CN117343958A - 一种新型冠状病毒重组dna疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种新型冠状病毒重组DNA疫苗及其应用。所述重组DNA疫苗将真核表达载体融合如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建得到。本发明通过优化表达载体、不同S基因优化方式和S蛋白结构，比较S蛋白体外表达效率和小鼠体内免疫效果，筛选出新型冠状病毒重组DNA疫苗pSN‑S‑6P，该疫苗对新型冠状病毒野生株以及不同变异株均产生较好的中和抗体活性和保护效力，具有很好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒重组DNA疫苗及其应用。
背景技术
尽管目前世界各地已有部分SARS-CoV-2疫苗被获批使用，但现有疫苗仍存在激活免疫系统的能力不足、免疫效果较弱等问题需要解决。此外，SARS-CoV-2持续发生变异，现有疫苗大多针对野生毒株设计，对变异株具有一定的免疫逃逸，保护能力下降。因此，为提高SARS-CoV-2疫苗保护效果，需进一步开发针对变异株更为有效的疫苗。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种新型冠状病毒重组DNA疫苗及其应用，该疫苗对野生株，以及各种不同变异株均产生较好的中和抗体活性和保护效力，具有很好的临床应用价值。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种新型冠状病毒重组DNA疫苗，其以真核表达载体融合如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建得到。
进一步地，所述真核表达载体为pSN。
进一步地，所述新型冠状病毒重组DNA疫苗具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
根据本发明实施例的第二方面，本发明提供如上任一项所述的新型冠状病毒重组DNA疫苗的制备方法，包括：
构建含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组质粒；
将所述重组质粒进行转化、扩增并表达，即得到重组DNA疫苗。
进一步地，所述重组质粒使用的载体为pSN。
根据本发明实施例的第三方面，本发明提供如上所述的重组DNA疫苗在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染中的应用。
进一步地，所述新型冠状病毒为Delta变异株、Beta变异株、野生株、Omicron-BA.1或Omicron-BA.2。
本发明实施例具有如下优点：
本研究使用真核表达系统，构建多种表达SARS-CoV-2Delta变异株S蛋白的重组DNA疫苗，通过优化表达载体、不同S基因优化方式和S蛋白结构，比较S蛋白体外表达效率和小鼠体内免疫效果，筛选出新型冠状病毒DNA候选疫苗pSN-S-6P，该候选疫苗对新型冠状病毒野生株以及不同变异株均产生较好的中和抗体活性和保护效力，具有很好的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供的pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒的体外表达效率结果，其中，**表示P<0.01；****表示P<0.0001；A.pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒的Western Blot结果；B.pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒的相对表达量结果。
图2为本发明提供的pVAX1-S、pSN-S重组质粒的特异性IgG抗体比较，其中，*表示P<0.05。
图3为本发明提供的pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒的体外表达效率结果，其中，*表示P<0.05；A.pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒的Western Blot结果；B.pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒的相对表达量结果。
图4为本发明提供的pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒的特异性IgG抗体比较。
图5为本发明提供的pSN-S-3和pSN-S-6P重组质粒的体外表达效率比较，其中，*表示P<0.05；A.pSN-S-3和pSN-S-6P重组质粒的Western Blot结果；B.pSN-S-3和pSN-S-6P重组质粒的相对表达量结果。
图6为本发明提供的含S蛋白不同结构的重组质粒免疫小鼠后特异性IgG抗体比较，其中，*表示P<0.05。
图7为本发明提供的含S蛋白不同结构的重组质粒免疫小鼠后中和抗体比较。
图8为本发明提供的pSN-S-6P重组质粒诱导的小鼠特异性细胞免疫应答结果，其中，*表示P<0.05；**表示P<0.01。
图9为本发明提供的pSN-S-6P重组质粒免疫金黄地鼠后特异性IgG抗体结果，其中，*表示P<0.05；**表示P<0.01。
图10为本发明提供的pSN-S-6P重组质粒免疫金黄地鼠后对不同变异株的交叉中和抗体结果。
图11为本发明提供的Delta变异株和Omicron-BA.2变异株感染后，肺脏病毒载量和病毒滴度结果，其中，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验动物：无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级6周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
HEK293细胞和RBD蛋白多克隆抗体由本实验室保存；SARS-CoV-2S蛋白使用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cells，CHO)表达，由本实验室保存；Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pVAX1、pCAGGS、pcDNA3.4和pSN表达载体由本实验室保存。
实施例1新型冠状病毒重组DNA疫苗表达载体的优化与筛选
(1)pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒的构建和体外表达效率比较
以WHO公布的Delta变异株S蛋白氨基酸为基础，将S蛋白福林蛋白酶切割位点682-RRAR-685氨基酸替换为682-GSAS-685，使其失去被福林样蛋白酶切割的能力，在986和987位氨基酸处引入2个脯氨酸的突变，K986P和V986P，得到更稳定的融合前构象，针对人密码子偏好性进行基因优化与合成，获得pUC57-S质粒。使用PCR方法，以pUC57-S质粒为模板，分别在S基因两端加入EcoR I和Xho I、EcoR I和Xba I、Xba I和Age I、Xho I和Xba I酶切位点，扩增用于连接pVAX1、pCAGGS、pcDNA3.4和pSN-S载体的S基因片段，使用无缝克隆的方法，连接含有相应酶切位点的载体片段，得到pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒，将重组质粒转化至Trans1-T1感受态细胞中，获得对应的重组菌。
将PCR鉴定和测序正确的pVAX1-S/Trans1-T1、pCAGGS-S/Trans1-T1、pcDNA3.4-S/Trans1-T1和pSN-S/Trans1-T1重组菌分别接种至含5mL LB培养基(50mg/L卡那青霉素)、5mL LB培养基(50mg/L氨苄青霉素)、5mL LB培养基(50mg/L氨苄霉素)和5mL LB培养基(50mg/L卡那霉素)的试管中，37℃摇床220rpm培养10h。培养后的菌液按1：200的比例分别接种至含300mL LB培养基(50mg/L卡那青霉素)、300mL LB培养基(50mg/L氨苄青霉素)、300mL LB培养基(50mg/L氨苄霉素)、300mL LB培养基(50mg/L卡那霉素)的锥形瓶中，于37℃摇床220rpm培养14h。参照无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒，方法为：向吸附柱中加入2.5mL的平衡液，于8000rpm离心2min，弃去废液；加入培养14h的300mL菌液，于8000rpm离心3min，弃去上清；加入20mL溶液P1，用移液枪吹打使细菌彻底悬浮；加入20mL溶液P2，缓慢的上下翻转10次，于室温静置5min；加入20mL溶液P4，缓慢的上下翻转10次，于室温静置10min；8000rpm离心20min；将上清使用过滤器过滤后，收集到50ml离心管中；向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，混匀后加入吸附柱中，于8000rpm离心2min，弃去废液；加入10mL漂洗液，8000rpm离心2min，弃去废液；再次加入10mL漂洗液，8000rpm离心2min，弃去废液；加入3mL无水乙醇，8000rpm离心2min，弃去废液；8000rpm空离5min；将吸附柱放于一个新的收集管中，在吸附膜中间正上方滴加1.5mL洗脱液，室温静置5min，之后8000rpm离心2min；收集收集管中的液体。1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行浓度和纯度的测定。分装后-40℃冰箱中保存，备用。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，质粒大小正确，条带单一，表明重组质粒具有良好的完整性。
使用Western Blot方法比较pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒的表达量。使用六孔板中单层贴壁70％～80％的HEK293细胞，参照Lipofecta mine 3000试剂说明书，分别将2.5μg的pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒转染至HEK293细胞。方法为：将3.75μL lipofectamine3000加入到125μL Opti-MEM中，使用移液器反复吹打混合液，充分稀释；将5μL P3000和2.5μg重组质粒加入到125μL Opti-MEM中，使用移液器反复吹打混合液，充分稀释；将P3000、重组质粒和Opti-MEM的混合液加入到lipofectamine3000和Opti-MEM的混合液中，混匀，室温静置15min；将混合液加入到对应的细胞孔中，于37℃，5％CO2的细胞培养箱培养。48h后收集蛋白样品，按照BCA蛋白定量试剂盒的说明计算蛋白样品的浓度，分别取20ng待比较蛋白样品和空细胞组蛋白样品上样。使用1：1000稀释的RBD蛋白多克隆抗体和GAPDH内参抗体作为一抗，1：5000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP作为二抗。分别计算HEK293细胞表达的SARS-CoV-2S蛋白灰度值和GAPDH内参灰度值的比值，将数据归一化处理，比较pVAX1-S、pCAGGS-S、pcDNA3.4-S和pSN-S重组质粒HEK293细胞中的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量大小。
结果显示，转染pVAX1-S重组质粒组HEK293细胞的S蛋白相对表达量最低，转染pSN-S重组质粒组HEK293细胞的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量最高，平均是pVAX1-S重组质粒组的3.5倍，二者差异极显著。转染pCAGGS-S重组质粒组HEK293细胞的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量平均是pVAX1-S重组质粒组的2.6倍，二者差异极显著。转染pCDNA3.4-S重组质粒组HEK293细胞的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量平均是pVAX1-S重组质粒组的1.7倍，二者差异不显著(图1)。
(2)pVAX1-S和pSN-S重组质粒的小鼠体内免疫效果比较
24只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成3组，每组8只。分别免疫pVAX1-S重组质粒、pSN-S重组质粒和pSN载体。共进行2次相同剂量免疫，每次免疫间隔21d。分别于第1次免疫后21d、在第2次免疫后21d采集小鼠血液，6000rpm离心10min，收集小鼠血清，用于特异性抗体检测。免疫方法为：将pVAX1-S重组质粒、pSN-S重组质粒、pSN载体稀释至2000ng/μL，免疫组小鼠分别免疫200μg/100μL pVAX1-S重组质粒、pSN-S重组质粒，载体对照组小鼠分别免疫200μg/100μL pSN载体。免疫途径为后肢外侧肌肉注射。使用建立的小鼠抗新型冠状病毒IgG抗体间接ELISA检测方法检测各组小鼠血清中的抗新型冠状病毒IgG抗体效价，判定为阳性时对应的最大检测血清稀释倍数为抗体效价。
结果显示，第1次免疫后21d，免疫pVAX1-S和pSN-S重组质粒小鼠血清中均产生了针对S蛋白的特异性IgG抗体。第2次免疫后21d，pVAX1-S重组质粒组免疫组小鼠血清中针对S蛋白的特异性IgG抗体效价平均为1：3738，pSN-S重组质粒免疫组小鼠血清中针对S蛋白的特异性IgG抗体平均效价为1：30400，比pVAX1-S重组质粒免疫组高了7.1倍，差异显著(图2)。
以上内容表明pSN-S重组质粒的体外表达效率和小鼠体内免疫效果均为最佳，因此，使用pSN表达载体作为DNA疫苗的候选表达载体。
实施例2新型冠状病毒S基因的优化与筛选
(1)5种含不同优化S基因的重组质粒构建和体外表达效率比较
为确定S基因的最优表达方式，以实施例1中设计的S蛋白氨基酸为基础，针对人密码子偏好性，设计了5种不同优化的S基因并进行基因合成。在S基因两端都分别加入Xho I和Xba I酶切位点，使用无缝克隆的方法，分别将S基因克隆到实施例1中筛选的DNA疫苗候选表达载体pSN，得到pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒，将重组质粒转化至Trans1-T1感受态细胞中，获得对应的重组菌。将PCR鉴定和测序正确的pSN-S-1/Trans1-T1、pSN-S-2/Trans1-T1、pSN-S-3/Trans1-T1、pSN-S-4/Trans1-T1和pSN-S-5/Trans1-T1分别接种至含5mL LB培养基(50mg/L卡那霉素)的试管中，按照实施例1的方法分别制备pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，质粒大小正确，条带单一，表明重组质粒具有良好的完整性。
按照实施例1的方法比较pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒在HEK293细胞中的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量大小。结果显示，转染pSN-S-3重组质粒组HEK293细胞的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量最高，转染pSN-S-5重组质粒组HEK293细胞的S蛋白相对表达量最低，二者相比差异显著。pSN-S-3重组质粒的平均表达量是其他4种重组质粒的1.1～1.6倍(图3)。结果表明优化的S-3基因体外表达效率最好。
(2)5种含不同优化S基因的重组质粒的小鼠体内免疫效果比较
按照实施例1的方法，分别使用pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒、pSN空载体免疫6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，进行小鼠免疫试验。检测各组小鼠血清中的抗新型冠状病毒IgG抗体效价。结果显示，第1次免疫后21d，pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒组小鼠血清中均产生了针对S蛋白的特异性IgG抗体，其中pSN-S-3重组质粒免疫后产生的针对S蛋白的特异性IgG抗体最高，pSN-S-4与pSN-S-5组相比，差异显著；在第2次免疫后21d，免疫pSN-S-1、pSN-S-2、pSN-S-3、pSN-S-4和pSN-S-5重组质粒组小鼠血清中针对S蛋白的特异性IgG抗体平均效价分别为1∶33822，1∶33600，1∶57200，1∶33600和1∶20200(图4)。
以上内容表明pSN-S-3重组质粒的体外表达效率和小鼠体内免疫效果均为最佳。
实施例3新型冠状病毒S蛋白的结构优化与筛选
(1)含S蛋白不同结构的重组质粒的构建和体外表达效率比较
为进一步提高S蛋白的体外表达效率和体内免疫效果，以实施例2筛选出的S基因最佳优化方式S-3为模板，对S蛋白817、892、899、942位氨基酸位点进行脯氨酸替换，进行基因合成，获得pUC57-S-6P质粒。使用PCR方法，以pUC57-S质粒为模板，两端加入Xho I和XbaI酶切位点，分别扩增含S蛋白全长的S-6P基因、缺失胞内区设计的S-6P-ΔCT基因、缺失胞内区和跨膜区设计的S-6P-ΔTM基因。使用无缝克隆的方法，分别将S-6P、S-6P-ΔCT和S-6P-ΔTM基因克隆到实施例1中筛选的DNA疫苗候选表达载体pSN，得到pSN-S-6P、pSN-S-6P-ΔCT和pSN-S-6P-ΔTM重组质粒，将重组质粒转化至Trans1-T1感受态细胞中，获得对应的重组菌。其中，S-6P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，pSN-S-6P的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
将PCR鉴定和测序正确的pSN-S-6P/Trans1-T1、pSN-S-6P-ΔCT/Trans1-T1和pSN-S-6P-ΔTM/Trans1-T1分别接种至含5mL LB培养基(50mg/L卡那霉素)的试管中，按照实施例1的方法分别制备pSN-S-6P、pSN-S-6P-ΔCT和pSN-S-6P-ΔTM重组质粒。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，质粒大小正确，条带单一，表明重组质粒具有良好的完整性。
按照实施例1的方法比较pSN-S-3和pSN-S-6P重组质粒在HEK293细胞中的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量大小。结果显示，转染pSN-S-6P重组质粒组HEK293细胞的SARS-CoV-2S蛋白相对表达量平均是pSN-S-3重组质粒组的1.3倍，二者差异显著(图5)。
(2)含S蛋白不同结构的重组质粒的小鼠体内免疫效果比较
按照实施例1的方法，分别使用pSN-S-3、pSN-S-6P、pSN-S-6P-ΔTM、pSN-S-6P-ΔCT重组质粒和pSN空载体免疫6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠。使用ELISA方法检测小鼠的特异性IgG抗体。结果显示，第1次免疫后21d，免疫组重组质粒小鼠血清中均产生了针对S蛋白的特异性IgG抗体，pSN-S-6P组平均是pSN-S-3组的5.5倍，差异显著；在第2次免疫后21d，pSN-S-6P免疫组小鼠血清中抗SARS-CoV-2Delta变异株S蛋白的特异性IgG抗体平均效价最高，分别为pSN-S-3、pSN-S-6P-ΔTM和pSN-S-6P-ΔCT免疫组的3倍、2.2倍和5.4倍(图6)。
将pSN-S-3、pSN-S-6P、pSN-S-6P-ΔTM、pSN-S-6P-ΔCT免疫组和pSN空载体对照组小鼠血清样本于56℃水浴锅中灭活30min，在96孔细胞培养板中对灭活的血清从1∶10开始进行倍比稀释，共稀释8个稀释度，每个稀释度重复3次。每孔中加入100个TCID50的SARS-CoV-2Delta变异株病毒，混匀后37℃作用1h，并设置细胞对照和病毒对照。在细胞培养板中加入等量的Vero E6细胞，每孔细胞数为3×105，37℃5％CO2的细胞培养箱中培养96h，根据病变情况确定中和抗体效价。结果显示，在第2次免疫后21d，pSN-S-6P重组质粒免疫组产生的中和抗体最高，分别为pSN-S-3、pSN-S-6P-ΔTM和pSN-S-6P-ΔCT免疫组的2倍、2倍和1.6倍(图7)。
以上内容表明pSN-S-6P重组质粒的体外表达效率和小鼠体内免疫效果均为最佳。
(3)pSN-S-6P重组质粒诱导的小鼠特异性细胞免疫应答
将pSN-S-3、pSN-S-6P重组质粒和pSN载体免疫小鼠后，在第2次免疫21d分离并培养小鼠脾脏淋巴细胞。使用流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞内CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞分泌IL-4、IFN-γ细胞因子的能力。结果显示，pSN-S-6P重组质粒免疫组小鼠脾淋巴细胞CD3+CD4 +IL-4比例约是pSN载体对照组的1.5倍，差异显著。pSN-S-6P免疫组小鼠脾淋巴细胞CD3+CD8+IFN-γ的比例约是pSN载体对照组的2.4倍，差异显著(图8)。结果表明，pSN-S-6P重组质粒免疫小鼠后能产生Th1/Th2混合型的细胞免疫应答。
实施例4pSN-S-6P在金黄地鼠中的免疫效果评价
为评估候选重组质粒pSN-S-6P在金黄地鼠中的免疫效果，将12只6周龄雌性金黄地鼠随机分成2组，每组6只，分别免疫pSN-S-6P和pSN重组质粒。共进行3次免疫，每次免疫间隔21天。三免后21天，pSN-S-6P免疫组，针对S蛋白的特异性IgG抗体平均效价可达1∶426667(图9)。针对Delta变异株、Beta变异株、WT(野生型)、Omicron-BA.1和Omicron-BA.2的平均中和抗体分别为1∶814、1∶148、1∶268、1∶33和1∶54(图10)。结果表明，pSN-S-6P重组质粒在金黄地鼠中具有良好的免疫效果，针对野生毒株以及不同变异株均可产生较好的交叉中和抗体，其中，对Delta变异株的中和抗体活性最佳。
实施例5pSN-S-6P在金黄地鼠中的保护效力评价
为进一步评估重组质粒pSN-S-6P在金黄地鼠中的保护效力，将pSN-S-6P免疫组按抗体效价结果平均分成2组，每组3只；pSN对照组随机分成2组，每组3只，将对照组和免疫组分别进行Delta变异株和Omicron-BA.2变异株的攻毒保护实验。攻毒后4天取肺脏，通过qPCR和TCID50方法测定病毒载量和病毒滴度。Delta变异株攻毒后，与对照组pSN相比，pSN-S-6P免疫组N基因和SgE基因拷贝数分别降低400000倍和20000倍以上；对照组平均病毒滴度为105.33TCID50/mL，免疫组检测不到病毒滴度。Omicron-BA.2变异株攻毒后，与对照组pSN相比，pSN-S-6P免疫组N基因和SgE基因拷贝数分别降低300倍和400倍以上；对照组平均病毒滴度为103.5TCID50/mL，免疫组检测不到病毒滴度(图11)。结果表明，pSN-S-6P重组质粒对野生毒株以及不同变异株产生较好的保护效力。
结论：本发明筛选出的pSN-S-6P具有良好体外表达效率和小鼠体内免疫效果，对新型冠状病毒野生株以及不同变异株均产生较好的中和抗体活性和保护效力，可有效预防和/或治疗新型冠状病毒感染。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (7)
1.一种新型冠状病毒重组DNA疫苗，其特征在于，将真核表达载体融合如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建得到。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒重组DNA疫苗，其特征在于，所述真核表达载体为pSN。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒重组DNA疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒重组DNA疫苗具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
构建含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组质粒；
将所述重组质粒进行转化、扩增并表达，即得到重组DNA疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒使用的载体为pSN。
6.权利要求1所述的重组DNA疫苗在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒为Delta变异株、Beta变异株、野生株、Omicron-BA.1或Omicron-BA.2。
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