JP7436488B2 - Aavベクター及びプロモーターの単一細胞トランスクリプトームベースの開発のための方法及び材料 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年12月28日に出願された、米国特許出願第62/785,818号の利益を主張する。先願の開示は、本出願の開示の一部(であり、参照により本出願に組み込まれる)と考えられる。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により付与されたMH113095の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本明細書は、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター及びプロモーターの単一細胞トランスクリプトームベースの開発のための方法及び材料に関する。例えば本明細書は、有効なAAVベクターを作製するための効率的及びハイスループットな方法を提供する。
効率的な標的化した遺伝子送達は、遺伝子療法及び回路ベースのツール、例えば光遺伝学の成功にとって根本的なものである。所望の細胞型における十分なレベルの遺伝子発現は必須であり、オフターゲット発現は、正確に標的化した療法、患者安全性及び回路特異的操作のために理想的には最小化されているべきである。
[実施例1]AAVベクター及びプロモーターの単一細胞トランスクリプトームベースの開発方法
材料及び方法
ライブラリー合成
(a)キャプシド又は(b)プロモーター/エンハンサーのいずれかを有するAAVのライブラリーを、特有のDNAバーコードを含むように操作する。特有のコンストラクトそれぞれについて複数のバーコードが存在する。キャプシドライブラリーは、表面露出位置にわたってランダム変異、セミランダムペプチドモチーフ及びランダムアミノ酸モチーフを有するキャプシドを含み、天然の血清型、天然の血清型の混合物又は合成配列に基づいている。エンハンサー/プロモーターライブラリーは、単一細胞ATAC-Seq試験から得られたモチーフ及び配列、合成配列並びに既存のプロモーターの変異バージョンを含む。
キャプシド及びプロモーターライブラリーの各メンバーの性能を評価するために、図2に示すようにscRNA-Seqを使用して細胞型を特定し、ベクター及びプロモーターの効率及び特異性を定量する。
最上位候補のキャプシド及びエンハンサーの性能を検証するために、二次的な評価ラウンドを行うことができる。特定の細胞型を標的とする最上位のベクター(親血清型と比較して最高レベルの導入遺伝子発現を示すウイルス、又は親血清型と比較して最高レベルの導入遺伝子発現及び他の全ての細胞型において最低レベルの導入遺伝子発現を示すウイルス)を選択する。最も効率的なウイルス(細胞1個当たりの転写物の総数で正規化して、最大コピー数のバーコード転写物を駆動するバリアント)及び最も特異的かつ効率的な発現を駆動するバリアント(最大コピー数のオンターゲットのバーコード転写物及び最小コピー数のオフターゲットの転写物を駆動するバリアント)及び疾患原因遺伝子の発現の野生型パターンに最もよく適合する遺伝子発現のパターンを駆動するバリアントを各細胞型又は遺伝子について選択する。異なるレベルのオフターゲット発現を示すバリアントをオフターゲットリード数の最適な閾値を決定するための二次スクリーニングのために選択する。これらを再び、特有のバーコード(例えば、限定されるものではないがGFP融合バーコード)を用いてそれぞれパッケージングし、プールし、組織に注入して、再びscRNA-Seqによってスクリーニングして全体の最高性能のベクターを決定する。
AAVライブラリーのさらなるバージョンを、AAVが、ゲノム中に位置するさらなる小ペプチドと共に、AAVゲノムの天然のコンフォメーションを使用するように構築する(図7A及び7B)。端的には、野生型AAVゲノムが、ITRパッケージングシグナル内に保持される。小さい汎用プロモーター(例えば小CMVプロモーター)により駆動される小ペプチドタグ及び小さい最小pAシグナル(例えば48bpのポリAシグナル)を、capオープン・リーディング・フレームの後ろかつITR間に付加する(図7A)。このライブラリーは、最小プロモーターと小ペプチド配列との間に介在配列(IVS)を含んでいてもよい(図7B)。
AAVライブラリーのさらなるバージョンを、大きく強い汎用プロモーターが、GFP又はスプリットGFP(スプリットGFPは、細胞表面に提示されるか、又は細胞の細胞質内に保持され得る)の発現を駆動し、そして、cap遺伝子がITR内にパッケージングされるように構築する(図8)。これらの場合において、ライブラリーは、repイントランス(rep in trans)のシステムにより作製する(図9)。これは、ヘルパーウイルス感染を保持し得る動物における安全性の上昇のために、複製不全ライブラリーを産生するという追加の利点を有するが、capが内在性AAVプロモーターにより駆動され、capが、cap遺伝子中のアミノ酸挿入を示す一連のバーコードと共にウイルス内にパッケージングされることを可能にするものである。端的には、これらのライブラリーは、AAV P40プロモーター、AAV P19+P40プロモーター、又はAAV P19+P40プロモーターのより長いバージョンを含み得る。コンストラクトはまた、プロモーター、例えばGFP、GFP11(例えばスプリットGFP)又は細胞表面に発現するGFP11のようなフルオロフォアの発現を駆動する汎用CAGプロモーターを含み得る。
プロモーターライブラリーは、scATACデータセット、例えば図10に示すように単一細胞をクラスター化させるのに使用したものから構築する。単一細胞ATACseqは、分離した網膜細胞においてオープンクロマチンの領域を決定するのに使用する。クラスターは、マーモセット黄斑scATAC-seqデータ(SnapATACを使用)から作成した後、同一サンプルからのscRNA-seqデータと統合する。統合したscRNA-seqデータからの遺伝子発現に基づいて細胞型を予測する(Seuratを使用)。プロモーターライブラリーを、特定の細胞型からの多数のDNA配列を共に対形成することにより構築する。
疾患遺伝子のプロファイルは、単一細胞RNA-Seqによって決定することができ、次いで所望のAAV(遺伝子の野生型コピーの発現の天然のパターン及びレベルを与える)を、疾患遺伝子プロファイルにAAVプロファイルを適合させることにより決定し得る。疾患遺伝子プロファイルは、RS1、USH2A及びABCA4について決定した(それぞれ図11A、11B及び11C)。
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、上述の説明は、本発明を説明することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されるものであることは、理解されるべきことである。他の態様、利点及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
(付記)
(付記1)
(a)AAV変異体又はプロモーターのライブラリーを作製するステップであって、ライブラリー内の各AAVが特有のDNAバーコードを含むか、又は各プロモーターコンストラクトが特有のDNAバーコードを含む、ステップ、
(b)AAV変異体又はプロモーターを、二重(キャプシドライブラリーについて)又は三重(プロモーターライブラリーについて)トランスフェクション手順を用いて、パッケージング細胞株中にパッケージングするステップ、
(c)AAV変異体のライブラリーを動物宿主の1つ以上の組織に送達するか、又は培養中の組織に感染させるステップ、
(d)AAV変異体のライブラリーを送達した動物宿主の1つ以上の組織又は培養組織内で、AAV変異体のライブラリー内のAAVベクターが互いに競合するのに適切な期間、AAV変異体のライブラリーをインビボで維持するか、又は培養中の組織におけるウイルスのライブラリーを培養するステップ、及び
(e)単一細胞又は単一核マイクロ流体方法を使用して、AAV変異体のライブラリーを送達した動物宿主の1つ以上の組織内の細胞から単一細胞又は単一核cDNAライブラリーを作製するステップ
を含む方法。
(付記2)
ステップ(e)が単一細胞マイクロ流体技術を使用する、付記1に記載の方法。
(付記3)
ステップ(e)が単一核マイクロ流体技術を使用する、付記1に記載の方法。
(付記4)
動物宿主の1つ以上の組織が神経組織を含む、付記1から3のいずれか一項に記載の方法。
(付記5)
神経組織が中枢神経系組織を含む、付記4に記載の方法。
(付記6)
中枢神経系組織が脳組織である、付記5に記載の方法。
(付記7)
神経組織が末梢神経系組織を含む、付記5に記載の方法。
(付記8)
動物宿主の1つ以上の組織が網膜組織を含む、付記1から3のいずれか一項に記載の方法。
(付記9)
動物宿主の1つ以上の組織が筋肉組織を含む、付記1から3のいずれか一項に記載の方法。
(付記10)
筋肉組織が横紋筋を含む、付記9に記載の方法。
(付記11)
筋肉組織が心筋を含む、付記9に記載の方法。
(付記12)
筋肉組織が平滑筋を含む、付記9に記載の方法。
(付記13)
動物宿主が霊長類である、付記1から12のいずれか一項に記載の方法。
(付記14)
霊長類が旧世界ザルである、付記13に記載の方法。
(付記15)
旧世界ザルがアカゲザル(Macaca mulatta)である、付記13に記載の方法。
(付記16)
霊長類が、テナガザル科又はヒト科の類人猿である、付記13に記載の方法。
(付記17)
霊長類がホモ属ではない、付記16に記載の方法。
(付記18)
霊長類がパン属ではない、付記16に記載の方法。
(付記19)
AAV変異体のライブラリーの送達が組織への注入を介するものである、付記1から18のいずれか一項に記載の方法。
(付記20)
インビボで所望の細胞型に感染し、少なくとも1週間前記細胞型内にインビボで維持される能力を有するAAV変異体を得る方法であって、
(a)前記細胞型を含む動物宿主にAAV変異体のライブラリーを導入するステップであり、前記ライブラリー内の各AAVが特有のDNAバーコードを含む、ステップ、及び
(b)1つ以上のAAV変異体についての前記バーコードに基づいて、前記1つ以上のAAV変異体を前記細胞型の細胞内に存在するものとして特定するステップであり、前記細胞が、前記ライブラリーを前記動物宿主に導入した後少なくとも1週間前記動物宿主内にあった、ステップ
を含む、方法。
(付記21)
前記細胞型が、中枢神経系細胞型又は末梢神経系細胞型である、付記20に記載の方法。
(付記22)
前記細胞型が、網膜細胞型、横紋筋細胞型、心筋細胞型又は平滑筋細胞型である、付記20に記載の方法。
(付記23)
前記動物宿主が霊長類である、付記20から22のいずれか一項に記載の方法。
(付記24)
前記霊長類が旧世界ザルである、付記23に記載の方法。
(付記25)
前記霊長類がアカゲザル(Macaca mulatta)である、付記23に記載の方法。
(付記26)
前記霊長類が、テナガザル科又はヒト科の類人猿である、付記23に記載の方法。
(付記27)
前記霊長類がホモ属ではない、付記26に記載の方法。
(付記28)
前記霊長類がパン属ではない、付記26に記載の方法
(付記29)
前記ライブラリーが、前記細胞型を含む組織への注入を介して前記動物宿主に導入される、付記20から28のいずれか一項に記載の方法。
(付記30)
前記少なくとも1週間が、1週間から12週間である、付記20から28のいずれか一項に記載の方法。
(付記31)
AAVウイルスのライブラリーからプロモーター配列を得る方法であって、
(a)細胞型を含む動物宿主に前記ライブラリーを導入するステップであり、前記ライブラリー内の各AAVが、蛍光ポリペプチドの発現を駆動するように構成された特有のプロモーター配列を含む、ステップ、及び
(b)前記蛍光ポリペプチドの前記発現に基づいて、1つ以上のプロモーター配列を前記細胞型の細胞内に存在するものとして特定するステップであり、前記細胞が、前記ライブラリーを前記動物宿主に導入した後少なくとも1週間前記動物宿主内にあった、ステップ
を含む方法。
(付記32)
前記細胞型が中枢神経系細胞型又は末梢神経系細胞型である、付記21に記載の方法。
(付記33)
前記細胞型が、網膜細胞型、横紋筋細胞型、心筋細胞型又は平滑筋細胞型である、付記21に記載の方法。
(付記34)
前記動物宿主が霊長類である、付記31から33のいずれか一項に記載の方法。
(付記35)
前記霊長類が旧世界ザルである、付記34に記載の方法。
(付記36)
前記霊長類がアカゲザル(Macaca mulatta)である、付記34に記載の方法。
(付記37)
前記霊長類が、テナガザル科又はヒト科の類人猿である、付記34に記載の方法。
(付記38)
前記霊長類がホモ属ではない、付記37に記載の方法。
(付記39)
前記霊長類がパン属ではない、付記37に記載の方法。
(付記40)
前記ライブラリーが、前記細胞型を含む組織への注入を介して前記動物宿主に導入される、付記31から39のいずれか一項に記載の方法。
(付記41)
前記少なくとも1週間が、1週間から12週間である、付記31から40のいずれか一項に記載の方法。
(付記42)
AAV repポリペプチドをコードする核酸、AAV capポリペプチドをコードする核酸、及び核酸カセットを含む単離された核酸であって、前記核酸カセットが、プロモーター配列、ペプチドタグをコードする核酸、核酸バーコード及びポリAテール配列を含む、単離された核酸。
(付記43)
前記AAV repポリペプチドをコードする前記核酸、前記AAV capポリペプチドをコードする前記核酸、及び前記核酸カセットが、2つの逆位末端反復配列の間に位置する、付記42に記載の単離された核酸。
(付記44)
前記核酸バーコードが20から30ヌクレオチドの長さである、付記42から43のいずれか一項に記載の単離された核酸。
(付記45)
前記単離された核酸がプラスミドである、付記42から44のいずれか一項に記載の単離された核酸。
(付記46)
AAV capポリペプチドをコードする核酸及び核酸カセットを含む単離された核酸であって、前記核酸カセットがプロモーター配列、蛍光ポリペプチドをコードする核酸及びポリAテール配列を含み、前記単離された核酸が全長repポリペプチドをコードする核酸を欠く、単離された核酸。
(付記47)
前記AAV capポリペプチドをコードする前記核酸及び前記核酸カセットが、2つの逆位末端反復配列の間に位置する、付記46に記載の単離された核酸。
(付記48)
全長repポリペプチドのアミノ酸配列の25%以下、50%以下、75%以下、又は85%以下である、repポリペプチドアミノ酸配列をコードする核酸を含む、付記46から47のいずれか一項に記載の単離された核酸。
Claims (24)
- (a)AAV変異体のライブラリーを作製するステップであって、ライブラリー内の各AAVが特有のDNAバーコードを含む、ステップ、
(b)AAV変異体を、二重トランスフェクション手順を用いて、パッケージング細胞株中にパッケージングするステップ、
(c)AAV変異体のライブラリーを動物宿主の1つ以上の組織に送達するステップであって、前記動物宿主が、ホモ属ではない霊長類であるステップ、
(d)AAV変異体のライブラリーを送達した動物宿主の1つ以上の組織内で、AAV変異体のライブラリー内のAAVベクターが互いに競合するのに適切な期間、AAV変異体のライブラリーをインビボで維持するステップであって、前記期間が少なくとも1週間であるステップ、
(e)AAV変異体のライブラリーを送達した組織を動物宿主から得るステップ、
(f)動物宿主から得た組織を分離して単一細胞を得るステップ、及び
(g)前記AAV変異体の特有のDNAバーコードに基づいて単一細胞のトランスクリプトームプロファイルを分析し、(i)単一細胞の細胞型及び(ii)単一細胞に感染したAAV変異体を特定するステップ
を含む方法。 - 前記動物宿主の1つ以上の組織が神経組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 神経組織が中枢神経系組織を含む、請求項2に記載の方法。
- 中枢神経系組織が脳組織である、請求項3に記載の方法。
- 神経組織が末梢神経系組織を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記動物宿主の1つ以上の組織が網膜組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記動物宿主の1つ以上の組織が筋肉組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 筋肉組織が横紋筋を含む、請求項7に記載の方法。
- 筋肉組織が心筋を含む、請求項7に記載の方法。
- 筋肉組織が平滑筋を含む、請求項7に記載の方法。
- 霊長類が旧世界ザルである、請求項1に記載の方法。
- 旧世界ザルがアカゲザル(Macaca mulatta)である、請求項11に記載の方法。
- 霊長類が、テナガザル科又はヒト科の類人猿である、請求項1に記載の方法。
- 霊長類がパン属ではない、請求項1に記載の方法。
- AAV変異体のライブラリーの送達が組織への注入を介するものである、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- インビボで所望の細胞型に感染し、少なくとも1週間前記細胞型内にインビボで維持される能力を有するAAV変異体を得る方法であって、
(a)前記細胞型を含む動物宿主にAAV変異体のライブラリーを導入するステップであり、前記ライブラリー内の各AAVが特有のDNAバーコードを含み、前記動物宿主が、ホモ属ではない霊長類である、ステップ、
(b)AAV変異体のライブラリー内のAAVベクターが互いに競合するのに適切な期間、AAV変異体のライブラリーをインビボで維持するステップであって、前記期間が少なくとも1週間であるステップ、
(c)前記細胞型を含む組織を動物宿主から得るステップ、
(f)動物宿主から得た組織を分離して単一細胞を得るステップ、及び
(g)前記AAV変異体の特有のDNAバーコードに基づいて単一細胞のトランスクリプトームプロファイルを分析し、(i)単一細胞及び(ii)単一細胞に感染したAAV変異体を特定するステップ
を含む、方法。 - 前記細胞型が、中枢神経系細胞型又は末梢神経系細胞型である、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞型が、網膜細胞型、横紋筋細胞型、心筋細胞型又は平滑筋細胞型である、請求項16に記載の方法。
- 前記霊長類が旧世界ザルである、請求項16に記載の方法。
- 前記霊長類がアカゲザル(Macaca mulatta)である、請求項16に記載の方法。
- 前記霊長類が、テナガザル科又はヒト科の類人猿である、請求項16に記載の方法。
- 前記霊長類がパン属ではない、請求項16に記載の方法
- 前記ライブラリーが、前記細胞型を含む組織への注入を介して前記動物宿主に導入される、請求項16から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1週間が、1週間から12週間である、請求項16から23のいずれか一項に記載の方法。
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