KR102027400B1

KR102027400B1 - 정의된 항원에 대한 보호 체액성 면역 반응을 형성하는 재조합 효모를 이용한 예방 접종

Info

Publication number: KR102027400B1
Application number: KR1020147019123A
Authority: KR
Inventors: 카린 브로이니히; 스벤-에리크 베렌스
Original assignee: 베로백신즈 게엠베하
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2019-10-04
Also published as: JP2015507472A; BR112014014390A2; WO2013107436A8; CN104428417B; US11065312B2; RU2630620C2; DE112012005213A5; US20150190486A1; EP2844759A1; DE102011121069A1; DK2844759T3; CA2859231C; JP6313215B2; EP2844759B1; CA2859231A1; ZA201405034B; PL2844759T3; BR112014014390B1; WO2013107436A1; RU2014127435A

Abstract

본 발명은 정의된 항원에 대한 체액성 면역 반응을 형성하기 위한 클루이베로마이세스 락티스 종(Kluyveromyces lactis species)의 재조합 효모, 이와 같은 재조합 효모의 제조 그리고 정의된 항원을 함유하는 악성 세포 및 병원체에 대한 보호적인 예방 접종을 위해 상기와 같은 효모를 사용하기 위한 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.

Description

정의된 항원에 대한 보호 체액성 면역 반응을 형성하는 재조합 효모를 이용한 예방 접종 {VACCINATION BY MEANS OF RECOMBINANT YEAST BY PRODUCING A PROTECTIVE HUMORAL IMMUNE RESPONSE AGAINST DEFINED ANTIGENS}

본 발명은 정의된 항원에 대한 체액성 면역 반응을 형성하기 위한 재조합 효모, 이와 같은 재조합 효모의 제조 그리고 정의된 항원을 함유하는 악성 세포 및 병원체에 대한 보호적인 예방 접종을 위해 상기와 같은 효모를 사용하기 위한 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.

백신은 질병을 예방하거나(예방 접종제) 확정된 질병을 치료하기 위해서(면역 치료 접종제) 사용된다. 예방 접종 프로그램은 최근 약 100년 사이에 감염 질병을 줄이는 데 중대한 기여를 하고 있다. 면역 치료 접종제는 겨우 약 20년 전부터 개발되어 사용되고 있는데, 말하자면 바이러스, 박테리아 혹은 기생충에 의한 지속적인 감염을 치료하거나 발암 물질에 의한 발병을 막기 위해서 개발되어 사용되고 있다. 접종의 목적은 세포성(즉, 실제로 T- 및 NK-세포 매개성) 및/또는 체액성(즉, 실제로 B-세포/항체-매개성) 면역 반응의 유도 그리고 병원체 또는 악성 (종양 유전자) 세포의 항원 성분에 대한 면역 기억(immunological memory)의 유도이다.

전통적인 백신은 유전 물질, 즉 DNA 또는 RNA 형태의 핵산을 포함하는, 독소가 약화된(비활동성) 또는 사멸된 형태의 모든 병원체를 함유한다. 이와 같은 전통적인 접종제는 제조를 위해서 대부분 특별한 안전 예방 조치 및/또는 실험 동물의 사용 및/또는 세포 배양의 사용을 필요로 한다; 또한, 전통적인 접종제는 많은 비용을 투자해서 그리고 저온 유통 체계(cold chain)를 사용해서 저장 및 운송해야만 하는 경우가 많다. 그밖에, 상기와 같은 전통적인 접종제는 접종된 개체 내에서의 제조로부터 (예컨대 실험 동물 또는 세포 배양으로부터) 얻어진 물질이 부작용을 발생하거나 병원체의 바람직하지 않은 재활성화(reactivation)를 야기할 수 있는 위험을 내포하고 있다. 진단에도 문제점들이 존재한다: 말하자면, 예를 들어 가축을 접종하는 경우에 접종된 동물은 자연적으로 감염된 동물과 구별될 수가 없어서, 결과적으로 새로운 감염의 검출을 토대로 하는 조기 경보 시스템의 작동이 실패할 수 있다. 그렇기 때문에, 단지 병원체 부분만을 함유하는 소위 "서브유닛( subunit )" 백신이 개발되었다. 그에 대한 전제 조건은 개별 병원체의 "주요 항원"이 공지되어 있다는 것이다. 주요 항원은 대부분 면역 체계에 의해서 검출될 수 있는 병원체의 표면 성분인데, 예를 들면 바이러스 막(viral envelope)의 단백질 또는 바이러스-캡시드(capsid)의 단백질이다. 이들은 완전한 바이러스 입자가 부재한 경우에도 숙주 내에서 바이러스에 대항하는 체액성의 그리고/또는 세포성의 면역 반응 및 면역 기억을 유도할 수 있다. 다시 말해 "서브유닛 예방 접종"의 경우에는 병원체의 전형적인 성분들이 결여되기 때문에, 감별 진단(differential diagnosis)에 의해 예방 접종된 개체가 자연적으로 감염된 개체와 구별될 수 있다; 그렇기 때문에 "서브유닛 마커 백신(marker vaccine)"이라고도 불린다. 다수의 서브유닛 백신의 단점은 제조 과정이 대체로 복잡하고 면역원성(immunogenicity)이 불충분한 경우가 많다는 것이다: 병원체 자체는 (전술된 제약들에 의해서) 효율적으로 증식될 수 있는 한편, 병원체의 주요 항원은 비용 집약적이고 대부분 비효율적인 방법에 의해서 유전 공학적으로 제조될 수밖에 없으며, 정제 과정도 매우 복잡하다. 이와 같은 방법에 의해서 획득된 서브유닛 백신은 상응하게 민감하고, 또한 냉동된 상태로 저장 및 운송되어야만 하며, 유효 수명이 짧다. 이와 같은 여러 가지 이유에서 대부분의 대량 접종제는 아직도 완전한 병원체를 이용하는 전통적인 원리를 토대로 한다. 예를 들어 넓게 퍼진 가금류 질병 전염성 점액낭염(IBD)에 대한 대부분의 접종제는 현재 대다수가 IBD를 발생시키는 전염성 점액낭염 바이러스(IBDV)의 독소가 약화된 (약해진) 또는 비활동성의 바이러스를 기본으로 한다.

서브유닛 백신에서 상대적으로 더 약한 면역원성의 문제점을 보조 백신의 추가 사용에 의해서 보상하려는 시도가 이루어지고 있다. 보조 백신은 경험적으로 볼 때 면역을 자극하는 것으로 입증된 물질이다. 이 보조 백신은 비-특정적으로 그리고 종종 다소 이해하기 어려운 방식으로 면역 반응을 강화한다. 지금까지는 단지 소수의 보조 백신만이 사람에게 사용하도록 허용되었다. 예를 들어 미국 내에서 사람에 사용하도록 허용된 몇몇 보조제는 알루미늄 염, 수산화알루미늄 및 알루미늄 인산염이다. 하지만, 알루미늄 염-제형은 관련 백신을 저장할 때에 추가의 어려움을 야기한다. 그밖에, 이와 같은 보조 백신은 모든 항원에 충분한 효과를 발휘하는 것은 아니다.

대부분의 서브유닛 백신이 속하는 외래 단백질의 유전 공학적인 제조는 다양한 숙주 세포 내에서 이루어질 수 있다. 장내 세균인 대장균( Escherichia coli ) 이외에 세포 배양시에 증식될 수 있는 포유 동물의 세포, 식물 세포 및 다양한 균류가 숙주 계(host system)로서 확정되었다. 박테리아 및 균류와 같은 미생물 계는 특히 경제적으로 대규모로 배양된다. 효모류인 사카로미세스( Saccharomyces ), 피치아( Pichia ) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)의 효모 세포는 수십 년 이래로 이미 외래 단백질의 발현을 위해서 일상적으로 사용되고 있다. 효모 세포는 박테리아에 비해 진핵 생물(eukaryote)이라는 장점을 갖는데, 다시 말해 효모 세포는 여러 측면에서 동물 세포와 동일하며, 그리고 진핵 생물 단백질이라는 장점도 갖는데, 다시 말해 동물 세포 내에서만 형성되어야 하고/하거나 활동해야 하는 단백질은 효모 내에서 천연 형태로 또는 거의 천연 형태로 경제적으로 제조될 수 있다(Bathurst, 1994; Gellissen & Hollenberg, 1997). 우선 효모는 단지 외래 단백질의 생성을 위해서만 사용되었고, 단백질은 효모 세포로부터 정제되어 서브유닛 백신으로서 사용되었다. 비로소 얼마 전부터 효모 자체 또는 효모의 세포 단편을 백신으로서 투여하는 시도가 이루어지고 있다.

약 5년 전부터 사카로미세스 세레비시에( Saccharomyces cerevisiae )("빵 효모", S. cerevisiae) 자체를 예방 접종에 사용하려는 시도가 이루어지고 있다: 따라서, S. cerevisiae의 피하 투여 방식으로 적용된 항원-발현성 세포에 의해서 수지상(dendritic) 세포가 활동하게 되고, 정의된 항원에 대해 항원-특정의 T-세포 면역 반응, 특별히 세포 독성 T-세포 반응을 발생시킬 수 있다는 사실이 나타날 수 있었다. 이와 같은 세포 면역 반응은 정의된 종양 세포의 투여에 대하여 보호적이라고 입증되었는데, 다시 말해 예방 접종된 동물에서 예방 접종 후에는 대조 동물에서보다 적은 종양이 생성되었다. 이와 같은 방법은 현재 종양 질병에 면역 치료 방식을 적용하는 예에서도 테스트 되고 있다(Stubbs 외, 2001; Lu 외, 2004).

당업자에게는 효모를 기본으로 하는 예방 접종과 관련된 내용이 기술되어 있는 다음과 같은 출처가 선행 기술로부터 공지되어 있다:

일련의 미국 특허, 말하자면 예컨대 20090304741호, 5830463호 및 10738646호 및 20070166323호는 하나 이상의 재조합 항원을 함유하는 S. cerevisiae를 면역 치료에 사용하는 내용을 기술하고 있다. 드러난 사실은, 상기 효모는 면역 반응, 특히 세포 매개성 면역 반응을 자극하기 위해서 작용한다는 것이다.

WO/2006/044923호는, C형 간염 바이러스(HCV)의 다양한 단백질을 재조합 방식으로 발현시키고 상기 HCV 단백질에 대한 면역 반응, 다른 무엇보다도 T-세포 반응을 야기할 수 있으며 만성적인 C형 간염에 대한 백신으로서 사용되어야만 하는 효모(S. cerevisiae)를 기술하고 있다.

WO/2007/092792호는 인플루엔자 바이러스-감염에 대한 재조합 S. cerevisiae의 사용 가능성을 기술하고 있으며, 이 경우에는 다양한 효모 균주의 조합이 이용되고, 이들의 적용은 T-세포 유도, 더 상세하게 말하자면 세포 면역 반응을 야기한다.

WO/2011/032119호는 효모를 기본으로 하는 면역 치료가 환자 내에서 발생시키는 효과를 개선하기 위한 방법과 관련이 있다. 이 방법은 효모를 기본으로 하는 제제, 즉 CD4+ TH17 세포의 생성 또는 생존 능력을 조절하는 제제를 포함한다.

이용 가능한 특허들 중에 어떤 특허에서도 효모가 감염 질병 또는 종양에 대한 보호적인 체액성 면역 반응을 유도하기에 적합하다고 입증되어 있지 않다(본 출원서의 주제). 또한, 효모 Saccharomyces cerevisiae 또는 Pichia pastoris가 사용되었지만, Kluyveromyces lactis는 사용되지 않았다(본 출원의 주제).

S. cerevisiae와 마찬가지로, "유산균 효모"인 Kluyveromyces lactis (K. lactis)도 GRAS 상태[GRAS: 일반적으로 안전한 것으로 간주 되는 상태(Generally Regarded As Safe)]를 갖는데, 다시 말해 이 유산균 효모는 동물 또는 사람에게 적용하기에 적합하다(van Ooyen 외, 2006). 형태학적으로는 빵 효모인 S. cerevisiae와 매우 유사하지만 상기 두 가지 종의 개발 방향은 1억 년 이상 전에 공통된 전구체로부터 상이한 방향으로 개발되었다. 그렇기 때문에 K. lactis는 여러 가지 특성에서 기본적으로 S. cerevisiae와 구별된다. 이러한 차이점들 중에 몇 가지는 생명공학 기술적인 적용 예에서의 사용 가능성을 위해 큰 중요성을 갖는다. S. cerevisiae의 진화(evolution)는 알코올 발효에 대한 재료 교체의 특수화를 야기했고, 그와 더불어 전구체의 다수 유전자의 손실을 야기했다. 하지만, 알코올 발효는 대부분의 효모에는 전형적이지 않다. 알코올 발효는, 산소가 존재하고 미토콘드리아 호흡이 원래 설탕 변환으로부터 훨씬 더 효율적인 에너지 수득을 가능케 하는 경우에도, S. cerevisiae 내에서 글루코스-농도가 높은 상태에서 이루어진다: 세포의 "발전소"인 미토콘드리아의 기능은 "글루코스-억압(repression)"에 의해서 전반적으로 억제된다. K. lactis는 미토콘드리아 기능의 조절에 있어서 S. cerevisiae와 현저하게 구별된다(Chen and Clark-Walker, 1995, Clark-Walker, 2007). K. lactis는 S. cerevisiae와 달리 소위 "크랩트리 네거티브(crabtree negative)" 효모에 속한다. 이와 같은 효모는 엄격한 호기성 조건 하에서는 일반적으로 에탄올을 형성하지 않고, 오히려 미토콘드리아 활성을 통해 ATP를 형성하면서 글루코스를 완전히 CO₂로 분해한다. 이와 같은 생리학적인 특성은 기본적으로 중요한데, 그 이유는 이러한 특성이 대규모 발효시에 생물체 수득률의 확실한 상승을 야기하기 때문이며, 이와 같은 수득률 상승은 상기와 같은 효모를 재조합 단백질의 생산자로서 이용하는 경우에 비용을 현저하게 낮추어준다. 그밖에, K. lactis에 대한 연구들이 보여준 사실은, 헥소키나아제(hexokinase)-매개성 글루코스-신호 경로 내에서의 돌연변이가 이종성(heterologous) 유전자의 발현을 개선할 수 있다는 것이다(Donnini 외, 2004). 특히 호흡기 유전자로부터의 감소된 글루코스 발현은 "크랩트리 네거티브(crabtree negative)" 효모의 한 가지 특징이며, 상기와 같은 효모 내에서 경험적으로 관찰된 더 양호한 외래 유전자 발현과 관련을 맺고 있다.

K. lactis 및 S. cerevisiae는 또한 세포 벽-글루칸의 구성에 있어서도 현저한 차이점을 갖는다(Backhaus 외, 2011); 이와 같은 차이점들은 추측건대 당단백질의 숙성에 참여한 골지체(golgi apparatus) 내에서의 상이한 글리코실 전이 효소에 기초한다: 따라서, S. cerevisiae 내에 있는 당단백질은 여러 가지 만노오스포스페이트를 함유하고, K. lactis 내에 있는 당단백질은 다른 무엇보다도 말단 N-아세틸글루코사민을 함유한다(Raschke and Ballou, 1972). 가정할 수 있는 사실은, 단백질의 글루코실화 및 분비 작용 그리고 세포 벽 생합성 측면에서 S. cerevisiae와 K. lactis 간의 상기와 같은 차이점들이 세포 내의 국소화(localization), 폴딩(folding) 및 안정성에 그리고 그와 더불어 이종 발현된 외래 단백질의 면역원성에 상당한 영향을 미친다는 것이다(Uccelletti 외, 2004).

WO/2010/054649호는 K. lactis의 재조합 시스템의 제조를 기술하고 있다. 이 간행물에 제시된 적용 예들에서는 균주 VAK367 - D4로부터 유도된 재조합 균주들이 다양한 항원에 대한 점막 또는 경구 예방 접종을 목적으로 사용되었다. 하지만, 경구/점막 예방 접종의 단점은 보호적인 면역화에 도달하기 위해서는 백신이 대량으로 사용되어야만 한다는 것이다.

도면에 대한 설명

도 1은 접종 균주 VAK887의 제조를 개략적으로 보여주고 있으며, 이 접종 균주는 IBDV VP2 외래 유전자를 상동 재조합을 통해 VAK367-D4 출발 균주 내부로 운반한다. IBDV 균주 D78의 VP2 유전자를 함유하는 플라스미드 Klp3-MCS(SEQ ID Nr.: 10)의 형질전환을 통해서 VP2 외래 유전자는 상동 재조합을 통해 염색체 LAC4 내부에 삽입되었으며, 이 염색체는 URA3 유전자의 삽입에 의해 파괴되었다. 숙주 게놈으로의 재조합에서는 URA3 유전자가 VP2 유전자로 대체되었고, LAC4 유전자가 재차 제조되었다; 재조합 효모 균주는 우라실이 없는 락토오스-매질에 대한 선택에 의해 얻어질 수 있었다. 이하에서는 KIGAL80 프로모터(Promotor)를 통한 LAC4(β-갈락토시다아제)의 발현, LAC4 프로모터를 통한 VP2 유전자의 발현이 제어된다.

도 2a는 원형 균주(VAK367)에 비해서 그리고 IBDV에 비해서 균주 VAK887에 의해 감염된 닭 세포 내에서 VP2-정의된 항체를 이용한 웨스턴 분석(Western Analysis)에 의한 IBDV VP2의 발현을 보여주고 있다. 도 2b는 VP2 발현하는 다양한 K. lactis 변이체 내에서 재조합 IBDV VP2 혹은 돌연변이 IBDV VP2-T2S의 발현 분석을 보여주고 있다. 원래의 K. lactis 변이체 VP2(VAK887)는 단지 적당한 양의 바이러스성 단백질만을 발현시킨다. VP2 단백질의 아미노산 위치 2에서 트레오닌이 세린으로 교체됨으로써, VP2 단백질 발현은 균주 K. lactis VP2-T2S(VAK888) 내에서 증가될 수 있다. 추가의 증가는 KIGAL4 유전자 투여량(VP2-T2S_GAL4 = VAK890)을 높임으로써 혹은 효모-코돈 최적화된 합성 VP2 유전자(oVP2-T2S = VAK910)를 사용함으로써 성취될 수 있다.

도 3은 90℃에서 2시간 동안 이루어지는 본 발명에 따른 효모의 열 비활성화가 재조합 VP2-T2S 단백질의 손실을 야기하지 않는다는 사실을 보여주고 있다(도 3a 참조). 비활성화되지 않은 효모, 비활성화된 효모 및 사료 펠릿(pellet)으로부터 얻어낸 효모로 이루어진 각각 동일한 양의 단백질이 SDS PAGE 상에서 분리되었고, IBDV 감염되었거나 감염되지 않은 가금류 세포로부터 얻어진 세포 용해물에 비해 항-VP2-항체를 이용한 웨스턴-블롯(Western Blot)에서 테스트 되었다. 도 3은 또한 변이체 VAK890 내에서 VP2-T2S의 양이 효모 세포당 약 0.7fg의 이종성 단백질에 달한다는 사실도 보여주고 있다(도 3b 참조). 여기에서는 규정된 양의 정제된 VP2-T2S가 발효기 내에서 추출된 K. lactis(균주 VAK890)의 규정된 세포 개수로 이루어진 VP2에 비해 웨스턴-블롯에서 염색되었고 그 결과가 농도계에 의해서 평가되었다.

도 4는 K. lactis 변이체인 VAK890의 피하 투여 방식으로 적용된 완전한 열 비활성화 효모 세포를 갖는 쥐에 실시한 예방 접종을 K. lactis 변이체인 VAK890의 완전한 효모 세포를 갖는 경구 예방 접종과 비교해서 설명하고 있다. 도 4a는 면역화 방식을 보여주고 있다: 각각 2주의 휴지기를 갖고 3회 피하 투여 방식으로 면역화되었다; 비교를 위해 2주 동안 2회 투여되었다. 마지막 효모 적용 2주 후(화살표)에는 처리된 쥐로부터 얻은 혈청 샘플을 IBDV-전용 ELISA에서 테스트하였고(도 4b 참조), 항-VP2 항체의 존재하에 IBDV-중화 검사(neutralisation assay)에서 테스트하였다(도 4c 참조). 도 4d는 VP2-발현하는 K. lactis[균주 KI VP2-T2S_GAL4 (VAK890)]로 처리된 쥐가 K. lactis 야생형(균주 VAK367)으로 처리된 쥐보다 더 높은 역가(titer)의 항체/중화 작용 항체를 구비한다는 내용을 요약적으로 보여주고 있다. 또한, 피하 투여 방식으로 적용된 K. lactis(균주 VAK890)가 K. lactis(균주 VAK890)로 사료 공급된 쥐보다 더 높은 역가의 항체/중화 작용을 하는 항체를 갖는다는 사실도 나타났다. 하지만, K. lactis(균주 890)로 경구 면역화된 쥐는 또한 K. lactis 야생형(균주 VAK367)으로 처리된 쥐에 비해 상승된 역가의 항체/중화 작용 항체도 나타냈다.

도 5는 K. lactis 변이체인 VP2-T2S_GAL4(VAK890)의 완전한 열 비활성화 효모 세포를 갖는 닭에서 실시된 경구 및 피하 투여 방식의 예방 접종을 보여주고 있다. 경구 예방 접종을 위해서는 짧은 1/1/1/1/1 방식(1주 투여, 1주 휴식, 1주 투여 등) 또는 상대적으로 더 긴 2/2/2 방식이 적용되었다(도 5a 참조). 예방 접종 후 1주 혹은 2주의 휴지기 후에는 IBDV(균주 Edgar)를 동물당 100 EID50의 농도로 투여하여 처리된 모든 동물이 감염되었다[바이러스 공격(Virus challenge); 검정색 막대]. 경구 투여 방식의 예방 접종 후, 특히 연장된 처리 방식을 적용한 후에는 다수의 동물에서 상승된 역가의 바이러스-중화 작용 항체가 검출될 수 있었다. 그와 달리 재조합 K. lactis를 이용한 피하 투여 방식의 예방 접종은 처리된 모든 동물에서 높은 역가의 바이러스-중화 작용 항체를 발생시켰다(도 5b, 도 5c 참조; IBDV-전용 ELISA, IBDV-중화 검사). 재조합 K. lactis-효모로 처리된 동물들 중에 어떤 동물도 어느 처리 방식이 적용되었는지와 상관없이 IBDV 감염 후에 죽지 않았다. 그와 반대로 대조군에서 치사율은 10-35%였다(도 5c 참조). 처리된 동물의 점액낭에서 병변을 분석한 결과는, 경구 투여 방식으로 처리된 동물들 중에 약 10%가 연장된 처리 방식을 적용한 다음에 IBDV를 이용한 접종 후에는 바이러스 감염의 징후를 전혀 나타내지 않았다는 것을 보여주었다: 이 경우에는 소위 "병변 스코어(score)"가 사용되었다 - 스코어 1, 2는 손상된 병변을 전혀 유도하지 않거나 거의 유도하지 않는다는 것을 의미하며; 스코어 3, 4는 손상된 병변 및 심하게 손상된 병변을 유도한다는 것을 의미한다. 그와 반대로 재조합 K. lactis 균주 VAK890이 피하 투여 방식으로 적용된 모든 동물은 접종에 의해 IBDV에 대해 완전한 보호 상태를 나타냈다(도 5c 참조).

도 6은 벡터 Klp3-MCS(SEQ ID Nr .: 10)의 구조를 개략적으로 보여주고 있다.

재조합 효모를 피하 투여 방식으로 예방 접종하기 위해 적용할 수 있는 가능성은 선행 기술에서 당업자에게 공지되어 있다: Stubbs 외, (2001) Nat. Med. 7: 625-629; Stubbs and Wilson (2002) curr. Opin. Mol. Ther. 4: 35-40; Wansley 외, (2008) Clin. Cancer Res. 14: 4316-4325; US 5,830,463호, WO/2006/044923호; WO/2007/092792호 및 WO/2011/032119호. 하지만, 이 간행물들의 실시예들에서는 오로지 효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용해서만 작업이 이루어졌다. "효모"란 수억 년의 기간(S. cerevisiae 및 K. lactis에 대해서는 약 1억년)에 걸친 다양한 진화로 인해 부분적으로 매우 다양한 특성을 지니고 단세포 형태로 성장하는 진핵 미생물에 대한 포괄적인 용어이다. 그렇기 때문에, 동물 또는 사람과 같이 더 고등한 진핵 생물에서 예방 접종할 목적으로 S. cerevisiae 및 K. lactis를 사용하는 경우에는 S. cerevisiae에 의해서 야기되는 면역 반응이 K. lactis에 의해서 야기되는 면역 반응과 매우 상이하다는 사실로부터 출발해야만 한다. 이와 같은 사실은 효모 내에서 발현된 외래 항원에 대한 면역 반응에 적용될 뿐만 아니라 효모 고유의 항원에 대한 면역 반응에도 적용된다. 완전한 S. cerevisiae 세포를 이용한 피하 투여 방식의 면역화에서는 T-세포 유도, 다시 말해 세포 면역 반응이 발생 되었다. 간단한 경로로(즉, 개별 항원-발현하는 균주의 직접적인 적용에 의해서) 이루어지는 재조합 항원을 갖는 S. cerevisiae에 대한 보호적인 체액성 면역 반응은 지금까지 선행 기술에 개시되지 않았다.

전술된 배경으로부터 출발하는 본 발명의 과제는, 정의된 항원에 대한 보호적인 체액성 면역 반응을 발생시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 추가의 과제는, 예방 접종된 개체를 자연적으로 감염된 개체에 대하여 구별시키는 것을 가능케 하는 서브유닛 마커 백신을 제조하는 것이다. 또 다른 과제는, 강한 보조 특성을 지니는 동시에 강력한 면역원이 되는 서브유닛 마커 백신을 제조하는 것이다.

상기 과제들은 외래 유전자를 효모 게놈 내에 의도한 바대로 통합시키는 효모-기반 발현 체계를 제공함으로써 해결되었다. 외래 유전자를 발현시키는 재조합 효모는 상기 시스템에 의해서 신속하게(즉, 몇 주 이내에) 제조될 수 있다. 효모는 발효기 내에서 대량으로[예컨대 킬로그램(kg) 범위로] 저렴하게 증식될 수 있다. 유가(Fed-Batch) 방식으로 조절된 발현 및 발효에 의해서는 세포 독성의 항원도 상기 효모 계 내에서 발현될 수 있다. 외래 유전자의 발현 후에는 효모가 열 비활성화되며, 그 다음에는 분말로서 냉동되지 않은 상태로 저장 및 운송될 수 있다. 효모 분말은 직접적으로, 다시 말해 추가의 분별 과정(fractionation) 없이 에멀전 또는 펠릿으로서 (실시예 참조) 서브유닛 마커 백신으로 사용될 수 있다. 항원-제형 및 효과적인, 즉 보호적인 면역화를 위해서 반드시 필요한 보조 효과는 두 가지 인자(factor)에 의해서 보증된다: (ⅰ) 발현된 외래 단백질을 의도한 바대로 유전 공학적으로 변형시킬 수 있는 가능성에 의해서, (ⅱ) 효모 내에서 외래 단백질을 발현시킴으로써 그리고 효모를 경구 혹은 피하 투여 형태로 직접적으로 적용함으로써; 효모 자체가 강력한 보조제 효과를 갖는다. 피하 투여 적용 방식이 바람직하다. 재조합 효모 균주가 제조되었다; 이 재조합 효모 균주는 특정 바이러스 항원을 발현시키고, 본 발명에 따른 방법에서 피하 투여 방식의 예방 접종을 위해 사용될 수 있다. 감염에 대한 완전한 예방적인 보호 효과는 관련 바이러스에 의해서 달성되었다. 이때에는 단지 매우 적은 양[예컨대 가금류에 피하 투여 방식으로 적용하는 경우에는 밀리그램(mg) 범위 안에 있는 양]의 효모가 사용되었다. 단지 2-3회만 적용하고서도 상기와 같은 보호 효과에 도달하였다.

본 발명에 따른 방법은 인체 의학적인 분야에 적용하기 위해서 적합할 뿐만 아니라 수의학적인 분야에 적용하기 위해서도 적합하다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 적용 분야는 수의학 분야이다.

본 발명에 따른 방법은 효모에 의해서 실시된다. 적합한 효모는 예컨대 Saccharomyces 종류, Pichia 종류 및 Kluyveromyces 종류의 효모이다. 바람직한 일 실시예에서 본 발명에 따른 방법은 Saccharomyces 종류 및 Kluyveromyces 종류의 효모를 이용해서 실시된다. 본원에서는 Saccharomyces cerevisiae 및 Kluyveromyces lactis(K. lactis)의 사용이 특히 바람직하다.

가장 바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 방법은 Kluyveromyces lactis를 이용해서 실시된다.

효모 K. lactis는 GRAS 상태[GRAS: 일반적으로 안전한 것으로 간주 되는 상태(generally regarded as safe)]를 갖는 소위 "식품 등급(food grade)"의 효모에 속한다. 식료품 첨가제로서 수천 년에 걸쳐 실험되었고 안전하다고 입증된 빵 효모와 마찬가지로, 유제품에서 자주 대표되는 효모인 K. lactis도 생필품 산업용으로 무해한 것으로 간주 된다.

"선행 기술"에 언급된 발효 가능성 이외에, 효모 K. lactis는 S. cerevisiae에 대하여 이종성 유전자의 발현과 관련해서 다수의 장점을 갖는다. K. lactis는 소위 "쁘띠 네거티브(petite negative)" 효모에 속하는데, 다시 말하자면 미토콘드리아 DNA의 손실이 치명적이다[미토콘드리아 막전위의 파괴로 인해(Chen 외, 1995; Clark-Walker, 2007)]. 미토콘드리아의 기능은 Ca² ⁺-의존성 신호 중개, 반응성 산소 화합물의 생성, 세포의 스트레스 응답, 단백질 글리코실화 및 세포벽 통합성과 밀접하게 결합 되어 있다. 그럼으로써, 미토콘드리아의 기능은 재조합 당단백질의 생성 및 세포 벽의 조성에 결정적인 영향을 미친다.

효모 및 포유 동물의 경우에는 내부 원형질 망상 조직 내에서 이루어지는 단백질 N-글리코실화의 제1 단계가 서로 동일하다. 하지만, 골지체 내에서 이루어지는 단계들은 서로 상이하다. 골지체 내에 존재하는 글리코실 전이 효소들은 상이한 효모 종에 있어서 서로 다르다. 그럼으로써, 세포 벽 내에 있는 당단백질의 조성에서 차이점이 나타난다. K. lactis 내에 당단백질은 S. cerevisiae에서의 만노오스 인산과 달리 말단의 N-아세틸글루코사민을 구비한다(Raschke 및 Ballou, 1972). 이와 같은 사실은 예방 접종의 경우에 개별 효모 종에 의해서 면역 체계를 자극하는 데 현저한 작용을 미칠 수 있다.

변형된 α1,6-만노실 전이 효소(KIOCH1)를 갖는 K. lactis 돌연변이체 내에서 이루어지는 재조합 단백질의 개선된 분비 작용은 단백질 글리코실화/분비 작용과 세포 벽 생합성(Uccelletti 외, 2004) 간의 결합을 명확하게 설명해준다. 단백질 글리코실화 내에서의 변형은 또한 분비 작용 도중에 불완전한 폴딩으로 인해 저지되는 재조합 단백질의 세포 내 국소화에 영향을 미친다.

K. lactis는 락토오스를 탄소원 및 에너지원으로서 이용할 수 있는 몇몇 효모 종류 중의 하나이다. 락토오스는 유장(whey)의 성분으로서 다량으로(예컨대 유제품 산업에서의 부산물로서) 생성되는 값싼 설탕이다. K. lactis는 락토오스에 의해 글루코오스를 사용하는 경우와 유사한 성장률에 도달할 수 있다. 락토오스-재료 교체에 참여하는 유전자의 조절은 집중적으로 검사되었다. 강력한 β-갈락토시다아제 프로모터(LAC4)는 이종성 유전자의 발현을 조절하기 위해서 그리고 재조합 단백질의 생성을 조절하기 위해서 이용될 수 있다. (van Ooyen 외, 2006, Breunig 외, 2000). 글루코오스 억압이 감소 됨으로써, 글루코오스를 함유하는 매질 내에서 배양된 K. lactis 배양균 내에서 이루어지는 유전자의 이종성 발현은 락토오스의 첨가에 의해서 신속하고도 효율적으로 유도될 수 있다.

본 발명에 따라, 유전 공학적인 방법을 통해서 K. lactis 균주, 바람직하게는 VAK367 - D4 및 이 균주의 변이체가 생성되었으며, 상기 균주는 효모 게놈의 LAC4 유전자 자리(locus)에서 외래 유전자의 의도된 통합을 가능케 한다(도 1 참조). 이 통합은 상응하게 구성된 플라스미드를 통한 단 하나의 단계를 필요로 한다; 재조합 균주의 선택은 항생제-내성 유전자를 사용하지 않고서도 가능하며, 재조합 균주 내에서 이루어지는 외래 유전자 발현은 LAC4 프로모터를 통해 매질 내에 락토오스를 첨가함으로써 유도될 수 있다. 외래 유전자가 통합된 K. lactis 세포는 상기 방식을 통해 몇 주 이내에 생성되어 특징을 나타낼 수 있다. 이와 같은 시스템의 두 가지 양상이 매우 중요하다: 한 편으로는 각각 규정된 양의 외래 단백질을 함유하는 효모 세포의 재생 가능한 번식이 가능하다(도 2, 도 3 참조). 다른 한 편으로는 (예를 들어 인플루엔자 항원 헤마글루티닌과 같이) (변형이 용이한) 플라스틱 항원에 대한 예방 접종을 목적으로 사용하는 경우에는, 예를 들면 전국적으로 유행할 가능성이 있는 새로운 인플루엔자 바이러스 균주가 발생할 때 단시간 내에 새로운 효모 균주들이 생성될 수 있다. 이때에는 새롭게 생성된 재조합 K. lactis 균주들이 실험된 균주들과 유사한 특성(예컨대 발효기 내에서의 성장 작용과 관련된 특성)을 지닐 가능성이 크다. KIGal4 전사 촉진제 유전자를 효모 게놈 내부에 추가로 통합함으로써, 외래 유전자의 발현율도 상당히 증가 될 수 있다(Kuger 외, 1990).

추가의 실시예에서 본 발명에 따른 방법은 특별한 K. lactis 균주, 즉 VAK367-D4 및 이 균주의 유도체를 이용해서 실시된다. K. lactis 균주인 VAK367-D4를 토대로 하여 구성되는 일련의 (VAK) 재조합 변이체가 발생 되었다. 일반적으로 상기 변이체는 상당한 양의 외래 단백질 또는 상기 외래 단백질의 도메인(domain) 혹은 이종 단백질 도메인과 통합된 상기 외래 단백질의 도메인을 유도 가능하게 발현시킨다. 이때 사용된 이종 단백질 도메인은 면역 반응(아쥬반트)을 의도한 바대로 자극하기 위해서 이용되거나 효모 세포 내에서 발현된 외래 단백질을 의도한 바대로 구획화(compartmentalization) 하기 위해서 이용된다. 아쥬반트 효과 외에 상기 발현된 외래 단백질의 구획화는 발현의 최적화를 위해서 혹은 발현 생성물의 제형을 위해서 중요하다.

추가의 일 실시예에서 본 발명에 따른 방법은 VAK367 - D4 및 그 유도체를 서브유닛 마커 백신으로 사용하는 방식으로 실시된다. 단지 정의된 단백질 항원(외래 단백질)만을 발현시키는 재조합 K. lactis를 백신으로 사용하는 것은 감별 진단에서 자연적으로 감염된 개체에 대하여 예방 접종된 개체의 구별(discrimination)을 가능케 한다. 상기 재조합 K. lactis 균주들 중에 한 가지(실시예들 참조)는 경구 및 피하 투여 방식의 접종을 위해서 성공적으로 사용되었다. 피하 투여 방식의 적용 예에서는 접종 대상(seed crystal)의 완전한 보호 효과가 얻어졌다.

본 발명의 의미에서 "외래 단백질"로서는 사람 또는 동물 내의 병원체 또는 돌연변이 발암 물질 세포에 대한 보호적인 면역 반응, 바람직하게는 보호적인 체액성 면역 반응을 발생하기에 적합한 모든 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질이 언급되었다. 외래 단백질은 단지 보호적인 면역 반응, 바람직하게는 보호적인 체액성 면역 반응만을 유도할 수 있는 항원이 특징을 나타낸 모든 종류의 질병 원인체 또는 종양으로부터 유래할 수 있다.

바람직한 일 실시예에서 외래 단백질은 단지 보호적인 면역 반응, 바람직하게는 보호적인 체액성 면역 반응만을 유도할 수 있는 항원이 특징을 나타낸 질병 원인체(바이러스, 박테리아, 기생충)로부터 유래한다.

그 예는 다음과 같다:

기생충으로부터 유래하는 외래 단백질

아메리카 구충( Necator americanus ); 십이지장충(Ancylostoma duodenale): ASP 단백질, 헤모글로빈을 분해하는 프로테아제

리슈마니아 ( Leishmania ): gp63, 46 kD 전편모충 ( Promatisgot)-항원, LACK

플라스모듐 ( Plasmodium ): CSP 단백질, CSA-1, CSA-3, EXP1, SSP2, STARP, SALSA, MSP1, MSP2, MSP3, AMA-1, GLURP, Pfs25, Pfs28, Pvs25, Pvs28, Pfs48/45, Pfs230

주혈흡충( Schistosoma ): TP1, Sm23, ShGSTs26 및 28, 파라미오신(paramyosin), 기생 동물-미오신, Sm14

박테리아로부터 유래하는 외래 단백질

결핵균( Mycobakterium tuberculosis ): Ag85A, Hsp65, R8307, 19 kD, 45 kD, 10.4

헬리코박터 파일로리 ( Helicobacter pylori ): VacA, LagA, NAP, hsp, 우레아제, 카탈라아제

그룹 A 연쇄상구균( Strepptococcus ): M, SCPA, 펩티다아제, 외독소 SPEA 및 SPEC, 피브로넥틴 결합 단백질( Fibronectin binding protein )

연쇄상구균 폐렴( Strepptococcus pneumonia ): PspA, Psa A, BHV 3, BHV 4

쥐티푸스균 ( Salmonella typhimurium ): Vi 항원

이질균( Shigella ): LPS

비브리오 콜레라( Vibrio cholera ): CTB

대장균( Escherichia coli ) ETEC: LT, LT-ST, CTB

페스트균( Yersinia pestis ): F1, V

종양 세포/종양으로부터 유래하는 외래 단백질(종양-관련 항원, TAA )

CEA

5T4

MUC1

MART1

HER-2

바이러스로부터 유래하는 외래 단백질이 특히 바람직하다.

칼리시비리다에 ( Caliciviridae ) (Norwalk, HEV): NV 60 kD; HEV ORF2

레오비리다에 ( Reoviridae ) (Rota): VP7, VP4

레트로비리다에 ( Retroviridae ) (HIV); Gag, Pol, Nef, Env, gp160, gp120, gp140, gp41

플라비비리다에 ( Flaviviridae ) (genus Flavivirus: WNV, Dengue, YF, TBE, JEV): preM-Env, NS3, NS4, NS5

플라비비리다에 ( Flaviviridae ) (genus Pestivirus BVDV, CSFV, BDV. Genus Hepacivirus HCV): E1, E2, E^RNS (Pesti), C, NS3, NS4, NS5

헤파드나비리다에 ( Hepadnaviridae ) (HBV): HBS 항원

파라믹소비리다에 ( Paramyxoviridae ) [파라믹소비리나에( Paramyxovirinae ): PIV-1, PIV-2, 볼거리, Sendai, PIV-2, PIV-4, 홍역]: M, HN, N, F

파라믹소비리다에 ( Paramyxoviridae ) [ 뉴모비리나에(Pneumovirinae ): RSV]: F, G, SH, M

라브도비리다에 ( Rhabdoviridae ) (Rabies): G

헤르페스비리다에 ( Herpesviridae ) (EBV, HSV2): gp350/220 (EBV), gB2, gD2 (HSV)

코로나비리다에 ( Coronaviridae ) (SARS): CoV, N, M, S

오르토믹소비리다에 ( Orthomyxoviridae ) (인플루엔자 A, B): HA, NA, M1, M2, NP

파필로마비리다에 ( Papillomaviridae ): L2, E6, E7

본 발명의 가장 바람직한 실시예에서, 외래 단백질은 예컨대 IBD-바이러스와 같은 비르나비리다에 ( Birnaviridae ) 과에 속하는 대표 바이러스로부터 유래하며, 보호적인 면역 반응, 바람직하게는 보호적인 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 K. lactis VAK367 - D4 변이체 VP2(VAK887)가 발생 되었으며, 이는 전염성 점액낭염 바이러스(IBDV 균주 D78)의 캡시드-형성 VP2-항원을 외래 단백질로서 발현시킨다(SEQ ID NR .: 1 및 2). K. lactis VAK367 - D4 변이체 VP2-T2S(VAK888)이 특히 바람직한데, 이 경우에는 VP2 단백질이 아미노산 위치 2에서 돌연변이되었으며[트레오닌을 세린으로 교체; Jagadish 외 (1991)], SEQ ID NR .: 3 및 4에 따른 뉴클레오티드- 혹은 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 특히 바람직한 일 실시예에서는 최적화된 K. lactis VAK367 - D4 변이체인 VP2-T2S_GAL4가 발생 되었으며, 이 경우에 VP2 단백질은 아미노산 위치 2에서 돌연변이되었으며(SEQ ID NR .: 3 및 4), 추가로 2개 이상의 KIGAL4 유전자를 함유한다(VAK890). K. lactis VAK367 - D4 변이체인 oVP2-T2S가 특히 바람직하며, 이 경우에는 돌연변이된 VP2-항원이 SEQ ID NR .: 5를 갖는 효모 코돈-최적화된 뉴클레오티드산 서열에 의해서 코딩되거나, 재조합에 의해 발현되고 돌연변이된 VP2 항원이 SEQ ID NR.: 6에 따른 아미노산 서열을 갖는다. 최적화된 K. lactis oVP2-T2S_GAL4 변이체(VAK911)는 다음과 같은 장점을 갖는다:

- 돌연변이에 의해서 외래 단백질이 추가로 안정화되었다.

- 전사 촉진제의 초과 발현에 의해서 그리고/또는 서열의 코돈-최적화에 의해서 VP2 발현의 뚜렷한 증가에 도달할 수 있었다(도 2 참조).

- 추가 KIGAL4 유전자의 통합이 상기 K. lactis 변이체의 더 높은 성장률과 상관 관계를 맺게 되었다.

- 상기 K. lactis 변이체는 고-세포 밀도 발효에 있어서 그리고 발현된 VP2 단백질 양에 있어서 특히 높은 재생 가능성을 갖는다(도 3 참조).

본 발명에 따라 형성되었고 외래 단백질로서 IBDV의 돌연변이된 VP2-항원을 재조합에 의해 발현하고 KIGAL4 전사 프로모터의 추가 복사체(copy)를 함유하는 K. lactis VP2-T2S_GAL4 변이체(VAK890)은 2011년 11월 29일에 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베에 소재하는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)에서 부다페스트 조약에 상응하게 DSM 25405번으로 기탁되었다.

본 발명에 따라 형성되었고 외래 단백질로서 IBDV의 돌연변이되고 코돈-최적화된 VP2-항원을 재조합에 의해 발현하는 K. lactis oVP2-T2S 변이체(VAK910)는 2011년 11월 29일에 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베에 소재하는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)에서 부다페스트 조약에 상응하게 DSM 25406번으로 기탁되었다.

본 발명에 따라 형성되었고 외래 단백질로서 IBDV의 돌연변이되고 코돈-최적화된 VP2-항원을 재조합에 의해 발현하고 KIGAL4 전사 프로모터의 추가 복사체를 함유하는 K. lactis oVP2-T2S 변이체(VAK911)는 2011년 11월 29일에 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베에 소재하는 소재하는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)에서 부다페스트 조약에 상응하게 DSM 25407번으로 기탁되었다.

추가의 일 실시예는 본 발명에 따른 재조합 효모를 보호적인 면역화, 특히 보호적인 체액성 면역화의 발생을 위한 방법에 사용하는 재조합 효모의 용도와 관련이 있다.

이와 같은 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:

a) 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 및 증식 단계,

b) 효모의 수거 및 비활성화 단계,

c) 재조합 효모를 결정될 면역 방식에 따라 적용하는 단계,

d) 형성된 항체의 역가 결정 단계, 및/또는

e) 면역화 입증 단계.

본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 및 증식은 종래 방식으로 이용할 수 있는 모든 방법으로 이루어질 수 있다. 본원에서는 경제적이면서도 높은 세포 수득률을 야기하는 방법이 특히 바람직하다. 이와 같은 방법에는 발효 방법, 특히 고-세포 밀도 발효 방법이 속한다. 유가( fed - batch ) 방식의 발효 프로토콜을 적용해서 발효를 실시하는 것이 특히 바람직한 것으로 입증되었다.

바람직한 일 실시예에서는, 재조합 효모가 경구/점막 또는 피하 투여 방식으로 적용됨으로써 보호적인 체액성 면역화에 도달하게 된다. 본 발명의 특히 바람직한 일 실시예에서는 제조합성 효모가 피하 투여 방식으로 적용된다. 본 발명에 따른 방법에서 특히 바람직한 것은 K. lactis, 특별히 유전 공학적으로 변형된 변이체인 VAK367 - D4 및 이로부터 유도된 변이체인 VAK890 및 그의 변이체를 피하 투여 방식의 적용을 위해서 사용하는 것이다.

재조합 효모 세포는 본 발명에 따른 방법에서 비활성 상태로/사멸된 상태로 사용되어야만 한다. 이 목적을 위하여 효모는 외래 유전자의 배양 및 발현 후에 건조된 다음에 이어서 비활성화된다. 상기 효모의 비활성화는 종래 방식으로 이용할 수 있는 모든 방법에 의해서 실시될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 적용하기에 특히 적합한 것은 열 비활성이다(예컨대 90℃에서 2시간 동안의 열 비활성화).

경구/점막 투여 방식의 예방 접종을 위해서는 예를 들어 짧은 1/1/1/1 면역 방식(1주 투여, 1주 휴식, 1주 투여 등) 또는 상대적으로 더 긴 2/2/2 방식(2주 투여, 2주 휴식, 2주 투여 등)이 적용될 수 있다. 피하 투여 방식의 예방 접종을 위해서는 예를 들어 각각 2주의 간격을 두고서 2배 또는 3배로 적용하는 방식이 사용될 수 있다(도 4 및 도 5 참조).

실시된 면역화를 입증하기 위하여 종래의 모든 방법들이 이용된다. 본 발명의 일 실시예에서는 면역화를 입증하기 위하여 바이러스-중화 작용 항체의 역가를 테스트한다. 이 목적을 위하여 예컨대 전용 ELISA-테스트 또는 중화 검사가 실시될 수 있다. 중화 검사에서는 규정된 개수의 IBD-바이러스가 면역화된 동물 또는 대조 동물의 규정된 양의 혈청과 혼합된다. 후속해서 상기와 같이 처리된 세포 배양 바이러스에 의해 감염의 억제(중화)에 대하여 테스트 된다. 면역화가 성공적으로 이루어졌는지의 여부는 "공격" 실험에서도 검사될 수 있는데, 예를 들면 "바이러스 공격" 실험에서 검사될 수 있다. 이 목적을 위하여, 처리된 동물에게 병원체 미생물 또는 바이러스의 투여량(dose)이 투여되며, 이와 같은 투여량은 통상 면역화되지 않은 동물에서는 질병을 야기할 수 있다. 상기와 같은 공격( challenge ) 후에 동물에게서 발병이 이루어지지 않으면, 성공적으로 이루어진 면역화에 대한 증거가 제시된다(도 5 참조). 마지막으로, 면역화의 증거는 면역 조직 화학법에 의해서도 제시될 수 있다. 이와 같은 방법에서는 공격( challenge ) 후에 병원체의 표적 기관이 감염 또는 병변에 대해서 검사된다(도 5 참조).

본 발명에 따르면, 각각 VAK367 - D4로부터 유도된 재조합 K. lactis 변이체는 피하 투여 방식의 적용에 의해서 예방 접종에 성공적으로 사용될 수 있었다는 사실이 나타났다. 실시예들에서 구현된 균주-변이체인 VAK890은 전염성 점액낭염 바이러스(IBDV; 균주 D78)의 VP2-항원을 발현시킨다. IBDV의 VP2로서는 바이러스성 캡시드-형성 단백질이 사용된다. VP2를 위해서는, 상기 항원에 대한 체액성 면역 반응의 개시가 관련 바이러스(IBDV)에 의한 후속적인 감염 전에 감염된 유기체를 예방적으로 보호하기에 충분하다는 사실이 공지되어 있다. 효과적인 체액성 면역 반응의 개시는 한 편으로는 바이러스-중화 작용 항체의 정량(quantificating)을 통해서 유도될 수 있다. 다른 한 편으로, 보호적인 면역 반응에 대한 증거는 "바이러스-공격-실험" 및 바이러스-공격( challenge ) 후의 면역 조직 화학법을 통해서 제시되었다. 본 발명에 따라, 상기와 같은 재조합 K. lactis 혹은 균주 VAK367-D4로부터 출발하는 재조합 K. lactis는 피하 투여 방식의 적용 예에서 효과적으로 작용하는, 즉 90-100%까지 보호할 수 있는 백신(90-100%는 예방 접종에서 "골드-스탠더드(Gold-Standard)"에 상응함)으로서 인정받았다(도 4 및 도 5 참조). 따라서, 재조합 K. lactis 혹은 균주 VAK367-D4로부터 출발하는 재조합 K. lactis는 예컨대 바이러스와 같은 감염 요인에 대한 "서브유닛"-마커 백신으로서 인정되었다. 다시 말해, 항원으로서는 일 바이러스의 소수의 면역원 단백질 서브유닛이 사용되었다. "서브유닛" 마커 백신으로서의 사용은 이와 같은 사용이 예방 접종된 유기체를 예방 접종되지 않은 감염된 유기체로부터 구별하는 것을 가능하게 한다는 내용을 암시한다. 이와 같은 구별은 예컨대 차별적인 진단 방법의 사용을 통해서 가능한데, 이 방법은 예방 접종을 위해서 사용되는 항원에 대한 항체를 입증해줄 뿐만 아니라 감염 요인의 추가 항원에 대한 항체까지도 입증해준다. 균주 VAK367-D4로부터 출발하는 재조합 K. lactis 균주 VAK890(DSM 25405)을 이용한 면역화에 의해서는 상응하는 바이러스 항원에 대한 높은 항체 역가를 발생할 수 있었다. 이와 같은 항체를 위해서는 이 항체가 바이러스 중화 작용을 한다는 사실이 나타날 수 있었다. 이러한 특성 및 측정된 높은 역가를 통해서 이미 상기 체액성 면역 반응은 관련 바이러스에 의한 후속적인 감염 전에 유기체를 보호하기에 충분하다는 내용이 경험적으로 도출될 수 있다. 최종 증거는 IBDV를 위해서 제시될 수 있었다. 발생 된 바이러스 중화 작용을 하는 항체의 높은 역가는 닭 모델에서 후속하는 바이러스 감염에 대한 예방 접종된 동물의 완전한 보호와 상관 관계가 있었다(도 5 참조).

K. lactis, 특별히 유전 공학적으로 변형된 변이체인 VAK367 - D4 및 그의 유도체, 예컨대 K. lactis VP2-T2S_GAL4(VAK890)의 사용은 종래의 방법들에 대하여 다음과 같은 중요한 장점들을 갖는다:

1. 외래 유전자 발현을 위해 사용하기 위해서, K. lactis는 S. cerevisiae에 대하여 중요하고도 기본적인 장점들을 가지며, 이들 장점은 백만 년의 기간에 걸쳐서 S. cerevisiae로부터 갈라져 나온 K. lactis의 생리학에 근거를 두고 있다.

2. 외래 유전자의 발현은 플라스미드 벡터를 통해서 이루어지지 않으며, 오히려 외래 유전자를 K. lactis 게놈의 규정된 유전자 장소에 의도한 바대로 그리고 안정적으로 통합한 후에 이루어진다. 이와 같은 사실은 비-선택적인 조건하에서 단백질 발현의 높은 재생 가능성을 가능케 한다. 이러한 양상은 발효기 내에서 효모 균주를 배양함으로써 이루어지는 접종제의 재생 가능한 발생을 위해서 중요하다. 균주 VAK367 - D4 및 그 유도체의 원리는 경구 예방 접종을 위해서 이미 기술되어 있다(WO 20101054649 A2호). 본 발명에서 이제 드러나는 사실은, 균주 VAK367 - D4 및 그의 유도체, 특히 K. lactis VP2-T2S_GAL4(VAK890) 및 oVP2-T2S_GAL4(VAK911)가 훨씬 더 적은 효모 량을 사용한 피하 투여 방식의 예방 접종에서는 바이러스 감염의 경우에 효과적인 보호 작용을 야기한다는 것이다.

3. 유전자 발현은 유도될 수 있고, 전사 활성체 Gal4의 농도를 높임으로써 그리고/또는 효모 숙주에 대한 적응시에 외래 유전자의 뉴클레오티드 서열의 코돈-최적화에 의해서 더욱 증가 될 수 있다. 유가식(Fed-Batch) 발효 프로토콜의 확립(establishment)은 세포 독성 항원의 효율적인 생성도 가능케 한다.

4. 외래 유전자를 VAK367 - D4 및 그의 유도체에 통합하는 것은 "1-단계-절차"이다. 다시 말하자면, 약 3주 이내에 새로운 재조합 균주들이 발생 되어 특징을 나타낼 수 있다; 이 사실은 변형된 바이러스 변이체에 대한 효율적인 접종제의 신속한 개발을 위해서 중요하다.

5. K. lactis 타입의 재조합 효모, 특별히 균주 VAK367 - D4의 재조합 효모 및 그의 유도체를 피하 투여 방식으로 투여함으로써, 쥐의 경우뿐만 아니라 닭의 경우에도 보호적인 면역 반응이 발생 될 수 있었다. 이 절차는 간단히 생각할 수 있다: 규정된 양의 비활성화된 (열-사멸된) 효모 세포가 2-3회 방법으로 접종 대상의 피부 아래에 주입된다. 마지막으로 적용하고 2주 후에, 상기 접종 대상의 혈청이 항원-특정 항체의 존재(presence) 및 기능에 대하여 검사된다. 바이러스 중화 테스트에 의해서는, 오로지 중화 작용 항체의 발생에만 기초하지 않는 경우에 상기 면역 반응이 두드러지게 나타난다는 사실이 입증될 수 있었다(보호적인 체액성 면역 반응). 따라서, K. lactis에 의해 피하 투여 방식으로 적용하는 경우에 유도될 수 있는 면역 반응은 다른 무엇보다도 T-세포 반응을 유도하는 그리고 S. cerevisiae에 의해 유도될 수 있는 면역 반응과 기본적으로 구별된다. 그렇기 때문에, K. lactis의 피하 투여 방식의 적용 가능성은 S. cerevisiae의 피하 투여 방식의 적용 가능성과 기본적으로 다른 것이다: K. lactis는 (예컨대 감염성 점액낭염 바이러스의 VP2 항원과 같은 바이러스성 항원, IBDV 또는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 HA 항원과 같은) 항원에서 보호적인 체액성 면역 반응을 발생시킬 수 있는 서브유닛 백신으로 적용될 수 있는 한편, S. cerevisiae는 (예컨대 C형 간염 바이러스의 NS3 단백질 또는 Her-2와 같은 종양 항원에서와 같은) 항원에서 보호적인 세포성 면역 반응을 발생시킬 수 있는 서브유닛 백신으로 적용될 수 있다. 유도된 면역 반응의 형태 면에서의 이와 같은 차이점은 추측하건대 전술된 바와 같은 S. cerevisiae 및 K. lactis의 매우 상이한 특성들로부터 유래할 수 있다.

요약해서 설명하자면, 본 발명은 선행 기술에 광대한 기여를 하고 있으며, 선행 기술에 대하여 다수의 바람직한 실시예들을 제공해준다:

본 발명에서는 예방 접종된 개체를 자연적으로 감염된 개체에 대하여 구별하는 것을 가능케 하는 서브유닛 마커 백신을 제조하는 데 성공하였다.

또한, 그와 동시에 강한 보조 특성을 가지면서 강력한 면역원이 되는 서브유닛 마커 백신이 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 서브유닛 마커 백신은 다중으로 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 서브유닛 마커 백신은 체계적이고 보호적인 면역 반응 및 접종 대상 내에서 유전 공학적인 기억을 형성한다.

본 발명에 의해서는, 세포 독성 항원에 대한 백신을 제조하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 방법은 새로운 백신 변이체의 가급적 신속한 발생을 가능케 한다.

예방 접종 방법들은 특히 매우 경제적이다.

본 발명에 따른 백신의 제조를 위해서는 실험용 동물이 필요치 않거나 배양 중인 동물 혹은 사람 세포의 사용이 반드시 필요하다.

본 발명에 따른 백신은 온도에 민감하지 않으며, 이들 백신은 냉동 없이 운송 및 저장될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서는 살아있는 재조합 세포 또는 유기체가 사용되지 않는다.

본 발명에 따른 방법에 의해서는, 사용되는 백신의 양뿐만 아니라 보호적인 면역화에 도달하기 위해서 반드시 필요한 적용 예의 개수도 최소 수준으로 한정할 수 있다.

실시예

1. K. lactis 균주 VAK367 - D4 ( metA ura3 -5 lac4 :: ScURA3 )의 발생.

외래 단백질의 이종성 발현을 위한 출발 균주인 VAK367은 다음과 같은 특성을 지닌다: 이 균주는 세포내 단백질이 검출 가능하게 방출되지 않으면서 높은 세포 밀도로 배양을 가능케 한다. 이와 관련해서 상기 균주는 다수의 유사 성질의 K. lactis 균주들과 구별된다. 균주 VAK367를 2회의 돌연변이 유발-라운드(round)에 의해 균주 CBS 2359(Centraalbureau voor Schimmecultures http://www.fungalbiodiversitycentre.com)로부터 유도하였으며, 이 균주는 아미노산 메티오닌 및 뉴클레오염기 우라실을 위한 영양 요구체(auxotroph)이다. 균주 VAK367로부터 유전 공학적인 방법에 의해서 균주 VAK367 - D4(2009년 11월 18일에 브라운슈바이크에 소재하는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)에서 DSM 23097이라는 기탁 번호로 기탁됨)를 유도하였고, 이때에는 플라스미드 pD4-2에 의해 LAC4 유전자의 +358 내지 +1181의 서열을 ScURA3 유전자로 대체하였다. 이때 균주 VAK367 - D4는, 락토오스-성장을 선택함으로써, 추가의 마커 없이도 LAC4 유전자 위치에서 외래 유전자의 통합을 가능케 한다. 이 경우에는 예컨대 Klp3-MCS(도 6 참조)와 같은 적합한 통합 벡터를 이용할 때에 파괴 카세트(disruption cassette)를 상동 재조합에 의해 대체함으로써, 결과적으로 ScURA3 마커의 손실하에 손상되지 않은 LAC4 유전자를 재구성하게 된다(도 1 참조).

2. 외래 유전자의 유도 가능한 발현을 가능케 하는 통합 벡터의 발생.

벡터: Klp3-MCS

벡터: Klp3-MCS(SEQ ID Nr .: 10)

벡터인 Klp3-MCS[(SEQ ID Nr .: 10)(도 6 참조)]로서는 YRp7을 기본으로 하는 E. coli 벡터를 사용하며, 이 벡터는 효모 내에서 자발적으로 복제할 수 없는데, 그 이유는 ARS1 서열이 소거되었기 때문이다. Klp3-MCS(SEQ ID Nr .: 10)는 K. lactis LAC4 프로모터 및 상동 재조합에 의해 LAC4 유전자 위치에서의 통합을 가능케 하는 서열을 포함한다.

LAC4 프로모터와 전사 스타트 사이에 DNA 세그먼트를 삽입하였으며, 이 DNA 세그먼트는 TEF1 종결자(terminator) 및 KIGAL80 프로모터를 포함한다. 그럼으로써, LAC4 오픈 리딩 프레임(개방형 해독틀; open reading frame)이 상동 재조합을 통한 재구성 후에 KIGAL80 프로모터의 제어하에 발현될 수 있다. KIGAL80 프로모터는 전사 인자인 KIGal4를 통해 LAC4 프로모터와 상호 조절된다(Zenke 외, 1993). 이와 같은 구성은 LAC4 코딩된 β-갈락토시다아제의 측정을 통해 외래 유전자 발현의 유도 실시를 가능케 한다. Klp3-MCS(SEQ ID Nr .: 10)는 multiple cloning site[(다중 클로닝 자리(MCS)]에 있는 독특한 교차점들 중에 하나를 통해 LAC4 프로모터와 TEF1 종결자 사이에 외래 유전자가 삽입되는 것을 가능케 한다(도 6 참조). 통합을 위해, 얻어지는 플라스미드를 적합한 제한 효소(restriction enzyme)에 의해 소화시킴으로써, 결과적으로 발현 카세트를 E. coli 벡터 서열로부터 분리시킨다. K. lactis VAK367 - D4로의 전환 후에는 상기 발현 카세트를 염색체적으로 통합한다; 나타나는 균주들은 박테리아 서열을 갖지 않는다.

3. 감염성 점액낭염 바이러스의 VPS2 -항원( IBDV 변이체 D78 )을 발현시키는 K. lactis 변이체.

재조합 효모 균주의 제조

IBDV D78 VP2를 위해 코딩하는 cDNA를 다음과 같은 올리고뉴클레오티드에 의해서 플라스미드 pD78A(Icard 외, 2008)로부터 증폭하였다:

Ascl 제한 교차점을 포함하는 IBDV_Ascl_fwd

(SEQ ID Nr .: 7), 및

Notl 제한 교차점을 포함하는 VP2_Notl_rev

(SEQ ID Nr .: 8).

VP2-T2S의 발생을 위해서는 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하였다:

IBDC_S:T_Ascl_fwd

(SEQ ID Nr .: 9), 및 VP2_Notl_rev (위 참조).

상기와 같이 증폭된 DNA 단편(fragment)을 뉴클레오티드 서열의 검사 및 확인 후에 Ascl 및 Notl 교차점을 통해 벡터 Klp3-MCS[(SEQ ID Nr .: 10)(도 6 참조)]로 복제하였다. 그 다음에 게놈 내부로의 통합을 실시하였다(도 1 참조). 상세하게 설명하자면, 통합 플라스미드를 제한 효소인 EcoRl에 의해서 소화시켰고, 소화된 단편들을 완전한 VAK367 - D4 세포로 형질 전환하였다. 상기 형질 전환된 세포들을 YEPD 배지(medium) 상에 클래딩(cladding) 하였고, 밤새 30℃에서 배양(incubating) 하였다. 양성의 군체(colony)를 발견하기 위해, 락토오스를 탄소원으로 함유하는 SM 배지 상에서 형질 전환 플레이트를 복제하였고, 2일 동안 30℃에서 배양하였다. 이 방법에서 확인된 양성의 클론들을 계속해서 검사하였다.

추가 KIGALA4 유전자 복제물의 게놈적인 통합을 종래의 방법에 따라서 실시하였다(Kuger 외, 1990). 코돈-최적화는 Saccharomyces cerevisiae 알고리즘을 따랐다(mr.gene.com, Raab 외, 2010). 코돈-최적화된 DNA 단편은 직접 합성하였다. 합성 때에는 5' Ascl 및 3' Notl 제한 교차점이 이미 형성되어 있다(mr.gene.com, 레겐스부르크, 독일). 그 다음에 이어서 벡터 Klp3-MCS(SEQ ID Nr .: 10)로의 클로닝(cloning)을 실시하였다.

웨스턴 블롯 분석( Western Blot Analysis ).

세포 펠릿을 B60 완충제[50mM의 HEPES-KOH pH 7.3; 60mM의 칼륨아세테이트; 5mM의 마그네슘아세테이트; 0.1% 트리톤 X100; 10% 글리세롤; 1mM의 나트륨 플루오르화물; 20mM의 글리세롤포스페이트; 10mM의 MgCl₂; 1mM의 DTT; 프로테아제 완전 억제제(Roche)] 내에서 재현탁하였고 유리 구슬(glass bead)과의 강력한 혼합에 의해 분시시켰다. 추출물을 원심 분리하였고(14000 U/min, 4℃에서 20 min) 단백질 농도를 결정하였다. 40㎍의 단백질 추출물을 SDS-PAGE에 의해 12%의 겔 내에서 분리시켰다. 그 다음에 단백질을 멤브레인(membrane) 위로 전송하였다. 토끼의 α-IBDV 항혈청(1:15,000; Granzow 외, 1997) 및 산양-α-토끼 HRP-결합된 항체(1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 사용해서 종래의 방법을 따라 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

노던 블롯 분석( Nothern Blot Analysis ).

RNA의 완전한 추출을 위해 5ml의 효모 배양균을 얼음으로 냉동하였다. Prot K 완충제(100mM의 Tris/HCL pH 7.9, 150mM의 NaCl, 25mM의 EDTA, 1% SDS) 및 50 mg의 프로테이나제 K(퍼멘타스) 내에서 유리 구슬과 강력하게 흔들어서 세포 용해를 실시하였다. 샘플을 35℃에서 1시간 동안 배양하여 RNA를 추출하였고, 에탄올로 침전시켰으며, DEPC 물속에서 재현탁하였다. 이 노던-분석을 Engler-Blum 외, 1993에 기술된 바와 같이 실시하였지만 몇 가지 차이점을 두고 실시하였다. 5㎍의 전체 RNA를 1%의 포름알데히드-아가로오스 겔 내에서 분리시켰고, 나일론 멤브레인(Amersham HybondTM-N+, GE Healthcare) 위로 전송하였다. 이 멤브레인을 68℃에서 DIG-표시된 RNA 프로브(probe)로 배양하였으며, 이 프로브는 DIG-NTPs(Roche)의 존재 상태에서 PCR 단편의 시험관내 전사에 의해 제조된 것이다. 블롯(blot)을 차단 용액으로 처리하였고, 항-DIG 알칼리-포스파타아제-컨쥬게이션된 항체(Roche)로 배양하였다. 종래 방법을 이용해서 상기 알칼리-포스파타아제의 활성을 결정하였다.

이종성 발현된 VP2 의 정량.

에피솜 VP2 플라스미드(pADH1-P_VP2-T2S)에 의해 전환된 효모 배양균의 Saugar 외, 2005. 2000 ODE에 따라 변형된 프로토콜을 사용하였고, 선택적인 배지(0,67% YNB, 2% 글루코오스 및 다음의 첨가제: 11 mg/l의 Ade; 14 mg/l의 Tyr; 각각 38 mg/l의 His, Trp, Arg, Met; 48 mg/l의 Phe; 각각 58 mg/l의 Leu, Ile, Lys, Val, Thr) 상에서 밤새 배양하였다. 수거하고 증류된 물로 정제한 후에 세포는 용해 완중제 시약(Lysis buffer)[10mM의 트리스(pH 8.0), 150mM의 NaCl, 20mM의 CaCl₂, 1mM의 EDTA, 프로테아제 완전 억제제(Roche), pH 8.0] 내에 있는 유리 구슬로 분리시켰다. 얻어지는 단백질 추출물을 원심 분리하였고(10,000g을 4℃에서 1시간 동안) 가용성 단편을 수크로오스 완충제 내에 있는 20%(w/v)의 수크로오스 쿠션 상에 적층하였다[10mM의 Tris pH 8.0, 150mM의 NaCl, 20mM의 CaCl₂; 프로테아제 완전 억제제(Roche)를 함유함]. 170.000g을 4℃에서 3시간 동안 원심 분리한 후에 펠릿을 200μl의 수크로오스 완충제 내에서 용해시켰고, 수크로오스 완충제 내에서 수크로오스 구배(gradient)가 20 내지 53%인 상태에서 114.000g을 17시간 동안 추가로 원심 분리하였다. 이 구배를 700μl의 단편에서 수집하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 이종성 발현된 VP2의 올리고머 단백질 착물을 상기 방식으로 농축 및 정제할 수 있었다. 단백질을 검출할 수 있었고, 단백질 양을 SDS PAGE 및 쿠마씨(Coomassie) 염색을 이용하여 표준 단백질과 비교해서 결정할 수 있었다(도면에는 도시되어 있지 않음). 그 다음에 이와 같이 정제된 VP2를 항-VP2 항체를 갖는 대등한 웨스턴 블롯 내에 표준으로서 삽입하였다. VP2 양을 다양한 발효 과정으로부터 얻어낸 규정된 개수의 효모 세포와 비교하였다(도 3 참조).

효모 발효 및 열 비활성화.

모든 실험적인 발효 과정을 DasGip 병렬 생물 반응기(parallel bioreactor)(DasGip AG, 율리히, 독일) 내에서 완전 설치된 4개의 2l 발효기를 이용하여 실시하였다. 제조 척도에 따른 발효 과정을 Organbalance GmbH 사(社)(베를린, 독일)를 통해서 실시하거나 또는 독자적인 실험실에서 Biostat ED 생물 반응기(B. Braun Biotech, 멜중엔, 독일) 내에서 10l 작업 용적(operating volume)으로 실시하였다. 모든 제조 공정을 유가(Fed-Batch) 방식으로 실시하였다. 2%의 효모-추출물 및 1%의 펩톤을 갖는 복합 배양 배지 및 20%의 락토오스-공급(Feed)-용액을 이용하였다. 효모 배양 온도를 30℃로 유지하였고, pO₂를 30% 포화 상태로 조절하였다. 발효 중에는 2M의 NaOH 또는 2M의 H₃PO₄를 첨가하여 pH-값을 5.0으로 유지하였다.

쥐 및 닭에게서 시험관내 실험을 하기 위해 효모를 냉동 건조한 후에 90℃에서 2시간 동안 열 비활성화하였다. 이와 같은 방법을 사용한 후에는 그램 세포 건조 중량당 10개 미만의 세포가 살아남았다.

4. 쥐에게 피하 투여 방식을 적용

감염된 점액낭염 바이러스의 VP2-항원(IBDV 변이체 D78)을 발현시키는 K. lactis 변이체(VAK890)을 피하 투여 방식으로 적용하기 위해서, 건조된 분말형 효모를 제1 적용을 위해 쥐 내에서 완전한 프로인트-보조 약물(CFA; Complete Freund Adjuvant)과 혼합하였다; 추가 적용 예에서는 효모를 불완전한 프로인트-보조 약물(IFA; Incomplete Freund Adjuvant)와 혼합하였다(200μl의 CFA 또는 IFA당 100㎍의 효모 재료). (100㎍의 효모를 함유하는) 200μl의 에멀전을 개체마다 면역화/부스트(boost)당 주입하였다. 그럼으로써, 쥐 개체에서 피하 투여 면역화당 투여된 VP2의 양은 약 18ng에 상응하게 되었다(도 3 참조). 최초 주입(0일) 후에 2주의 간격을 두고서 2회 "부스트"하였다(14일과 28일에; 도 4 참조). 추가 2주 후에는 혈청을 획득하기 위하여 동물을 혼수 상태에서 사멸시켰다.

4. 닭에게 피하 투여 방식을 적용

닭에게 피하 투여 방식을 적용하기 위해서, 감염된 점액낭염 바이러스의 VP2-항원(IBDV 변이체 D78)을 발현시키는 5mg의 건조된 분말형 K. lactis 변이체(VAK890)를 750μl의 인산 완충 식염수(PBS; Phosphate Buffered Saline) 및 500μl의 살균 증류된 물속에서 용해하여 1.25ml의 IFA를 갖는 에멀전을 제조하였다. (1mg의 효모를 함유하는) 상기 500μl의 에멀전을 0일, 14일 그리고 28일에 주입하였다(도 5 참조). 그럼으로써, 닭 개체의 피하 투여 면역화당 투여된 VP2의 양은 약 180ng에 상응하게 되었다(도 3 및 도 4 참조).

6. 바이러스 "공격( challenge )"

예방 접종 후에는(도 5 참조) 42일째에 IBDV 균주 "Edgar"의 100 EID₅₀을 경구 투여 방식을 통해 닭 접종 대상에 주입하였고, 6일 후에 치사율을 확인하였다. 그 다음에 혼수 상태에서 동물을 사멸한 후에 혈청을 획득하였고, 동물의 점액낭을 제거했다. 이 점액낭을 우선 24시간 동안 10%의 중성 완충된 포르말린 내에서 고정한 다음에 파라핀 속에 매립하였다.

7. 효소-결합 면역흡착 검사( ELISA ; Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay ).

구매 가능한 ELISA-테스트용 IDEXX FlockChek^® IBD ELISA 키트(IDEXX Laboratories, Inc.)를 통해 접종 대상의 혈청 내에 있는 IBDV 전용 항체 역가를 결정하였다. 쥐 접종 대상으로부터 얻어낸 혈청의 경우에는 제조자가 상이한 2차 항체를 사용하였다(Sigma Aldrich).

8. 중화-검사.

바이러스-중화 작용 항체의 농도를 결정하기 위한 중화 검사를 Schroeder 외, 2000의 프로토콜에 따라서 실시하였다.

9. 면역 조직 화학법 .

파라핀 속에 매립된 점액낭으로부터 4마이크로미터 두께의 유기 단편을 제조하였다. 파라핀을 제거한 후에 상기 점액낭을 표준 절차에 따라서 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 현미경을 이용해서 샘플을 검사하였고, 1-4 크기(scale)의 소위 "병변 스코어"를 결정하였다(1 = 정상 내지 10%의 소낭 위축; 2 = 10-30%의 소낭 위축; 3 = 30-70%의 소낭 위축; 4 = 70%를 초과하는 위축).

결과

IBDV VP2 를 발현시키는 K. lactis 균주의 제조 및 최적화

IBDB VP2 유전자가 통합된 다양한 K. lactis 변이체가 제조되었다. 예방 접종 실험을 위해, VP2 단백질이 아미노산 위치 2에서 돌연변이되었고[트레오닌이 세린으로 교체됨; Jagadish 외, (1991)] 2개 이상의 KIGAL4 유전자의 탠덤(tandem)-통합체를 추가로 함유하는 최적화된 변이체가 사용되었다(변이체 VP2-T2S_GAL4; 균주 VAK890). 돌연변이에 의해서 외래 단백질이 추가로 안정화되었다; 전사 활성체의 초과 발현에 의해서 VP2 발현의 확연한 증가에 도달할 수 있었다(도 2 참조). 추가 KIGAL4 유전자의 통합은 상기 K. lactis 변이체의 더 높은 성장률과도 상관 관계를 맺게 되었다. VP2-발현하는 관련 K. lactis 균주(VAK890)를 위한 성장 조건이 최적화됨으로써, 결과적으로 효모는 발현된 VP2를 높은 밀도로 그리고 재생 가능한 양으로 발효시킬 수 있게 된다. 제조 후에는 효모가 냉동 건조되었고, 90℃에서 2시간 동안 비활성화되었다. 비활성화의 증거가 제시되었다: 비활성화된 효모 재료 g당 10개 미만의 효모 세포가 살아남았다. 효모 세포당 VP2의 양이 확인되었다: 이 양은 균주 VAK890을 사용한 경우 효모 세포당 약 0.7 fg의 이종성 VP2 단백질에 해당하는 것이다(도 3 참조).

쥐 및 닭에게 피하 투여 방식을 적용

예방 접종은 전술된 바와 같이 실시되었다; 마지막으로 적용하고 2주 후에, 처리된 접종 대상의 혈청이 중화 작용을 하는 항체의 존재에 대하여 검사되었다. 이 목적을 위하여 IBDV-전용 ELISA가 이용되었고, IBDV 중화 검사가 실시되었다(도 4 및 도 5 참조). 또한, 예방 접종된 닭으로 "바이러스-공격" 실험을 하였다. 이 목적을 위하여, 심하게 감염된 IBDV 균주 "Edgar"의 동물당 100 EID50의 바이러스 투여량이 동물에게 공급되었는데, 이 농도는 감염되지 않는 가금류에서 약 10-35%의 치사율(도 5d 참조)을 나타내는 상당한 점액낭염을 야기한다. "바이러스-공격( challenge )" 실험에 이어서 접종 대상의 점액낭이 면역 조직 화학법을 통해 감염 징후 및 점액낭 내에서의 병변에 대하여 검사되었고, 소위 "병변 스코어"(도 5 참조)에 따른 특징을 나타냈다.

쥐를 이용한 실험뿐만 아니라 닭을 이용한 실험도, K. lactis 균주인 VAK890을 피하 투여 방식으로 적용함으로써 높은 역가의 바이러스-중화 작용 항체가 실제로 처리된 모든 동물에게서 발생 될 수 있다는 사실을 보여주었다(도 4b 및 도 4c; 도 5b 및 도 5c 참조). 또한, 실제로 예방 접종된 모든 닭 발단자(proband)가 바이러스 공격에 대하여 보호되었고 실제로 자신의 점액낭 속에서 바이러스 감염 징후를 전혀 나타내지 않았다는 사실도 드러났다(도 5 참조). 따라서, K. lactis 균주인 VAK890을 피하 투여 방식으로 접종 받은 모든 동물은 VP2에 대하여 상당한 체액성 면역 반응을 보여주었다. 이와 같은 면역 반응은 1번의 부스트 후에 이미 관찰될 수 있었으며, 이와 같은 내용으로부터 도출될 수 있는 사실은, 불완전한 프로인트-보조 약물을 이용해서 추가로 실시될 수 있는 두 번의 주입(injection)(면역화 및 한 번의 부스트)로도 이미 보호 효과를 나타내기에 충분하다는 것이다. 또한, K. lactis 균주인 VAK890을 접종 받은 모든 닭 발단자는 후속하는 바이러스 감염에 대해서도 보호되었다(도 5 참조).

축약어에 대한 설명

ARS1: 자발적으로 복제하는 서열; 복제가 도입되는 DNA 상의 뉴클레오티드 서열

Asc Ｉ: 제한 엔도뉴클레아제 Asc I

CFA: 완전한 프로인트-보조 약물

DNA: 데옥시리보누클레오티드산

DEPC: 디에틸피로카보네이트

DIG-NTP: 디곡시제닌-뉴클레오티드트리포스페이트

DSMZ: 독일 미생물 및 세포 배양 모임(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

DTT: 디티오트레이톨

E. Coli: 대장균(Escherichia coli)

EcoRI: 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI

EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산

EID50: 알 또는 배아 감염치 - 50%의 감염된 알에서 감염을 발생시키기 위해 필수적인 전염성 바이러스의 개수

ELISA: 효소-결합 면역흡착 검사

GAL4: 효모 전용 전사 활성체

GRAS: 일반적으로 안전한 것으로 간주 되는 상태(Generally Regarded As Safe)

HEPES: 2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)-에탄술폰산

Hpa I: 제한 엔도뉴클레아제 Hpa I

HRP: 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)

IBDV: 전염성 점액낭염의 바이러스

IFA: 불완전한 프로인트-보조 약물

K. lactis: 클루이베로마이세스 락티스( Kluyveromyces lactis )

KIGAL4: KIGAl4/Lac9 단백질을 코딩하는 K. lactis 유전자

KIGAL80: KIGAl80 단백질을 코딩하는 K. lactis 유전자

LAC4: β-갈락토시다아제-효소를 위해서 코딩하는 K. lactis 유전자

Not I: 제한 엔도뉴클레아제 Not I

ODE: 광학 밀도 단위

PBS: 인산 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline)

PCR: 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)

RNA: 리보핵산(ribonucleic acid)

S. cerevisiae: 사카로미세스 세레비시에( Saccharomyces cerevisiae )

Sal I: 제한 엔도뉴클레아제 Sal I

SDS: 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate)

SDS-PAGE: SDS를 사용하는 폴리아크릴아미드겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)

TEF1: 전사 인자 EF-1α를 위해서 코딩하는 아륵술라아데니니보란( arxula adeninivorans) 유전자

VP2: IBDV의 캡시드를 형성하는 바이러스 단백질

VP2-T2S: 위치 2에서 아미노산이 세린으로 교체된 트레오닌을 갖는 VP2

VAK: 백신 균주

YEPD: 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스(Yeast Extract Peptone Dextrose)

YRp7: S. cerevisiae-E.coli shuttle 벡터, Genbank Accession U03501(Botstein 외, 1979)

참고문헌 목록

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

DSM25405

20111129

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

DSM25406

20111129

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

DSM25407

20111129

SEQUENCE LISTING <110> Martin-Luther-Universit채t Halle-Wittenberg <120> Erzeugung einer humoralen Immunantwort mittels Hefe-basierter Vakzinierung <130> MLU_Breu_1 <160> 10 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Birnaviridae <220> <221> source <222> 1..1371 <223> /mol_type="DNA" /organism="Birnaviridae" <400> 1 atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60 ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120 gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180 cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagggcaa tgggaactac 240 aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagttacaa ctactgcagg 300 ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacacttc ctggtggcgt ttatgcacta 360 aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420 tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480 ggggaagggg tcaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540 ggtgacccca ttcccgcaat agggcttgac ccaaaaatgg tagccacatg tgacagcagt 600 gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660 caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat cacaagcctc 720 agcgttgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccacg gccttgtact gggcgccacc 780 atctacctca taggctttga tgggacaacg gtaatcacca gggctgtggc cgcaaacaat 840 gggctgacga ccggcaccga caaccttatg ccattcaatc ttgtgattcc aacaaacgag 900 ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960 gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaaga gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020 aactatccag gggccctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaaagagt ggcaacagga 1080 tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140 aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200 atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260 gactttcgtg aatacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320 gcattcggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggagga tagctgtgtg a 1371 <210> 2 <211> 456 <212> PRT <213> Birnaviridae <220> <221> SOURCE <222> 1..456 <223> /mol_type="protein" /organism="Birnaviridae" <400> 2 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val His Gly Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Thr Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val 450 455 <210> 3 <211> 1371 <212> DNA <213> Birnaviridae <220> <221> source <222> 1..1371 <223> /mol_type="DNA" /organism="Birnaviridae" <400> 3 atgtctaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60 ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120 gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180 cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagggcaa tgggaactac 240 aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagttacaa ctactgcagg 300 ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacacttc ctggtggcgt ttatgcacta 360 aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420 tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480 ggggaagggg tcaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540 ggtgacccca ttcccgcaat agggcttgac ccaaaaatgg tagccacatg tgacagcagt 600 gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660 caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat cacaagcctc 720 agcgttgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccacg gccttgtact gggcgccacc 780 atctacctca taggctttga tgggacaacg gtaatcacca gggctgtggc cgcaaacaat 840 gggctgacga ccggcaccga caaccttatg ccattcaatc ttgtgattcc aacaaacgag 900 ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960 gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaaga gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020 aactatccag gggccctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaaagagt ggcaacagga 1080 tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140 aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200 atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260 gactttcgtg aatacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320 gcattcggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggagga tagctgtgtg a 1371 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Birnaviridae <220> <221> SOURCE <222> 1..456 <223> /mol_type="protein" /organism="Birnaviridae" <400> 4 Met Ser Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val His Gly Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Thr Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val 450 455 <210> 5 <211> 1371 <212> DNA <213> Birnaviridae <220> <221> source <222> 1..1371 <223> /mol_type="DNA" /organism="Birnaviridae" <400> 5 atgtccaact tacaagacca aacccaacaa atcgtccctt ttatcagatc cttattaatg 60 cctactaccg gtcctgcttc tattcctgat gacaccttgg aaaaacacac cttgagatcc 120 gaaacttcaa cctataactt gactgtcggt gacactggtt ctggtttaat cgttttcttc 180 cctggttttc ctggttcaat tgtcggtgcc cactatacct tacaaggtaa cggtaactat 240 aagttcgatc aaatgttgtt gaccgcccaa aatttgcctg cctcctataa ctattgtaga 300 ttggtttcta gatctttaac cgtcagatca tccactttgc ctggtggtgt ctatgctttg 360 aacggtacaa tcaacgctgt cacatttcaa ggttccttgt ccgaattgac cgatgtctcc 420 tataacggtt taatgtccgc tactgccaat atcaatgaca aaattggtaa cgtcttagtc 480 ggtgaaggtg ttactgtttt gagtttgcca acctcttatg acttgggtta tgtcagattg 540 ggtgacccta ttcctgctat cggtttagac ccaaaaatgg ttgccacttg tgactctagt 600 gatagaccaa gagtctatac catcactgct gccgatgact atcaattctc ctcccaatat 660 caacctggtg gtgtcactat caccttgttc tctgccaaca tcgacgctat aacatctttg 720 tccgtcggtg gtgaattggt attccaaacc tccgtccatg gtttagtatt gggtgccacc 780 atctatttga ttggtttcga cggtacaacc gtcattacta gagccgttgc tgccaacaat 840 ggtttaacca ctggtactga caacttgatg ccattcaact tggtaatccc taccaacgaa 900 atcacacaac caatcacatc catcaaattg gaaattgtca cctccaaatc cggtggtcaa 960 gccggtgacc aaatgtcatg gagtgctaga ggttcattag ccgtaaccat ccacggtggt 1020 aactatcctg gtgccttgag acctgtcact ttagtcgcct atgaaagagt tgctactggt 1080 tccgtcgtta ctgttgccgg tgtttcaaac ttcgaattga tcccaaaccc agaattggcc 1140 aaaaacttgg ttaccgaata tggtagattc gaccctggtg ctatgaacta tacaaaattg 1200 atcttatccg aaagagacag attgggtatc aaaactgtct ggcctactag agaatatacc 1260 gactttagag aatatttcat ggaagtcgcc gacttaaatt ccccattgaa aatcgccggt 1320 gcctttggtt ttaaggacat cattagagcc attagaagaa tagccgtctg a 1371 <210> 6 <211> 456 <212> PRT <213> Birnaviridae <220> <221> SOURCE <222> 1..456 <223> /mol_type="protein" /organism="Birnaviridae" <400> 6 Met Ser Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val His Gly Leu Val 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Thr Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val 450 455 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> source <222> 1..28 <223> /mol_type="DNA" /note="Oligonucleotide for PCR amplification" /organism="synthetic construct" <400> 7 ggcgcgccga tgacaaacct gcaagatc 28 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> source <222> 1..38 <223> /mol_type="DNA" /note="Oligonucleotid f체r PCR Amplifikation" /organism="synthetic construct" <400> 8 ataagaatgc ggccgctcac acagctatcc tccttatg 38 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> source <222> 1..35 <223> /mol_type="DNA" /note="Oligonucleotid f체r die PCR-Amplifikation" /organism="synthetic construct" <400> 9 ggcgcgccga tgtctaacct gcaagatcaa accca 35 <210> 10 <211> 8157 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> source <222> 1..8157 <223> /mol_type="DNA" /note="plasmid vector" /organism="synthetic construct" <400> 10 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 60 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 120 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 180 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 240 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 300 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 360 ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 420 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 480 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 540 gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 600 aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 660 caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 720 tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 780 acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 840 gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 900 agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 960 gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1020 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1080 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 1140 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 1200 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 1260 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtac ttctagtgta 1320 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 1380 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 1440 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 1500 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 1560 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 1620 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 1680 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 1740 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 1800 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 1860 tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 1920 ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 1980 atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2040 tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgctcc cggctcgtat 2100 gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2160 cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctgggtaccg ggcccgcgac 2220 ctaaccattc aaatgattca taactatctc ctagccagaa ttcgtaccca actcttggga 2280 aatcaggagg ctgatattcg ccagtaagct tcatagaagt gttcaagttt attttgttag 2340 caaagatcgt gtacttctga acagtctcaa acccatagta aaatacaact ggggatatac 2400 gagagttaac cgtgactaca gctagagaac cattagaacc tttttcgaca ctcactccat 2460 ggatgttttg cttcattaaa tcaatattgt acttcttcca gttcttaaag tccctaggtt 2520 catcattatt cgttggaggt ctccagaaag tgattgaaga accctcaaac ttgctggaaa 2580 tttccttacc cttgaccttt aggctttcaa ttttacccaa caatttgtcc aagataaaat 2640 gcaatccact ggattcaact gagacataac gtttaccgtc gttgatcttc gcagcttttt 2700 ctgctgtctc tgtaacaaaa tcgggtacct tcaatggaag ttcagcttgg ccccaggcaa 2760 tttcatgacc tgcctttaga acaccagcat catctttcaa cacggcaaca acataagttg 2820 tatcagaagg aatagtaaca gattcttctg gctttaaaga tggaacgtcg attgtctttc 2880 ccgtgtcctt gtcgataaac aataagtggt ctgtcgtaat gaagtcgtgc ttatttgtga 2940 ttgttacaga tccgtgcgca attttaatat gaacgggttc aataaccttc ttatactcta 3000 caaggcccgg agtaggatta tgctcactgt tacacaaacc atccatgatg aacactccgt 3060 catgaacctc ttccttaaag tcaccaccat aagcataagc tttatgcaac ttaccatctg 3120 cagtactaac atcttcgaat tcaataccgt gatttgccca ttcccagata aagccacctt 3180 ggtaaaactt ctccttgtag aacaactctt gatattcttt caaagagcca ggaccgttac 3240 ccattgcatg gccgtactca cacaagatca aaggcttttc aaacttacca ttttcatcag 3300 tgtggttctt cctccacctt tccataattt caaatgttgg gtacatgaaa ctaaagatat 3360 ctgcactcaa agcgttcaag tcaccctcat aatgcacaag tctggtagga tccaattgtt 3420 taattaactt gtacatggct ttgtggtttc tgccataaca agcttcgtta cccaaggacc 3480 agataataat cgaaggatga ttgacatctc ttaggacaag ttgggaagct ctgtctaagt 3540 acgcgacctc gtactctgga ttatctgata agtaatgggc attaacatcg tagagtttat 3600 ttttagtatc tggatattca gcctccaagt tcgtatgacg attaaatggc tcttgaacac 3660 catgagtttc aagatctgcc tcgtcaatga cccagaagcc cagcttatcg aagaggtcat 3720 acaccttagg atggtttgga taatgcgagt tacgaacagc attgatgtta aacttcttca 3780 ttagaatcaa gtccctaaca acaaaatcta atggcacagc tctaccgaac cttggatggt 3840 gatcatgtct gttgacacct ctaaagagaa tgtctttgcc attaacagta atgttaccgt 3900 ccttcaactc cacttgtctg aaaccaacat ggtgcttaat agattgaatc acactgccat 3960 cagatccaat taaatccaac tggtacttgt acaaagtagg attttctgcg gtccaatgtt 4020 ctggggcctt gacgttgatc ttgaaagctg tttcttcgtt ctttttggtg gagaaggaaa 4080 taaattcttt agttgaaaaa gtcgtgttcc cattctcctc gttcaacaaa gagcttgcat 4140 cgtaaacttt agatccatct tcaggttcgt aaagtgtgaa attgatgtga tcataagaag 4200 aaccctggac atcaactttc acagaaagct ctgcatcctg atactgagag tccacaaaag 4260 ttgtagtgac cctaacgtct tcaatatggg ccttcttagg caattttagt aaagaaacgt 4320 ctctgtaaat accagagagc caccattgat cttggtcctc gatataagtg gaatcggacc 4380 acttgaaaac cttgacgacc actaagtttt cgccctcaga aacgtacttt tggatatcaa 4440 attcagcccc gttacgggac cccttattga aacccacata ttgaccatta acataaagct 4500 cgtaacaatt gtccacaccc tcaaatctca atctgtgctc gaacgactca atcgatttcg 4560 aatctaattc aaaagttcta gcataaacac cagtaggatt tacagtggga ggatttggga 4620 tgtcgattgg gatagggtac tgtacgttcg tgtaaattgg tttaccgtac ttccagtctt 4680 cctgaagttc ccaatgggat ggcacagaaa tggtgctcca tttctttgcc gtttcccagt 4740 ctaaattctt agcatccgga gcgtcaagag gtgcatcaaa caacgcaaaa gcccaaggcc 4800 cattgagaga ttcgaaaata tcctgatcat agtagtaagc cctagtaggc aatctatttt 4860 cgtgaacctt tttggggttc cttaaattct caggaataag gcaagccatg gtgccgtcct 4920 gccgagatat tgtgtacact ggatcaaata ataacacttt caaagtgact aaatcacaat 4980 tgtcccaaga tatactatag ctctctgttt aacctttata ttgtcaaaaa gggacaatga 5040 atgaaagtac aaacacaaac acaaacacaa tggaagggag tgtccagggt ggtgattcct 5100 gactgtactg attcgacgga gttttatttg atttcgttga agtggttaaa gtgaataatt 5160 cttgaattga gaggaacaaa gagtggataa aataacggaa tggagaggtc cgagcgatga 5220 ataatgtacg attcggaaga ctatgagccg gctgaacctg aggttatgga ccactaacgt 5280 cctggttgac aagagtagtc atgtaataca aacgtaaatg tgatatttaa tagaatataa 5340 gtagatatag ttaaaaagaa gaagaagaat agaaagaata agggtattag aaatttagag 5400 tcattttaaa caattgataa cttgggttaa agctcgaagt tttgttgata gtagtttttt 5460 tttttgtttt agttggtttg ttcaatagta taaggttaca gggtgcgaga caaacgttgt 5520 aacacttttc atctcccccc gctaatcacc tagtcgagag ctcgttttcg acactggatg 5580 gcggcgttag tatcgaatcg acagcagtat agcgaccagc attcacatac gattgacgca 5640 tgatattact ttctgcgcac ttaacttcgc atctgggcag atgatgtcga ggcgaaaaaa 5700 aatataaatc acgctaacat ttgattaaaa tagaacaact acaatataaa aaaactatac 5760 aaatgacaag ttcttgaaaa caagaatctt tttattgtca gtactgagtc gaggcggccg 5820 ctggccaccc gggtctagag gcgcgccgtc gacggtacag cttctcgatg agtatgtgtg 5880 tttatttttt ttttattttt tttgccaaat tctgctcttt cctaaatttc aagtgttgag 5940 cttgttatcc gctcacaatt ccagcttttg tctcttcacc ttttccaact acaagcgcaa 6000 cataacaaaa gaataataat tctcctaaga aacacaagcc tcatatacct ttcgagttag 6060 ggaagaacat cttctctcat gatacacatt gattcgagct attaaatacc tttttctcaa 6120 tcgaaatctc aagtaaaaca gcaatgaaaa cattacgtaa ctaaaggtgt tcaccactag 6180 aaatcatacc cttcacactc gacttcaagt agtgaatggt gtagcaacaa agtccaaata 6240 ccaatgtcaa ccaagtaacc gaccgcacta ctagaaaaag acgctgttgc tcggaccaca 6300 aatttccgct acacttttca caactatact gaagatacaa aaaacgtgtg tgggtatggc 6360 tggctaccag gtcgcctggt taaaccaagt caacgtgata catatgtacg ttccaacact 6420 aagcctaccc taagtttcgg ctcacaggct aggctattat taacatgcaa gacaagggag 6480 aagcaaagca aagaccaacc gaaacccacc agagcaccct gaactttgcg gtgaacagaa 6540 ttccgcaaca tatctgagga taccatgatc tcgttttcct actccatatg ggaatcaccc 6600 actgttgtcc gtaaatatga ccaaattcct accttgattc ctcacgaata atcgcagtcc 6660 gaaaagccgt tccaaaagcc agtccacagt ccatcaattg gtatgatgat tgtttttttg 6720 ttcaaactga cacactaacg gtgtggaatg cgaagagtga gcttaccctt ctcctctttg 6780 ctagcagtac ttgcctacct acctactcta ctacgctgcc atattgtcta acattcggct 6840 ttctctattt ctacctggcc tggatggctc cgtctcgccc gcctcacaca catacattcc 6900 tccccctctc gcctgcccca taataattaa acaagttaac aaaaggcgtt acctcttccg 6960 catcctctcc aatctcatac gattcccctt tcatccgact tacccaacaa gatacaggat 7020 ctcagtgaaa gatccttcct gccctccctg tctgttgtct actctacatg cgacttggaa 7080 ggccaaagga ctatcgcatg attattcgcc gggaacccgc gagttccctg ctcttttctt 7140 tcaaaccagg cagcaaacca ggtgaacaca ctctgatgta gtgcagtccc taagtccttt 7200 gaagattcgg ggagctagct acccacgcga atgtaacaaa agaacattta cttttgtggg 7260 gggtggaaaa gtcgattagg atcttgcagc acagaaactg cgcaggggtt tttttcatct 7320 tggagaagca actggctaaa ttcgacacaa acaaaaactg aaaaatggaa aataaaaaat 7380 gaaaaagcaa gctgaattcg aagaagggag aattccgcct tctgcaacca cactaatggt 7440 tggtagtcaa tagatacgca ttagaaggtt actattttat gagtcgatcc ccgcggtgga 7500 gctccaattc gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac 7560 gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 7620 tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 7680 gcctgaatgg cgaatggcgc gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 7740 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 7800 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 7860 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 7920 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 7980 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 8040 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 8100 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaattt 8157

Claims

외래 유전자로서 전염성 점액낭염 바이러스(IBDV)의 VP2-항원을 코딩하고 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 종의 효모 게놈 내에 통합되는 유전자를 구비하고, 외래 단백질로서의 전염성 점액낭염 바이러스의 VP2-항원의 발현을 가능케 하는, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 종의 재조합 효모로서,
상기 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 종의 재조합 효모는
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) VAK 890 DSM 25405,
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) VAK 910 DSM 25406, 및
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) VAK 911 DSM 25407로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 효모가 보호적인 체액성 면역 반응을 발생시키기 위해서 사용되는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 재조합 효모가 서브유닛 마커 백신(subunit marker vaccine)으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 3 항에 있어서,
상기 서브유닛 마커 백신이 예방 접종된 개체를 자연적으로 감염된 개체에 대하여 구별하기 위해서 사용되는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 3 항에 있어서,
상기 서브유닛 마커 백신이 동시에 강력한 보조 작용을 하는 특성을 지니는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 3 항에 있어서,
상기 서브유닛 마커 백신이 강력한 면역성을 지니는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
추가의 벡터 서열 또는 선택 마커 없이 외래 유전자의 통합이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
외래 유전자 발현이 구성적으로(constitutively) 이루어지거나, 또는 외래 유전자 발현이 유도될 수 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
외래 유전자 발현이 내인성 리포터 유전자(endogenous reporter gene)의 발현을 통해서 간접적으로 정량될 수 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
외래 유전자가 항원 특성을 지니는 외래 단백질의 발현을 가능케 하는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
재조합 효모는, 상당한 양의 외래 단백질을 유도 가능하게, 또는 구성적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
전염성 점액낭염 바이러스(IBDV)의 VP2-항원이 SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 3 및 SEQ ID Nr.: 5로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 코딩되는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
전염성 점액낭염 바이러스(IBDV)의 VP2-항원이 SEQ ID Nr.: 2, SEQ ID Nr.: 4 및 SEQ ID Nr.: 6으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 전염성 점액낭염 바이러스(IBDV)의 돌연변이된 VP2-항원이고 SEQ ID Nr.: 4에 따른 아미노산 서열을 갖거나, 또는 전염성 점액낭염 바이러스(IBDV)의 코돈-최적화된 VP2-항원이고 SEQ ID Nr.: 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
피하 투여 방식의 예방 접종 방법에 사용하기 위한, 재조합 효모.
제 14 항에 있어서,
재조합 효모의 완전한 효모 세포를 사용해서 피하 투여 방식의 예방 접종 방법에 사용하기 위한 재조합 효모로서, 상기 방법은:
a) 재조합 효모의 배양 및 증식 단계,
b) 효모의 수거 및 비활성화 단계,
c) 재조합 효모를 결정될 면역 방식에 따라 적용하는 단계,
d) 형성된 항체의 역가 결정 단계, 및
e) 면역화 입증 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 효모.
제 1 항 또는 제 2 항의 재조합 효모의 완전한 효모 세포를 사용해서 피하 투여 방식의 예방 접종 방법에 사용하기 위한 백신으로서, 상기 방법은:
a) 재조합 효모의 배양 및 증식 단계,
b) 효모의 수거 및 비활성화 단계,
c) 재조합 효모를 결정될 면역 방식에 따라 적용하는 단계,
d) 형성된 항체의 역가 결정 단계, 및
e) 면역화 입증 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신.
제 16 항에 있어서,
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 종의 재조합 효모의 완전한 효모 세포를 피하 투여 방식으로 적용함으로써, 발현된 외래 단백질에 대한 체액성 면역화를 발생시키는 것을 특징으로 하는, 백신.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제