CN1888050A - 一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株。本发明提供的酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS，CCTCC NO：M206068。酵母菌株基因组中含有乙型肝炎病毒的PreS全长基因。酵母菌株经过诱导，可以分泌表达乙肝病毒PreS蛋白(即大蛋白也称L蛋白)，表达量达10mg/L。PreS蛋白在发酵液中能形成球状的、直径为30mm的蛋白质颗粒。该蛋白和蛋白颗粒具有良好的抗原性。用家兔免疫试验比较PreS蛋白和S蛋白的免疫效果，表明本发明所提供的菌株所表达的PreS蛋白比目前市场上的S抗原疫苗具有更好的免疫原性，是新一代高效乙肝疫苗的优选蛋白。

Description

一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株及制备方法

                         技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种酵母工程菌株，同时涉及工程菌株的制备方法。该菌株可以产生乙肝病毒PreS抗原蛋白。用PreS蛋白作疫苗，免疫动物诱导产生抗体的效果比现有乙肝S疫苗提高了50％，能有效解决目前10-20％的接种人群对S蛋白疫苗无反应或低反应这一问题。

                         背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的转染性疾病。全世界有3.5亿的乙肝携带者，中国是乙肝感染高发国，约60％的人受过HBV感染，约有1.2亿HBV携带者。HBV感染常常发展为肝癌和肝硬化，在中国每年约有30万人死于与乙肝相关的疾病。目前对乙肝还没有特别有效的治疗药物和治疗手段，用疫苗进行预防和阻断传播途径仍是最有效的手段。

第一代乙肝疫苗为血源疫苗，来源于乙肝病人血清中的22nm的粒子，这种粒子不含乙肝病毒DNA，只含表面抗原和脂质，具有很强的免疫原性，免疫效果也最好。但血源疫苗受到来源、安全性等限制，难以满足普遍接种的需要，而且产品容易受到血清中存在的各种病毒如艾滋病、丙肝病毒等污染，现在我国已经禁用血源疫苗。第二代乙肝疫苗为基因工程蛋白疫苗，主要成分是用酵母或哺乳动物细胞(如CHO)表达的乙肝病毒表面抗原主蛋白(S蛋白，HBsAg)。S蛋白疫苗在预防乙肝传播方面发挥了重要作用，但仍有不足，在免疫试验区仍有少数免疫过的儿童感染乙肝，大约有10-20％的接种人群对S蛋白疫苗无反应或低反应，不能产生足够的保护作用。因此，进一步提高乙肝疫苗的免疫原性和加强免疫保护性非常必要。

乙肝病毒的外膜蛋白(抗原蛋白)由基因组的S区编码，S区有3-4个翻译起始点，分别编码表面抗原主蛋白(S，HBsAg)、中蛋白(M)和大蛋白(L，全长PreS蛋白)。S蛋白是其中最小的蛋白，含226个氨基酸，中蛋白MP为S蛋白N端加上55个氨基酸的PreS2，大蛋白PreS为中蛋白N端加上108aa的PreS1。三种蛋白均具有很强的免疫原性。目前新一代乙肝疫苗的研究非常注重PreS蛋白，主要原因如下：1、虽然PreS蛋白虽然在Dane颗粒中含量很少(10-20％)，远不及S蛋白(70-80％)，但PreS蛋白暴露于颗粒表面，宿主的免疫应答更多是针对PreS蛋白。2、进来研究结果证实PreS蛋白可以获得比S蛋白更为全面和持久的免疫效果。特别是PreS蛋白的N端，即PreS1部分，具有极强的免疫原性，有文献报道，单独使用PreS1肽段即能起免疫保护作用，用识别PreS1的21-47位氨基酸的人源化抗体注射黑猩猩可使其在一年内免受HBV的浸染。PreS1区24-47位氨基酸与肝细胞受体结合，用含这段氨基酸序列的合成肽段免疫黑猩猩，即能产生中和抗体，起到完全得保护作用。PreS1还参与乙肝吸附和进入细胞过程，还可能与病毒装配和分泌有关，J.Le.Seyee等人(1999)证实PreS1的第3-77aa影响乙型肝炎病毒的感染力。3、PreS2蛋白的C端与S蛋白相连形成M蛋白，PreS2也是暴露于HBV囊膜外层的，其上具有多聚人血清白蛋白(Polymenized HumanSerum Albumin，PHSA)的受体(PHSA-R)，能与PHSA结合。由于肝细胞表面也有PHSA-R，HBV能通过血循环中存在的PHSA的介导，吸附到肝细胞表面。PreS2有良好的免疫原性，能刺激机体产生相应抗体—抗PreS2。此抗体出现于急性感染恢复早期，比抗S抗体出现早而维持时间与抗S抗体一样。抗PreS2亦具有中和作用，可作为机体康复的指标之一。因此，理论上PreS蛋白(PreS1+PreS2+S蛋白)集中PreS1，PreS2和S蛋白的免疫原性，大量的研究结果亦表明PreS蛋白的免疫原性和免疫保护性比S蛋白强。目前，PreS疫苗还处于研究阶段，国内外还没有产品进入市场。

目前，生产乙肝病毒表面抗原主蛋白(S蛋白，HBsAg)是用哺乳动物细胞(CHO)或酵母进行表达。使用哺乳动物细胞表达系统，表达的S蛋白翻译后修饰和糖基化更接近于天然状态，免疫效果比较理想，但细胞培养生产能力低，且产品纯化工艺较为繁琐。使用哺动物细胞CHO生产S蛋白主要是国内一些研究所和企业，1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物技术研究所等单位研制成功哺乳动物(CHO)细胞表达的基因工程疫苗，现已有长春生物技术研究所、华北制药集团、北京华尔盾公司、兰州生物技术研究所、武汉生物技术研究所和成都生物技术研究所获得生产批文。酵母作为单细胞真核生物，具有生长快速、培养基廉价、操作简便的特点，并可实现外源蛋白的分泌表达，使纯化工艺简化，酵母表达系统也可对表达的S蛋白进行翻译后修饰。使用酵母发酵系统生产S蛋白主要是国外一些医药公司，如史克必成公司、默克公司，目前有国内公司引进该技术在国内进行生产。经过十几年的发展，酵母表达系统已经相当完备，近年来甲醇营养型酵母(Methy-lotrophicyeast)表达系统，主要是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，以其高稳定、高表达、高分泌等特点得到广泛利用。

                         发明内容

本发明的目的是在于提供一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株。该工程菌株可以生产PreS疫苗，用于乙肝的预防。PreS蛋白包含PreS1、PreS2和S三个区域，与现有的S疫苗(HBsAg)相比，PreS蛋白含有更多的抗原表位，PreS2中120-145位氨基酸还含有能中和病毒的抗原决定簇，PreS蛋白比S蛋白具有更强的免疫原性，并且PreS1(21-47位氨基酸)是病毒与肝细胞受体的结合位点，因此，用PreS蛋白作疫苗，能有效地解决目前10-20％的接种人群对S蛋白疫苗无反应或低反应的这一问题。

该酵母工程菌株命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115/PreS，菌株已提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2006年7月19日，保藏编号为CCTCC NO：206068分类命名：巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris GS115/PreS。该酵母菌株染色体上整合有HBV PreS基因序列。酵母工程菌株Pichia pastoris GS115/PreS由以下步骤制备：

A、全长PreS基因的PCR扩增和克隆：

根据HBV标准株参比序列设计引物：

正向引物：5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’

反向引物：5’GTCCTAGGTCAGAATTCAAATGTATACCCAAAG 3’

从武汉地区乙型肝炎病人阳性血清中提取HBV基因组，以之为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到全长PreS基因，再将该片段连接到pUCm-T(购自TaKaRa公司)载体上，筛选的阳性克隆通过测序加以确定。

B、pPIC9K-PreS质粒的构建：提取pUCm-T-PreS质粒和pPIC9K(购自invitrogen公司)质粒，用SnaB I和Avr II进行双酶切，电泳回收1.2kbPreS片段和pPIC9K载体线性片段，用T4 DNA连接酶连接，转化E.coli DH5a(购自武汉凌飞科技有限公司)后经筛选和鉴定得到重组pPIK9K-PreS克隆。

C、巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS的获得。用Sal I酶切使pPIC9K-PreS线性化，电转法转化巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris GS115(购自invitrogen公司)菌株。电转后在组氨酸缺陷的MD平板上筛选His⁺Mut⁺表型转化菌株，提取所获酵母菌株基因组用PCR进行鉴定。

D、菌株的筛选：将MD平板上获得的菌株接种到含高浓度G418浓度(2-4mg/L)的BMGY平板上，28℃培养4天，挑选抗G418浓度最高的几个菌落分别接种到BMGY液体培养基中，05％-1％甲醇诱导表达96小时，SDS-PAGE检测，通过观察PreS蛋白表达量的比较，选出产量最高的菌株，将之命名为巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS。

本发明获得的巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS具有如下特点：

巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS，基因工程菌株，菌体呈球形，菌落光滑，呈乳白色，最适生长温度29℃-30℃，代谢型为His⁺Mut⁺。

菌株的基因组中含有HBV PreS基因序列，经甲醇诱导后可以分泌表达PreS蛋白，分子量为48kD。

发酵所用培养基为BMGY和基本盐培养基，其中BMGY培养基为摇瓶种子培养基，含1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，1.34％YNB，1％甘油，pH6.0；基本盐培养基为发酵培养基，每升培养基中含有26.7ml85％磷酸，0.93g硫酸钙，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，40g甘油，发酵前用30％的氨水调pH5.0。

发酵流程为：将巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS接种到BMGY液体培养基中，30℃摇床培养24-28小时，转种至10倍体积的BMGY液体培养基中扩大培养，30℃培养至A₆₀₀ 2.0-2.5，再接种到发酵罐(基本盐培养基)中，28℃培养，培养至菌体量为80mg/ml时补甘油2％，继续培养至溶解氧上升到20％以上，加入甲醇诱导，甲醇浓度维持在0.5％-1％。诱导表达96小时，离心收集上清。收集的上清液经过膜浓缩器进行脱盐和浓缩，再经过柱层析分离纯化得到PreS蛋白

本发明的优点和效果是：利用本发明提供的发酵工艺，分泌PreS蛋白的量可以达到10mg/L，部分PreS蛋白在发酵液中能形成球状的蛋白质颗粒，电镜观察发现蛋白质颗粒直径为30mm。ELISA检测证明可溶性的PreS蛋白和蛋白颗粒都具有良好的抗原性。用家兔免疫试验比较PreS蛋白和市购的乙肝S蛋白疫苗的免疫效果，表明PreS蛋白产生的S抗体的时间比购的乙肝S蛋白疫苗提前7天，并且抗体滴度水平比购的乙肝S蛋白疫苗要高50％。因此，本发明所提供的PreS蛋白比目前市场上的购的乙肝S蛋白疫苗具有更好的免疫原性，是新一代高效乙肝疫苗的首选蛋白。

                         附图说明

图1.重组质粒pPIC9K-PreS的酶切和PCR鉴定(0.7％琼脂糖凝胶电泳)。

1.PCR结果，产生的PreS基因片段大小为1.2kb

2.pPIC9K-PreS质粒AvrII酶切结果，单带，大小为10.5kb

3.pPIC9K-PreS质粒AvrII和EcoRI双酶切结果，出现两条带，大小分别为9.8kb和0.67kb

4.DNA分子量标识(Marker)(λ/HindIII)

图2巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS的PCR鉴定

1.以巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS基因组为模板加入PreS引物PCR的产物，大小为1.2kb。

2.DNA分子量标识(Marker)(λ/HindIII)

图3.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS诱导表达PreS蛋白(12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)及western blot检测

1.阴性对照，含pPIC9K载体的巴斯德毕赤酵母菌Pichia Pastoris GS115经过甲醇诱导后的上清，含66kD带。

2.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS经过诱导后的上清，箭头处示意诱导表达的48kD的PreS蛋白。

3.蛋白质分子量标识(Marker)

4.Western blot：样品同1，阴性对照

5.Western blot：样品同2，48kD处为PreS蛋白。

图4.高产菌株的筛选(12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)

C：阴性对照：含pPIC9K载体的巴斯德毕赤酵母菌Pichia Pastoris GS115经过甲醇诱导后的上清。

M：蛋白质分子量标识(Marker)

1-5：挑选的5个转化了PreS基因的巴斯德毕赤酵母菌Pichia PastorisGS115经过甲醇诱导后的上清。其中5号泳道的菌株表达量最高，命名为巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS。

图5.发酵液上清的蔗糖梯度离心结果

将巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS经诱导表达后去除菌体的上清浓缩液进行蔗糖梯度离心，出现两条带a和b。经Western blot检测，a带物质不能与HBs抗体发生反应，而b带物质可以与HBs抗体发生反应。

图6.电镜观察PreS蛋白形成的颗粒(图5中b带物质)。颗粒呈圆形，表面光滑，直径大约30mm。

图7.PreS蛋白和市售乙肝疫苗的免疫原性比较

4组家兔分别在第1和25天免疫注射(图下方带*号处显示注射时间)PreS蛋白和市售乙肝疫苗(HBsAgS蛋白为主要成分，购自深圳康泰公司)。第1、3组注射市售乙肝疫苗，注射剂量分别为2μg和10μg；第2，4组注射PreS蛋白，注射量分别为2μg和10μg。抗体滴度水平通过ELISA.检测。试验组1，2，3，4的数值分别用以△，□，▲，■表示。结果表明PreS蛋白产生的抗HBsAg抗体滴度水平要比注射同剂量HBsAg试验组高出50％，并且产生抗体的时间要早一周左右，同时注射PreS蛋白的2、4试验组抗HBsAg抗体滴度在105天内均保持在1∶2000的水平之上，而注射了HBsAg的1，3试验组在105天时抗HBsAg抗体滴度已经分别下降到1∶1400和1∶1000。

                         具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》(第三版，2002年，科学出版社)中所述实验方法。

1.HBV全长PreS基因的PCR扩增：

根据HBV标准株序列设计引物：

正向引物：5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’

反向引物：5’GTCCTAGGTCAGAATTCAAATGTATACCCAAAG 3’

用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人阳性血清中提取HBV基因组DNA，以之作为模板。用上述引物进行PCR扩增，得到全长preS基因。将PreScDNA片段连接到到pUCm-T载体上，获得pUCm-T-PreS质粒，转化E.coliDH5α感受态细胞(感受态细胞制备参照《分子克隆实验指南》中CaCl₂法进行)，在含Amp的LB培养基平板上用X-gal和IPTG蓝白斑法筛选阳性克隆并用EcoRI酶切鉴定。筛出的阳性克隆进行测序确定。测序结果证实本发明所克隆的DNA片段为HBV PreS基因，全长1206bp，与HBV参比株进行比较，得出本发明获得的HBV基因型为Adr亚型。基因序列为SEQIDNO：1

2.pPIC9K-PreS质粒的构建：用碱裂解法提取pUCm-T-PreS质粒和pPIC9K质粒，各用SnaB I和Avr II进行双酶切，电泳回收PreS DNA片段和pPIC9K载体线性片段，用T4DNA连接酶在16℃连接18小时，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含Amp和Kan的LB平板上筛选阳性克隆，用酶切及PCR鉴定。鉴定结果见图1，用Avr II单酶切获得一条10.5Kb的带，用Avr II和EcoRI双酶切获得两条大小分别为9.8kb，0.67kb的带，以pPIC9K-PreS质粒为模板加入上述步骤1引物进行PCR，得单一的1.2kb带，以上结果与预期相符。

3.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS的获得：采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris GS115菌株及筛选His⁺Mut⁺表型转化菌株。经SalI酶切完全线性化后的pPIC9K-PreS，电转化巴斯德毕赤酵母PichiaPastoris GS115感受态细胞，转化条件：0.5mm电转杯，电压1500V，电容50uF，时间10ms，电转结束后，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，混匀，取0.5mL涂布在组氨酸缺陷的MD平板上，选出阳性克隆在高浓度G418(2-4mg/ml)平皿上进行筛选，挑取抗高浓度G418的单菌落，提取酵母基因组DNA作为模板，用5’AOX1和3’AOX1为引物进行PCR鉴定。

5’AOX1 primer 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

3’AOX1 primer 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

PCR结果见图2，扩增得到了预期的1.2kb的带。

4.高产菌株的筛选

挑取能在G418浓度2mg/ml至4mg/ml的BMGY培养基平板生长的酵母菌落，接种到含有5ml BMGY液体培养基中，30℃摇床培养24小时，转种至95mlBMGY液体培养基的500ml锥形瓶中，30℃摇床培养至A₆₀₀达4-5之间，收集菌体，离心收集酵母菌体，将酵母菌体重悬于含有100ml基本盐培养基中，28℃甲醇诱导表达96小时，离心去除酵母菌体。浓缩至5ml，SDS-PAGE检测，比较PreS蛋白的表达水平，从中挑选出表达量最高的酵母菌株。结果见图4，第5泳道的菌株表达PreS蛋白的量最高，命名为巴斯德毕赤酵母菌株PichiaPastorisGS115/PreS。

5.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS发酵和PreS蛋白的诱导表达：所构建的表达菌株以及巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/pPIC9K菌株(阴性对照)在含有50mL BMGY液体培养基中，28℃培养至A₆₀₀值4～5。离心收集菌体，重悬于含100mL基本盐培养基中。28℃0.5％-1％甲醇诱导表达96小时，离心收集上清，待检。

SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物：取上述诱导培养基上清透析浓缩，加入等体积蛋白质样品处理液，沸水浴10min后取20μL加样电泳。聚丙烯酰胺凝胶浓度为12％。SDS-PAGE结果见图3，可以看到大小为48kD的蛋白带出现，经过Westblot检测，证实该蛋白带是PreS蛋白。

6.电镜观察

发酵液上清经脱盐浓缩后，60000g高速离心2小时，收集沉淀，沉淀用10mmol/L Tris(pH8.0)悬浮，再用20％-80％(w/v)的蔗糖梯度40000g离心2小时。蔗糖梯度离心结果见图5，得到两条密度相同物质组成的带a和b。Westernblot结果表明b带物质可以被HBs抗体识别，而a带物质不能与HBs抗体反应。

将b带物质收集，经洗糖处理，10mmol/L Tris(pH8.0)重悬后，透射电镜放大22000倍观察。结果见图6，可以观察到PreS蛋白形成直径为30纳米左右的颗粒。

7.PreS蛋白和市售乙肝疫苗的免疫原性比较

PreS蛋白用1％Al(OH)3吸附，PreS蛋白浓度20ug/ml。在第1和25天免疫注射PreS蛋白和市售乙肝疫苗(HBsAgS蛋白)。4组家兔中，其中第1、3组注射市售乙肝疫苗，注射剂量分别为2μg和10μg；第2，4组注射PreS蛋白，注射量分别为2μg和10μg。在初次免疫后第14天开始对免疫兔进行耳静脉取血，以后定期取血，每次每只采血1ml左右。抗体产生情况及其滴度水平用ELISA方法检测，血清抗体阳转的阈值定为阴性对照血清读数的平均值乘2，高于上述阈值读数的最高稀释度，即为该血清的滴度。

结果见图7，各注射组在第一次免疫后均产生抗HBsAg抗体。S蛋白(1，3试验组)在第21天能检测到抗体，而PreS蛋白(2，4试验组)在第14天就可检测到抗体。抗体滴度水平在加强免疫后明显升高，在49天时，4个试验组的抗体滴度水平同时达到最高峰，分别为1∶2000，1∶2700，1∶2200，1∶3200，，PreS蛋白产生的抗HBsAg抗体滴度水平要比注射同剂量HBsAg试验组高出50％，并且注射PreS蛋白的2、4试验组抗HBsAg抗体滴度在105天内均保持在1∶2000的水平之上，而注射了HBsAg的1，3试验组在105天时抗HBsAg抗体滴度已经分别下降到1∶1400和1∶1000。

                         SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株及制备方法

<130>一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株及制备方法

<160>PreS

<170>PatentIn version3.1

Sequence

<210>1

<211>1206

<212>DNA

<213>hepatitis B virus

<400>PreSequenceString：

tacgtaatgg gaggttggtc ttccaaacct cgacaaggca tggggacaaa tctttctgtt      60

cccaatcctc tgggattctt tcccgatcac cagttggacc ctgcgttcgg agccaattca      120

aacaatccag attgggactt caaccccaac aaggatcact ggccagaggc aaatcaggta      180

ggagcgggag cattcgggcc agggttcacc ccaccacacg gaggtctttt ggggtggagc      240

cctcaggctc agggcatatt gacaacagtg ccagtagccc ctcctcctgc ctccaccaat      300

cggcagtcag gaagacagcc tactcccatc tctccacctc taagagacag tcatcctcag      360

gccatgcagt ggaactccac aacattccac caagctctgc tagaccccag agtgaggggc      420

ctatactttc ctgctggtgg ctccagttcc ggaacagtaa accctgttcc gactactgcc      480

tcacccatat cgtcaatctt ctcgaggact ggggaccctg caccgaacat ggagaacaca      540

acatcaggat tcctaggacc cctgctcgtg ttacaggcgg ggtttttctt gttgacaaga      600

atcctcacaa taccacagag tctagactcg tggtggactt ctctcaattt tctaggggga      660

gcacccacgt gtcctggcca aaattcgcag tccccaacct ccaatcactc accaacctct      720

tgtcctccaa tttgtcctgg ctatcgttgg atgtgtctgc ggcgttttat catattcctc      780

ttcatcctgc tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc tggactacca aggtatgttg      840

cccgtttgtc ctctacttcc aggaacatca actaccagca cgggaccatg caagacctgc      900

acgattcctg ctcaaggaac ctctatgttt ccctcttgtt gctgtacaaa accttcggac      960

ggaaactgca cttgtattcc catcccatca tcctgggctt tcgcaagatt cctatgggag      1020

tgggcctcag tccgtttctc ctggctcagt ttactagtgc catttgttca gtggttcgta      1080

gggctttccc ccactgtttg gctttcagtt atatggatga tgtggtattg ggggccaagt      1140

ctgtacaaca tcttgagtcc ctttttacct ctattaccaa ttttcttttg tctttgggta      1200

tacatt                                                                 1206

Claims (2)

1.一种表达乙肝病毒PreS抗原疫苗的酵母工程菌株，其特征在于：巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS，CCTCC NO：M206068。

2.根据权利要求1所述的一种表达乙肝病毒Pres抗原疫苗的酵母工程菌株，其特征是巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris GS115/PreS的基因组中含有乙肝病毒PreS基因序列，经甲醇诱导后分泌表达PreS蛋白，分子量为48kD。

Images