CN112725292B - 一种基于s基因断裂的aav-hbv重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于S基因断裂的AAV‑HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用。本发明采用同源重组的方法构建pAAV‑HBV1.04质粒，通过三质粒共转染293T细胞方法体外包装生产重组病毒。用重组病毒通过尾静脉注射免疫系统正常的C57BL/6小鼠形成HBV cccDNA持续存在的HBV慢性感染小鼠模型。本发明中的小鼠模型能产生真实HBV cccDNA并且能作为唯一得转录模板发挥功能。本发明构建的新型HBV慢性感染小鼠模型可用于研究长期慢性感染条件下HBV cccDNA形成和维持的机制，用于研究与免疫系统相关的问题，用于寻找和评估新的抗HBV药物。

Description

一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型 的建立方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝性DNA病毒，基因组为部分双链松弛环状DNA(Relaxed circular DNA,rcDNA)，全长约3.2kb，是目前已知的最小的DNA病毒(Ganem,D.and A.M.Prince,Hepatitis B virus infection--natural history andclinical consequences.N Engl J Med,2004.350(11):p.1118-29.)。HBV感染宿主细胞后其rcDNA会在宿主细胞细胞核中被DNA损伤修复系统修复为共价闭合环状DNA(covalentlyclosed circular DNA,cccDNA)，cccDNA是病毒转录的模板。尽管疫苗能有效预防HBV感染，但是对全球约2.5亿慢性乙肝患者没有帮助(WHO.Hepatitis B Fact Sheet.Availableat:https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b(Accessed:March 2020)(2020).)。HBV慢性感染能导致逐渐恶化的肝疾病如肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌，仍然是严重的公共健康问题。HBV建立长期慢性感染不能被清除的主要原因是其复制中间体cccDNA无法被现有药物清除。

目前美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗乙型肝炎的药物为干扰素α和核苷/核苷酸类似物，核苷/核苷酸类似物可以有效抑制病毒的复制，但是不能清除病毒感染已经建立的cccDNA池，停药后病毒复制反弹。干扰素α也能抑制病毒复制，但是存在副作用大，应答率低，费用昂贵等问题，也不能清除cccDNA池(Gregorek,H.,et al.,Persistenceof HBV-DNA in children with chronic hepatitis B who seroconverted to anti-HBsantibodies after interferon-alpha therapy:correlation with specific IgGsubclass responses to HBsAg.J Hepatol,2005.42(4):p.486-90.)。研究HBV慢性感染机制和寻找新的能治愈乙型肝炎药物仍然是重大的科学问题。目前关于cccDNA生物学特征还不是很清楚，主要原因是缺乏合适的慢性感染模型。HBV长期慢性感染的原因是cccDNA的长期稳定存在，不能被彻底清除。因此建立合适的HBV慢性感染模型来寻找这些问题的答案十分关键。

由于HBV感染进入肝细胞依赖受体NTCP介导，这导致HBV具有严格的宿主特异性，只有少数细胞和动物模型可以使用，这为HBV的深入研究带来了不便。HepG2 2.15是使用比较多的非感染型细胞系，其整合了HBV二倍体基因组到宿主基因组。因为与自然感染生理条件不同，所以实验结果不一定准确。HepG2-NTCP和Huh7-NTCP是过表达HBV特异性受体NTCP的感染型细胞系，但是需要高滴度的野生型病毒才能成功感染。人肝原代细胞PHH可以被HBV感染，是HBV研究的金标准，但是来源有限，价格昂贵也限制了其应用。在体外细胞水平证明有作用的药物在进入临床实验前需在动物活体水平验证药物有效性和安全性。HBV只能感染灵长类动物如黑猩猩，在自然界黑猩猩是濒临灭绝的动物，不能再供研究使用。猕猴能作为一种可选的体内模型，但高昂的成本也限制了其应用。小鼠是良好的小型实验室动物模型，成本低，易操作，但是小鼠肝细胞不支持HBV感染，由于不清楚的原因即使过表达人NTCP受体的小鼠肝细胞也不支持HBV复制。目前只有uPA/SCID小鼠可以支持HBV复制，因为缺乏免疫系统，不适合研究免疫相关的问题。HBV转基因小鼠由于和自然感染生理条件不同，实验结果也不一定准确。

尽管上述例举的HBV研究模型均不完美，但这些模型在HBV致病机制研究和抗HBV药物的发现上仍发挥了重要作用。研究HBV慢性感染免疫相关和cccDNA长期稳定存在机制的问题仍需要更合适的模型。

近来一些研究组报道了其他非感染型的HBV表达系统。通过在体外培养细胞转染含HBV基因组的质粒和从小鼠尾静脉用流体力学注射(Hydrodynamic injection，HDI)含HBV基因组的质粒或腺相关病毒(AAV)的方法来支持HBV的复制。Huang et al.在2006年使用了pAAV-HBV1.2(携带具有复制能力的HBV基因组)质粒HDI小鼠尾静脉能建立慢性感染。但是注射小鼠只有40％建立了慢性感染。小鼠是否建立慢性感染与小鼠本身的遗传背景和AAV载体骨架均有关(Huang,L.R.,et al.,An immunocompetent mouse model for thetolerance of human chronic hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U SA,2006.103(47):p.17862-7.)。在这之前慢性感染模型多使用HBV转基因小鼠，但是小鼠的操作是在非生理条件下进行，因此研究者想建立非转基因小鼠HBV慢性感染模型。Huang etal.在2012年发现小鼠尾静脉HDI低剂量的Ad-HBV(腺病毒载体含具有复制能力HBV基因组)也能建立小鼠慢性感染(Huang,L.R.,et al.,Transfer of HBV genomes using lowdoses of adenovirus vectors leads to persistent infection in immune competentmice.Gastroenterology,2012.142(7):p.1447-50.e3.)。Dion et al.在表达HLA-A2和HLA-DR1的小鼠尾静脉注射包装好的AAV，能高效转导小鼠肝细胞，克服病毒进入的困难，所有注射小鼠都能建立慢性感染(Dion,S.,et al.,Adeno-associated virus-mediatedgene transfer leads to persistent hepatitis B virus replication in miceexpressing HLA-A2 and HLA-DR1 molecules.J Virol,2013.87(10):p.5554-63.)。Lucifora et al.用包装好携带HBV1.2倍基因组的AAV尾静脉注射小鼠，在肝脏中检测到了HBV cccDNA的持久形成。但是Dion和Lucifora构建的模型中HBV cccDNA是如何形成的不清楚，以及形成的HBV cccDNA是否发挥了功能也不确定。在2014年，Qi et al.通过整合有loxp-嵌合内含子prcccDNA质粒和pCMV-Cre质粒转染培养细胞能形成rcccDNA。将loxp-嵌合内含子prcccDNA质粒尾静脉注射Alb-Cre转基因小鼠或用prcccDNA和pCMV-Cre同时注射均能产生rcccDNA，但是质粒骨架来源于大肠杆菌会产生免疫原性，并且重组效率低(Qi,Z.H.,et al.,Recombinant Covalently Closed Circular Hepatitis B Virus DNAInduces Prolonged Viral Persistence in Immunocompetent Mice.Journal ofVirology,2014.88(14):p.8045-8056.)。Wu et al.也运用Cre-loxp技术和睡美人转座子系统，建立了整合2-60个HBV单拷贝的HepG2来源细胞系，用于研究cccDNA(Wu,M.,et al.,Establishment of Cre-mediated HBV recombinant cccDNA(rcccDNA)cell line forcccDNA biology and antiviral screening assays.Antiviral Research,2018.152:p.45-52.)。也有研究者通过minicircle技术来建立minicircle HBV cccDNA，然后在体外和体内研究cccDNA生物学特征。上述这些模型均存在不足，要么不能判断cccDNA有没有发挥作用，要么形成的cccDNA是重组cccDNA，不是真实的HBV cccDNA。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒复制小鼠模型的建立方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明经过实验发现，使用靶向小鼠肝脏AAV病毒载体介导HBV1.04倍基因组到小鼠的肝脏建立了HBV持续性感染模型，可用于HBV cccDNA生物学机制研究和抗HBV药物的研发。

本发明是这样实现的，一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒，所述重组病毒载体质粒序列见SEQ ID NO.3所示，是DNA拷贝数为大于1的多拷贝。该病毒能形成具有生物学功能的真实HBV cccDNA。

重组病毒AAV-HBV1.04的包装信号是AAV2的末端重复序列。

本发明还披露了一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒的制备方法，以pAAV-TBG>hSLC10A1[NM_003049.3]:WPRE为模板扩增AAV载体骨架，以2倍体为模板扩增HBV目的片段，再通过同源重组方法构建到AAV载体质粒中；其中，所述HBV2倍体的核苷酸序列见SEQID NO.2，用于扩增AAV载体骨架的引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，用于扩增HBV目的片段的引物序列见SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示

进一步地，所述重组病毒包装的HBV基因型为D型或A、B、C、E、F、G基因型中的一种。

进一步地，所述重组病毒为血清型为8型的AAV8重组AAV病毒。当然也可以是血清型为6型，7型，9型的重组AAV病毒，它具有感染小鼠肝脏组织细胞的特异性。或具有感染小鼠肝脏组织细胞特异性的其它嵌合型AAV病毒。

本发明还披露了如上述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒在制备用于建立HBV cccDNA持续存在慢性感染小鼠模型的制剂中的应用。

本发明还披露了如上述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒在建立HBVcccDNA持续存在慢性感染小鼠模型中的应用。

本发明还披露了一种建立HBV cccDNA持续存在慢性感染小鼠模型的方法，将权利要求1中所述的重组病毒载体质粒通过三质粒共转染法转染293T细胞体外包装生产重组AAV-HBV1.04病毒，用重组AAV-HBV1.04病毒通过尾静脉注射免疫系统正常的C57BL/6小鼠形成HBV cccDNA持续存在的HBV慢性感染小鼠模型。注射的AAV病毒量为5x10¹⁰vg或大于该注射剂量。在小鼠血清中能持续检测到s抗原和e抗原，为持续HBV病毒复制、携带模型。

进一步地，更详细的方法步骤包括：用PCR方法扩增出带有同源臂的AAV载体质粒骨架片段和HBV1.04的两个片段，胶回收后得到纯化的片段，然后用同源重组技术将三个片段进行重组，将重组产物转化感受态细胞，用氨苄抗性LB固体平板进行筛选，挑取单菌落摇菌后进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的菌种保种并提取得到质粒pAAV-HBV1.04。接着用质粒pAAV-HBV1.04转染Huh7细胞，通过检测细胞培养上清中的s抗原和e抗原来确定构建质粒是否正确。然后用质粒pAAV-HBV1.04，pAAV2/8和pHelper共转293T细胞包装生产得到浓缩的AAV-HBV1.04。再用AAV-HBV1.04转导AML12细胞，通过检测细胞培养上清中的s抗原和e抗原来确定包装的AAV是否正常工作。最后用AAV-HBV1.04通过尾静脉注射小鼠，通过检测小鼠血清中s抗原和e抗原来判断是否形成慢性感染小鼠模型。

本发明中的小鼠模型能形成真实的HBV cccDNA，并且小鼠具有免疫功能，能为探究HBV慢性感染的免疫学相关问题以及为寻找彻底清除HBV cccDNA的药物研究提供了重要的模型。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

HBV长期慢性感染的原因是HBV cccDNA在宿主细胞长期稳定存在。目前的药物只能抑制HBV复制，不能清除HBV转录模板cccDNA，因此不能彻底治愈慢性乙肝。HBV细胞模型可以用来研究HBV生活周期的一些具体过程，但是不适合用于研究长期慢性感染下cccDNA的形成和调控，也不能用于研究与宿主免疫系统相关的问题。HBV有严格的宿主特异性，只能感染树鼩、猕猴和黑猩猩，但是由于成本昂贵，操作不方便，伦理问题，不适合用于实验室研究。小鼠是良好的小型实验室动物，但是不支持HBV感染。正如背景中所述已有的HBV小鼠模型都存在不足。

本发明通过携带HBV1.04倍基因组的AAV尾静脉注射小鼠构建的慢性感染模型，克服了HBV不能感染小鼠肝细胞的问题。现有的通过AAV方式携带HBV1.2倍基因组构建的慢性感染小鼠模型，其携带的基因组序列线性方向上就能转录pgRNA和翻译HBs蛋白，会对cccDNA是否发挥作用产生干扰。还有的慢性感染小鼠模型产生的是重组cccDNA,不是真实的HBV cccDNA。我们HBV1.04基因组构建的策略，从HBV S基因断开使得线性方向不能转录pgRNA和翻译HBs蛋白，既排除了HBV1.04基因组自身的干扰，又能形成真实的HBV cccDNA。

采用本发明构建的HBV1.04倍体基因组线性方向不能形成转录产物pgRNA和翻译HBs蛋白。只有当AAV-HBV1.04病毒转导细胞发生同源重组后才能形成HBV cccDNA,进而转录pgRNA和翻译HBs蛋白,完成HBV的复制周期。与已报道的AAV-HBV1.2相比，AAV-HBV1.04自身不能生成pgRNA和HBs产物，避免了HBV 1.2倍体在不发生同源重组时也能转录pgRNA和翻译HBs蛋白与不能判断形成的HBV cccDNA是否发挥功能的问题。本发明的创新性在于HBV1.04倍体能形成真实的HBV cccDNA，只需用ELISA法检测小鼠血清中s抗原表达情况就能快速间接判断HBV cccDNA是否形成。本发明中HBV cccDNA的形成来源于HBV1.04倍体的同源重组和新合成核衣壳中rcDNA的重新入核，保证了生成的cccDNA能发挥生物学功能。目前已报道的大多数小鼠模型生成的cccDNA不是真实的HBV cccDNA，而是重组cccDNA。本发明中的小鼠模型能产生真实HBV cccDNA并且能作为唯一的转录模板发挥功能。本发明构建的新型HBV慢性感染小鼠模型可用于研究长期慢性感染条件下HBV cccDNA形成和维持的机制，用于研究与免疫系统相关的问题，用于寻找和评估新的抗HBV药物。

附图说明

图1是同源重组技术构建pAAV-HBV 1.04质粒示意图；

图2是HBV 1.2倍体和HBV 1.04倍体基因组开放阅读框和构建好质粒的菌液PCR鉴定；

图3是pAAV-HBV1.2和pAAV-HBV1.04质粒转染Huh7细胞，转染2d和4d细胞培养上清中s抗原和e抗原的表达情况；

图4是用三质粒共转293T细胞包装好的AAV-HBV1.04转导AML12细胞，转导第3，5，7，9天时细胞培养上清中s抗原和e抗原的表达情况；

图5是AAV-HBV1.04转导AML12细胞后加入不同DNA损伤修复抑制剂(ATM抑制剂：Ku55933；ATR抑制剂1：AZD6738；ATR抑制剂2：VE821；Chk1抑制剂：HY-104022)，加入抑制剂作用2天后更换新鲜培养基，转导第7天时细胞培养上清中s抗原和e抗原的表达情况；

图6是AAV-HBV1.2和AAV-HBV1.04尾静脉注射小鼠，注射剂量为5x10¹⁰vg/只小鼠，转导不同周数小鼠血清中s抗原和e抗原的表达情况。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式做出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用，具体如下实施例所示。

实施例1

构建pAAV-HBV1.2和pAAV-HBV1.04质粒。同源重组技术构建pAAV-HBV 1.04质粒，示意图见图1，pAAV-HBV1.04载体质粒序列见SEQ ID NO.3所示。选取HBV基因组rcDNA小S区为起点沿着HBV基因组rcDNA延伸回到起点后再多约127bp(同源臂)作为终点，得到的HBV基因组DNA长度除以3182为1.04个拷贝。起点和终点的选取可以在小S区前后变动。

一、PCR技术扩增AAV线性化载体骨架片段和HBV目的片段

用于扩增AAV载体骨架的模板为pAAV-TBG>hSLC10A1[NM_003049.3]:WPRE(该AAV载体骨架序列是常用序列)。用于扩增HBV目的片段的模板为本实验室保存的含HBV1.3倍体或2倍体质粒(均为基因型D，序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)。设计并合成引物见下表，利用takara公司高保真DNA聚合酶(货号R045A)，反应体系25μl，PrimeSTAR MaxPremix(2x)12.5μl，引物F/R各0.5μl，模板1μl(1ng)，灭菌蒸馏水10.5μl。反应条件98℃，10s，60℃，5s或15s，72℃，5s/kb，30-35个循环。扩增HBV1.2倍体用的模板为HBV1.3倍体，使用的扩增引物为HBV1.2F/HBVterR和HBVterF/HBV1.2R。扩增HBV1.04倍体用的模板为HBV2倍体，使用的扩增引物为HBV1.04F/HBVterR和HBVterF/HBV1.04R。本实施例中，HBV1.04的扩增用2倍体，1.3倍体扩增不出目标片段。因为目标序列是从S基因处开始的。HBV1.2是为了用作对照，其序列比1.3倍体5’端短一点，可以直接PCR获得HBV1.2。用2倍体也能PCR扩增获得1.2倍体。

本实施例中涉及的引物序列如下：

Primer name	Sequence order(5’-3’)
		HBV 1.2F	CAACTTTGTATAGAACCCGCAAATATACATCGTATCCATGG，SEQ ID NO.4；
HBV 1.2R	CCCACTTTGTACAAGATCTCGTACTGAAGGAAAGAAGTCAGAAG，SEQ ID NO.5；
		HBV 1.04F	CAACTTTGTATAGAATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC，SEQ ID NO.6；
HBV 1.04R	CCCACTTTGTACAAGCAGTAGTCATGCAGGTTCGGC，SEQ ID NO.7；
		HBV ter F	CTGCGTTAATGCCCTTGTATGCA，SEQ ID NO.8；
HBV ter R	TGCATACAAGGGCATTAACGCAG，SEQ ID NO.9；
		AAV2-HR-F	CTTGTACAAAGTGGGAATTCCGATAATCAAC，SEQ ID NO.10；
AAV2-HR-R	TTCTATACAAAGTTGTCTAGAAGGAACCCCT，SEQ ID NO.11。

二、用DNA胶回收试剂盒(Vazyme，货号DC301)得到纯化后的目的片段

1.DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

2.加入等倍体积Buffer GDP。50-55℃水浴7-10min,根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。

3.短暂离心收集管壁上的液滴。将Fsatpure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把≤700μL溶胶液转移至吸附柱中，12000x g离心30-60s。若溶胶体积大于700μL，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12000x g离心30-60s。

4.弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12000x g离心30-60s。

5.弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入600μL Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12000x g离心30-60s。

6.重复步骤5。

7.弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12000x g离心2min。

8.将吸附柱置于1.5ml灭菌的离心管中，加入7-30μL Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12000x g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

三、无缝克隆技术定向克隆获得重组质粒

将纯化得到的片段用ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix(货号RK21020)按说明书进行同源重组，10μl反应体系：

	2-3个片段组装
		片段总量	xμl
H<sub>2</sub>O	5-xμl
		2x MultiF Seamless Assembly Mix	5μl
总体积	10μl

反应条件：50℃15min。1-2个片段插入到载体，推荐用0.02-0.5pmols的DNA总量(包含所有片段和载体的DNA总量)。可根据片段的长度和质量来计算得到每个片段的pmols数，计算公式：pmols＝(质量ng)x1000/(碱基对数x650道尔顿)。

四、将上面同源重组得到的混合物转化DH5α感受态细胞

将上面同源重组产物放置在冰上冷却。取冻存在-80℃的100μl感受态放冰上融化，将感受态细胞加入到同源重组产物中，用移液枪轻轻吹打混匀，插入冰中，30min后转移到42℃的水浴锅中热激90s，放冰上冷却2-3min，加入1ml新鲜LB培养基，放在37℃摇床，220转振荡培养1h，将培养物5000转离心5min，用移液枪丢弃850μL上清，将剩下的液体吹打混匀，用玻璃棒均匀的涂抹在氨苄抗性的LB固体平板上。37℃培养箱正置15min后倒置，第二天观察细菌生长情况，分别挑取一定数量不同位置单菌落在氨苄抗性的LB培养基中培养。

五、菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳对克隆进行鉴定

PCR反应体系为：摇浑的菌液1μl，上下游引物各0.5μl，2xDNA聚合酶mix 12.5μl，去离子水10.5μl。使用的引物对为：HBV1.2F/HBVterR，HBVterF/HBV1.2R，HBV1.04F/HBVterR，HBVterF/HBV1.04R。PCR反应程序为：预变性：95度3min，32个扩增循环：95度，15s，60度，15s，72度，3min，72度延伸10min。将PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳并进行成像。

HBV 1.2倍体和HBV 1.04倍体基因组开放阅读框和构建好质粒的菌液PCR鉴定结果见图2所示。

六、扩大培养鉴定正确的克隆菌，并提取质粒

选取步骤五中鉴定正确的菌液，在超净工作台中按1：1000接种到装有6ml LB培养基的15ml离心管中。放置在37度摇床，200转/分钟，培养16h。离心菌液弃去上清得到菌体，再按质粒提取试剂盒中操作说明进行质粒的提取。

七、用构建好的质粒pAAV-HBV1.2和pAAV-HBV1.04转染Huh7细胞进一步验证克隆是否表达

当天晚上在24孔细胞培养板每个孔中种10⁵个细胞，第二天上午细胞密度约为60％进行质粒PEI转染。PEI转染的方法为：在1.5ml的无菌EP管中用opti-MEM分别稀释1μg质粒和3μL PEI，然后将稀释好的PEI加入到稀释好的质粒中，轻轻吹打混匀8-10下，静置20min,将混合液均匀的加到孔板中。

pAAV-HBV1.2和pAAV-HBV1.04质粒转染Huh7细胞，转染2d和4d细胞培养上清中s抗原和e抗原的表达情况见图3所示。结果显示，在pAAV-HBV1.2组可以同时检测到s抗原和e抗原，在pAAV-HBV1.04组只能检测到e抗原，不能检测到s抗原，与预期一致。

八、AAV包装与浓缩

将得到的AAV-HBV 1.2，AAV-HBV 1.04质粒分别和pAAV2/8，pHelper质粒共转293T细胞包装相应的AAV。

具体方法为：(1)以T75细胞培养瓶为例，细胞生长密度为80％时需转染的总质粒量为15μg。三种质粒的摩尔比为1：1：1。使用的转染试剂为PEI，质粒与PEI之比为1：3，转染使用的溶剂为DMEM。

(2)转染10小时以上即可换液，换液前需要用PBS洗一次，后加入新鲜培养基。

(3)换液72小时后收取细胞上清和细胞，使用反复冻融法裂解细胞，对细胞上清和细胞进行浓缩后，用提基因组DNA试剂盒进行提取AAV病毒基因组的DNA，并利用q-PCR方法对病毒浓缩液的滴度进行检测。

九、用包装好的AAV-HBV1.04转导AML12细胞检测细胞培养上清中s抗原和e抗原的表达

使用PEG8000将AAV-HBV1.04转导AML12细胞，转导24小时换新鲜培养基，分别收取3，5，7，9天上清检测s抗原和e抗原。

结果参考图4，在AAV-HBV1.2组，可以检测到e抗原和s抗原，在AAV-HBV1.04组可以检测到e抗原，s抗原在转导5天后才能检测到。这说明AAV-HBV1.04转导AML12细胞后不能立即生成HBs蛋白，只有经过一定的时间发生同源重组生成了HBV cccDNA才能生成HBs蛋白。

十、细胞核中HBV cccDNA池的维持需要新生成的rcDNA的重新入核回补。为了验证AAV-HBV1.04转导AML12是否有rcDNA入核并在细胞DNA损伤修复系统下形成cccDNA的过程，本实施例中晚上在24孔板中每孔铺5x10⁵个AML12细胞，第二天上午用浓度为5万MOI的AAV-HBV1.04转导细胞，转导1天后，弃去旧的培养基，用PBS洗3次，更换含有不同抑制剂的2％DMSO新鲜培养基，转导3天后更换含有不同抑制剂的2％DMSO新鲜培养基，转导5天后，弃去旧的培养基，用PBS洗3次，更换2％DMSO新鲜培养基，收取转导第7天后的细胞培养上清。检测转导7天后细胞培养上清中s抗原和e抗原。ATM抑制剂：Ku55933使用浓度为5μM；ATR抑制剂1：AZD6738使用浓度为2.5μM；ATR抑制剂2：VE821使用浓度为2.5μM；Chk1抑制剂：HY-104022使用浓度为5μM。

结果如图5，与不加抑制剂组相比，加了ATR抑制剂组，s抗原和e抗原表达均显著降低，表明ATR参与了rcDNA修复为cccDNA过程。

十一、用包装好的AAV-HBV1.04尾静脉注射小鼠检测小鼠血清中s抗原和e抗原

(1)小鼠的AAV病毒注射：将小鼠分为HBV1.2组和HBV1.04组，每组7只小鼠，AAV注射剂量为5x10¹⁰vg/只小鼠。注射之后定期通过眼眶取血收集小鼠血清样品并检测s抗原和e抗原。

(2)ELISA检测s抗原和e抗原：用PBS将小鼠血清稀释100倍，分别取75μl和50μl的稀释液进行检测，使用的商业化ELISA检测试剂盒。显色后使用酶标仪读取数值(使用波长为450nm)，分别检测了转导后1，2，3，4，6，10，14周血清样品s抗原和e抗原。

结果参考图6，AAV-HBV1.04组和AAV-HBV1.2组一样，均能检测到s抗原和e抗原长期稳定表达，表明用AAV-HBV1.04构建的小鼠模型能形成HBV cccDNA。采用我们方法构建的小鼠模型，注射的AAV量要求不高，只需要5x10¹⁰vg/只即可，并且能形成真实的HBV cccDNA，在我们的模型中只有cccDNA是病毒转录的唯一模板，不存在AAV引入基因组产生的干扰问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4134

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 1

gggccctgca ggtcgacaag cttgtattca atctaagcag gctttcactt tctcgccaac 60

ttacaaggcc tttctgtgta aacaatacct gaacctttac cccgttgccc ggcaacggcc 120

aggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcttgg tcatgggcca 180

tcagcgcatg cgtggaacct tttcggctcc tctgccgatc catactgcgg aactcctagc 240

cgcttgtttt gctcgcagca ggtctggagc aaacattatc gggactgata actctgttgt 300

cctatcccgc aaatatacat cgtttccatg gctgctaggc tgtgctgcca actggatcct 360

gcgcgggacg tcctttgttt acgtcccgtc ggcgctgaat cctgcggacg acccttctcg 420

gggtcgcttg ggactctctc gtccccttct ccgtctgccg ttccgaccga ccacggggcg 480

cacctctctt tacgcggact ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt 540

cgcttcacct ctgcacgtcg catggagacc accgtgaacg cccaccaaat attgcccaag 600

gtcttacata agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac 660

ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc 720

tttgtactag gaggctgtag gcataaattg gtctgcgcac cagcaccatg caactttttc 780

acctctgcct aatcatctct tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg 840

ggtggctttg gggcatggac atcgaccctt ataaagaatt tggagctact gtggagttac 900

tctcgttttt gccttctgac ttctttcctt cagtacgaga tcttctagat accgcctcag 960

ctctgtatcg ggaagcctta gagtctcctg agcattgttc acctcaccat actgcactca 1020

ggcaagcaat tctttgctgg ggggaactaa tgactctagc tacctgggtg ggtgttaatt 1080

tggaagatcc agcgtctaga gacctagtag tcagttatgt caacactaat atgggcctaa 1140

agttcaggca actcttgtgg tttcacattt cttgtctcac ttttggaaga gaaacagtta 1200

tagagtattt ggtgtctttc ggagtgtgga ttcgcactcc tccagcttat agaccaccaa 1260

atgcccctat cctatcaaca cttccggaga ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc 1320

ctagaagaag aactccctcg cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat 1380

ctcaatctcg ggaatctcaa tgttagtatt ccttggactc ataaggtggg gaactttact 1440

gggctttatt cttctactgt acctgtcttt aatcctcatt ggaaaacacc atcttttcct 1500

aatatacatt tacaccaaga cattatcaaa aaatgtgaac agtttgtagg cccactcaca 1560

gttaatgaga aaagaagatt gcaattgatt atgcctgcca ggttttatcc aaaggttacc 1620

aaatatttac cattggataa gggtattaaa ccttattatc cagaacatct agttaatcat 1680

tacttccaaa ctagacacta tttacacact ctatggaagg cgggtatatt atataagaga 1740

gaaacaacac atagcgcctc attttgtggg tcaccatatt cttgggaaca agatctacag 1800

catggggcag aatctttcca ccagcaatcc tctgggattc tttcccgacc accagttgga 1860

tccagccttc agagcaaaca ccgcaaatcc agattgggac ttcaatccca acaaggacac 1920

ctggccagac gccaacaagg taggagctgg agcattcggg ctgggtttca ccccaccgca 1980

cggaggcctt ttggggtgga gccctcaggc tcagggcata ctacaaactt tgccagcaaa 2040

tccgcctcct gcctccacca atcgccagtc aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc 2100

tttgagaaac actcatcctc aggccatgca gtggaattcc acaaccttcc accaaactct 2160

gcaagatccc agagtgagag gcctgtattt ccctgctggt ggctccagtt caggaacagt 2220

aaaccctgtt ctgactactg cctctccctt atcgtcaatc ttctcgagga ttggggaccc 2280

tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg attcctagga ccccttctcg tgttacaggc 2340

ggggtttttc ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac 2400

ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac 2460

ctccaatcac tcaccaacct cttgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct 2520

gcggcgtttt atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct 2580

tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcct caacaaccag 2640

cacgggacca tgccggacct gcatgactac tgctcaagga acctctatgt atccctcctg 2700

ttgctgtacc aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc 2760

tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt 2820

gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat 2880

gatgtggtat tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc 2940

aattttcttt tgtctttggg tatacattta aaccctaaca aaacaaagag atggggttac 3000

tctctaaatt ttatgggtta tgtcattgga tgttatgggt ccttgccaca agaacacatc 3060

atacaaaaaa tcaaagaatg ttttagaaaa cttcctatta acaggcctat tgattggaaa 3120

gtatgtcaac gaattgtggg tcttttgggt tttgctgccc cttttacaca atgtggttat 3180

cctgcgttga tgcctttgta tgcatgtatt caatctaagc aggctttcac tttctcgcca 3240

acttacaagg cctttctgtg taaacaatac ctgaaccttt accccgttgc ccggcaacgg 3300

ccaggtctgt gccaagtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggctt ggtcatgggc 3360

catcagcgca tgcgtggaac cttttcggct cctctgccga tccatactgc ggaactccta 3420

gccgcttgtt ttgctcgcag caggtctgga gcaaacatta tcgggactga taactctgtt 3480

gtcctatccc gcaaatatac atcgtttcca tggctgctag gctgtgctgc caactggatc 3540

ctgcgcggga cgtcctttgt ttacgtcccg tcggcgctga atcctgcgga cgacccttct 3600

cggggtcgct tgggactctc tcgtcccctt ctccgtctgc cgttccgacc gaccacgggg 3660

cgcacctctc tttacgcgga ctccccgtct gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac 3720

ttcgcttcac ctctgcacgt cgcatggaga ccaccgtgaa cgcccaccaa atattgccca 3780

aggtcttaca taagaggact cttggactct cagcaatgtc aacgaccgac cttgaggcat 3840

acttcaaaga ctgtttgttt aaagactggg aggagttggg ggaggagatt aggttaaagg 3900

tctttgtact aggaggctgt aggcataaat tggtctgcgc accagcacca tgcaactttt 3960

tcacctctgc ctaatcatct cttgttcatg tcctactgtt caagcctcca agctgtgcct 4020

tgggtggctt tggggcatgg acatcgaccc ttataaagaa tttggagcta ctgtggagtt 4080

actctcgttt ttgccttctg acttctttcc ttcagtacga gatgctagcc cggg 4134

<210> 2

<211> 6364

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 2

aattccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60

gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttctga ctactgcctc tcccttatcg 120

tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180

ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240

ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300

cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaact 360

tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420

ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480

ctaattccag gatcctcaac aaccagcacg ggaccatgcc ggacctgcat gactactgct 540

caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600

tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660

cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720

actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780

ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840

ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 900

atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 960

ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 1020

ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 1080

ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140

acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200

ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 1260

tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320

acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 1380

tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440

cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500

gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560

cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620

cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 1680

aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740

gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800

ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860

actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1920

aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980

gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040

cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 2100

actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag cgtctagaga cctagtagtc 2160

agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 2220

tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2280

cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggagact 2340

actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400

aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460

ttggactcat aaggtgggga actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520

tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580

atgtgaacag tttgtaggcc cactcacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2640

gcctgccagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2700

ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2760

atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820

accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880

tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacacc gcaaatccag 2940

attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000

cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060

agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagtcag 3120

gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180

ggaattccac aaccttccac caaactctgc aagatcccag agtgagaggc ctgtatttcc 3240

ctgctggtgg ctccagttca ggaacagtaa accctgttct gactactgcc tctcccttat 3300

cgtcaatctt ctcgaggatt ggggaccctg cgctgaacat ggagaacatc acatcaggat 3360

tcctaggacc ccttctcgtg ttacaggcgg ggtttttctt gttgacaaga atcctcacaa 3420

taccgcagag tctagactcg tggtggactt ctctcaattt tctaggggga actaccgtgt 3480

gtcttggcca aaattcgcag tccccaacct ccaatcactc accaacctct tgtcctccaa 3540

cttgtcctgg ttatcgctgg atgtgtctgc ggcgttttat catcttcctc ttcatcctgc 3600

tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc tggactatca aggtatgttg cccgtttgtc 3660

ctctaattcc aggatcctca acaaccagca cgggaccatg ccggacctgc atgactactg 3720

ctcaaggaac ctctatgtat ccctcctgtt gctgtaccaa accttcggac ggaaattgca 3780

cctgtattcc catcccatca tcctgggctt tcggaaaatt cctatgggag tgggcctcag 3840

cccgtttctc ctggctcagt ttactagtgc catttgttca gtggttcgta gggctttccc 3900

ccactgtttg gctttcagtt atatggatga tgtggtattg ggggccaagt ctgtacagca 3960

tcttgagtcc ctttttaccg ctgttaccaa ttttcttttg tctttgggta tacatttaaa 4020

ccctaacaaa acaaagagat ggggttactc tctaaatttt atgggttatg tcattggatg 4080

ttatgggtcc ttgccacaag aacacatcat acaaaaaatc aaagaatgtt ttagaaaact 4140

tcctattaac aggcctattg attggaaagt atgtcaacga attgtgggtc ttttgggttt 4200

tgctgcccct tttacacaat gtggttatcc tgcgttgatg cctttgtatg catgtattca 4260

atctaagcag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc tttctgtgta aacaatacct 4320

gaacctttac cccgttgccc ggcaacggcc aggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac 4380

ccccactggc tggggcttgg tcatgggcca tcagcgcatg cgtggaacct tttcggctcc 4440

tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt gctcgcagca ggtctggagc 4500

aaacattatc gggactgata actctgttgt cctatcccgc aaatatacat cgtttccatg 4560

gctgctaggc tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg tcctttgttt acgtcccgtc 4620

ggcgctgaat cctgcggacg acccttctcg gggtcgcttg ggactctctc gtccccttct 4680

ccgtctgccg ttccgaccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggact ccccgtctgt 4740

gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg catggagacc 4800

accgtgaacg cccaccaaat attgcccaag gtcttacata agaggactct tggactctca 4860

gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag 4920

gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag gcataaattg 4980

gtctgcgcac cagcaccatg caactttttc acctctgcct aatcatctct tgttcatgtc 5040

ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac atcgaccctt 5100

ataaagaatt tggagctact gtggagttac tctcgttttt gccttctgac ttctttcctt 5160

cagtacgaga tcttctagat accgcctcag ctctgtatcg ggaagcctta gagtctcctg 5220

agcattgttc acctcaccat actgcactca ggcaagcaat tctttgctgg ggggaactaa 5280

tgactctagc tacctgggtg ggtgttaatt tggaagatcc agcgtctaga gacctagtag 5340

tcagttatgt caacactaat atgggcctaa agttcaggca actcttgtgg tttcacattt 5400

cttgtctcac ttttggaaga gaaacagtta tagagtattt ggtgtctttc ggagtgtgga 5460

ttcgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatcaaca cttccggaga 5520

ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc ctagaagaag aactccctcg cctcgcagac 5580

gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat ctcaatctcg ggaatctcaa tgttagtatt 5640

ccttggactc ataaggtggg gaactttact gggctttatt cttctactgt acctgtcttt 5700

aatcctcatt ggaaaacacc atcttttcct aatatacatt tacaccaaga cattatcaaa 5760

aaatgtgaac agtttgtagg cccactcaca gttaatgaga aaagaagatt gcaattgatt 5820

atgcctgcca ggttttatcc aaaggttacc aaatatttac cattggataa gggtattaaa 5880

ccttattatc cagaacatct agttaatcat tacttccaaa ctagacacta tttacacact 5940

ctatggaagg cgggtatatt atataagaga gaaacaacac atagcgcctc attttgtggg 6000

tcaccatatt cttgggaaca agatctacag catggggcag aatctttcca ccagcaatcc 6060

tctgggattc tttcccgacc accagttgga tccagccttc agagcaaaca ccgcaaatcc 6120

agattgggac ttcaatccca acaaggacac ctggccagac gccaacaagg taggagctgg 6180

agcattcggg ctgggtttca ccccaccgca cggaggcctt ttggggtgga gccctcaggc 6240

tcagggcata ctacaaactt tgccagcaaa tccgcctcct gcctccacca atcgccagtc 6300

aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc tttgagaaac actcatcctc aggccatgca 6360

gtgg 6364

<210> 3

<211> 7081

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aattcctctt catcctgctg 180

ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 240

ctaattccag gatcctcaac caccagcacg ggaccatgcc gaacctgcat gactactgct 300

caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 360

tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 420

cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 480

actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 540

ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 600

ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc tgaattttat gggttatgtc attggaagtt 660

atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 720

ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 780

ctgccccatt tacacaatgt ggttatcctg cgttaatgcc cttgtatgca tgtattcaat 840

ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 900

acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 960

ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcgtgcg tggaaccttt tcggctcctc 1020

tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1080

acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc 1140

tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1200

cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1260

gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1320

cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1380

cgtgaacgcc caccgaatgt tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctctgc 1440

aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1500

gttgggggag gagattagat taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1560

ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1620

actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1680

aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1740

gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 1800

cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 1860

actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag catctagaga cctagtagtc 1920

agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 1980

tgtctcactt ttggaagaga aaccgttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2040

cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggaaact 2100

actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2160

aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aacctcaatg ttagtattcc 2220

ttggactcat aaggtgggga actttactgg tctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2280

tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2340

atgtgaacag tttgtaggcc cacttacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2400

gcctgctagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2460

ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2520

atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2580

accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2640

tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacaca gcaaatccag 2700

attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 2760

cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 2820

agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagacag 2880

gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 2940

ggaattccac aacctttcac caaactctgc aagatcccag agtgagaggc ctgtatttcc 3000

ctgctggtgg ctccagttca ggagcagtaa accctgttcc gactactgcc tctcccttat 3060

cgtcaatctt ctcgaggatt ggggaccctg cgctgaacat ggagaacatc acatcaggat 3120

tcctaggacc ccttctcgtg ttacaggcgg ggtttttctt gttgacaaga atcctcacaa 3180

taccgcagag tctagactcg tggtggactt ctctcaattt tctaggggga actaccgtgt 3240

gtcttggcca aaattcgcag tccccaacct ccaatcactc accaacctcc tgtcctccaa 3300

cttgtcctgg ttatcgctgg atgtgtctgc ggcgttttat catcttcctc ttcatcctgc 3360

tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc tggactatca aggtatgttg cccgtttgtc 3420

ctctaattcc aggatcctca accaccagca cgggaccatg ccgaacctgc atgactactg 3480

cttgtacaaa gtgggaattc cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg 3540

actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct 3600

ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg 3660

ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact 3720

gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc 3780

gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc 3840

cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag 3900

ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc 3960

ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg 4020

gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg 4080

gccgcctccc cgcatcggga attcctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 4140

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 4200

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 4260

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagagaata 4320

gcaggcatgc tggggagggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 4380

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 4440

ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg caggggcgcc tgatgcggta 4500

ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgtcaaagca accatagtac 4560

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggggtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 4620

acacttgcca gcgccttagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 4680

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 4740

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca 4800

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 4860

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac tctatctcgg gctattcttt tgatttataa 4920

gggattttgc cgatttcggt ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 4980

gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc 5040

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 5100

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 5160

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata 5220

cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 5280

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 5340

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 5400

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 5460

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 5520

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 5580

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 5640

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 5700

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 5760

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 5820

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 5880

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 5940

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 6000

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 6060

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc 6120

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 6180

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 6240

tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 6300

ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 6360

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 6420

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 6480

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 6540

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta 6600

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 6660

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 6720

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 6780

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 6840

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 6900

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 6960

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 7020

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 7080

t 7081

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> HBV 1.2 F

<400> 4

caactttgta tagaacccgc aaatatacat cgtatccatg g 41

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> HBV 1.2 R

<400> 5

cccactttgt acaagatctc gtactgaagg aaagaagtca gaag 44

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> HBV 1.04 F

<400> 6

caactttgta tagaattcct cttcatcctg ctgctatgc 39

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> HBV 1.04 R

<400> 7

cccactttgt acaagcagta gtcatgcagg ttcggc 36

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> HBV ter F

<400> 8

ctgcgttaat gcccttgtat gca 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> HBV ter R

<400> 9

tgcatacaag ggcattaacg cag 23

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> AAV2-HR-F

<400> 10

cttgtacaaa gtgggaattc cgataatcaa c 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> AAV2-HR-R

<400> 11

ttctatacaa agttgtctag aaggaacccc t 31

Claims (7)

1.一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒，其特征在于：将HBV基因组从S基因处断开使得AAV-HBV1.04本身无法支持HBV复制，只有当重组发生产生cccDNA后HBV复制才能发生，所述重组病毒载体质粒序列见SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒的制备方法，其特征在于：扩增AAV载体骨架，以2倍体为模板扩增HBV目的片段，再通过同源重组方法构建到AAV载体质粒中；其中，所述HBV2倍体的核苷酸序列见SEQ ID NO.2，用于扩增AAV载体骨架的引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，用于扩增HBV目的片段的引物序列见SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求2所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒的制备方法，其特征在于：所述重组病毒包装的HBV基因型为D型或A、B、C、E、F、G基因型中的一种。

4.根据权利要求2所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒的制备方法，其特征在于：所述重组病毒为血清型为8型的AAV8重组AAV病毒或者血清型为6型，7型，9型的重组AAV病毒。

5.如权利要求1所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒在制备用于建立HBVcccDNA持续存在慢性感染小鼠模型的制剂中的应用。

6.如权利要求1所述的一种基于S基因断裂的AAV-HBV重组病毒在建立HBV cccDNA持续存在慢性感染小鼠模型中的应用。

7.一种乙肝病毒cccDNA小鼠模型的建立方法，其特征在于：将权利要求1中所述的重组病毒载体质粒通过三质粒共转染法转染293T细胞体外包装生产重组AAV-HBV1.04病毒，用重组AAV-HBV1.04病毒通过尾静脉注射免疫系统正常的C57BL/6小鼠形成HBV cccDNA持续存在的HBV慢性感染小鼠模型。

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