CN104651321A

CN104651321A - 一种重组呼肠孤病毒、其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104651321A
Application number: CN201310578140.2A
Authority: CN
Inventors: 孙逸武; 马洪宝
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明涉及一种重组呼肠孤病毒，特别涉及一种能够表达乙肝表面抗原或抗原表位的重组呼肠孤病毒、其制备方法及其在制备HBV疫苗中的应用。本发明利用基因工程技术将编码具有较强免疫原性和抗原性的HBsAg的中和表位的DNA插入呼肠孤病毒的外层或非结构蛋白的基因组，最终经筛选建立稳定复制、稳定表达HBV抗原的重组病毒株，与目前使用的肌肉注射型乙型肝炎病毒（HBV）疫苗相比较，口服型疫苗既方便，又经济，更利于推广。

Description

一种重组呼肠孤病毒、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种能够表达乙肝表面抗原或抗原表位的重组呼肠孤病毒、其制备方法及其在制备HBV疫苗中的应用。

背景技术

我国是乙型肝炎流行区，乙肝表面抗原（HBsAg）携带率平均约10%，全国人群乙型肝炎感染率更高达60%，由其引起的肝硬化和肝癌更是全世界尚未攻克的难题。目前临床使用的乙型肝炎疫苗以生物工程生产的HBsAg为抗原，必须肌肉注射激活机体的体液免疫系统。既不方便也不经济，人们一直期盼口服型乙型肝炎疫苗。美国科学家首先在土豆中成功表达了HBsAg，国内学者跟进在水稻中表达HBsAg，试图研发植物型口服乙型肝炎疫苗。但最终未能通过临床试验的检验，未能成为成熟的产品。

呼肠孤病毒是一种双链RNA病毒，具有稳定而裸露的二十面体外壳。通常可存在于人的呼吸道和胃肠道，并不引起任何已知的疾病，自愿者人体感染实验研究结果也显示一般呼肠孤病毒感染并无临床症状。正因为呼肠孤病毒的这些生物学特性和生物学上的相对安全性，使我们尝试改造呼肠孤病毒基因组结构使之成为载体，用于基因治疗和生产新型疫苗。Roner等成功将CAT(Chloramphenicalacetyltransferase)插入呼肠孤病毒Sigma-2基因片段，稳定表达Sigma2-CAT崁合蛋白。本项目将利用呼肠孤病毒作为载体研发口服型HBV疫苗，基本的设想是通过口服表达HBV抗原蛋白的重组呼肠孤病毒,后者感染肠粘膜后进入淋巴结和血液激发机体的粘膜和体液免疫反应。

本发明是利用基因工程技术将编码具有较强免疫原性和抗原性的HBsAg基因插入呼肠孤病毒的外层或非结构蛋白的基因组，最终经筛选建立稳定复制、稳定表达HBV抗原的重组病毒株，通过口服重组病毒刺激机体的粘膜和全身体液免疫。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够表达乙肝表面抗原或抗原表位的重组呼肠孤病毒、其制备方法及其在制备HBV疫苗中的应用。

本发明的第一个目的提供一种重组呼肠孤病毒，其特征在于所述重组呼肠孤病毒能够表达乙肝表面抗原或抗原表位。

优选的，所述重组呼肠孤病毒逆转录得到的cDNA具有SEQIDNO：2所示的DNA序列。

本发明的第二个目的提供一种重组呼肠孤病毒的制备方法，其特征在于将编码HBsAg的124-147位氨基酸（表1）的基因片段克隆入编码呼肠孤病毒的外层蛋白Sigma-3的DNA（表2）的开放阅读框架中,采用逆向转录系统产生所述的重组呼肠孤病毒，产生表达HBsAg抗原表位的Sigma3融合蛋白（图1a、1b）。

表1.HBsAg全长DNA序列，编码226个氨基酸,下划线部分编码“A”决定簇（110-168）的中和免疫表位（124-147位氨基酸）。

表2.Sigma3的编码区cDNA序列（下划线部分编码其抗原决定簇）

本发明的第三个目的是提供所述重组呼肠孤病毒的应用，其特征在于所述重组呼肠孤病毒用于制备HBV疫苗。

本发明的第四个目的是提供一种HBV疫苗，其特征在于含有如上所述的重组呼肠孤病毒和辅料。

本发明具有积极的效果：（1）现有的病毒疫苗都为提取的蛋白、灭活病毒或减毒病毒。而本发明根据呼肠孤病毒的生物学特点及基因组特点，利用呼肠孤病毒的载体功能提呈抗原。这类基于裸露RNA孤病毒的疫苗设计迄今尚无报道。根据免疫理论，全新设计的基于裸露的呼肠孤病毒的口服HBV疫苗将会诱导粘膜和体液免疫反应。（2）与目前使用的肌肉注射型乙型肝炎病毒（HBV）疫苗相比较，口服型疫苗既方便，又经济，更利于推广。因此，本项工作无论在应用还是在技术方面都是一项创新。

附图说明

图1为Sigma3蛋白3D模拟结构:图1A为野生型;图1B为Sigma3/HBsAg融合蛋白，HBsAg“A”抗原决定簇中的免疫中和表位(红色)替换Sigma3的抗原表位(112-DVSPDDLDRVRTE-124）。

图2为PCR产物电泳图，其中M：DNA分子量标记。图2A中S3：ReovirusSigma3；S3-3’：Sigma33’DNA片段；S3-5’：Sigma35’DNA片段；HBsAg-“A”：HBsAgA抗原决定簇。图2B中Sigma3和HBsAg“A”抗原决定簇崁合cDNA。

图3为重组呼肠孤病毒表达Sigma3/HBsAg融合蛋白（F）和Sigma3野生型蛋白（W），A部分表示采用抗呼肠孤病毒Sigma3单克隆抗体4F2检测Sigma3野生型蛋白（W）；B部分表示采用抗HBsAg多克隆抗体检测Sigma3/HBsAg融合型蛋白（F）。M为蛋白分子量标记。

图4为小鼠血清中抗HBsAg-IgG检测结果柱状图。

图5为小鼠粪便中抗HBsAg-IgA检测结果柱状图。

具体实施方式

实施例1

本实施例描述了重组呼肠孤病毒株的构建方法。

一.呼肠病毒基因组构建

（1）呼肠病毒基因克隆:呼肠病毒的10个基因片段通过RT-PCR产生，这些PCR扩增的产物克隆入pBluescriptII载体，然后克隆入T7RNA转绿酶启动子控制的质粒pT7。克隆产物均转染感受态细菌DH5α，在琼脂糖固体培养后，挑选单个菌落，经液体培养，得到克隆的基因，并进一步测序分析鉴定。

表3.呼肠病毒基因组PCR引物

（2）Sigma3/HBsAg融合基因的构建

呼肠孤病毒III型Dearing的上述cDNA质粒作为PCR的模板，采用以下列表4内的引物产生Sigma3蛋白cDNA（1；3）的5’和3’端片段。所产生呼肠孤病毒cDNA的PCR引物均带有分别与HBsAgDNA互补序列（A抗原决定簇）。经高温变性，然后退火形成全长融合DNA，再用呼肠孤病毒Sigma3cDNA5’和3’远端引物扩增全长融合DNA(图2)。最后克隆入T7RNA转绿酶启动子控制的质粒pT7，用于病毒复活系统。即与其他9个基因的cDNA质粒共转染BHK-T7细胞，产生表达HBsAga决定簇的变异呼肠孤病毒株。所有PCR产物经凝胶电泳分离，并用QiangenDNA试剂合抽提纯化。DNA序列经测序证实(图3)。

表4.S3/HBsAg融合基因的PCR引物

表5.Sigma3-HBsAg“A”融合DNA。测序碱基序列，经校对、拼接后的DNA全长序列谱。

二..病毒产生体系及方法：

（1）细胞培养：BHK-T7和L929细胞维持在含10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的MEM培养基中。BHK-T7细胞是RNA逆转录酶转化的细胞株，Geneticin(1mg/ml)用于其选择性条件培养。用于生产病毒的BHK-T7细胞以3x10⁶接种在60cm培养皿，在不含Geneticin的培养基，当细胞达90%密度,即可接受转染。

（2）细胞转染：750ulOPTI-MEM1[培养基]加入1.5ml离心管，然后加入53.25ulTransIT-LT1(Miru)至OPTI-MEM1（每1ugDNA3ulTransIT-LT1）,轻轻混合后，在室温培养20分钟。17.75ug呼肠孤病毒的10个基因的cDNA质粒加入到上述混合液，震荡混合2秒后，继续在室温培养30分钟。各cDNA片段的量见下表2。从准备好的BHK-T7细胞培养皿吸出培养液，加入5ml新鲜培养液。然后将cDNA混合液均匀地点滴到细胞表面，置37℃培育2天，复活病毒。

表6.转染细胞时各cDNA片段的量

呼肠孤病毒cDNA片段	Ug/cDNA片段
		pT7-L1，pT7-L2,pT7-L3	2ug
pT7-M1，pT7-M2,pT7-M3	1.75ug
		pT7-S1	2ug
pT7-S2，pT7-S3,pT7-S4	1.5ug

（3）病毒生产：经2-3天培养后，采用冰冻-融化法裂解BHK-T7细胞，释放出病毒。经离心去除细胞残片，收集的上清液感染小鼠L929细胞，37℃培育3-5天。采用冰冻-融化裂解法从L929细胞收获含病毒的上清液，做1：1000稀释后，感染规模化培养的单层L929细胞。可经多次反复以上步骤，扩増病毒达到量产的目的。

（4）病毒滴度测定：L929细胞为病毒滴度测定的靶细胞，以每孔1x10⁵的密度放置细胞于6孔培养板，每孔培养液为2毫升。上述收集的含病毒的上清液，以10倍稀释成6个梯度，然后感染已准备好的L929细胞。感染48小时后，采用中性红染色做溶斑测定，从而决定病毒滴度。通常要求病毒滴度大于10⁷CFU/ml。

三.病毒及疫苗制备

L929细胞裂解上清液经0.45过滤，采用氯化铯梯度离心分离病毒。氯化铯梯度1.2–1.4g/m3，速度62000xg,离心18小时。相应病毒的区带（1.36g/cm3）被收集后在病毒保存液（150mMNaCl,15mMMgCl,10mMTris-HCl\[pH7.4])内透析。规模生产可采用EDTAcellulose层析分离病毒。分离的病毒保存在-80℃。

实施例2

本实施例描述了抗HBsAg抗体的检测。

WesternBlot用来检测HBsAg和呼肠孤病毒蛋白。被野生基因型和呼肠孤病毒变异株感染的L929细胞溶解在RIPALysisBuffer(NaCl150mM,NP-401%,Sodiumdeoxycholate0.5%,SDS0.1%,3.1MTris,pH8.0)。SDS凝胶电泳分离后，转移到PVDF膜。PVDF膜用含3%BSA的TBS-T溶液(20mMTris-HCl,pH7.5,150mmNaCl,and0.05%Tween20)封闭，然后以1:500至1:1000加入抗HBsAg多克隆抗体（Biosciences）或抗呼肠孤病毒Sigma3单克隆抗体4F2（MPBiomedicals）。2小时后，与HRP抗体（1:1000）在TBS-T中继续孵育1小时。其检测结果如图3。

实施例3

本实施例描述了动物实验结果。

C57BL/6J小鼠由得到科研管理机构批准的动物房管理。所有小鼠饲养在23℃,正常的白昼间歇。6-8周小鼠将被选用于实验，分成对照（表达野生型Sigma3的病毒）和疫苗（表达融合Sigma3/HBsAg的病毒）组，每组8只小鼠。将1X10⁶PFU的病毒接种于小鼠口腔。在0；2；4；6；8；10；12；14周采取血清和粪便样本，粪便用PBS制备成20%悬液，收集离心上清。所有样本在-20℃保存。ELISA检测小鼠血清的抗HBsAg的IgG和IgA抗体(HBsAbELISAKit,Biocare),具体方法按该Biocare提供的操作说明。其中图4显示了小鼠血清中抗HBsAg-IgG检测结果柱状图；图5中显示了小鼠粪便中抗HBsAg-IgA检测结果柱状图。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组呼肠孤病毒，其特征在于：所述重组呼肠孤病毒能够表达乙肝表面抗原或抗原表位。

2.如权利要求1所述的重组呼肠孤病毒，其特征在于：所述重组呼肠孤病毒逆转录得到的cDNA具有SEQIDNO：2所示的DNA序列。

3.一种如权利要求1或2所述的重组呼肠孤病毒的制备方法，其特征在于将编码HBsAg的124-147位氨基酸的基因片段克隆入编码呼肠孤病毒的外层蛋白Sigma-3的DNA的开放阅读框架中，采用逆向转录系统产生所述的重组呼肠孤病毒。

4.一种如权利要求1或2所述的重组呼肠孤病毒的应用，其特征在于：所述重组呼肠孤病毒用于制备HBV疫苗。

5.一种HBV疫苗，其特征在于：含有如权利要求1或2所述的重组呼肠孤病毒和辅料。