDA0001361150420000281
Figure IDA0001361150420000291
Figure IDA0001361150420000301
Figure IDA0001361150420000311
Figure IDA0001361150420000321
Figure IDA0001361150420000331
Figure IDA0001361150420000341
Figure IDA0001361150420000351
Figure IDA0001361150420000361

Claims (45)

1.一种重组HBV cccDNA，包含HBV基因组或其片段；和attR位点，其中attR位点位于紧邻preS1基因的起始密码子之前，并且在聚合酶基因的末端蛋白质结构域和间隔区之间，且所述位点对应于SEQ ID NO：3的2847和2848位之间；所述片段可复制并包含preS1基因的起始密码子与聚合酶基因的末端蛋白质结构域之间的区域。
2.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是全长基因组。
3.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是基因型B或基因型D基因组。
4.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是在GeneBank JN664917.1，X02496，AY217370，AY220698，GQ205440或HPBHBVAA中指定的基因组。
5.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23表示的基因组。
6.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是超长度基因组。
7.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是基因型D的1.1单位或1.3单位基因组。
8.权利要求1的重组HBV cccDNA，其中HBV基因组是由SEQ ID NO：9表示的1.3单位基因组。
9.权利要求1-8中任一项的重组HBV cccDNA，其中重组HBV cccDNA中HBV基因组的片段是表达编码HBV的包膜蛋白、核心/前核蛋白、x蛋白和/或聚合酶蛋白的核酸。
10.权利要求1的重组HBV cccDNA，其序列在SEQ ID NO：2中列出。
11.权利要求1-10中任一项的重组HBV cccDNA用于转染细胞系或原代细胞的用途。
12.权利要求11的用途，其中细胞系是来自肝性细胞的细胞系。
13.权利要求11的用途，其中细胞系是来自肝细胞的细胞系。
14.权利要求11的用途，其中细胞系是HepG2或HepaRG。
15.权利要求11的用途，其中原代细胞是原代肝性细胞。
16.权利要求11的用途，其中原代细胞是原代肝细胞。
17.权利要求1-10中任一项的重组HBV cccDNA用于抗HBV药品评估的用途。
18.权利要求17的用途，其中抗HBV药品是ETV、HAP 12、HAP 2、Pegasys或R848。
19.建立基于cccDNA的HBV动物模型的方法，其中所述方法包括将权利要求1-10中任一项的重组HBV cccDNA递送到动物中。
20.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少30天。
21.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少37天。
22.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少42天。
23.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少44天。
24.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少49天。
25.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少51天。
26.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少56天。
27.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少70天。
28.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少104天。
29.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少120天。
30.权利要求19的方法，其中所建立的动物模型在肝细胞中表达HBV抗原至少134天。
31.权利要求19-30中任一项的方法，其中动物具有功能先天和适应性免疫的免疫活性。
32.权利要求19-30中任一项的方法，其中动物是小鼠。
33.权利要求32的方法，其中小鼠是C3H/HeN小鼠或CBA/J小鼠。
34.权利要求19-30中任一项的方法，其中重组HBV cccDNA通过流体动力注射递送至动物。
35.包含权利要求1至10中任一项的重组HBV cccDNA的组合物或试剂盒。
36.一种制备权利要求1至10中任一项的重组HBV cccDNA的方法，包括以下步骤：
a)将HBV基因组或其片段插入产生小环DNA的亲本载体的对整合酶特异性的attP和attB位点中并以attP和attB为侧翼，以形成亲本HBVcircle构建体；
b)将亲本HBVcircle构建体转化到小环生产者中，通过位点特异性重组产生重组HBVcccDNA。
37.权利要求36的方法，其中小环生产者是微生物。
38.权利要求36的方法，其中小环生产者是细菌。
39.权利要求36的方法，其中小环生产者是埃希氏菌属细菌。
40.权利要求36的方法，其中小环生产者是大肠杆菌。
41.权利要求36的方法，其中小环生产者是菌株ZYCY10P3S2T。
42.权利要求36-41中任一项的方法，其中整合酶选自整合酶ΦC31、R4、TP901-1、ΦBT1、Bxb1、RV-1、AA118、U153、ΦFC1。
43.权利要求36-41中任一项的方法，其中生产小环DNA的亲本载体是从SystemBiosciences购买的pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。
44.权利要求36-41中任一项的方法，其中亲本HBVcircle构建体的DNA序列为SEQ IDNO：1。
45.权利要求1至10中任一项的重组HBV cccDNA或权利要求35的组合物或试剂盒在评估用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
CN201680007347.6A 2015-01-27 2016-01-25 重组hbv cccdna、其产生方法及其用途 Active CN107208102B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2015071604 2015-01-27
CNPCT/CN2015/071604 2015-01-27
CN2015090258 2015-09-22
CNPCT/CN2015/090258 2015-09-22
PCT/EP2016/051409 WO2016120186A1 (en) 2015-01-27 2016-01-25 Recombinant hbv cccdna, the method to generate thereof and the use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107208102A CN107208102A (zh) 2017-09-26
CN107208102B true CN107208102B (zh) 2021-07-06

Family

ID=55315390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680007347.6A Active CN107208102B (zh) 2015-01-27 2016-01-25 重组hbv cccdna、其产生方法及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20170327797A1 (zh)
EP (1) EP3250685A1 (zh)
JP (1) JP2018502604A (zh)
CN (1) CN107208102B (zh)
WO (1) WO2016120186A1 (zh)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2595980E (pt) 2010-07-22 2014-11-27 Gilead Sciences Inc Métodos e compostos para tratar infeções pelo vírus da família paramyxoviridae
TWI698444B (zh) 2014-10-29 2020-07-11 美商基利科學股份有限公司 製備核糖苷的方法
CA2998189C (en) 2015-09-16 2021-08-03 Gilead Sciences, Inc. Methods for treating arenaviridae and coronaviridae virus infections
PT3507276T (pt) 2016-09-02 2022-01-11 Gilead Sciences Inc Compostos moduladores do recetor de tipo toll
WO2018045150A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Gilead Sciences, Inc. 4,6-diamino-pyrido[3,2-d]pyrimidine derivaties as toll like receptor modulators
IL265921B1 (en) 2016-10-14 2024-01-01 Prec Biosciences Inc Transgenic meganonucleases specific for recognition sequences in the hepatitis B virus genome
AR110768A1 (es) 2017-01-31 2019-05-02 Gilead Sciences Inc Formas cristalinas de tenofovir alafenamida
CN106868045A (zh) * 2017-02-24 2017-06-20 重庆市科学技术研究院 乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法
CN110869028B (zh) 2017-03-14 2023-01-20 吉利德科学公司 治疗猫冠状病毒感染的方法
JOP20180040A1 (ar) 2017-04-20 2019-01-30 Gilead Sciences Inc مثبطات pd-1/pd-l1
CN115403626A (zh) 2017-05-01 2022-11-29 吉利德科学公司 新结晶形式
US10675296B2 (en) 2017-07-11 2020-06-09 Gilead Sciences, Inc. Compositions comprising an RNA polymerase inhibitor and cyclodextrin for treating viral infections
CN109593783A (zh) * 2017-09-30 2019-04-09 中国科学院动物研究所 一种体外产生环状核酸分子的方法
CN109897825A (zh) * 2017-12-07 2019-06-18 复旦大学 一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统
AU2018392212B9 (en) 2017-12-20 2021-03-18 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3' cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the STING adaptor protein
US10966999B2 (en) 2017-12-20 2021-04-06 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3′3′ cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein
UA126458C2 (uk) 2018-02-13 2022-10-05 Гіліад Сайєнсіз, Інк. Інгібітори pd-1/pd-l1
EP3759109B1 (en) 2018-02-26 2023-08-30 Gilead Sciences, Inc. Substituted pyrrolizine compounds as hbv replication inhibitors
US10870691B2 (en) 2018-04-05 2020-12-22 Gilead Sciences, Inc. Antibodies and fragments thereof that bind hepatitis B virus protein X
TWI818007B (zh) 2018-04-06 2023-10-11 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 2'3'-環二核苷酸
WO2019193543A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3'3'-cyclic dinucleotides
TW202005654A (zh) 2018-04-06 2020-02-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 ２，２，─環二核苷酸
US11142750B2 (en) 2018-04-12 2021-10-12 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the Hepatitis B virus genome
JP7242702B2 (ja) 2018-04-19 2023-03-20 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１阻害剤
TW202014193A (zh) 2018-05-03 2020-04-16 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 包含碳環核苷酸之2’3’－環二核苷酸
MA52709A (fr) 2018-05-23 2021-03-31 Modernatx Inc Administration d'adn
TWI732245B (zh) 2018-07-13 2021-07-01 美商基利科學股份有限公司 Pd‐1/pd‐l1抑制劑
WO2020028097A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of (r)-11-(methoxymethyl)-12-(3-methoxypropoxy)-3,3-dimethyl-8-0x0-2,3,8,13b-tetrahydro-1h-pyrido[2,1-a]pyrrolo[1,2-c] phthalazine-7-c arboxylic acid
WO2020086556A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Gilead Sciences, Inc. Pd-1/pd-l1 inhibitors
EP3873608A1 (en) 2018-10-31 2021-09-08 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds having hpk1 inhibitory activity
CA3117556A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds as hpk1 inhibitors
CN109652452A (zh) * 2018-12-13 2019-04-19 重庆市科学技术研究院 长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法
EP3921416A1 (en) * 2019-02-06 2021-12-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Minicircle producing bacteria engineered to differentially methylate nucleic acid molecules therein
CN113543851A (zh) 2019-03-07 2021-10-22 捷克共和国有机化学与生物化学研究所 2’3’-环二核苷酸及其前药
JP7350872B2 (ja) 2019-03-07 2023-09-26 インスティチュート オブ オーガニック ケミストリー アンド バイオケミストリー エーエスシーアール，ヴイ．ヴイ．アイ． ３’３’－環状ジヌクレオチドおよびそのプロドラッグ
WO2020178768A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3'3'-cyclic dinucleotide analogue comprising a cyclopentanyl modified nucleotide as sting modulator
TW202104210A (zh) 2019-04-17 2021-02-01 美商基利科學股份有限公司 Hiv蛋白酶抑制劑
TW202210480A (zh) 2019-04-17 2022-03-16 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
TWI751517B (zh) 2019-04-17 2022-01-01 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
TWI826690B (zh) 2019-05-23 2023-12-21 美商基利科學股份有限公司 經取代之烯吲哚酮化物及其用途
CN110669735A (zh) * 2019-06-18 2020-01-10 广州市第八人民医院 用于诱导形成HBV cccDNA的系统及构建方法
EP3990476A1 (en) 2019-06-25 2022-05-04 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
US20220257619A1 (en) 2019-07-18 2022-08-18 Gilead Sciences, Inc. Long-acting formulations of tenofovir alafenamide
WO2021034804A1 (en) 2019-08-19 2021-02-25 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical formulations of tenofovir alafenamide
AU2020351204A1 (en) * 2019-09-18 2022-04-21 Intergalactic Therapeutics, Inc. Synthetic DNA vectors and methods of use
CN114555799A (zh) 2019-09-30 2022-05-27 吉利德科学公司 Hbv疫苗和治疗hbv的方法
EP4069729A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Precision BioSciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hepatitis b virus genome
PE20230376A1 (es) 2019-12-24 2023-03-06 Carna Biosciences Inc Compuestos moduladores de la diacilglicerol quinasa
WO2021154687A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Gilead Sciences, Inc. Methods for treating sars cov-2 infections
CN115298181A (zh) 2020-03-12 2022-11-04 吉利德科学公司 制备1’-氰基核苷的方法
CN113493855B (zh) * 2020-03-19 2023-12-26 首都医科大学附属北京佑安医院 一种基于RAA-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒
EP4121437A1 (en) 2020-03-20 2023-01-25 Gilead Sciences, Inc. Prodrugs of 4'-c-substituted-2-halo-2'-deoxyadenosine nucleosides and methods of making and using the same
EP4132651A1 (en) 2020-04-06 2023-02-15 Gilead Sciences, Inc. Inhalation formulations of 1'-cyano substituted carbanucleoside analogs
CN111705080A (zh) * 2020-05-14 2020-09-25 广州市第八人民医院 Hbv非人动物模型的构建方法及其应用
CA3179226A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Tomas Cihlar Remdesivir treatment methods
JP2023527875A (ja) 2020-06-01 2023-06-30 モダーナティエックス・インコーポレイテッド フェニルアラニンヒドロキシラーゼバリアント及びその使用
EP4174181A1 (en) * 2020-06-24 2023-05-03 Xiamen University Drug screening model and method for targeting hbv cccdna
CN115996928A (zh) 2020-06-24 2023-04-21 吉利德科学公司 1’-氰基核苷类似物及其用途
EP4192474A1 (en) 2020-08-07 2023-06-14 Gilead Sciences, Inc. Prodrugs of phosphonamide nucleotide analogues and their pharmaceutical use
KR20230057419A (ko) 2020-08-24 2023-04-28 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 인지질 화합물 및 이의 용도
PE20231983A1 (es) 2020-08-27 2023-12-12 Gilead Sciences Inc Compuestos y metodos para el tratamiento de infecciones virales
TWI811812B (zh) 2020-10-16 2023-08-11 美商基利科學股份有限公司 磷脂化合物及其用途
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
CN114686496A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 广州市第八人民医院 用于制备HBV cccDNA的核酸、载体和宿主细胞
CN112725292B (zh) * 2021-01-11 2022-05-31 武汉大学 一种基于s基因断裂的aav-hbv重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用
CN113025651B (zh) * 2021-03-31 2023-03-24 重庆医科大学 靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用
WO2022240806A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Modernatx, Inc. Non-viral delivery of dna for prolonged polypeptide expression in vivo
WO2022241134A1 (en) 2021-05-13 2022-11-17 Gilead Sciences, Inc. COMBINATION OF A TLR8 MODULATING COMPOUND AND ANTI-HBV siRNA THERAPEUTICS
US20230000873A1 (en) 2021-05-26 2023-01-05 Gilead Sciences, Inc. Phospholipid formulations of 1'-cyano substituted carba-nucleoside analogs
CN117377671A (zh) 2021-06-23 2024-01-09 吉利德科学公司 二酰基甘油激酶调节化合物
US11932634B2 (en) 2021-06-23 2024-03-19 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
EP4359415A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
US20230212199A1 (en) 2021-08-18 2023-07-06 Gilead Sciences, Inc. Phospholipid compounds and methods of making and using the same
TW202345786A (zh) 2022-03-02 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療病毒感染的化合物及方法
WO2023167944A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Gilead Sciences, Inc. Compounds and methods for treatment of viral infections
WO2023168254A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Gilead Sciences, Inc. Antiviral compounds and methods of making and using the same
WO2023168194A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Gilead Sciences, Inc. Antiviral compounds and methods of making and using the same
US20240009220A1 (en) 2022-06-06 2024-01-11 Gilead Sciences, Inc. Methods for treatment of viral infections
US20240051962A1 (en) 2022-06-29 2024-02-15 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of a nucleoside analogue and uses thereof
US20240043466A1 (en) 2022-06-30 2024-02-08 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of a nucleoside analogue and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888426A (zh) * 2011-07-19 2013-01-23 中国科学院深圳先进技术研究院 微环基因载体及其制备方法和应用
CN103898100A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 深圳先进技术研究院 cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒
CN104278055A (zh) * 2013-07-04 2015-01-14 中国科学院上海巴斯德研究所 制备hbv持续感染动物模型的试剂和方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1403385A1 (en) 2002-09-27 2004-03-31 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for assaying replication of HBV and testing susceptibility to drugs
US7452696B2 (en) * 2006-10-27 2008-11-18 National Taiwan University Recombinant plasmid and method for expressing hepatitis B viral antigens and virions in vivo
KR20150054795A (ko) 2012-09-10 2015-05-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및 예방을 위한 6-아미노산 헤테로아릴다이하이드로피리미딘

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888426A (zh) * 2011-07-19 2013-01-23 中国科学院深圳先进技术研究院 微环基因载体及其制备方法和应用
CN103898100A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 深圳先进技术研究院 cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒
CN104278055A (zh) * 2013-07-04 2015-01-14 中国科学院上海巴斯德研究所 制备hbv持续感染动物模型的试剂和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHIHUA QI等.Recombinant Covalently Closed Circular Hepatitis B Virus DNA Induces Prolonged Viral Persistence in Immunocompetent Mice.《Recombinant Covalently Closed Circular Hepatitis B Virus DNA Induces Prolonged Viral Persistence in Immunocompetent Mice》.2014,第88卷(第14期), *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018502604A (ja) 2018-02-01
CN107208102A (zh) 2017-09-26
EP3250685A1 (en) 2017-12-06
US20170327797A1 (en) 2017-11-16
WO2016120186A1 (en) 2016-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107208102B (zh) 重组hbv cccdna、其产生方法及其用途
CN111218459B (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
Ganem et al. The molecular biology of the hepatitis B viruses
Hasegawa et al. Enhanced replication of a hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis
Chang et al. A new avian hepadnavirus infecting snow geese (Anser caerulescens) produces a significant fraction of virions containing single-stranded DNA
US10704061B2 (en) Lentiviral vectors
CN103998604B (zh) Hbv聚合酶突变体
EP0038765B1 (fr) Vaccin contre l&#39;hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin
Wu et al. Amino acid substitutions at positions 122 and 145 of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) determine the antigenicity and immunogenicity of HBsAg and influence in vivo HBsAg clearance
EP0101617B1 (en) Recombinant dna containing a hepatitis b virus gene, mammalian cells transformed with the cloned viral dna, and production of hepatitis b virus proteins
JP2019088323A (ja) 外来抗原を含むヒトサイトメガロウイルス
JPH02501186A (ja) 異種ウイルス性ペプチド粒子の免疫原
Lu et al. Study of the early steps of the Hepatitis B Virus life cycle
WO2016070008A1 (en) Hepatitis b reporter viruses and cccdna-based expression vectors
EP2198020B1 (en) Polynucleotides allowing the expression and secretion of recombinant pseudo-virus containing foreign epitopes, their production, and use
JP3621355B2 (ja) 遺伝子治療用組換ｂ型肝炎ウイルスプラスミドベクター
Ackrill et al. Specific deletions in the hepatitis B virus core open reading frame in patients with chronic active hepatitis B
JP6313215B2 (ja) 組み換え酵母を用いた、定義された抗原に対する防御的体液性免疫応答の生成による予防接種
JPH04504357A (ja) ワクシニアベクター、ワクシニア遺伝子およびその発現産物
Ryu Molecular aspects of hepatitis B viral infection and the viral carcinogenesis
JP2004175665A (ja) タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤
Cui et al. Identification of a mutation in Hepatitis B virus surface antigen capable of evading ELISA screening
US9247720B2 (en) Primate model from the family cercopithecidae infected by a HBV strain of human genotype
JP2022072093A (ja) ＨｉＢｉＴを利用したＢ型肝炎ウイルス複製モニタリングシステム
CN106399374B (zh) 双表达小干扰rna的复制缺损型乙型肝炎病毒载体、其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1240270

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant